Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Podsumowanie

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Streszczenie

Fosforylacja białek w określonych miejscach determinuje jego konformację i interakcję z innymi cząsteczkami. W ten sposób fosforylacja białek wpływa na funkcje biologiczne i charakterystykę komórki. Obecnie najpowszechniejszą metodą wykrywania miejsc fosforylacji jest chromatografia cieczowa/analiza spektrometrii mas (LC/MS), która jest szybką i czułą metodą. Jednak stosunkowo labilne ugrupowania fosforanowe są często uwalniane z fosfopeptydów na etapie fragmentacji, co często daje sygnały fałszywie ujemne. W takich przypadkach tradycyjny test kinazy in vitro z użyciem mutantów skierowanych na miejsce byłby dokładniejszy, ale ta metoda jest pracochłonna i czasochłonna. Dlatego korzystna może być alternatywna metoda wykorzystująca konkurencję peptydów. Ustalono motyw rozpoznawania konsensusu kinazy białkowej aktywowanej monofosforanem adenozyny (AMPK) ¹ i został zweryfikowany za pomocą pozycyjnego skanowania biblioteki peptydów². W ten sposób miejsca fosforylacji AMPK dla nowego substratu można było przewidzieć i potwierdzić za pomocą testów konkurencji peptydów. W tym raporcie opisujemy szczegółowe etapy i procedury testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro, ilustrując fosforylację czynnika 2 związanego z erytroidem 2 (Nrf2) za pośrednictwem AMPK. Aby uwierzytelnić miejsce fosforylacji, przeprowadziliśmy sekwencyjny test kinazy in vitro przy użyciu mutanta specyficznego dla miejsca. Ogólnie rzecz biorąc, test konkurencji peptydów zapewnia metodę badania przesiewowego wielu potencjalnych miejsc fosforylacji i identyfikacji miejsc do walidacji przez mutanty miejsca fosforylacji.

Wprowadzenie

Fosforylacja białek w określonej reszcie odgrywa znaczącą rolę w szerokim zakresie procesów komórkowych. W związku z tym zrozumienie sieci sygnalizacyjnych wymaga identyfikacji określonych miejsc fosforylacji. Ponadto miejsce fosforylacji określa wpływ na funkcję białka, ponieważ poszczególne domeny w białku mają różne struktury i funkcje. Aktywność czynnika jądrowego erytroidalnego 2 związanego z czynnikiem 2 (Nrf2), kluczowego przeciwutleniającego czynnika transkrypcyjnego, jest dwukierunkowo regulowana przez fosforylację w różnych miejscach. Nasze badania koncentrowały się na kinazach, które katalizują fosforylację Nrf2. Reakcja stresowa Nrf2 na prowokację oksydacyjną zachodzi szybko, głównie poprzez fosforylację seryny 40 i za pośrednictwem kinazy białkowej C (PKC)-δ, która aktywuje Nrf2^3,4. I odwrotnie, Fyn katalizuje hamującą fosforylację Nrf2 w tyrozynie 568 w celu ścisłej kontroli aktywności⁵.

Najczęstszą metodą używaną do wykrywania miejsc fosforylacji jest chromatografia cieczowa/analiza spektrometrii mas (LC/MS). W ten sposób można szybko i bardzo czuło wygenerować dane mapowania miejsc fosforylacji; Ma jednak kilka ograniczeń technicznych, często generując sygnały fałszywie ujemne. Słabe pokrycie sekwencji często występuje w analizie LC/MS. Aby zidentyfikować miejsca fosforylacji, wymagane są informacje na temat maksymalnego pokrycia aminokwasami białka⁶. Proteoliza białka będącego przedmiotem zainteresowania kilkoma proteazami na etapie trawienia może być pomocna w poprawie pokrycia sekwencji. Kolejną przeszkodą w identyfikacji reszt fosforylacji jest łatwa utrata kwasu fosforowego, która jest często obserwowana w przypadku peptydów fosforylowanych seryną i treoniną^6,7. Nietrwałe ugrupowania fosforanowe są często uwalniane z fosfopeptydów podczas procesu fragmentacji⁷. Drugą opcją przy poszukiwaniu miejsc fosforylacji jest użycie metody mikromacierzy peptydowej. Możliwe jest badanie przesiewowe miejsc docelowych kinazy za pomocą chipa mikromacierzy zawierającego fragmenty peptydów pochodzące z białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak ze względu na wymagania sprzętowe do produkcji i wykrywania chipa mikromacierzy, metoda mikromacierzy peptydowej jest uważana za czasochłonną i kosztowną.

