Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych.

Streszczenie

Ocena składu i funkcji białek synaptycznych stanowi ważne wyzwanie w neurobiologii. Jednak nie jest łatwo ocenić neuroprzekaźnictwo zachodzące w synapsach, ponieważ jest ono wysoce regulowane przez dynamiczne interakcje białko-białko i zdarzenia fosforylacji. W związku z tym, gdy stosuje się jakąkolwiek metodę do badania transmisji synaptycznej, głównym celem jest zachowanie tych przejściowych modyfikacji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych. Innymi słowy, protokół opisuje metodologię biochemiczną do przeprowadzania wzbogacania białek z przedziałów presynaptycznych, postsynaptycznych i pozasynaptycznych. Po pierwsze, synaptosomy lub zakończenia synaptyczne uzyskuje się z neuronów, które zawierają wszystkie przedziały synaptyczne za pomocą nieciągłego gradientu sacharozy. Warto zauważyć, że jakość tego początkowego preparatu błony synaptycznej ma kluczowe znaczenie. Następnie izolację różnych przedziałów subsynaptycznych uzyskuje się za pomocą lekkiej solubilizacji przy użyciu łagodnych detergentów w różnych warunkach pH. Pozwala to na separację przez wirowanie gradientowe i izopikenne. Wreszcie, wzbogacenie białek w różnych przedziałach subsynaptycznych (tj. pre-, post- i zewnątrzsynaptycznych frakcjach błonowych) jest walidowane za pomocą analizy immunoblot przy użyciu dobrze scharakteryzowanych markerów białka synaptycznego (tj. odpowiednio SNAP-25, PSD-95 i synaptofizyny), umożliwiając w ten sposób bezpośrednią ocenę dystrybucji synaptycznej dowolnego konkretnego białka neuronalnego.

Wprowadzenie

Transmisja synaptyczna opiera się na fizycznej integralności synapsy, koncepcji, która została przewidziana już w 1897 roku przez Fostera i Sherringtona¹. W związku z tym zrozumienie rozmieszczenia kluczowych składników neurotransmisji (np. kanałów jonowych, receptorów itp.) jest niezbędne do wyjaśnienia funkcji synaptycznych, zarówno w normalnych, jak i patologicznych warunkach. Mikroskopia elektronowa (EM) w ogromnym stopniu przyczyniła się do obecnego ultrastrukturalnego pojęcia prototypowych synaps ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W ten sposób EM precyzyjnie ustalił różnice między gęstościami pre- i postsynaptycznymi, które są oddzielone szczeliną o dość jednolitej odległości (~25 nm)². Co ciekawe, aparat postsynaptyczny wykazuje względnie ciągłe, gęste od elektronów pogrubienie poniżej błony plazmatycznej, tzw. gęstość postsynaptyczną, czyli PSD². I odwrotnie, w aparacie presynaptycznym zauważalna nieciągła sieć cytomatrix jest umieszczona tuż pod błoną plazmatyczną, co jest niezbędne do wyrównania i dokowania pęcherzyków synaptycznych do strefy aktywnej błony plazmatycznej³. W związku z tym EM stanowi złote podejście eksperymentalne do badania dystrybucji białek w strukturalnie zachowanych synapsach OUN. Jednak informacje dostarczane przez mikrofotografie elektronowe są statyczne. Rzeczywiście, coraz więcej dowodów pokazuje, że synapsy in vivo są niezwykle dynamiczne, a zatem doświadczają dramatycznych zmian strukturalnych przy długotrwałej transmisji synaptycznej. Ponadto morfologia i skład synaps mogą się zmieniać w różnych regionach OUN oraz w trakcie rozwoju, dojrzewania, starzenia się i rozwoju stanów neuropatologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół skoncentrowany na izolowaniu białek należących do różnych przedziałów synaptycznych w warunkach fizjologicznych stanowi cenne narzędzie do bardziej kompleksowego badania funkcjonowania synapty.

