Artykuł metodologiczny

Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej

15.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55664

⸱

1 maja 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Johns Hopkins School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 3Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.

Streszczenie

Komórki nieustannie zmieniają swoją architekturę błony i rozkład białek, ale niezwykle trudno jest zobrazować te zdarzenia w rozdzielczości czasowej i przestrzennej odpowiednio rzędu ms i nm. Opracowaliśmy technikę czasowo-rozdzielczej mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która indukuje zdarzenia komórkowe za pomocą optogenetyki i wizualizuje wynikającą z tego dynamikę błony poprzez zamrażanie komórek w określonych punktach czasowych po stymulacji. Aby zademonstrować tę technikę, wyraziliśmy rodopsynę kanałową, światłoczuły kanał kationowy, w neuronach hipokampa myszy. Błysk światła stymuluje aktywność neuronów i indukuje uwalnianie neuroprzekaźników z zakończeń synaptycznych poprzez fuzję pęcherzyków synaptycznych. Optogenetyczna stymulacja neuronów jest połączona z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem w celu śledzenia zmian morfologicznych podczas transmisji synaptycznej. Korzystając z komercyjnego instrumentu, uchwyciliśmy fuzję pęcherzyków synaptycznych i regenerację błony pęcherzyków synaptycznych. Aby zobrazować sekwencję zdarzeń, wygenerowano duże zbiory danych i przeanalizowano je na ślepo, ponieważ zmiany morfologiczne były śledzone w różnych komórkach w czasie. Niemniej jednak flash-and-freeze umożliwia wizualizację dynamiki membrany na mikrofotografiach elektronowych z rozdzielczością czasową ms.

Wprowadzenie

Wizualizacja dynamiki błony i białka w komórce jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia biologii komórek poszczególnych procesów. Dynamiczne zdarzenia związane z handlem można rejestrować za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Jednak w takich obrazach w dużej mierze brakuje kontekstu subkomórkowego, ponieważ struktury subkomórkowe nie mogą być całkowicie "pomalowane" przez barwniki lub sondy fluorescencyjne i rozdzielone przestrzennie i spektralnie1,2. Z drugiej strony, podczas gdy mikroskopia elektronowa może nakreślić architekturę subkomórkową w najdrobniejszych szczegółach, nie może uchwycić dynamiki komórkowej, ponieważ próbki muszą być utrwalone przed obrazowaniem. W związku z tym zazwyczaj nie wystarcza pełne zrozumienie dynamiki komórkowej przy użyciu tylko jednej metody obrazowania.

Aby przezwyciężyć ograniczenia mikroskopii świetlnej i elektronowej, opracowano techniki mikroskopii korelacyjnej. Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) wizualizuje dynamikę wewnątrzkomórkową za pomocą mikroskopii świetlnej i leżących pod nią struktur subkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej. W CLEM komórki zaangażowane w różne procesy, takie jak cytokineza i endocytoza3,4,5,6, są obrazowane na żywo, a następnie przetwarzane do mikroskopii elektronowej. Chociaż CLEM ujmuje pewne aspekty dynamiki wewnątrzkomórkowej, istnieją cztery czynniki, które ograniczają użyteczność tego podejścia. Po pierwsze, rozdzielczość czasowa jest ograniczona przez to, jak szybko komórki mogą zostać unieruchomione, co zwykle trwa s - min ze względu na powolną dyfuzję i reakcję utrwalaczy7. Po drugie, architektura subkomórkowa jest obserwowana post facto8; W związku z tym dynamiczne zmiany morfologiczne nie mogą być uchwycone przy użyciu tego podejścia. Po trzecie, mikrofotografie fluorescencji i elektronów nie mogą być precyzyjnie wyrównane ze względu na kurczenie się tkanek spowodowane odwodnieniem podczas przygotowywania próbki do mikroskopii elektronowej9,10. Po czwarte, zdarzenia takie jak cytokineza i endocytoza nie zachodzą w tym samym czasie w każdej komórce5,11, a zatem konkretna komórka, która jest zaangażowana w zdarzenie, musi zostać zidentyfikowana z dużej populacji komórek. Ten proces jest często pracochłonny. W związku z tym niezbędna jest nowa metoda, aby wywołać określone zdarzenia w każdej komórce i uchwycić wynikającą z tego dynamikę komórkową poprzez szybkie unieruchomienie komórek w określonych punktach czasowych.

Ostatnio opracowano kilka narzędzi do indukowania określonej dynamiki komórkowej za pomocą światła (optogenetyka). Rodopsyna kanałowa jest światłoczułym, nieselektywnym kanałem kationowym wyizolowanym z Chlamydomonas reinhardtii12,13. Kiedy rodopsyna kanałowa ulega ekspresji w błonach neuronalnych, krótki błysk światła indukuje napływ jonów sodu do neuronów i wyzwala potencjał czynnościowy14,15. Potencjał czynnościowy następnie rozchodzi się do zakończeń synaptycznych, gdzie pęcherzyki synaptyczne łączą się w ciągu milisekund16,17,18 Dlatego rodopsyna kanałowa indukuje aktywność neuronalną. Aby śledzić dynamikę błony na zakończeniach synaptycznych, neurony muszą być unieruchomione w określonych punktach czasowych po stymulacji z precyzją ms.