Aby przezwyciężyć te wyzwania, można zastosować test kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro dla kinazy białkowej o znanych motywach rozpoznawania. Jeśli zostanie ustalony motyw rozpoznawania konsensusu kinazy, można przewidzieć przypuszczalne miejsca fosforylacji potencjalnego substratu i potwierdzić autentyczność tych miejsc. Najbardziej przekonującą metodą tej procedury jest wykazanie zniesienia fosforylacji w zmutowanym białku, w którym przewidywana reszta jest podstawiona niefosforylującym aminokwasem (tj. seryną lub treoniną do alaniny; tyrozyny do fenyloalaniny). Jednak produkcja i izolacja zmutowanych białek jest czasochłonna. Jako alternatywa na początkowym etapie badań, konkurencyjny test kinazy peptydowej jest prosty i wygodny. W tym miejscu opisujemy protokół testu konkurencji peptydów in vitro oraz walidacji miejsca fosforylacji.

Protokół

1. Bezpieczeństwo

UWAGA: Ten protokół używa [^γ-32P]-ATP do oceny aktywności AMPK. Fosfor-32 jest izotopem promieniotwórczym, w dużej mierze emitującym promieniowanie beta. Ponieważ rozmiar cząsteczki beta jest niezwykle mały, może ona łatwo przenikać przez ubranie i skórę. Zarówno zewnętrzne, jak i wewnętrzne narażenie na promieniowanie beta może być szkodliwe dla zdrowia ludzkiego, w tym powodując oparzenia skóry i uszkodzenia tkanek.

1. Wykonaj wszystkie czynności, które wymagają użycia [^γ-32P]-ATP, stosując odpowiednią ochronę, taką jak ekranowanie akrylowe.
2. Upewnij się, że cały personel jest wyposażony w elektroniczne dozymetry osobiste (EPD) do monitorowania stopnia narażenia na szkodliwe promieniowanie podczas wszystkich zabiegów.
3. Z promieniowaniem typu open source należy radzić sobie tylko po odpowiednim przeszkoleniu i uzyskaniu zgody organów regulacyjnych.
   UWAGA: Tutaj wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone po ukończeniu szkolenia na temat wykorzystania promieniowania open-source na Uniwersytecie Narodowym w Seulu i uzyskaniu zgody rządu koreańskiego (nssc.go.kr/nssc/en).
4. Utylizuj odpady radioaktywne zgodnie z lokalnymi przepisami.
   UWAGA: W tym przypadku przestrzegano wytycznych Instytutu Ochrony Środowiska i Bezpieczeństwa Uniwersytetu Narodowego w Seulu. Poniżej znajduje się lista organów regulacyjnych w Stanach Zjednoczonych i krajach europejskich: Stany Zjednoczone Ameryki, Amerykańska Komisja Dozoru Jądrowego (http://www.nrc.gov/); Zjednoczone Królestwo, Urząd ds. Bezpieczeństwa i Higieny Pracy (HSE) (http://www.hse.gov.uk); Francja, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); oraz Niemcy, Federalne Ministerstwo Środowiska, Ochrony Przyrody, Bezpieczeństwa Budowlanego i Jądrowego (BMU) (http://www.bmu.de).