Tutaj opisujemy ten rodzaj uzupełniającego podejścia eksperymentalnego, które pozwala na preparatywne wzbogacenie biochemiczne różnych przedziałów błony synaptycznej - mianowicie poza-, pre- i postsynaptycznych domen błonowych. Ta metoda frakcjonowania błonowego, po raz pierwszy opisana przez Philipsa i wsp. (2001)⁴, opiera się na przesunięciu pH, które osłabia interakcje adhezyjne zachodzące w aparacie pre- i postsynaptycznym. Po pierwsze, stosując łagodne detergenty o pH 6,0, można dostrzec połączenie adherens, które utrzymuje aparat pre- i postsynaptyczny i które jest utrzymywane z pozasynaptycznej domeny błonowej, która jest rozpuszczona, a zatem może być ekstrahowana z kontaktów synaptycznych. Następnie podniesienie pH z 6,0 do 8,0 w obecności łagodnych detergentów osłabia siłę połączenia adherens, które utrzymuje presynaptyczną strefę aktywną ściśle związaną z gęstością postsynaptyczną. W związku z tym przedział presynaptyczny jest rozpuszczony i może zostać oddzielony od gęstości postsynaptycznej, która jest w większości zachowana, ponieważ stężenie użytego detergentu nie sprzyja jego rozpuszczaniu⁴. Co ciekawe, skuteczność frakcjonowania, ostatecznie wyższa niż 90%, może być potwierdzona przez różne markery subsynaptyczne: i) białko 25 związane z synaptosomalami (SNAP-25) z presynaptycznej strefy aktywnej; ii) synaptofizyna, z frakcji pozasynaptycznej (tj. poza strefą aktywną i obejmująca mikrosomy); oraz iii) białko gęstości postsynaptycznej 95 (PSD-95), z gęstości postsynaptycznej. Warto zauważyć, że ta metoda frakcjonowania błony mózgowej została z powodzeniem zastosowana. W związku z tym udało się precyzyjnie określić subsynaptyczną lokalizację różnych receptorów, takich jak receptory kwasu alfa-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (AMPA)⁵, receptor adenozyny A₁ (A₁R)⁶, receptor adenozyny A_2A (A_2AR)⁷, receptory adenozynotrifosforanu (ATP) P2⁸, podjednostki receptora nikotynowego acetylocholiny⁹, oraz receptor choroby Parkinsona GPR37¹⁰. Szereg ograniczeń może jednak utrudniać prawidłową ocenę rozkładu synaptycznego danego białka neuronalnego. Dlatego w tej procedurze nie tylko w pełni opisujemy cały protokół, ale także podkreślamy kilka krytycznych punktów, które należy wziąć pod uwagę, takich jak dość duża ilość potrzebnej tkanki, niska wydajność białka i obowiązkowy wymóg walidacji skuteczności każdej separacji przed wykonaniem ostatecznego eksperymentu.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Barcelonie (CEEA), zgodnie z wytycznymi opisanymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych¹¹ i zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej, prawem 86/609/CCE, FELASA i wytycznymi ARRIVE. W związku z tym myszy są trzymane w standardowych klatkach, z dostępem ad libitum do pożywienia i wody, i są utrzymywane w kontrolowanych standardowych warunkach (12-godzinny cykl ciemności/światła rozpoczynający się o 7:30, temperatura 22 °C i wilgotność 66%).

1. Uzyskiwanie synaptosomów mózgu myszy za pomocą nieciągłego gradientu sacharozy

Uwaga: Ta metoda została zgłoszona wcześniej¹⁰.

