Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodologię przygotowania próbek tkanek sercowo-naczyniowych do analizy MS, która pozwala na (1) analizę składu białka ECM, (2) identyfikację miejsc glikozylacji oraz (3) charakterystykę składu form glikanów. Metodologia ta może być zastosowana, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych tkankach.

Streszczenie

Zwłóknienie jest cechą charakterystyczną wielu chorób sercowo-naczyniowych i wiąże się z zaostrzonym wydzielaniem i odkładaniem się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Korzystając z proteomiki, zidentyfikowaliśmy wcześniej ponad 150 białek ECM i związanych z ECM w tkankach sercowo-naczyniowych. Warto zauważyć, że wiele białek ECM jest glikozylowanych. Ta potranslacyjna modyfikacja wpływa na fałdowanie, rozpuszczalność, wiązanie i degradację białek. Opracowaliśmy metodę sekwencyjnej ekstrakcji i wzbogacania białek ECM, która jest kompatybilna z późniejszą analizą nienaruszonych glikopeptydów metodą tandemowej spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej (LC-MS/MS). Strategia opiera się na sekwencyjnych inkubacjach z NaCl, SDS do decelularyzacji tkanek i chlorowodorkiem guanidyny do solubilizacji białek ECM. Ostatnie postępy w LC-MS/MS obejmują metody fragmentacji, takie jak kombinacje dysocjacji zderzeń o wyższej energii (HCD) i dysocjacji przeniesienia elektronów (ETD), które pozwalają na bezpośrednią analizę składu glikopeptydów białek ECM. W niniejszej pracy opisano metodę przygotowania ECM z próbek tkanek. Metoda ta pozwala nie tylko na profilowanie białek, ale także na ocenę i charakterystykę glikozylacji za pomocą analizy MS.

Wprowadzenie

Zwłóknienie jest cechą charakterystyczną wielu chorób. Fibroblasty namnażają się i różnicują w kierunku wysoce syntetycznych fenotypów, które są związane z zaostrzonym wydzielaniem i odkładaniem się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)¹. Nadmierne odkładanie się ECM może być kontynuowane, nawet po ustąpieniu początkowego urazu, prowadząc do upośledzenia funkcjonalnego. Korzystając z proteomiki, zidentyfikowaliśmy wcześniej ponad 150 ECM i białek związanych z ECM w tkance serca^2,3. Są to nie tylko białka strukturalne, ale także białka matrikomórkowe i proteazy, które przyczyniają się do ciągłej przebudowy i dynamicznej adaptacji serca. Warto zauważyć, że wiele białek ECM jest glikozylowanych⁴. Ta modyfikacja potranslacyjna (PTM) polega na dodaniu reszt cukrowych do określonych pozycji aminokwasów i wpływa na fałdowanie, rozpuszczalność, wiązanie i degradację białek⁵.

Istnieją dwa główne typy glikozylacji, które występują u ssaków. (1) N-glikozylacja zachodzi w azocie karboksamidowym reszt asparaginy (Asn) w sekwencji konsensusu Asn-Xaa-Thr/Ser, gdzie Xaa jest dowolnym aminokwasem z wyjątkiem proliny. (2) W O-glikozylacji reszty cukru przyłączają się do reszt seryny i treoniny (Ser, Thr) lub, w znacznie mniejszym stopniu, do hydroksyproliny i hydroksylizyny. Podczas gdy O-glikozylacja może zachodzić w różnych grupach białek, N-glikozylacja jest ograniczona do wydzielanych białek lub zewnątrzkomórkowych domen białek błonowych⁵. To sprawia, że N-glikozylacja jest atrakcyjnym celem podczas badania ECM.

Proteomika ustanawia nowy standard analizy zmian białek w chorobie. Do tej pory większość badań proteomicznych koncentrowała się na białkach wewnątrzkomórkowych⁶. Wynika to głównie z następujących powodów. Po pierwsze, obfitość białek wewnątrzkomórkowych utrudnia identyfikację rzadkich składników ECM. Jest to szczególnie istotne w tkance serca, w której białka mitochondrialne i miofilamentowe stanowią dużą część zawartości białka⁷. Po drugie, integralne białka ECM są silnie usieciowane i trudne do rozludnienia. Wreszcie, obecność obfitych PTM (tj. Glikozylacja) zmienia masę cząsteczkową, ładunek i właściwości elektroforetyczne peptydów, wpływając zarówno na separację, jak i identyfikację za pomocą tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej (LC-MS / MS). W ostatnich latach opracowaliśmy i udoskonaliliśmy metodę sekwencyjnej ekstrakcji i wzbogacania białek ECM, która jest kompatybilna z późniejszą analizą spektrometrii mas (MS). Strategia opiera się na inkubacjach sekwencyjnych.

Pierwszy krok jest wykonywany za pomocą NaCl, bufora jonowego, który ułatwia ekstrakcję powiązanych z ECM i luźno związanych białek ECM, a także nowo zsyntetyzowanych białek ECM. Nie zawiera detergentów, nie denaturuje, nie narusza błon komórkowych i nadaje się do dalszych testów biochemicznych⁸. Następnie decelularyzacja uzyskuje się za pomocą dodecylosiarczanu sodu (SDS). Na tym etapie niskie stężenie SDS zapewnia destabilizację błony i uwalnianie białek wewnątrzkomórkowych, jednocześnie zapobiegając zakłóceniu bardziej rozpuszczalnych nieintegralnych składników ECM. Na koniec białka ECM są ekstrahowane za pomocą buforu chlorowodorku guanidyny (GuHCl). GuHCl jest skuteczny w ekstrakcji silnie usieciowanych białek i proteoglikanów z tkanek takich jak ścięgna⁹, chrząstka¹⁰, vessels^11,12,13 i heart^2,3. Zastosowaliśmy to frakcjonowanie biochemiczne w połączeniu z LC-MS/MS, aby zbadać przebudowę ECM w chorobach sercowo-naczyniowych^{2,3,11,12,13,14}. Ostatnie postępy w dziedzinie stwardnienia rozsianego obejmują nowatorskie metody fragmentacji, takie jak kombinacje dysocjacji zderzeń o wyższej energii (HCD) i dysocjacji przeniesienia elektronów (ETD), które pozwalają na bezpośrednią analizę nienaruszonych glikopeptydów^3,15.