2. Konkurencyjny test kinazy in vitro

1. Budowa konkurencyjnych peptydów
   1. Określ motyw konsensusu fosforylowany przez AMPK.
      UWAGA: AMPK rozpoznaje motyw konsensusu, Φ-[X,β]-X-X-Ser/Thr-X-X-X-Φ. W sekwencji konsensusu Φ reprezentuje aminokwasy hydrofobowe (tj. walinę [V], leucynę [L], metioninę [M] i izoleucynę [I]), a β reprezentuje aminokwasy zasadowe (tj. lizynę [K], argininę [R] i histydynę [H])¹.
   2. Wybrać reszty seryny lub treoniny z sekwencji docelowych zgodnie z powyższym motywem konsensusu. Użyj trzech przypuszczalnych miejsc ludzkiego Nrf2 (#1, 148-157 składającego się z Ser153; #2, 330-339 składającego się z Ser335; i #3, 553-562 składającego się z Ser558)⁸.
   3. Komercyjnie syntetyzować peptydy 10-resztowe, które naśladują domniemane miejsca. Otrzymaj zsyntetyzowany produkt w postaci liofilizowanego proszku o czystości większej niż 98% dla każdego peptydu.
   4. Rozpuścić peptydy za pomocą buforu kinazy, aby osiągnąć stężenie 71,667 g/l. Jeśli peptyd nie jest rozpuszczalny w buforze kinazy, należy go rozpuścić w 20% DMSO. Jeśli pozostaje nierozpuszczalny, peptyd naśladujący przypuszczalne miejsce może zostać rozszerzony w celu zwiększenia rozpuszczalności.

2. Konkurencyjny test kinazy AMPK in vitro
   1. Przygotować 5× bufor kinazy w następujący sposób: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl₂; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β-glicerofosforan (inhibitor fosfatazy seryny/treoniny); 5 mM Na₃VO₄ (inhibitor fosfatazy tyrozynowej); 0,5% (v/v) zestaw koktajli inhibitorów proteazy III, 1 mM zimne ATP; i 500 μM AMP.
      UWAGA: AMP jest niezbędnym składnikiem bufora kinazy do badania aktywności AMPK. Bufor może być używany do pomiaru aktywności zarówno kinaz serynowo-treoninowych, jak i kinaz tyrozynowych.
   2. Rozmrozić następujące rekombinowane białka i syntetyczne peptydy na lodzie: AMPK; Nrf2; oraz oligopeptydy #1, #2 i #3.
   3. Przygotuj bufor reakcyjny na lodzie: 0,15 μg AMPK, 0,4 μg Nrf2 (~4 pmol), 0,43 mg oligopeptydu (~300 nmol) i 6 μl buforu kinazy 5×. Doprowadzić końcową objętość do 30 μl sterylną wodą destylowaną (DW).
      UWAGA: Dodanie [^γ-32P]-ATP po przygotowaniu buforu reakcyjnego może zmniejszyć sygnał radioaktywny w wyniku autofosforylacji kinazy.
3. Uruchamianie reagentów
   UWAGA: Wszystkie poniższe procesy muszą być wykonywane pod ochroną za pomocą akrylowej osłony, stojaka lub bloku, a także odpowiednich środków ochrony osobistej.
   1. Ustaw bloki grzewcze na 30 °C przed rozpoczęciem eksperymentu.
   2. Dodać 1 μl [^γ-32P]-ATP (1 μCi) do probówek reakcyjnych na lodzie. Wymieszać bufor reakcyjny, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