Aby uchwycić dynamikę błony po wywołaniu aktywności neuronalnej, połączyliśmy stymulację światłem z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem17,18,19. Zamrażanie pod wysokim ciśnieniem pozwala na niemal natychmiastowe unieruchomienie komórek przy zmniejszonym tworzeniu się kryształków lodu20. Kryształki lodu mogą pękać błony i zakłócać architekturę subkomórkową21. Zmieniając odstępy czasu między stymulacją a zamrożeniem, transport błonowy w obrębie zakończeń synaptycznych został uchwycony po indukcji potencjału czynnościowego.

Tutaj demonstrujemy eksperymentalne procedury z wykorzystaniem skomercjalizowanego zamrażarki wysokociśnieniowej, która łączy czasową kontrolę stymulacji świetlnej z zamrażaniem wysokociśnieniowym. W przeciwieństwie do innych instrumentów, które wymagają zewnętrznego urządzenia do sterowania stymulacją światłem i zamrażaniem, stymulacja światłem jest w pełni zintegrowana z tym systemem i może być stosowana za pomocą ms precision19. Proces ten składa się z wielu etapów. 1) Neurony hipokampa myszy są hodowane na dyskach szafirowych i zakażone lentiwirusem przenoszącym wektor ekspresyjny dla rodopsyny kanałowej18. 2) Neurony są stymulowane i zamrażane w określonych punktach czasowych po stymulacji. 3) Zeszklona woda jest zastępowana rozpuszczalnikiem organicznym, podczas gdy lipidy i białka są sieciowane utrwalaczami w celu zachowania architektury wewnątrzkomórkowej. 4) Próbki są infiltrowane i zatopione w żywicy epoksydowej. 5) Ultracienkie skrawki pobiera się za pomocą ultramikrotomu. 6) Cienkie przekroje są obrazowane na transmisyjnym mikroskopie elektronowym. 7) Akwizycja i analiza obrazu odbywa się na ślepo w odniesieniu do punktów czasowych lub genotypów. Dynamikę komórkową można określić poprzez rekonstrukcję obrazów rozdzielczych w czasie17,18. Przygotowanie próbki (kroki 2 - 5 powyżej) wymaga tygodnia, ale późniejsza analiza obrazu trwa od miesięcy do roku.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami i przepisami dotyczącymi użytkowania zwierząt przez National Institutes of Health. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Johns Hopkins School of Medicine.

1. Izolacja i hodowla neuronów hipokampa myszy

  1. Rozwiń korę mózgową od dnia poporodowego 0 do dnia 2 (P0 - 2) mysi mózg18. Odizoluj astrocyty od kory mózgowej.
    UWAGA: Mózg myszy został odizolowany po ścięciu. Astrocyty służą jako warstwa zasilająca neurony hipokampa.
  2. Potraktuj korę 800 μl 0,05% trypsyny-EDTA przez 15 minut w temperaturze 37 °C, aby oddzielić astrocyty.
  3. Hodować astrocyty w kolbie T-75 z 13 ml DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,2% penicyliny-streptomycyny przez jeden tydzień w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Umieścić jedno umyte kwasem i wysterylizowane szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm w każdym dołku na płytce 12-dołkowej.
  5. Krótko umyj dwa 6-milimetrowe dyski szafirowe pokryte węglem w 70% etanolu i umieść je na każdym szklanym szkiełku nakrywkowym.
  6. Przygotować roztwór poli-D-lizyny (PDL), mieszając 3 ml kwasu octowego 17 nM z 1 ml kolagenu z ogona szczura i 1 ml PDL (1 mg/ml). Nanieść 200 μl roztworu PDL na szafirowe krążki i szklane szkiełka nakrywkowe przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Usuń roztwór PDL i wysusz na powietrzu. Przed użyciem wysterylizuj płytkę zgodnie z przygotowaniem w krokach 1,4 - 1,6 przez 30 minut w świetle ultrafioletowym.
  8. Wysiew astrocyty z kroku 1.3 w 2 ml DMEM o gęstości 5x104 komórki/dołek na płytce, jak przygotowano w krokach 1.4 - 1.6. Uprawiaj je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez tydzień.
  9. Dodaj 20 μl fluoro-deoksyurydyny (końcowe stężenie: 80 μM) do każdego dołka przez co najmniej kilka godzin przed hodowlą neuronów.
    UWAGA: Fluoro-deoksyurydyna zatrzymuje podział astrocytów.
  10. Zmień pożywkę na 1,5 ml neuronalnej pożywki podstawowej (patrz Tabela materiałów) zawierającej 1% L-alanylo-L-glutaminy (patrz Tabela materiałów), 2% suplementu bez surowicy dla komórek nerwowych (patrz Tabela materiałów) i 0,2% penicyliny-streptomycyny.
  11. Przygotuj roztwór papainy, dodając 20 jednostek papainy do 5 ml roztworu enzymatycznego (1,65 mM cysteiny, 1 mM CaCl2 i 0,5 mM EDTA w DMEM). Zakwasić roztwór, przepuszczając gaz CO2 przez 20 minut. Filtruj i sterylizuj za pomocą filtra 0,22 μm.
  12. Zbierz mózg z P0 - 2 mouse18. Natychmiast przenieś mózg do lodowatego roztworu soli Hanksa (HBSS). Wypreparuj hipokampy pod mikroskopem stereoskopowym, utrzymując tkankę zanurzoną w HBSS.
  13. Umieść oba hipokampy w 1 ml roztworu papainy przygotowanego w kroku 1.11. Inkubować przez 1 godzinę na termomikserze w temperaturze 37 °C i prędkości 750 obr./min.
  14. Zastąp papainę 1 ml roztworu inaktywującego zawierającego 2,5 mg inhibitora trypsyny i 0,5 mg albuminy na ml DMEM. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Odessać roztwór inaktywujący.
  15. Dodać 200 μl neuronalnej pożywki podstawowej (patrz tabela materiałów) do izolowanego hipokampa. Rozprowadzić za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby oddzielić komórki. Poczekaj, aż niezdysocjowane komórki osiądą na dnie. Ostrożnie usuń podłoże z komórkami od góry.
  16. Powtórz krok 1.15 3x. Zbierz wszystkie zdysocjowane komórki w nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  17. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Płytki neuronów o gęstości 6,5 x 104 komórki / dołek na wierzchu warstwy astrocytów przygotowanej w krokach 1,1 - 1,10.
  18. Zainfekuj neurony lentiwirusem eksprymującym rodopsynę kanałową w DIV 3 (3 d in vitro) 18.
  19. Wykonaj flash-and-freeze na bloku DIV 14, zgodnie z opisem w krokach 2.1 - 2.5 poniżej.