1. Przygotować świeży bufor izolacyjny (IB) o pH 7,4, 2 M sacharozy, 1 M sacharozy/0,1 mM CaCl₂ i 0,1 mM CaCl₂ (patrz Tabela 1). Schłodzić roztwory na lodzie.
2. Poświęć pięć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Odetnij głowę i szybko usuń mózg każdego zwierzęcia. Wypreparuj obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania (tj. hipokamp, 0,25-0,35 g świeżej tkanki) i umieść go w 5 ml szklanej probówki Pottera-Elvehjema na lodzie z 1 ml IB.
3. Homogenizować tkankę za pomocą mieszadła homogenizującego (10 uderzeń przy 700-900 obrotach na minutę), najlepiej w łaźni lodowej, aby wykluczyć podgrzanie próbki.
4. Umieścić homogenizowaną tkankę (1 ml) w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 6 ml 2 M sacharozy i 2,5 ml 0,1 mM CaCl₂ w temperaturze 4 °C. Mieszać powoli, odwracając probówkę.
   Uwaga: Dodatek wapnia jest niezbędny do utrzymania interakcji adhezyjnych między organellami, a tym samym do zachowania struktury różnych "gęstości".
5. Umieść roztwór w probówce wirówkowej o pojemności 12 ml i powoli dodaj 2,5 ml 1 M sacharozy/0,1 mM CaCl₂ na wierzch każdej probówki, aby utworzyć gradient sacharozy.
   Uwaga: Oznacz położenie interfejsu gradientu na probówce wirówki za pomocą trwałego markera.
6. Zważyć i zrównoważyć probówki wirówkowe z roztworem IB w odpowiednich stalowych wspornikach i z zamykającymi się pokrywami.
7. Odwirowywać probówki przez 3 godziny w temperaturze 100 000 x g i temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem wahadłowym. Całkowicie napełnij wirnik wszystkimi stalowymi wspornikami (w razie potrzeby nawet pustymi).
8. Odrzuć górną warstwę zawierającą mielinę. Za pomocą pipety Pasteura zebrać biały pierścień między interfazą sacharozy 1,25-M i 1-M odpowiadającą frakcji synaptosomu.
9. Rozcieńczyć synaptosomy 9-krotnością ich objętości za pomocą IB w probówce wirówkowej.
10. Zważyć i zrównoważyć probówki wirówkowe z roztworem IB w odpowiednich stalowych wspornikach i z zamykającymi się pokrywami.
11. Odwirowywać probówki przez 30 minut przy 15 000 x g i temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem kubełkowym.
12. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1,1 ml roztworu IB. Zebrać 100 μl tego roztworu synaptosomalnego i wirować przez 5 minut w temperaturze 11 000 x g i 4 °C.
13. Zawiesić osad synaptosomalny w 5% dodecylosiarczanie sodu (SDS) i przechowywać tę próbkę w temperaturze -20 ºC.
    Uwaga: Ta próbka będzie odpowiadać całkowitej frakcji synaptosomu do dalszej analizy Western-blot. Pozostała frakcja synaptosomalna (~1 ml) może być albo zamrożona w temperaturze -20 ºC do czasu użycia, albo przetworzona w celu późniejszego frakcjonowania subsynaptycznego. Synaptosomy lub oczyszczone synapsy stanowią od 1 do 2% całkowitej objętości hipokampa¹².