      UWAGA: Radioaktywność ³²P ma krótki okres półtrwania wynoszący około 14 dni⁹. Dostosuj objętość, biorąc pod uwagę okres półtrwania (np. po miesiącu od produkcji [γ-32 P]-ATP dodaj 4 μL [^γ-32P]-ATP, aby uzyskać 1 μCi).
   3. Inkubować próbkę w bloku grzewczym w temperaturze 30 °C przez 15-30 minut. Na tym etapie należy przygotować 7,5% żele do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE). Dostosuj zawartość procentową żelu w zależności od wielkości białka docelowego.
   4. Zatrzymaj reakcję kinazy, dodając 3 μl 10× buforu próbki SDS (10% (v/v) glicerol, 20% (w/v) SDS, 15,42% (w/v) ditiotreitol, 90% (v/v) 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) i 0,02% (w/v) błękitu bromofenolowego). Wymieszać bufor reakcyjny, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
   5. Próbki należy uruchomić w 7,5% żelu SDS-PAGE przy napięciu 70 V przez 20 minut i w sposób ciągły pod napięciem 140 V przez 1 godzinę
      UWAGA: Niebieska linia bromofenolu na końcu żelu zawiera bardzo wysokie sygnały radioaktywne. Zaleca się usunięcie żelu poniżej niebieskiej linii przed przejściem do następnego kroku w celu zmniejszenia sygnałów tła.
   6. Po SDS-PAGE delikatnie usuń żel z kółka. Umieść żel w szklanej tubce, aby wykonać następny krok.
   7. Utrwalić żel buforem utrwalającym przez 20 minut (50% metanolu i 10% lodowatego kwasu octowego).
   8. Delikatnie przenieś żel na bibułę filtracyjną i przykryj go przezroczystym opakowaniem. Należy pamiętać, że na tym etapie żel może zostać łatwo rozerwany. Suszyć żel w suszarce próżniowej do żelu w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę.
4. wizualizacja
   1. Żel należy wystawić na działanie ekranu luminoforowego lub kliszy rentgenowskiej przez noc (zwykle przez około 16 godzin).
      UWAGA: Ekran luminoforowy może być ponownie użyty po wystawieniu na działanie bardzo jasnego światła. W przypadku użycia kliszy rentgenowskiej należy naświetlić żel przez dwa dni. Filmy rentgenowskie mają niższą czułość niż ekrany fosforowe.
   2. Zeskanuj ekran luminoforowy za pomocą imagera luminoforowego. Wyeksportuj obraz jako plik TIFF lub bitmapowy o wysokiej rozdzielczości.
   3. Po wizualizacji przenieś żel do szklanego lub plastikowego pojemnika w celu barwienia Coomassie na błękit brylantowy (CBB).
   4. Umyj żel za pomocą DW. Wyrzuć DW i zabarwij żel odczynnikiem barwiącym przez 1 godzinę.
   5. Wyrzuć odczynnik i odbarwiaj żel za pomocą DW przez 1 godzinę lub przez noc. Umieść żel między przezroczystymi foliami z tworzywa sztucznego (lub ich odpowiednikiem), aby zeskanować za pomocą skanera biurowego.