2. Flash-and-Freeze (Błysk i zamrożenie)

  1. Przygotowanie utrwalacza
    1. Pod kapturem chemicznym dodaj następujące substancje do stożkowej probówki, aby przygotować utrwalacz: 2,5 ml aldehydu glutarowego (10% zapasu acetonu), 0,25 g tetratlenku osmu, 0,25 ml wody i 22,25 ml bezwodnego acetonu.
      UWAGA: Końcowe stężenie każdego składnika powinno wynosić 1% w acetonie. Aldehyd glutarowy jest dodawany w celu zachowania struktur białkowych podczas substytucji przez wymrażanie. UWAGA: Ostra toksyczność tetratlenku osmu jest wysoka. Narażenie na opary może uszkodzić rogówkę oka. Należy się z nim obchodzić wyłącznie w certyfikowanym kapturze chemicznym.
    2. Podaniec 1 ml utrwalacza do ponumerowanych fiolek kriogenicznych (2 ml). Utrwalacz należy przechowywać zamrożony w ciekłym azocie do czasu użycia.
      UWAGA: Tetratlenek osmu i aldehyd glutarowy reagują krzyżowo i wytrącają się; Tak więc, po wymieszaniu, natychmiast podwielokrotnić, zakryć probówki i zanurzyć krioprobówki w ciekłym azocie, aby zamrozić utrwalacz. Użyj ołówka, aby ponumerować fiolki kriogeniczne, ponieważ aceton może zmyć markery.
  2. Przygotowanie soli fizjologicznej
    1. Przygotuj fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej, mieszając Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM) i glukozę (10 mM).
      UWAGA: Podane wartości są stężeniami końcowymi. Krioprotektanty nie są stosowane w hodowlach jednowarstwowych. Jednak w przypadku próbek grubszych niż 5 μm wymagany jest odpowiedni krio-protektorektor. Zazwyczaj zaleca się stosowanie 20% BSA. Pasta drożdżowa i E. coli OP50 mogą być również stosowane jako krioprotektoranty dla larw much lub C. elegans.
    2. Dodać CaCl2 przy 4 mM i MgCl2 przy 1 mM stężeniach końcowych.
      UWAGA: Stężenia CaCl2 i MgCl2 różnią się w zależności od eksperymentów. Aby zapewnić wychwytywanie produktów pośrednich egzocytarnych, w tych konkretnych eksperymentach stosuje się 4 mM wapnia, aby zwiększyć prawdopodobieństwo uwolnienia pęcherzyków18.
    3. Sprawdź osmolarność za pomocą osmometru. Upewnij się, że wynosi 300 ± 5 mOsm.
    4. Dodać antagonistę receptora AMPA (NBQX) do końcowego stężenia 3 μM i antagonistę receptora GABA (bicukullinę) do końcowego stężenia 30 μM.
      UWAGA: Antagoniści receptorów neuroprzekaźników są dodawani, aby uniknąć powtarzającej się aktywności sieci po stymulacji neuronalnej18.
    5. Podgrzej sól fizjologiczną do temperatury 37 °C przed użyciem.
  3. Przygotowanie specjalistycznej zamrażarki wysokociśnieniowej i automatycznego urządzenia do substytucji zamrażania
    1. Przed zamrożeniem pod wysokim ciśnieniem należy schłodzić automatyczną jednostkę do substytucji zamrażania do -90 °C, napełniając zbiornik ciekłym azotem.
    2. Schłodzić aceton w małym kubku do temperatury -90 °C, umieszczając go w komorze na próbkę.
    3. Napełnij ciekły azot dewara i dewara do przechowywania zamrażarki wysokociśnieniowej (patrz tabela materiałów) ciekłym azotem.
    4. Skonfiguruj protokół stymulacji światłem za pomocą monitora z ekranem dotykowym.
      1. Nazwij program, klikając "Edytuj" obok "Nazwa programu" w oknie stymulacji świetlnej. Pojawi się kolejne okno.
      2. Skonfiguruj program, wpisując "15 000 ms" w "ciemnej fazie", "100 ms" w "okresie", "10 ms" w "pulsie" i "1" w "liczbie okresów" dla pojedynczego bodźca trwającego 10 ms. Zamroź komórki 90 ms później (rysunek 1C).
        UWAGA: "Faza ciemna" pozwala komórkom zregenerować się po ekspozycji na światło podczas ładowania próbki. "Okres" określa częstotliwość stymulacji. Na przykład, jeśli bodziec ma być zastosowany przy 20 Hz, kolumna ta powinna być ustawiona na 50 ms. "Puls" określa czas trwania bodźca świetlnego. Wreszcie "liczba okresów" określa całkowitą liczbę zastosowanych bodźców. Aby skonfigurować stymulację o wysokiej częstotliwości, patrz rysunek 1E.