Tutaj opisujemy metodologię przygotowania ECM do analizy MS, która pozwala na analizę składu białek, identyfikację miejsc glikozylacji i charakterystykę form glikanów. W porównaniu z poprzednimi analizami glikozylacji ECM¹⁶, metodologia ta pozwala na bezpośrednią ocenę zmian składu w profilach glikozylacji w sposób specyficzny dla danego miejsca przy użyciu MS. Zastosowaliśmy tę metodologię do tkanek sercowo-naczyniowych. Można go jednak również zastosować, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych próbkach tkanek i może dostarczyć bezprecedensowego wglądu w biologię ECM.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Lokalny Komitet Etyki Badań Naukowych w Wandsworth (numer referencyjny: 06/Q0803/37) i otrzymało instytucjonalną aprobatę od biura badań i rozwoju. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Ekstrakcja białek macierzy zewnątrzkomórkowej

UWAGA: Ludzkie tkanki przedsionkowe użyte do tych eksperymentów zostały uzyskane z przydatków przedsionków podczas krążenia pozaustrojowego, tuż po zatrzymaniu krążenia serca. Wszystkie próbki zostały pobrane w St George's Hospital w Londynie w Wielkiej Brytanii. Wszystkie próbki tkanek muszą być zamrożone w temperaturze -80 °C. Nie należy używać próbek zakonserwowanych utrwalaczami, takimi jak paraformaldehyd, które sieciują białka.

1. Przygotować wszystkie ekstrakcyjne przed eksperymentami, zgodnie z tabelą 1, w celu zminimalizowania czasu między etapami ekstrakcji. Wszystkie inkubacje należy wykonywać w temperaturze pokojowej (RT) w środowisku o kontrolowanej temperaturze (tj. ~20 °C), aby zapewnić spójność między ekstrakcjami.
2. Zważ 20-50 mg tkanki. Jeżeli ma zostać pobranych kilka próbek, należy je pokroić i zważyć jedna po drugiej, aby uniknąć całkowitego rozmrożenia tkanek. Za pomocą skalpela pokrój tkankę w kostkę na 3-4 mniejsze kawałki (tj. 2-3 mm) i umieść je razem w probówkach o pojemności 1,5 ml.
3. Dodać 500 μl lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; patrz Tabela 1 i Tabela Materiałów) i wykonać pięć płukań w celu zminimalizowania zanieczyszczenia krwi.
4. Etap ekstrakcji 1: Inkubacja z buforem NaCl
   1. Po umyciu PBS umieścić próbki w probówkach o pojemności 1,5 ml z nakrętkami. Dodać bufor NaCl (patrz Tabela 1) w ilości 10-krotności (v:w) masy tkanki. Wirować rurki przy RT przez 1 godzinę przy minimalnej prędkości (tj. 600 obr./min).
      UWAGA: Niska prędkość wirowania ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć mechanicznego uszkodzenia tkanki na tym etapie. Użyj adaptera piankowego, aby umieścić wszystkie rurki podczas ekstrakcji.
   2. Przenieść ekstrakty do nowych probówek i odwirować w stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ekstrakty przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Krótko przemyć pozostałe granulki tkanek świeżym buforem NaCl. Do przemywania należy użyć tego samego rodzaju buforu (tj. 100 μl buforu NaCl), aby zapobiec ekstrakcji innych białek o różnej rozpuszczalności (tj. białek, których nie można ekstrahować za pomocą NaCl).
   3. Po umyciu należy upewnić się, że bufor został całkowicie usunięty, aby zminimalizować nakładanie się zawartości białka na kolejne etapy ekstrakcji. Wyrzuć bufor NaCl używany do mycia.
      UWAGA: Stosunek objętości buforu do masy tkanki jest ważny dla powtarzalnej ekstrakcji. Stosunek 10:1 (v:w) dla ekstrakcji NaCl i SDS oraz 5:1 dla etapu GuHCl zapewnia wystarczającą ilość białka bez nasycania buforu. Stężenie białka po ekstrakcji wynosi około 1-2 μg/μl.
5. Ekstrakcja Krok 2: Decelularyzacja za pomocą bufora SDS
   1. Dodać bufor SDS (Tabela 1) w ilości dziesięciokrotnej (v:w) masy tkanki; zastosowanie niskich stężeń SDS (tj. 0,1%) ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia utraty białek ECM podczas decelularyzacji. Wirować rurki przy RT przez 16 godzin z minimalną prędkością (tj. 600 obr./min).
      UWAGA: Niska prędkość wirowa minimalizuje mechaniczne zakłócenia ECM.
   2. Przenieś ekstrakty do nowych probówek. Wirować przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Krótko przemyć pozostałe granulki tkanek za pomocą _{ddH 2}O, aby usunąć SDS. Upewnij się, że płyn został całkowicie usunięty po umyciu.
6. Etap ekstrakcji 3: Inkubacja z buforem GuHCl
   1. Dodać bufor GuHCl (Tabela 1) w ilości pięciokrotnej (v:w) masy tkanki. Wirować rury przy RT przez 72 godziny z maksymalną prędkością (tj. 3,200 obr./min); energiczne wirowanie ułatwia mechaniczne zakłócenie ECM.
   2. Przenieś ekstrakty do nowych probówek. Wirować w temperaturze 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

2. Kwantyfikacja i wytrącanie białek

UWAGA: Ze względu na obecność detergentów, bufor SDS jest niezgodny z bezpośrednią kwantyfikacją białka na podstawie pomiarów absorbancji przy 280 nm. Aby zapewnić powtarzalną kwantyfikację, należy użyć testów kolorymetrycznych dla wszystkich ekstraktów białkowych¹⁷.