2. Izolacja przed, po- i pozasynaptyczna

1. Przygotować 2x świeży bufor do solubilizacji, pH 6,0; 1x bufor do solubilizacji, pH 6,0; bufor do solubilizacji, pH 8,0; i 0,1 mM CaCl₂ (patrz Tabela 1). Schłodzić roztwory na lodzie.
   Uwaga: pH tych roztworów należy dokładnie dostosować, aby uzyskać dobre frakcjonowanie subsynaptyczne.
2. Powoli rozcieńczyć 1 ml zawieszonej frakcji synaptosomalnej (patrz krok 1.12) 5 ml 0,1 mM CaCl₂.
3. Dodać taką samą objętość (5 ml) lodowatego buforu do rozpuszczania 2x o pH 6,0 i inkubować przez 50 minut na lodzie pod dużym mieszaniem w zlewce na lodzie.
   Uwaga: Podczas gdy 1% Triton X-100 o pH 6,0 rozpuszcza wszystkie białka błony plazmatycznej, zachowuje białka w kontaktach lub połączeniach synaptycznych (tj. strukturach pre- i postsynaptycznych)⁴.
4. Umieść roztwór w probówce wirówkowej. Zważyć i zrównoważyć probówki z równoważnymi objętościami 0,1 mM CaCl₂ i 2x roztworem buforowym do solubilizacji, pH 6,0, w odpowiednich stalowych wspornikach i z zamykającymi pokrywkami.
5. Odwirowywać probówki przez 30 minut przy 40 000 x g i temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem wahadłowym. Otrzymany supernatant reprezentuje frakcję pozasynaptyczną, a osad odpowiada połączeniom synaptycznym (tj. frakcjom pre- i postsynaptycznym).
6. Zagęścić supernatant zawierający frakcję pozasynaptyczną do końcowej objętości 200 μl za pomocą 15 ml 10K probówki filtracyjnej odwirowanej w temperaturze 4 000 x g i 4 °C.
7. Otrzymaną stężoną frakcję pozasynaptyczną (200 μl) wytrącić 5 objętościami (1 ml) wstępnie schłodzonego (-20 °C) acetonu przez noc w temperaturze -20 °C.
8. Następnego dnia odwirować frakcję pozasynaptyczną przez 30 minut w temperaturze 18 000 x g i temperaturze -15 °C. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant acetonu i wysuszyć osad, aby usunąć wszelkie ślady acetonu.
9. Na koniec ponownie zawiesić osad zawierający białka pozasynaptyczne z 200 μl 5% SDS. W razie potrzeby poddać sonikację osadu.
10. Nie przerywając go, ostrożnie przemyć osad zawierający frakcje pre- i postsynaptyczne 2 ml 1x buforu do rozpuszczania o pH 6,0. Odrzuć bufor.
11. Zawiesić osad z 10 ml 1x buforu do rozpuszczania o pH 8,0, używając szklanej pipety Pasteura.
    Uwaga: Podczas gdy 1% Triton X-100 przy pH 8,0 rozpuszcza specjalizację presynaptyczną, zachowuje nierozpuszczalną gęstość postsynaptyczną⁴.
12. Inkubować zawiesinę przez 50 minut na lodzie przy silnym mieszaniu w zlewce na lodzie.
13. Umieść roztwór w probówce wirówkowej. Zważyć i zrównoważyć probówki z 1x roztworem buforowym do solubilizacji, pH 8,0, w odpowiednich stalowych wspornikach i z zamykającymi się pokrywkami.
14. Odwirowywać probówki przez 30 minut przy 40 000 x g i temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem kubełkowym; otrzymany supernatant odpowiada frakcji presynaptycznej, a osad frakcji postsynaptycznej.
15. Przetwarzać supernatant zawierający frakcję presynaptyczną, jak opisano w krokach 2.6-2.9.
16. Zawiesić osad zawierający frakcję postsynaptyczną w 200 μl 5% SDS. W razie potrzeby poddać sonikację osadu.

3. Analizuj próbki za pomocą immunoblot, aby potwierdzić frakcjonowanie błony

1. Określ ilość białka w każdej frakcji (tj. frakcję całkowitą, dodatkową, pre- i postsynaptyczną) za pomocą testu białka kwasu bicinchoninowego.
2. Pobrać 20 μg białka z każdej frakcji i rozcieńczyć je do końcowej objętości 50 μl w buforze do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE). Gotować przez 5 minut w temperaturze 100 ºC.
3. Oddzielić białka za pomocą elektroforezy SDS-PAGE 10%, z 4% koncentratem żelu w warunkach redukcyjnych. Elektroforezę przy stałym napięciu 80 V, aż barwnik dostanie się do dolnego żelu, a następnie zwiększyć napięcie do 120 V.
4. Przenieś białka do membrany PVDF i blokuj roztworem blokującym IB przez 45 minut w temperaturze pokojowej pod ciągłym wstrząsaniem.
5. Inkubować błonę przez noc w temperaturze 4 ºC ze wskazanym przeciwciałem pierwszorzędowym (tj. anty-SNAP-25, anty-PSD-95, anty-synaptofizyną lub anty-GPR37) rozcieńczonym w roztworze blokującym IB pod ciągłym wstrząsaniem.
6. Przemyć membranę trzy razy (po 10 minut) roztworem myjącym IB w celu wyeliminowania niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego.
7. Inkubować ze wskazanym przeciwciałem drugorzędowym przez 90 minut w ciemnych warunkach w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu.
8. Przemyć membranę trzykrotnie (po 10 minut) roztworem myjącym IB w celu wyeliminowania niezwiązanego przeciwciała drugorzędowego.
9. Inkubować membranę z podłożem chemiluminescencyjnym (przygotować mieszaninę w ciemnych warunkach i zgodnie z proporcją 1:1 roztworów A i B podaną przez producenta).
10. Przeanalizuj membranę w chemiluminescencyjnym urządzeniu detekcyjnem.