    5. Aby uzyskać kontrolę "bez stymulacji", wpisz "15 s" w "ciemnej fazie", "0 ms" w "okresie", "1 ms" w "pulsie" i "0" w "liczbie okresów" w oknie ustawień stymulacji światłem, jak opisano w kroku 2.3.4.
      UWAGA: Domyślnie "impuls" musi wynosić co najmniej 1 ms.
    6. Na ekranie głównym upewnij się, że pole stymulacji światłem jest zaznaczone.
    7. Skonfiguruj protokół przechowywania, klikając "Przechowywanie próbek" na ekranie głównym. Kliknij "Edytuj". W następnym oknie użyj "+" lub "-", aby wybrać "2", aby zapisać 2 dyski w każdym kanale (w sumie 3 kanały). Zaznacz "Pamięć LN2 włączona
      8. ".
  4. Ładowanie i zamrażanie próbek w zamrażarce wysokociśnieniowej
    UWAGA: Wszystkie etapy montażu i ładowania próbki są wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym o zakresie powiększenia 7,5-60X. W krokach 2.4.1 - 2.4.4 do manipulowania próbkami używa się pęsety. Doświadczenia muszą być przeprowadzane w temperaturze fizjologicznej.
    1. Umieść jeden szafirowy dysk, stroną z komórką skierowaną do góry, w zagłębieniu czarnej, środkowej płyty (Rysunek 1B).
    2. Umieść pierścień dystansowy 100 μm na szafirowym krążku (Rysunek 1B).
    3. Umieść pusty krążek szafirowy na pierścieniu dystansowym (Rysunek 1B) po zanurzeniu jednej strony dysku we wstępnie podgrzanym roztworze soli fizjologicznej z kroku 2.2. Upewnij się, że między dwoma szafirowymi dyskami nie są uwięzione pęcherzyki powietrza.
    4. Umieść kolejny pierścień dystansowy 100 μm i pierścień dystansowy 400 μm (Rysunek 1B). Usuń nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej.
    5. Umieść zespół z kroku 2.4.3 między dwoma przezroczystymi półcylindrami (Rysunek 1A). Zamknij górną czerwoną pokrywę, aby rozpocząć proces zamrażania.
      UWAGA: Wstępnie ustawiony protokół uruchamia się automatycznie po zamknięciu pokrywy. Próbka pozostaje w tej samej orientacji w komorze zamrażania, a błysk światła jest przykładany od góry zespołu próbki. Czerwona pokrywa wysuwa się automatycznie po zakończeniu procesu zamrażania.
    6. Przechowuj próbkę w schowku dewar.
      UWAGA: Po zamrożeniu próbka jest automatycznie wrzucana do dewara magazynowego wypełnionego ciekłym azotem i przechowywana tam do czasu dalszej obróbki. Magazyn Dewara ma trzy komory, a każda komora może pomieścić maksymalnie 3 próbki. Zazwyczaj dwie próbki są zamrażane w tych samych warunkach stymulacji, a zamrażarka wysokociśnieniowa jest zaprogramowana do przechowywania obu w tej samej komorze.
    7. Powtórzyć kroki 2.4.1 - 2.4.6 dla każdej próbki.
    8. Przejdź do kroku 2.5, gdy wszystkie komory są pełne.
      UWAGA: Urządzenie zostało ustawione na przechowywanie do 6 próbek w magazynie dewara na raz. Dlatego po każdej 6próbce należy wykonać krok 2.5. Po rozładowaniu powtórz kroki 2.4.1 - 2.4.6.
  5. Pobieranie próbek i przenoszenie ich do zautomatyzowanej jednostki zamrażania i substytucji
    1. Otwórz drzwi do schowka dewara, który znajduje się pod stołem zamrażarki wysokociśnieniowej. Wyjmij dewar do przechowywania i umieść go na blacie.
    2. Za pomocą rąk wyjmij komorę na próbkę z dewara i przenieś ją do specjalistycznej tacki na próbki wypełnionej ciekłym azotem. Odblokuj pokrętło, aby zwolnić pojemnik na próbkę.
    3. Wyjmij przezroczyste półcylindry z kubka na próbkę za pomocą pęsety po wstępnym schłodzeniu końcówek pęsety ciekłym azotem (~-196 °C). Ostrożnie przenieś środkową, czarną płytkę do małego kubka zawierającego ciekły azot.
      UWAGA: Końcówki pęsety muszą być wstępnie schłodzone do temperatury ciekłego azotu. Próbka musi być przez cały czas przechowywana w ciekłym azocie, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu.