1. Kwantyfikacji.
   1. Przygotować wzorce do krzywej kalibracyjnej, używając albuminy surowicy bydlęcej (BSA) seryjnie rozcieńczanej w odpowiednim buforze ekstrakcyjnym (tj. NaCl, SDS lub GuHCl)^17. W tym czasie rozmrozić ekstrakty próbki.
   2. Rozcieńczyć próbki w buforze ekstrakcyjnym w celu uzyskania stężeń w liniowym zakresie absorbancji; rozcieńczenie w stosunku 1:10 (v:v) daje zadowalające wyniki. Rozcieńczyć próbki GuHCl równą ilością ddH₂O w celu określenia ilościowego, ponieważ test kolorymetryczny nie jest zgodny ze stężeniami >4 M GuHCl.
   3. Należy użyć testu kolorymetrycznego na bazie kwasu bicinchoninowego (BCA)¹⁷ (patrz Tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi testów na płytkach 96-dołkowych; zaleca się wykonanie co najmniej podwójnych pomiarów.
   4. Po inkubacji przez 30 minut należy dokonać odczytów absorbancji przy długości fali 570 nm w celu obliczenia stężenia białka przy użyciu standardowej krzywej kalibracyjnej BSA¹⁷.
2. Wytrącanie białek
   1. Rozmrozić ekstrakty GuHCl w temperaturze pokojowej. Podwielokrotność 10 μg białka na każdą próbkę do nowych probówek. Do bezpośredniej analizy glikopeptydowej, podwielokrotność 50 μg. Dodać 10-krotność objętości etanolu i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: GuHCl nie jest kompatybilny z dalszymi reakcjami enzymatycznymi i większością zastosowań elektroforetycznych. Usunięcie GuHCl jest wymagane przed deglikozylacją i trawieniem trypsyny. Rozpuszczalność GuHCl w etanolu i odwrotnie, niska rozpuszczalność białek pozwala na skuteczne usuwanie GuHCl, zapewniając jednocześnie około 98% odzysku białek¹⁸.
   2. Odwirować próbki o masie 16 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć wytrąconego osadu. Suszyć granulki przez 15 minut za pomocą koncentratora próżniowego (patrz tabela materiałów) w RT.
      UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół, a wysuszone granulki przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
   3. Opcjonalnie należy przeprowadzić elektroforezę żelową w ramach kontroli jakości (QC, patrz Metody Uzupełniające).

3. Sekwencyjna deglikozylacja do oceny zajętości miejsca N-glikozylacji

1. Podczas suszenia próbki (zob. etap 2.2.2) należy przygotować bufor deglikozylacyjny zawierający enzymy deglikozylacji rozgałęziające, zgodnie z tabelą 1. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje o produkcie.
2. Do każdej próbki dodać 10 μl buforu deglikozylacyjnego zawierającego enzymy. Zapewnić odpowiednie ponowne zawieszenie osadów, wykonując szybkie wirowanie i wirowanie próbek.
   UWAGA: Usunięcie monomerów cukrów za pomocą enzymów rozgałęziających jest niezbędne do późniejszego i całkowitego usunięcia kompleksu sacharydów sprzężonych z O i ułatwia późniejsze rozszczepienie cukrów połączonych z N przez PNGazę-F.
3. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 25 °C, aby umożliwić usunięcie siarczanu heparanu przez heparynazę II. Zwiększyć temperaturę do 37 °C i inkubować przez 36 godzin, delikatnie mieszając.
   UWAGA: Biorąc pod uwagę małe objętości reakcji i wydłużony czas inkubacji, należy użyć wytrząsarek inkubatora i szczelnie zapakować wiele probówek o pojemności 1,5 ml w stożkowej probówce o pojemności 50 ml pochylonej wewnątrz inkubatora pod kątem około 45°.
4. Po 36 godzinach odwirować próbki przez 1 minutę przy 16 000 x g i odparować _H2Oz próbek za pomocą koncentratora próżniowego w temperaturze pokojowej przez około 45 minut.
5. Ponownie zawiesić wysuszone próbki w 10 μl_H218O zawierającej 50 U/ml PNGazy-F, która rozszczepia wszystkie glikany związane ze asparaginą w reakcji deamidacji.
   UWAGA: Otrzymany kwas asparaginowy ma nadmiar masy 2,98 Da, co wskazuje na obecność N-glikozylacji podczas analizy MS.
6. Inkubować przez 36 godzin w temperaturze 37 °C przy stałym mieszaniu w wytrząsarce inkubatora.

4. Trawienie trypsyny w roztworze

UWAGA: Ten krok powinien być przeprowadzony zarówno dla próbek niezdeglikozylowanych (tj. używanych do bezpośredniej analizy glikopeptydu), jak i deglikozylowanych (tj. używanych do oceny zajętości glikanów).