Wyniki

Opisana metodologia była szeroko stosowana do analizy subsynaptycznej białek neuronalnych w ujęciu ogólnym oraz w szczególności do izolacji i charakterystyki biochemicznej receptorów synaptycznych^5,6,7,8,9. Co ciekawe, przedstawiony tutaj reprezentatywny wynik wykazuje użyteczność tej procedury eksperymentalnej w analizie subsy...

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół stanowi potężne narzędzie biochemiczne do badania subsynaptycznego rozmieszczenia określonych białek w dowolnym regionie mózgu. Istnieją jednak pewne wady związane z tą techniką, które zasługują na podkreślenie w tym miejscu. Na przykład jednym z głównych ograniczeń jest stosunkowo duża ilość tkanki potrzebna do oczyszczenia rozsądnej ilości białka w celu przeprowadzenia analizy immunoblot wszystkich frakcji subsynaptycznych. Problem ten może być związany z faktem, że synapsy (tj. sy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sacharoza	Trzustka Quí mica SL, Barcelona, Hiszpania	1,316,211,211
CaCl2	Pancreac Quí mica SL, Barcelona, Hiszpania	2,112,211,210
MgCl2· 6H2O	Trzustka Quí mica SL, Barcelona, Hiszpania	1,313,961,210
Koktajl inhibitorów proteazy Zestaw III	Millipore, Darmstadt, Niemcy	535140
Trizma Base	Sigma, St. Louis, MO, USA	T1503
Tris-HCl	Trzustka Quí mica SL, Barcelona, Hiszpania	1,236,541,209
Triton X-100	Sigma, St. Louis, MO, USA	X100
SDS	Sigma, St. Louis, MO, USA	L3771
Glycerol	Sigma, St. Louis, MO, USA	G5516
Bromofenol Blue	Pancreac Quí mica SL, Barcelona, Hiszpania	1,311,651,604
Dithiothreitol	Sigma, St. Louis, MO, USA	D0632
Tween 20	Sigma, St. Louis, MO, USA	P2287
Odtłuszczone mleko
NaCl	Pancreac Quí mica SL, Barcelona, Hiszpania	1,216,591,211
KCl	Trzustka Quí mica SL, Barcelona, Hiszpania	1 314 941 210
KH2PO4	Merck	4873
Na2HPO4	Pancreac Quí mica SL, Barcelona, Hiszpania	1,316,781,211
Basic 20 pH	Crison, Alella, Hiszpania
Polytron VDI 12 Adaptowalny homogenizator	VWR, Radnor, PA, USA.
Ultra-przezroczyste probówki (14x89mm)	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona	344059	Probówki powinny być prawie całkowicie napełnione, gdy są używane, aby zapobiec zapadaniu się w wyniku ultrawirowania.
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 Ultracel -10K	Merck Millipore, Darmstadt, Niemcy	UFC901008
Wirówka 5430R	Eppendorf, Hamburgo, Niemcy
Optima L-90K Ultrawirówka	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona
Sonifier 250	Branson, Danbury, Connecticut
Amersham Imager 600	GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Hiszpania
Jednorazowe szklane pipety Pasteura 230 mm	VWR, Radnor, PA, USA	612-1702
Waga kompaktowa EK-610	A& D, Tokio, Japonia
Pierce™ Zestaw do oznaczania białek BCA	Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA
SuperSignal west pico podłoże chemiluminescencyjne	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA
Waga precyzyjna GR 200	A& D, Tokio, Japonia
Przeciwciało anty-GPR37	Domowe przeciwciało anty-GPR37 wyprodukowane i zwalidowane w laboratorium Francisco Ciruela.		Przeciwciała pierwszorzędowe stosowane w końcowym stężeniu 0,250 μ g / mL
Anti-SNAP-25, anty-PSD-95, anty-synaptofizyna	Abcam, Cambridge, Wielka Brytania		Pierwszorzędowe przeciwciała rozcieńczone 1:10 000
HRP sprzężone z kozią anty-mysią IgG	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.		Przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:10 000
koniugugowaną z HRP kozą anty-króliczą IgG	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.		Przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone 1:30 000

w proszku