3. Test kinazy in vitro z użyciem mutanta specyficznego dla danego miejsca

1. Mutageneza ukierunkowana na miejsce pGEX-NRF2
   1. Wzór podkładu mutagencyjnego
      UWAGA: Zaprojektowanie odpowiednich starterów mutagennych ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku mutagenezy. Poniżej przedstawiono kilka zagadnień dotyczących projektowania starterów mutagennych. Utwórz starter składający się z 25 do 45 zasad, z pożądaną mutacją w środku startera. Podkład powinien mieć 40-60% zawartości GC i kończyć się jedną lub kilkoma zasadami G lub C. Upewnij się, że T_m startera jest równe 78 °C lub więcej zgodnie ze wzorem [T_m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / długość zasad) - % niedopasowania].
      UWAGA: Oczyść starter, ponieważ jego czystość jest ważna dla wydajności mutacji. Istnieje kilka stron internetowych poświęconych projektowaniu starterów mutagennych.
      1. Otwórz program do projektowania podkładów dla "projektowania starterów do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
      2. Wklej ludzką sekwencję DNA Nrf2 (nr dostępu. NM_006164.4) i wybierz przycisk "prześlij przetłumaczone".
      3. Wybierz resztę seryny 558 z translowanej sekwencji aminokwasów, która ma zostać zmieniona na alaninę. Używając startera mutagennego, zastąp kodon seryną od agc do gcc, alaniną.
      4. Weź pod uwagę długość podkładu, T_m i zawartość GC.
         UWAGA: Starter mutagenny został ostatecznie zaprojektowany jako 5'-ctactgaaaaaacaactc gccaccttatatctcgaag-3'.
   2. Reakcja syntezy zmutowanej nici z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)
      1. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR na lodzie: 10× bufor reakcyjny, 50 ng pGEX-GST-Nrf2, 125 ng startera do przodu, 125 ng startera odwrotnego, 1 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM), polimeraza DNA 2,5 U Pfu i sterylny DW do 50 μL.
      2. Uruchom PCR do syntezy nici z mutacją pGEX-GST-Nrf2 z następującym programem cyklicznym: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 30 s; 18 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, w temperaturze 55 °C przez 1 minutę i w temperaturze 68 °C przez 90 s; oraz 1 cykl w temperaturze 68 °C przez 5 min.
         UWAGA: W zależności od długości plazmidu parametry cyklu mogą ulec zmianie.
      3. Umieść go na lodzie na 2 minuty, aby schłodzić reagenty do następnego kroku. Alternatywnie przechowuj je przez noc w temperaturze 4 °C.
   3. Trawienie DPN I i selekcja zmutowanego plazmidu
      1. Dodać 1 μl enzymu restrykcyjnego Dpn I (10 U/μL) do każdego z reagentów po schłodzeniu. Dokładnie i delikatnie wymieszać za pomocą pipetowania i odwirowywania przez 1 minutę.
      2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w celu wytrawienia rodzicielskiego dwuniciowego DNA pGEX-GST-Nrf2.
      3. Delikatnie rozmrozić α superkompetentne komórki DH5 na lodzie.
      4. Dodać 50 μl reagenta do 150 μl wstępnie schłodzonego DH5 α nadkompetentnych komórek i inkubować na lodzie przez co najmniej 30 minut.
      5. Przenieś rurki do bloku grzewczego nagrzanego do 42 °C i pozostaw je na 90 sekund. Umieść je na lodzie na 2 minuty.
      6. Dodać wstępnie podgrzany bulion lizogeniczny (LB) do przekształconych komórek α DH5 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z wytrząsaniem przy 180 obr./min.
      7. Przekształcone komórki rozprowadzić na płytkach agarowych LB-ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
         UWAGA: Ampicylina jest używana do selekcji, ponieważ plazmid GEX-GST-Nrf2 ma marker oporności na ampicylinę. Należy stosować odpowiednie antybiotyki, w zależności od markera oporności mutagenizowanego plazmidu.
      8. Wybrać pojedynczą kolonię z płytki, przenieść ją do 5 ml LB-ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 180 obr./min. W celu weryfikacji sekwencji mutagennej należy ocenić co najmniej trzy kolonie.
      9. Ekstrahuj DNA za pomocą zestawu do miniprzygotowania DNA do analizy sekwencji DNA; postępuj zgodnie z protokołem producenta.
      10. Zweryfikuj mutagenne sekwencje DNA za pomocą automatycznego analizatora sekwencji DNA zgodnie z protokołem producenta. Użyć co najmniej 200 ng konstruktu DNA do weryfikacji zmutowanych sekwencji.
2. Oczyszczanie rekombinowanego białka GST-Nrf2
   1. Ekspresja mutagennego białka fuzyjnego GST-Nrf2 w Escherichia coli
      1. Przekształć mutagenny plazmid pGEX-GST-Nrf2 w komórki BL21. Zaszczepić pojedynczą rodzinę w 25 ml bulionu LB zawierającego ampicylinę (100 μg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C na rotatorze przez noc.