1. Do oceny zajętości miejsca N-glikozylacji należy użyć 10 μg białka całkowitego (jak wskazano w poprzednim kroku). W przypadku próbek przeznaczonych do bezpośredniej analizy glikopeptydowej należy użyć 50 μg białka jako ilości wyjściowej.
   UWAGA: Poniższe kroki są opisane dla 10 μg białka. W razie potrzeby zwiększ objętości (tj. 5 razy dla 50 μg).
2. Denaturować białka w każdej próbce podwielokrotności przy użyciu 9 M mocznika i 3 M tiomocznika, przy końcowych stężeniach odpowiednio 6 M mocznika i 2 M tiomocznika (np. dla próbki 10 μl, 20 μl mocznika/tiomocznika).
3. Zredukuj białka, dodając 100 mM ditiotreitolu (DTT, 3,33 μL, stężenie końcowe: 10 mM). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z mieszaniem przy 240 obr./min.
4. Schłodzić próbki do temperatury suchej temperatury przed wykonaniem alkilacji, dodając 0,5 M jodoacetamidu (3,7 μl, stężenie końcowe: 50 mM). Inkubować w ciemności przez 1 godzinę.
5. Użyć wstępnie schłodzonego (-20 °C) acetonu (6-krotność objętości próbki) do inkubacji próbek przez noc w temperaturze -20 °C. Wytrącić przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C.
6. Odessać supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć wytrąconego osadu. Suszyć granulki białka za pomocą koncentratora próżniowego przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
7. Zawiesić ponownie w 20 μl 0,1 M buforu wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB) o pH 8,2 i zawartości trypsyny (0,01 μg/μl) i trawić przez noc w temperaturze 37 °C i 240 obr./min.
8. Przerwać trawienie poprzez zakwaszenie próbek 10% kwasem trifluorooctowym (TFA, 2 μl dla końcowego stężenia 1% TFA).

5. Oczyszczanie peptydów za pomocą kolumn C18

UWAGA: Usuwanie zanieczyszczeń zakłócających z mieszaniny peptydów po trawieniu zmniejsza tłumienie jonów i poprawia stosunek sygnału do szumu oraz pokrycie sekwencji. Etap ten należy przeprowadzić zarówno dla próbek niezdeglikozylowanych, jak i zdeglikozylowanych.

1. Aktywuj żywicę na płytce wirowej C18 (patrz Tabela Materiałów) za pomocą 200 μl metanolu na studzienkę i odwiruj przy 1 000 x g przez 1 min.
2. Przemyć, dodając 200 μl na studzienkę 80% acetonitrylu (ACN) i 0,1% TFA w_H2O. Wirować przy 1.000 x g przez 1 min.
3. Zrównoważyć, dodając 200 μl na studzienkę 1% ACN i 0,1% TFA w H₂O. Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
4. Załadować próbki (całą objętość) z etapu 4 do studzienek zawierających żywicę i odwirować przy stężeniu 1 500 x g przez 1 minutę. Ponownie załadować przepływowy przepływ po raz drugi i powtórzyć wirowanie.
5. Przemyć, dodając 200 μl na studzienkę 1% ACN i 0,1% TFA w H₂O. Wirować przy 1 500 x g przez 1 min. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
6. Eluować próbki za pomocą 170 μl na studzienkę 50% ACN, 0,1% TFA w H₂O. Odwirować przy 1 500 x g przez 1 minutę. Powtórzyć poprzedni krok i połączyć zebrany eluat.
7. Suszyć eluat za pomocą koncentratora próżniowego przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Jeśli nie zostanie natychmiast zużyty, wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
   UWAGA: Próbki deglikozylowane przeznaczone wyłącznie do identyfikacji białek są gotowe do użycia dla LC-MS/MS po tym etapie. Kroki 6 i 7 nie są wymagane w przypadku tych próbek.
8. Rozmrozić i ponownie zawiesić zdeglikozylowane próbki w 2% ACN i 0,05% TFA w_H2Odo końcowego stężenia białka 0,5 μg/μL. Postępować do etapu 6 dla bezpośredniej analizy glikopeptydowej próbek niezdeglikozylowanych.
9. Opcjonalnie przefiltruj peptydy przed znakowaniem za pomocą tandemowych znaczników masy (TMT); patrz Metody uzupełniające dotyczące dopasowania peptydów.

6. Etykietowanie za pomocą TMT (tylko do bezpośredniej analizy glikopeptydowej)

1. Rozmrozić i ponownie zawiesić wysuszone granulki w 50 μl 50 mM TEAB do uzyskania stężenia 1 μg/μL.
2. Ponownie umieścić w fiolce 0,8 mg odczynnika TMT Zero (TMT⁰, patrz Tabela Materiałów) w 41 μl ACN. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi ponownego wymieszania.
3. Oznaczyć próbki peptydów w stosunku 50 μg peptydów do 0,4 mg TMT⁰ (tj. 50 μL peptydów na 20,5 μl TMT⁰). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
4. Ugasić reakcję znakowania, dodając 5% hydroksyloaminy w stosunku 6:100 (tj. 4,23 μl 5% hydroksyloaminy). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
5. Suszyć próbki peptydów znakowanych TMT⁰ przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą koncentratora próżniowego. Zawiesić w 10 μl ddH₂O.
   UWAGA: Ze względu na reszty glikanów, glikopeptydy wykazują większą masę cząsteczkową niż peptydy nieglikozylowane. TMT⁰ zwiększa stan naładowania glikopeptydów. Zmniejsza to ich stosunek względnej masy do ładunku (m/z) i ułatwia fragmentację ETD.