3. Zamrożenie substytucji w Automatycznym Urządzeniu do Zamrażania

  1. Za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety (końcówki w temperaturze ~-196 °C) szybko przenieś środkową płytkę z kroku 2.5.3 do wstępnie schłodzonego acetonu (-90 °C).
  2. Oddziel szafirowy krążek od środkowej płyty, delikatnie potrząsając lub stukając.
    UWAGA: Czasami oddzielenie szafirowego dysku od środkowej płyty może być trudne. W takiej sytuacji należy pozostawić środkową płytkę we wstępnie schłodzonym acetonie (-90 °C) na kilka minut. Delikatne stukanie pęsetą pomaga również oddzielić szafir od środkowej płytki.
  3. Umieścić fiolkę kriogeniczną zawierającą utrwalacze (krok 2.1) w komorze na próbki jednostki podstawiania. Przenieść krążek szafiru do fiolki kriogenicznej i nałożyć nakrętkę na fiolkę.
  4. Ustaw program substytucji zamrażania w następujący sposób: (i) -90 °C przez 5 - 30 godzin, (ii) -90 - -20 °C w ciągu 14 godzin (5 °C/h), (iii) -20 °C przez 12 godzin i (iv) -20 °C - 20 °C w 4 godziny (10 °C/h).
    UWAGA: Czas trwania pierwszego kroku w temperaturze -90 °C może być różny. Całkowity czas trwania substytucji zamrażającej jest ustawiony w taki sposób, że program kończy się rano (~1,5 d po eksperymencie) około godziny 8 rano, tak aby kolejne kroki można było wykonać w ciągu dnia.

4. Infiltracja i zatapianie plastiku za pomocą żywicy epoksydowej

  1. Po zakończeniu programu użyj rąk w rękawiczkach, aby przenieść fiolki kriogeniczne zawierające krążki szafiru z komory na próbki jednostki zastępczej do kaptura chemicznego.
  2. Za pomocą pipety dodaj aceton (temperatura pokojowa) do każdej fiolki kriogenicznej i myj każdy krążek szafirowy 4 - 6 razy przez 1 - 2 godziny.
  3. Opcjonalnie inkubować próbki w 0,1% octanie uranylu przez 1 godzinę, jeśli potrzebny jest dodatkowy kontrast. Umyć 4 - 6x acetonem przez 1 - 2 h.
    UWAGA: UWAGA: Istnieje ryzyko związane z narażeniem wewnętrznym po inhalacji octanu uranylu, który powoduje podrażnienie górnych dróg oddechowych. Wysokie narażenie może uszkodzić komórki krwi. Praca z octanem uranylu powinna być wykonywana pod wentylacją wywiewną. Zalecana jest odzież ochronna.
  4. Przygotować płynne podłoże z żywicy epoksydowej, ważąc 6,2 g eteru poliglicerolowego, 4,4 g żywicy epoksydowej bisfenolu-A i 12,2 g bezwodnika bursztynowego dodecenylu (DDSA). Dokładnie wymieszaj i dodaj 800 μl benzylodimetyloaminy (BDMA) podczas mieszania. Odgazowywanie przez 10 minut.
  5. Przygotuj 30, 70 i 90% żywicę epoksydową w acetonie ze 100% żywicy epoksydowej przygotowanej w kroku 4.4.
  6. Dodać 30% żywicy epoksydowej do fiolek kriogenicznych zawierających krążki szafirowe i inkubować przez 2 - 3 godziny w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 120 obr./min.
  7. Zastąp 30% żywicę epoksydową 70% żywicą epoksydową, pipetując i inkubuj przez 3 - 4 godziny w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej.
  8. Za pomocą pęsety przenieś każdy szafirowy krążek, komórką do góry, na nasadkę kapsułki do zatapiania. Dodaj 90% żywicy epoksydowej do nakrętki. Inkubować O/N w temperaturze 4 °C.
  9. Następnego dnia przygotuj świeże podłoże z żywicy epoksydowej, jak w kroku 4.4.
  10. Przenieś każdy szafirowy krążek, stroną z komórką skierowaną do góry, do nasadki kapsułki do zatapiania. Napełnij nakrętkę świeżo przygotowaną 100% żywicą epoksydową. Zmieniaj na świeżą 100% żywicę epoksydową co 2 godziny, powtarzając trzy razy.
  11. Umieścić próbki w piecu o temperaturze 60 °C na 48 godzin w celu polimeryzacji.

5. Próbki montażowe

  1. Umieść próbkę do góry nogami na mikroskopie stereoskopowym tak, aby szafirowy krążek znajdował się w górnej części bloku żywicy. Usuń cienką warstwę żywicy epoksydowej z wierzchu, drapiąc ją żyletką.
  2. Za pomocą żyletki przetnij płytką linię wzdłuż krawędzi szafirowego dysku; ta linia pomaga oddzielić szafirowy krążek od żywicy epoksydowej w kroku 5.3.
  3. Oddziel dysk szafirowy od żywicy epoksydowej, zanurzając go w ciekłym azocie na około 10 s.
    UWAGA: Ogniwa pozostaną w żywicy epoksydowej.
  4. Po wyjęciu szafirowego dysku użyj lunety preparcyjnej, aby znaleźć obszar z komórkami (powiększenie 4-10X). Wytnij wokół obszaru zainteresowania (~2 x 2 mm) za pomocą żyletki (obosiecznej). Aby utrzymać preparat na miejscu, wykonaj ten krok, gdy próbka jest przyklejona do powierzchni mikroskopu.
  5. Zamontuj mały kawałek plastiku (~2 x 2 x 5 mm) zawierający komórki za pomocą kleju zawierającego cyjanoakrylan etylu na cylindrycznym atrapie bloku wykonanym z żywicy epoksydowej. Inkubować blok w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę.