      2. Zaszczepić wyhodowane komórki w 100 ml bulionu LB zawierającego ampicylinę (100 μg/ml) w stosunku rozcieńczenia 1:100.
      3. Inkubować w temperaturze 37 °C na rotatorze do momentu, gdy absorbancja przy 600 nm osiągnie około 0,4-0,8 (około 4 h).
      4. Dodać 100 μl 1 M IPTG do 100 ml hodowanych komórek, aby przygotować końcowe stężenie 1 mM IPTG.
      5. Inkubować komórki w temperaturze 30 °C na rotatorze przez 6 godzin lub przez noc w celu ekspresji białka.
      6. Odwirować komórki przy 5,000 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić granulki komórek z 1 ml bakteryjnego buforu do lizy (25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,1% CHAPS, 1 μg/ml pepstatyny, 0,5 μg/ml leupeptyny i 1 mM PMSF) na lodzie.
      7. Lizuj granulki ogniw za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego w odstępach 2-sekundowych przez 2 minuty przy 50% maksymalnej mocy wyjściowej.
      8. Odwirować komórki w temperaturze 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant.
   2. Oczyszczanie rekombinowanego białka GST-Nrf2
      1. Przygotuj 200 μl 50% (v/v) kulek glutationowo-agarozowych i przemyj 1 ml PBS (pH 7,3; 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ i 1,8 mM KH₂PO₄). Zebrać kulki przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 1 minutę. Powtórz krok prania trzy razy.
      2. Dodać lizat komórkowy do przygotowanych 200 μl 50% (v/v) kulek glutationowo-agarozowych i inkubować w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-to-end przez 2 godziny.
      3. Zebrać kulki glutationowo-agarozowe połączone z białkiem GST-Nrf2 przez odwirowanie przy 500 x g przez 1 min. Usunąć supernatant za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 31 G.
      4. Umyj koraliki 1 ml PBS (pH 7,3), jak w kroku 1.
      5. Dodać 500 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl i 10 mM zredukowanego glutationu, pH 8,0) do kulek glutationowo-agarozowych połączonych z GST-Nrf2. Inkubować w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-of-end przez 30 min.
      6. Wirować przy 500 x g przez 1 minutę i zebrać supernatant.
      7. Ponownie dodać 300 μl buforu elucyjnego do kulek i powtórzyć kroki 3.2.2.5-3.2.2.6 dwukrotnie.
   3. Potwierdzenie oczyszczonego białka GST-NRF2
      1. Przygotować 5 μl próbki do wizualizacji ilości białka z 0,5 μg standardowego białka BSA.
      2. Próbki należy umieścić w 7,5% żelu SDS-PAGE pod napięciem 70 V przez 20 minut, a następnie przy napięciu 140 V przez 60 minut.
      3. Zabarwić żel 0,1% roztworem barwiącym CBB (0,1 g CBB R250, 40 ml 99% metanolu, 10 ml lodowatego kwasu octowego i 50 ml destylowanego_H2O) przez 2 godziny i odbarwić (30 ml metanolu, 10 ml lodowatego kwasu octowego i 60 ml destylowanego_H2O), aż pasma będą wyraźnie widoczne.
      4. Umieść odbarwiony żel na bibule filtracyjnej i przykryj przezroczystym opakowaniem. Suszyć żel w suszarce próżniowej do żelu w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę.
      5. Określić ilość zmutowanego białka GST-Nrf2 za pomocą densytometrii do testu kinazy AMPK in vitro.
3. Test aktywności in vitro AMPK z mutantem specyficznym dla danego miejsca
   UWAGA: Test kinazy AMPK in vitro przeprowadza się zgodnie z krokami 2.2-2.4, przy użyciu 0,4 μg oczyszczonego GST-Nrf2 typu dzikiego lub mutanta GST-Nrf2-S558A bez inhibitorów peptydów. Postępuj zgodnie ze wszystkimi wskazówkami dotyczącymi bezpieczeństwa radiacyjnego opisanymi w kroku 1.
   1. Przygotować bufor reakcyjny na lodzie z 0,15 μg AMPK, 0,4 μg zmutowanego lub dzikiego typu GST-Nrf2 i 6 μl buforu 5 kinaz. Napełnij do 30 μl sterylnym DW.
   2. Dodać 1 μL [^γ-32P]-ATP (1 μCi/μL) do probówek reakcyjnych na lodzie. Wymieszać bufor reakcyjny, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, a następnie odwirować.
   3. Próbki inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 30 °C przez 30 minut.
   4. Zatrzymaj reakcję kinazy, dodając 3 μl 10× buforu próbki SDS.
   5. Stosować w żelu 7,5% SDS-PAGE przy napięciu 70 V przez 20 minut, a następnie przy napięciu 140 V przez 1 godzinę.
   6. Utrwalić żel buforem utrwalającym przez 20 minut, przesunąć go na bibułę filtracyjną i przykryć żel przezroczystym opakowaniem.
   7. Wysuszyć żel w suszarce próżniowej do żelu w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę, a następnie wystawić go na noc na ekran fosforowy lub film rentgenowski.
   8. Zeskanuj ekran luminoforowy za pomocą imagera luminoforowego i przenieś żel do szklanej probówki w celu barwienia CBB po wizualizacji zgodnie z krokiem 2.4.