7. Wzbogacanie glikopeptydów

1. Stosować reakcyjne znajdujące się w zestawie (patrz tabela materiałów).
2. Dodać 50 μl buforu wiążącego do każdej próbki o objętości 10 μl z kroku 6.5. Wirować roztwór żywicy wychwytującej gliko, aż stanie się jednorodny. Użyj chromatografii cieczowej opartej na zwitterionowej interakcji hydrofilowej (ZIC-HILIC) capture¹⁵.
3. Przenieść 50 μl zawiesiny żywicy do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Wirować przez 1 minutę przy 2 500 x g i usunąć supernatant. Dodać 60 μl próbki (tj. próbki z buforem wiążącym) do probówek zawierających granulki żywicy. Wymieszać za pomocą pipety i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w mieszaniu przy 1 200 obr./min.
4. Wirować przez 2 minuty przy 2 000 x g i przenieść supernatant do nowych probówek. Zachowaj rurki. Dodać 150 μl buforu do płukania do probówek z żywicą. Wymieszać za pomocą pipety i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w mieszaniu przy 1 200 obr./min.
5. Wirować przez 2 minuty przy 2 500 x g. Przenieść supernatant do tych samych probówek (od kroku 7.4). Powtórz kroki prania dwa razy.
6. Dodać 75 μl buforu elucyjnego i wymieszać za pomocą pipety. Mieszać przy 1.200 obr./min przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie odwirowywać probówki przez 2 minuty przy 2.500 x g. Przenieść supernatanty do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Powtórz etapy przemywania, a następnie przenieś supernatant eluatu do tej samej probówki.
7. Odwirować probówki zawierające eluat (tj. glikopeptydy) przez 2 minuty przy 2 500 x g. Przenieść supernatant do nowych probówek, aby zapewnić usunięcie pozostałości żywicy z poprzednich etapów.
8. Wysuszyć całkowite 150 μl eluatu za pomocą koncentratora próżniowego przez około 2 godziny w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić wysuszone glikopeptydy w 15 μl 2% ACN i 0,05% TFA w ddH₂O.
9. Kontynuuj wykonywanie LC-MS/MS przy użyciu fragmentacji HCD w celu analizy składu białka ECM oraz LC-MS/MS przy użyciu fragmentacji HCD i ETD w celu scharakteryzowania glikopeptydu. Patrz punkt 8.

8. Analiza spektrometrii mas

1. Wykonać LC-MS/MS z wykorzystaniem fragmentacji HCD w celu analizy składu białka ECM; szczegółowe informacje można znaleźć w metodach uzupełniających.
2. Przeprowadzić LC-MS/MS przy użyciu fragmentacji HCD i ETD w celu scharakteryzowania glikopeptydu (szczegółowe informacje można znaleźć w metodach uzupełniających); wzbogaconą próbkę należy porównać z niewzbogaconym materiałem wejściowym¹⁵.
   UWAGA: Szczegółowe opisy metod LC-MS/MS do pośredniej analizy glikopeptydowej, bezpośredniej analizy glikopeptydowej i przeszukiwania bazy danych znajdują się w Metodach uzupełniających. Badaczy zainteresowanych scharakteryzowaniem składu białek i glikanów ECM za pomocą spektrometrii mas zachęcamy do zapoznania się z wcześniejszymi publikacjami^3,11,15.

Wyniki

Schematyczny przebieg pracy protokołu jest przedstawiony na rysunku 1.

protokół ekstrakcji ECM

Efektywność ekstrakcji można monitorować, uruchamiając porcje z każdego ekstraktu na żelach akrylamidowych Bis-Tris i używając barwienia srebrem do wizualizacji. Rysunek 2A przedstawia komplementarność ekstraktów NaCl, SDS i GuHCl po ekstrakcji sekwencyjnej. Ta kontrola jakości pozwala na identyfikację potencjalnych problemów z jakością próbki, takich jak nadmierna degradacja białka. Po ekstrakcji glikoproteiny ECM są obfite w ekstrakty GuHCl (Figura 2B).

Deglikozylacja

Aby ocenić skuteczność deglikozylacji, należy równolegle przeprowadzić kontrolę bez deglikozylacji. Czasy deglikozylacji muszą być odpowiednie, aby osiągnąć całkowite i jednorodne usunięcie pozostałości cukru, jak pokazano na rysunku 3A. Rysunek 3B przedstawia reprezentatywny przykład próbek skutecznie deglikozylowanych przez dodanie enzymów do usuwania GAG i enzymów deglikozylacji, które są ukierunkowane na mniejsze oligosacharydy związane z N i O.

Glikoproteomika

Protokół oceny zajętości sekwonów NxT/S poprawia pokrycie sekwencji białek dla glikoprotein ECM po stwardnieniu rozsianym (Rysunek 3C) i pozwala na wstępne badanie przesiewowe obecności glikoprotein. Pomaga to skrócić czas wyszukiwania glikopeptydów, ponieważ bazy danych można dostosować tak, aby zawierały wcześniej zidentyfikowane glikoproteiny. Fragmentacja HCD-ETD służy do identyfikacji i charakterystyki składu oligosacharydów przyłączonych do glikoprotein ECM. Rysunek 4A przedstawia reprezentatywne widmo uzyskane dla peptydu znakowanego ¹⁸O po deglikozylacji (pośrednia analiza glikopeptydowa). Rysunek 4B jest reprezentatywnym przykładem widma uzyskanego po analizie nienaruszonych glikopeptydów z ekstraktów ECM (bezpośrednia analiza glikopeptydowa).