6. Podział na sekcje

  1. Użyj ultramikrotomu do podzielenia próbki na sekcje.
    1. Przyciąć powierzchnię próbki osadzonej w tworzywie sztucznym szklanym nożem z prędkością 3 mm/s i grubością 200 nm/sekcję. Wytnij 4-5 odcinków od powierzchni, w której znajdują się astrocyty.
    2. Przełącz się na nóż diamentowy i sekcję z prędkością 0,8 mm/s i grubością 40 nm/sekcję. Wytnij 20 - 25 sekcji.
  2. Zbierz wstęgi odcinków na jednoszczelinowych siatkach miedzianych pokrytych 0,7% polioctanem winylu (patrz Tabela materiałów).

7. Obrazowanie za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)

  1. Przed obrazowaniem TEM należy zabarwić skrawek 2,5% octanem uranylu w metanolu przez 5 minut.
  2. Umyj kratkę 15x w 50% metanolu. Następnie pierz w ultraczystej wodzie 15x, przy czym każde pranie trwa 30 sekund.
  3. Krótko wysuszyć sekcję na powietrzu i umieścić siatkę w uchwycie na próbki TEM.
  4. Obraz w powiększeniu 93 000x.
  5. Pobierz images.
    UWAGA: Obrazowanie jest zwykle wykonywane na ślepo w stosunku do punktów czasowych lub genotypów i zazwyczaj zbieranych jest ~200 obrazów na punkt czasowy.

8. Analiza obrazu

  1. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania (np. ImageJ) z niestandardowym makrem (Watanabe, Davis i Jorgensen, niepublikowane).
    UWAGA: Współrzędne x/y są rejestrowane z pęcherzyków, błony plazmatycznej, błony strefy aktywnej i wszystkich innych organelli związanych z błoną w synapsach. Pliki tekstowe zawierające te informacje są eksportowane do innego oprogramowania (np. Matlab). Dane są dalej analizowane za pomocą niestandardowych programów.

Wyniki

Stosując opisany powyżej protokół, przeprowadziliśmy eksperymenty typu „flash-and-freeze” w neuronach hipokampa myszy wykazujących ekspresję channelropsyny. Neurony te zamrażano po 15 ms lub 100 ms od momentu zapalenia światła. Wykazaliśmy wcześniej, że egzocytoza i endocytoza pęcherzyków synaptycznych zachodzą w terminalach synaptycznych odpowiednio w punktach czasowych 15 ms i 100 ms18. Zdarzenia te zostały pomyślnie zarejestrowane w odpowiednich momentach (Rysunek 2), co sugeruje, że eksperymenty flash-and-freeze można z powodzeniem przeprowadzić przy użyciu wybranej specjalistycznej zamrażarki wysokociśnieniowej (patrz Tabela materiałów).

figure-results-1
Rysunek 1. Ładowanie próbek i programowanie zamrażarki wysokociśnieniowej. A) Stół do ładowania próbek w zamrażarce wysokociśnieniowej. Płyta środkowa, której szczegóły konstrukcyjne przedstawiono na wstawce, jest umieszczana w uchwycie CLEM w celu załadowania próbki. Jeden z półwalców umieszcza się w dolnej części stołu do ładowania próbek, a drugi przymocowuje klipsem do górnej pokrywy. Po załadowaniu próbki płytę środkową przesuwa się do przodu w stronę dolnego półwalca i zamyka pokrywę, aby rozpocząć zamrażanie. B) Montaż preparatu. Szafirowy dysk zawierający neurony umieszcza się w zagłębieniu płyty środkowej stroną z komórkami do góry. Bezpośrednio nad szafirowym dyskiem wewnątrz zagłębienia umieszcza się pierścień 100 µm. Następnie umieszcza się pusty szafirowy dysk zanurzony w soli fizjologicznej stroną z roztworem do dołu. Należy unikać pęcherzyków powietrza. Na koniec ciasno umieszcza się powyżej pierścień 100 µm oraz pierścień 400 µm. Nadmiar cieczy usuwa się za pomocą papieru filtracyjnego. C) Przekrój poprzeczny kapsułki zatapiającej z szafirowym dyskiem zanurzonym w żywicy epoksydowej. Szafirowy dysk umieszcza się na dnie kapsułki stroną z komórkami do góry i pokrywa żywicą epoksydową w celu infiltracji i zatopienia. D) Programowanie zamrażarki wysokociśnieniowej dla pojedynczego bodźca o czasie trwania 10 ms. Preparaty są zamrażane 90 ms po impulsie świetlnym. E) Programowanie zamrażarki wysokociśnieniowej dla 10 bodźców przy częstotliwości 20 Hz. Preparaty są zamrażane 5 ms po ostatnim impulsie świetlnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2. Wizualizacja egzocytozy i endocytozy w neuronach hipokampa myszy. Neurony hipokampa są stymulowane jednorazowo i utrwalane w określonych odstępach czasu. Mikrografie elektronowe przedstawiają egzocytozę pęcherzyka synaptycznego A) oraz ultraszybką endocytozę B). PSD, gęstość postsynaptyczna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Podejście "flash-and-freeze" wizualizuje dynamikę błony poprzez wywołanie określonego zdarzenia komórkowego za pomocą optogenetyki i zamrożenie komórek w określonych punktach czasowych po stymulacji19. W tej demonstracji użyliśmy rodopsyny kanałowej, światłoczułego kanału kationowego, do stymulacji neuronów i uchwycenia fuzji i odzyskiwania pęcherzyków synaptycznych na końcach synaptycznych. W ostatnich latach opracowano wiele narzędzi optogenetycznych 22,23, z których wszystkie są kompatybilne z flash-and-freeze. Na przykład transport organelli można indukować za pomocą indukowanej światłem heterodimeryzacji kryptochromu i CIB124. Podobnie, skład lipidowy błony plazmatycznej może być zmieniony przez indukowaną światłem translokację fosfataz fosfoinozytolicznych do błony plazmatycznej25. Co więcej, małe, wrażliwe na światło związki, takie jak azobenzen, zmieniają konformację w zależności od długości fal oświetlenia. Ta zmiana konformacyjna może być wykorzystana do aktywacji kanałów bramkowanych ligandem lub do zmiany składu lipidowego w błonie26,27. Związki w klatkach mogą być również używane do indukowania aktywności komórkowej. Jednak dioda LED używana w obecnej konfiguracji może nie wytwarzać wystarczającej energii do rozłączenia w klatkę; W związku z tym prawdopodobnie konieczne będą dalsze optymalizacje systemu. Niemniej jednak zastosowania tych narzędzi aktywowanych światłem są elastyczne - wiele zdarzeń komórkowych może być wywołanych przez błysk światła. Funkcja "flash-and-freeze" może uchwycić powstałą dynamikę membrany.