Wyniki

Rysunek 1 i Rysunek 2 pokazują wyniki powtórzonych eksperymentów w poprzednio opisanym artykule⁸. Trzy różne 10-resztowe oligopeptydy naśladujące przypuszczalne miejsca docelowe AMPK (#1, 148-157 zawierające Ser153; #2, 330-339 zawierające Ser335; i #3, 553-562 zawierające Ser558) zostały zsyntetyzowane i wykorzystane jako konkurenci w teście kinazy in vitro. Fosforylacja Nrf2 przez AMPK została z...

Dyskusja

Jako prosty i wygodny sposób oceny autentyczności przewidywanych miejsc fosforylacji, w których pośredniczy AMPK, opisujemy tutaj test kinazy in vitro, który można wykorzystać do odkrycia określonego miejsca fosforylacji przy użyciu konkurencyjnych peptydów i zweryfikowania go za pomocą mutanta specyficznego dla miejsca. Reprezentatywne dane uzyskane z konkurencyjnego testu aktywności AMPK in vitro odpowiadały wynikom testu z użyciem zmutowanego białka skierowanego do miejsca, co wskazuje, że test konku...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HEPES	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	15630
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	208337
EGTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E3889
DTT	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D9779
β-glicerofosforan	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G9422
Na3VO4	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	450243
Koktajl inhibitorów proteazy	Calbiochem, Nottingham, Wielka Brytania	539134
ATP	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2383
AMP	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A1752
AMPK	Upstate Biotechnology, Jezioro Placid, NY	14-840
Nrf2 (WT)	Abnova, Tajpej, Tajwan	H00004780-P01
[γ-32P]-ATP	PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA	NEG502A
Odczynnik do barwienia EZblue	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1041
Pfu turbo polimeraza DNA	Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia	600250
mieszanka dNTP	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	200415-51	Unikaj wielokrotnego cyklu rozmrażania i zamrażania
DpnI	New England Biolabs, Ipswich, MA	R0176S
LB bulion	Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Holandia	L1704
Ampicillin	Affymetrix, Santa Clara, CA	11259
Agaroza LE	iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea Południowa	32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit	Real Biotech Corporation, Tajpej, Tajwan	QDF100
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	161-0400
Albumina surowicy bydlęcej	Bovogen Biologicals, Wiktoria, Australia	BSA100
Sepharose glutationu 4B	GE Opieka zdrowotna, Marlborough, MA	17-0756-01
Kwas octowy lodowaty	Duksan czyste chemikalia, Ansan, Korea
Alkohol metylowy	Daejung Chemikalia & Metals, Siheung, Korea Południowa	5558-4410
[nagłówek]
Tajfun FLA 7000	GE Healthcare, Marlborough, MA	28-9558-09
Zestaw SDS-PAGE	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	1658001FC
Pompa próżniowa	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	165-178
Suszarka do żelu	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	165-1746
Tańczący shaker	FINEPCR, Seul, Korea	CR300	Maszyna jest potrzebna do prania
krokowego Maszyna do PCR	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	T100
Inkubator/wytrząsarki	N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea	NB-205L
Mikrowirówki	LABOGENE, Seul, Korea	1730R
Kolumny	chromatograficzneLaboratoria Bio-Rad, Hercules, CA	732-1010