Rysunek 1: Omówienie metody. (A) Po sekwencyjnym wzbogaceniu w białka ECM, przeprowadza się analizy LC-MS/MS na ekstraktach deglikozylowanych. (B) Alternatywnie, niedeglikozylowane ekstrakty ECM są dodatkowo wzbogacane o glikopeptydy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ekstrakcja białek ECM. (A) 3 różne ekstrakty z procedury ekstrakcji sekwencyjnej ("angielski Quickstep") są komplementarne pod względem zawartości białka. Podczas gdy ekstrakty SDS są wzbogacone w białka wewnątrzkomórkowe, ekstrakty GuHCl zawierają większość białek ECM. Udane frakcjonowanie jest wizualizowane przez inny wzór barwienia srebrem. (B) Białka ECM, takie jak małe proteoglikany bogate w leucynę decorin, biglycan i mimekan, są wykrywane głównie w ekstraktach GuHCl, z niewielką obecnością w ekstraktach SDS i NaCl. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Analiza glikozylacji. (A) Do pełnej deglikozylacji wymagane są odpowiednie czasy inkubacji. Przykład pokazuje wpływ czasu inkubacji podczas usuwania łańcuchów glikozaminoglikanu z dekoryny glikoproteinowej. (B) Glikoproteiny ECM są ozdobione dużymi i powtarzalnymi łańcuchami glikozaminoglikanu oraz krótkimi i różnorodnymi oligosacharydami sprzężonymi z N i O. Pas 1 na każdym z immunoblotów reprezentuje nieleczone ekstrakty sercowe. Lane 2 zawiera ekstrakty potraktowane enzymami trawiącymi glikozaminoglikany. Próbki na torze 3 zawierają ponadto enzymy do usuwania oligossacharydów związanych z N i O. Galektyna-1 nie jest glikozylowana, stąd nie ma zmiany wielkości białka. Na podstawie Lynch M i wsp.⁴ (C) W analizie LC-MS/MS, próbki potraktowane PNGazą-F w obecności H₂¹⁸O osiągają lepsze pokrycie sekwencji (%, po prawej stronie) w porównaniu do próbek niezdeglikozylowanych. Ciemnozielone obszary reprezentują pokrycie sekwencji przez LC-MS/MS. Czerwone, przerywane linie reprezentują glikozyty, z liczbami wskazującymi ich położenie aminokwasów. Wykrywanie glikozylacji dekoryny w pozycji Asn²¹¹ (N, wyróżnionej pogrubioną czcionką) pokazano szczegółowo jako przykład na rysunku 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Analiza glikopeptydu przez MS. (A) Stosując podejście proteomiczne typu shotgun na ekstraktach wzbogaconych w ECM, glikopeptydy można zidentyfikować na podstawie obecności deamidowanych asparaginy w sektonach NxT / S i znakować ¹⁸O. Przykład przedstawia widmo HCD MS/MS dla peptydu dekoryny zawierającego uprzednio glikozylowany Asn²¹¹. Uzyskane dane można wykorzystać do stworzenia dostosowanej do potrzeb bazy danych glikoprotein ECM. (B) Fragmentację HCD-ETD stosuje się do analizy ekstraktu ECM wzbogaconego glikopeptydem. Widmo ETD MS/MS pozwala na scharakteryzowanie składu glikanów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

A. Roztwory podstawowe
DTT (ditiotreitol, C4H10O2S2)	100 mM naziemna telewizja cyfrowa w ddH2 O.1
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy, C10H16N2O8)	250 mM EDTA w ddH2O, pH 8,0.
GuHCl (chlorowodorek guanidyny, CH,6,ClN3)	8 M GuHCl w ddH2O.
IAA (Jodoacetamid, C, 2H, 4INO)	500 mM IAA w ddH2 O.1,2
Octan Na (octan sodu,C2H3,NaO2)	1 M octan Na w ddH2O, pH 5,8.
NaCl (chlorek sodu, NaCl)	1 M NaCl w ddH2O.
Fosforan Na dwuzasadowy (Fosforan disodowy, Na2H2PO4)	1 M Na fosforan dwuzasadowy w ddH2O, pH 6,8.
SDS (Dodecylosiarczan sodu, NaC12H25SO4)	1% SDS (35 mM) w ddH2 O.3
TFA (kwas trifluorooctowy,C2HF3O2)	10% TFA (1,2 M) w ddH2O.
TEAB (wodorowęglan trietyloamonu, C7H17NO3)	1M TEAB w ddH2O, pH 8,5
Tiomocznik (Tiomocznik, CH4N2S)	3 M tiomocznik w ddH2O.
Tris-HCl (chlorowodorek trisu (NH11C4O3 [HCl])	100 mM Tris–HCl w ddH2O, pH 7,5.
Mocznik (mocznik, CH4N2O)	9 M mocznik w ddH2O.
B. reakcyjne
Bufor równoważny oczyszczający C18	1% ACN, 0,1% TFA w ddH2O
Bufor do płukania kolumny czyszczącej C18	80% ACN, 0,1% TFA wH2O
Bufor elucyjny oczyszczający C18	50% acetonitryl, 0,1% TFA w ddH2O
Bufor deglikozylacyjny (4x)	600 mM NaCl i 200 mM Na fosforan w ddH2O, pH 6,8.
Bufor GuHCl4	4 M chlorowodorek guanidyny, 50 mM octan Na i 25 mM EDTA w ddH2O, pH 5,8. Przed użyciem dodać 1:100 (v:v) koktajlu inhibitorów proteinazy.
Bufor NaCl4	0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl i 25 mM EDTA w ddH2O, pH 7,5. Przed użyciem dodać 1:100 (v:v) koktajlu inhibitorów proteinazy.
PBS (1x)	1,7 mM KH2PO4, 5 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,4. Przed użyciem dodać 25 mM EDTA i 1:100 (v:v) koktajlu inhibitorów proteinazy.
Bufor próbki (4x)	100 mM Tris, 2% SDS, 40% glicerol, 0,02% błękit bromofenolowy w ddH2O, pH 6,8. Przed użyciem dodać 10% ß-merkaptoetanolu.
Bufor SDS4	0,1 % SDS i 25 mM EDTA w ddH2O. Przed użyciem dodać 1:100 (v:v) koktajlu inhibitorów proteinazy.
C. Enzymy
Chondroitynaza ABC5	0,5 U/ml w buforze deglikozylacyjnym (1x)
Keratanaza5	0,1 U/ml w buforze deglikozylacyjnym (1x)
Heparynaza II5	0,1 U/ml w buforze deglikozylacyjnym (1x)
α2-3,6,8,9-Neuraminidaza (sialidaza)5	0,025 U/ml w buforze deglikozylacyjnym (1x)
β1,4-galaktozydaza5	0,015 U/ml w buforze deglikozylacyjnym (1x)
β-N-acetyloglukozaminidaza5	0,25 U/ml w buforze deglikozylacyjnym (1x)
Endo-α-N-acetylogalaktosaminidaza (O-glikozydaza)5	0,013 U/ml w buforze deglikozylacyjnym (1x)
PNGaza-F(N-glikozydaza-F)6	50 U/ml w H218O
trypsyna	0,01 μg/μl w buforze TEAB
Tabela UWAGI.
1 Roztwór podstawowy przechowywać w temperaturze -20 °C.
2 IAA powinno być chronione przed światłem.
3 SDS łatwo krystalizuje w temperaturze < 20 °C. W celu ułatwienia solubilizacji 1% SDS (roztworu podstawowego) należy ogrzać bufor pod gorącą wodą z kranu.
4 ekstrakcyjne mogą być przechowywane w RT. Dodaj koktajl inhibitorów proteinaz o szerokim spektrum działania, jak wskazano przed użyciem.
5 Enzymy te powinny być dodane podczas pierwszego etapu deglikozylacji.
6 PNGaza-F powinna być dodawana tylko podczas drugiego etapu deglikozylacji.

Tabela 1: Roztwory podstawowe, reakcyjne i enzymy. W tabeli przedstawiono skład każdego roztworu podstawowego i bufora reakcyjnego wymaganych do ekstrakcji i późniejszego przetwarzania (w tym trawienia enzymatycznego) białek ECM serca przed analizą SM.

Dyskusja

Ten protokół proteomiczny został zoptymalizowany w ciągu ostatnich kilku lat w naszym laboratorium. W tym przypadku użyliśmy tkanki serca, ale do jej zastosowania do innych tkanek mogą być wymagane tylko niewielkie korekty. Na przykład protokół ekstrakcji musi uwzględniać komórkowość tkanki. Tkanka serca jest wysoce komórkowa w porównaniu z tkanką naczyniową. W przypadku stosowania tkanki naczyniowej stężenie SDS może być niższe (tj. 0,08%), a czas decelularyzacji krótszy (tj. 4 h)11,12,13. Zastosowanie enzymów deglikozylacyjnych ma kluczowe znaczenie dla analizy składu ECM metodą LC-MS/MS. Jednak czas inkubacji musi być dostosowany do różnych typów tkanek. Na przykład heparynaza II wymagała wydłużonego czasu inkubacji w temperaturze 25 °C przy użyciu próbek takich jak skóra, które są bogate w białka błony podstawnej (np. agryna, perlekan) (dane nie pokazane). Bezpośrednią analizę glikopeptydu można przeprowadzić na kondycjonowanych pożywkach z komórek w hodowli¹⁵. Etapy wzbogacania mogą nie być wymagane do analizy tego uproszczonego subproteomu. Podobnie jak ekstrakty GuHCl, ekstrakty NaCl są również podatne na analizę glikoproteomiczną z niewielkimi modyfikacjami. Inne protokoły ekstrakcji w celu wzbogacenia białek ECM można dostosować do charakterystyki glikopeptydów ECM ^19,20.

Glikozylacja jest najbardziej złożonym PTM⁵. Pośrednią identyfikację glikopeptydów uzyskuje się przez wykrycie deamidowanego Asn z włączonym ¹⁸O w sekgonie NxT/S. Deamidated Asn na innych pozycjach może reprezentować fałszywe alarmy. Podobnie N-glikozylację należy rozpatrywać w kontekście ontologii białek: białka wewnątrzkomórkowe zawierające sekwon NxT/S nie będą glikozylowane, ale mogą powodować wyniki fałszywie dodatnie. Ponieważ obecne algorytmy wyszukiwania nie pozwalają na przesiewanie PTM tylko w z góry określonych sekwencjach (tj. Asn w NxT/S), wymagane jest ręczne filtrowanie danych. Identyfikacja obecności/braku glikozylacji w tych pozycjach może być porównana między próbkami chorobowymi i kontrolnymi. Nie ma enzymu równoważnego PNGazie F dla O-deglikozylacji (tj. wprowadzania przesunięcia masy na treoninę lub serynę). Dlatego identyfikacja O-glikozylacji jest ograniczona do bezpośredniej analizy glikopeptydu. Bezpośrednia analiza glikopeptydu służy do uzyskania informacji o składzie cukrów przyłączonych do białek, ale nie dostarcza informacji strukturalnych glikanu. Co więcej, skład glikanów jest wynikiem syntezy i przetwarzania glikanów po wydzieleniu.

Nasza 3-etapowa metoda ekstrakcji białek ECM ("English Quickstep")⁶ pozwoliła na scharakteryzowanie ECM w różnych tkankach sercowo-naczyniowych. Frakcjonowanie tkanki na kilka ekstraktów jest wymagane w celu uzyskania uproszczonego proteomu ECM, jak omówiono w innym miejscu⁶. W przeciwnym razie białka wewnątrzkomórkowe przyczyniłyby się do nadmiernego dynamicznego zakresu obfitości białek w ekstraktach, co utrudniłoby identyfikację mniej obfitych białek ECM. Co więcej, białka wewnątrzkomórkowe przenoszą O-glikozylacje⁵, które komplikują wzbogacanie glikopeptydów ECM i późniejszą analizę SM. Inni autorzy zastosowali podobne metody ekstrakcji do scharakteryzowania na przykład płuc²¹ i tkanek chrzęstnych¹⁰, jednak nie kontynuowali analizy glikozylacji. Dotychczasowa analiza glikozylacji koncentrowała się wyłącznie na identyfikacji glikozytów, wymagała usunięcia glikanu z rdzenia białka i nie mogła ocenić O-glikozylacji^22,23. Matryce lektynowe i wzbogacanie chemiczne są dostępne do oceny typów glikanów w próbkach biologicznych na podstawie ich specyficzności wiązania, ale techniki te nie mogą przypisać typów glikanów do określonych białek²⁴ ani nie mogą ocenić miejsc glikozylacji.

Początkowo stosowaliśmy elektroforezę żelową przed LC-MS/MS białek ECM. Chociaż separacja żeli jest przydatna w uzyskiwaniu uproszczonych frakcji białkowych podatnych na analizę LC-MS/MS, najnowsze urządzenia oferują szybsze skanowanie. W ten sposób można pominąć etap separacji elektroforetycznej. Stanowi to dodatkową zaletę, ponieważ duże białka ECM, które są zatrzymywane na wierzchu żelu, są analizowane bardziej efektywnie. Jednak informacje dotyczące Mw nienaruszonych białek są tracone. Etap parowania przed deglikozylacją PNGazy F zapewnia całkowite usunięcie zwykłego_H2Ow celu zminimalizowania wyników fałszywie ujemnych. Reszty cukrowe (tj. zmienne masy glikanów) zakłócają rozdzielanie przez LC i utrudniają późniejszą identyfikację peptydów przez MS/MS. Protokół pan-deglikozylacji jest również zalecany do analizy proteomicznej białek ECM, które nie koncentrują się na glikozylacji.

Proteomika może dostarczyć bezprecedensowego wglądu w ECM. Poza wsparciem strukturalnym, glikany przyłączone do ECM są niezbędne do interakcji gospodarz-patogen, komunikacji komórka-komórka i odpowiedzi immunologicznej²⁵, tj. odrzucenia przeszczepu allogenicznego po przeszczepie narządu. Glikoproteomika będzie podstawowym narzędziem w glikobiologii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A. Chemikalia
Acetonitryl, klasa MS ( ACN, C2H3N)	Thermo Scientific	51101	5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4
Koktajl inhibitorów proteinaz	Sigma-Aldrich	P8340	1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Fosforan disodowy (Na2H2PO4)	Sigma-Aldrich	S7907	3.1
Ditiotreitol (DTT, C4H10O2S2)	Sigma-Aldrich	D0632	4.3
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA, C10H16N2>O)	Sigma-Aldrich	E9884	1.3,   1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Etanol (C2H6O)	VWR	437433T	2.2.1
Chlorowodorek guanidyny (GuHCl, CH6ClN3)	Sigma-Aldrich	G3272	1.6.1
Glicerol (C3H8O3)	Acros organics	158920025	Suppl 1.1
H2O LC-MS Cromasolv	Sigma-Aldrich	39253-1L-R	W całym protokole
H218O	Taiyo Nippon Sanso	FO3-0027	3.5
Hydroksyloamina (HA, H3NO)	Sigma-Aldrich	467804	6.4
Jodoacetamid (IAA, C2H4INO)	Sigma-Aldrich	A3221	4.4
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10x	Lonza	51226	1.3
Octan sodu (C2H3NaO2)	Sigma-Aldrich	S7545	1.6.1
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	1.4.1, 3.2
Dodecylosiarczan sodu (SDS, NaC12H25SO4)	Sigma-Aldrich	466143	1.5.1
Wodorowęglan trietyloamonu (TEAB, C7H17NO3)	Sigma-Aldrich	11268	4.7, 6.1
Kwas trifluorooctowy (TFA, C2HF3O2)	Sigma-Aldrich	T62200	4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3
Tiomocznik (CH4N2S)	Sigma-Aldrich	T8656	4.2
Chlorowodorek trisu (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl])	Sigma-Aldrich	T3253	1.4.1, Suplement 1.
Mocznik (CH4N2O)	Sigma-Aldrich	U1250	4.2
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
B. Enzymy
α 2-3,6,8,9-neuraminidaza (sialidaza)	EDM Milipor	362280 (KP0012)	3.1
i beta; 1,4-galaktozydaza	EDM Milipory	362280 (KP0004)	3.1
β-N-acetyloglukozaminidaza	EDM Milipory	362280 (KP0013)	3.1
Chondroitynaza ABC	Sigma-Aldrich	C3667	3.1
Endo-&alfa;-N-acetylogalaktosaminidaza (O-glikozydaza)	EDM Milipor	362280 (KP0011)	3.1
Heparynaza II	Sigma-Aldrich	H6512	3.1
Keratanaza	Sigma-Aldrich	G6920	3.1
PNGase-F (N-glikozydaza F)	EDM Milipory	362280 (KP0001)	3.5
Trypsin	Thermo Scientific	90057	4.7
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Uwagi
C. Zestawy odczynników
30 kDa Filtry wirowe MWCO	Amicon, Millipore	10256744	5.9, Suppl 2
Macro SpinColumn C-18, 96-dołkowa płytka	Aparat Harvarda	74-5657	5.1
NuPAGE Novex BisTris Żele akrylamidowe	Thermo-Scientific	NP0322PK2	Suppl 1
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Thermo Scientific	23227	2.1.3
Zestaw do wzbogacania glikopeptydów ProteoExtract	Merk Millipore	72103	7
Tandem masowy tag 0 (TMT0)	Thermo Scientific	900067	6.2, 6.3
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
D. Sprzęt i oprogramowanie
Uznanie: Pułapka PepMap100 C18, 5 mm x 300 &mikro; m, 5 i mikro; m, 100 i Aring;	Thermo Scientific	160454	Suplement 3, 4
Uznanie PepMap100 C18, 50 cm x 75 &mikro; m, 3 i mikro; m, 100 i Aring;	Thermo Scientific	164570	Suplement 3
Byonic Search Engine	Protein Metrics	Wersja 2.9.30	Suplement 5
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano	Thermo Scientific	n/a	Suplement 3, 4
Źródło jonów EASY-Spray	Thermo Scientific	ES081	Suppl 4
EASY-Spray PepMap RSLC C18,  50 cm x 75 &mikro; m, 2 i mu; m, 100 i Aring;	Thermo Scientific	ES803	Suppl 4
Maskotka Wyszukiwarka	Matrix Science	Wersja 2.3.01	Suplement 3
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spektrometr masowy	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	Suppl 4
Oprogramowanie Proteome Discoverer	Thermo Scientific	Wersja 2.1.1.21	Suplement 3, 5
Picoview Nanospray Źródło	Nowy cel	550	Suppl 3
Q Exactive HF Spektrometr	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBFZ	Suppl 3
Koncentrator Savant SpeedVac	Thermo Scientific SPD131DDA		2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11
Oprogramowanie do rusztowań	Oprogramowanie proteomowe	Wersja 4.3.2	Suplement 3