Istnieją dwa główne ograniczenia metody "flash-and-freeze". Po pierwsze, przechwytuje "migawki" określonego zdarzenia z różnych komórek. Innymi słowy, nie jest możliwe śledzenie dynamiki błony w jednej komórce przez pewien okres czasu. Tak więc, aby zrekonstruować dowolne zdarzenie komórkowe, należy pozyskać i przeanalizować dużą liczbę obrazów z każdej próbki i w każdym punkcie czasowym. Co więcej, w neuronach konieczna jest jeszcze większa liczba obrazów, ponieważ fuzja pęcherzyków synaptycznych zachodzi tylko w 20-30% synaps w neuronach hipokampa myszy18,28. Analiza tak dużego zbioru danych wymaga ogromnych ilości czasu. W przyszłości akwizycja i analiza obrazów muszą zostać zautomatyzowane, aby podejście to było bardziej efektywne29,30.

Drugie ograniczenie wynika z charakteru techniki zamrażania wysokociśnieniowego. Kiedy komórki zamarzają, woda komórkowa przegrupowuje się, tworząc kryształki lodu, jeśli szybkość zamarzania jest niższa niż 100 K/s21. Te kryształki lodu mogą przenikać przez błony lub koncentrować substancje rozpuszczone, aby zmienić lokalne ciśnienie osmotyczne, powodując pęknięcie membran. Aby uniknąć kryształków lodu, na próbki stosuje się wysokie ciśnienie (~2,000 atm). Ze względu na efekt przechłodzenia, szybkość zamarzania 100 K/s jest wystarczająca, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu przez wodę pod tym ciśnieniem21. Teoretycznie próbki o grubości nawet 500 μm można zamrozić bez kryształków lodu, ale około 200 μm jest prawdopodobnie praktycznym limitem, ponieważ prostopadłościenne formy lodu mają tendencję do tworzenia się w grubej tkance, pogarszając morfologię. W przypadku przetwarzania próbek grubszych niż 5 μm konieczne jest użycie odpowiedniego środka krioochronnego, takiego jak BSA. Jednak BSA zmieni osmolarność roztworu i może wpływać na odpowiedź fizjologiczną komórek. W związku z tym konieczne są szeroko zakrojone eksperymenty kontrolne w celu walidacji stosowania BSA w poszczególnych systemach. Kryształki lodu mogą również tworzyć się po zamrożeniu pod wysokim ciśnieniem, jeśli próbki zostaną przypadkowo usunięte z kąpieli ciekłego azotu. Dlatego tak ważne jest, aby przez cały czas utrzymywać próbki w ciekłym azocie i używać wstępnie schłodzonych kleszczyków do manipulowania nimi.

Planując eksperymenty, należy wziąć pod uwagę następujące trzy punkty. Po pierwsze, maksymalne natężenie światła (linia 460 nm) wynosi 5,5 - 8,0 mW/mm2. To, czy ta intensywność jest wystarczająca do wywołania aktywności, musi zostać zweryfikowane za pomocą obrazowania żywych komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym przed eksperymentami z błyskiem i zamrażaniem. Po drugie, eksperymenty muszą być przeprowadzane w temperaturze fizjologicznej. Stolik zamrażarki wysokociśnieniowej jest podgrzewany do temperatury 37 °C na potrzeby eksperymentów z neuronami hipokampamyszy 31. Wreszcie, punkty czasowe muszą być starannie dobrane, aby uchwycić dynamikę membrany. Wstępne badania wykazały, że endocytoza jest zakończona po 100 ms stymulacji. W związku z tym zbadano również trzy dodatkowe punkty czasowe (15, 30 i 50 ms), aby śledzić dynamikę membrany17,18. Te punkty czasowe były niezbędne do wizualizacji zdarzeń transportu błonowego podczas transmisji synaptycznej. Jednak wymagania dotyczące liczby punktów czasowych są różne w każdym zdarzeniu komórkowym. W związku z tym przed zainicjowaniem zbierania dużych zbiorów danych należy pobrać próbki z kilku punktów czasowych.

Oświadczenia

Publikacja tego artykułu w otwartym dostępie była sponsorowana przez Leica Mikrosysteme GmbH.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa (SW). Dziękujemy Johns Hopkins School of Medicine Microscope Facility za wsparcie techniczne. Dziękujemy Erikowi Jorgensenowi i Christianowi Rosenmundowi oraz członkom ich laboratoriów za rozwój tej techniki. Dziękujemy firmie M. Wayne Davis za zaprojektowanie pierwszego urządzenia. Dziękujemy Paulowi Wurzingerowi, Cveta Tomovej i Delgermai Luvsanjav za ich pomoc techniczną. Dziękujemy również Natalie R. Hamilton i Grantowi F. Kusickowi za krytyczną lekturę manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System zamrażania i zatapiania w niskiej temperaturze  do mikroskopii świetlnej i elektronowej -AFS IILeica 
Zamrażarka wysokociśnieniowa - EM-ICELeica EM ICE to specjalistyczna zamrażarka wysokociśnieniowa, która umożliwia precyzyjną kontrolę stymulacji świetlnej i zamrażania.
OsmometrGonotec
Ultramikrotom UC7Leica 
PiekarnikNiebieski M
ŻyletkaPersonna
Aldehyd glutarowyEMS16530
Tetratlenek osmuEMSRT19132Toksyczny, otwarty tylko pod certyfikowanym kapturem chemicznym
AcetonEMS RT10016
HEPESEmdmillipore391340-250GM
GlukozaSigma49159-1KG
KClSigma746436-1KG
NaClSigmaS7653-1KG
CaCl2Sigma21115-250ML
MgCl2J.T.Baker2444-01
Płynna żywica epoksydowa Eponate 12Ted Pella18028
Żywica epoksydowa bisfenolu A Araldite 502Ted Pella18028
Bezwodnik bursztynowy Dodecenyl (DDSA)Ted Pella18028
Benzylodimetyloamina (BDMA)Ted Pella18241
Specjalna kapsułka do zatapiania (BEEM)EMS70021
Siatka miedzianaTed Pella1GC12H
Polioctan winylu ( Pioloform F)Ted Pella19244
Octan uranyluPolysciences21447-25
Cyjanoakrylan etylu (Super klej)Scotch170497
Trypsin-EDTAThemo scientific25300-120
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)Thermo scientific10569-044Należy podgrzać do 37 & stopni; C przed użyciem
FBS (Płodowa surowica bydlęca)Thermo scientific26140-079
Pen-StrepThermo scientific15140-122
Fluoro-deoksyurydyna (FUDR)SigmaF0503
Szkiełko nakrywkoweFisherS175223Należy myć kwasem
Krążek szafirowyTechnotrade616-100
Acetic kwasEmdmillipore1000631011
Poli-D-lizyna (PDL)SigmaP6407
Kolagen z ogona szczuraThermo scientificA10483-01
Neurobasal AFisher10888022Należy podgrzać do 37 & stopni; C przed użyciem
L-alanyl-L-glutamina (Glutamax)Fisher35050-079
Surowica bez suplementu  (B-27) Fisher17504044
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo scientific24020117
PapainaWorthingtonLS003126Active Unit należy obliczyć dla każdej partii
ThermomixerEppendorf Thermomixer C
Inhibitor trypsynySigmaT9253
NBQXTocris03-731-0
BicculineTocris01-091-0
Bibuła filtracyjna Whatman I
Philips CM20
Transmisyjny mikroskop elektronowy GE

Bibliografia

  1. Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), aab3500(2015).
  2. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. Correlated light microscopy and electron microscopy. Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).
  4. Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
  5. Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography. Cell. 150 (3), 508-520 (2012).
  6. Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution. Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).
  7. Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).
  8. Müller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis. Cellular Electron Microscopy. 79, Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X06790045 101-119 (2007).
  9. Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).
  10. Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM. Micron. 88, 77-83 (2016).
  11. Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  12. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  13. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  14. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  15. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  16. Heuser, J. E., Reese, T. S. Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).
  17. Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. eLife. 2, e00723(2013).
  18. Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
  19. Watanabe, S. Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution. Front Synaptic Neurosci. 8, 24(2016).
  20. Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer-Verlag. (1987).
  21. Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
  22. Weitzman, M., Hahn, K. M. Optogenetic approaches to cell migration and beyond. Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).
  23. Niu, J., Ben Johny,, Dick, M., E, I., Inoue, T. Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects. Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).
  24. van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Optogenetic control of organelle transport and positioning. Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).
  25. Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. Optogenetic control of phosphoinositide metabolism. Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).
  26. Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).
  27. Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides. J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).
  28. Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse. Science. 262 (5134), 754-757 (1993).
  29. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), e329(2004).
  30. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  31. Watanabe, S., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

stymulacja optogenetycznafuzja p cherzyk w synaptycznychmro enie pod wysokim ci nieniemtransmisja synaptycznaneurony hipokampa myszyultraszybka endocytozatransmisyjna mikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły