Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Min Sung Joo; Ja Hyun Koo; Sol-Bi Shin; Hyungshin Yim; Sang Geon Kim

doi:10.3791/55708

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55708

⸱

18 maja 2017

Min Sung Joo¹ , Ja Hyun Koo¹ , Sol-Bi Shin² , Hyungshin Yim² , Sang Geon Kim¹

¹College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Seoul National University, ²College of Pharmacy and Institute of Pharmaceutical Science and Technology, Hanyang University

W tym artykule

Podsumowanie

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Streszczenie

Fosforylacja białek w określonych miejscach determinuje jego konformację i interakcję z innymi cząsteczkami. W ten sposób fosforylacja białek wpływa na funkcje biologiczne i charakterystykę komórki. Obecnie najpowszechniejszą metodą wykrywania miejsc fosforylacji jest chromatografia cieczowa/analiza spektrometrii mas (LC/MS), która jest szybką i czułą metodą. Jednak stosunkowo labilne ugrupowania fosforanowe są często uwalniane z fosfopeptydów na etapie fragmentacji, co często daje sygnały fałszywie ujemne. W takich przypadkach tradycyjny test kinazy in vitro z użyciem mutantów skierowanych na miejsce byłby dokładniejszy, ale ta metoda jest pracochłonna i czasochłonna. Dlatego korzystna może być alternatywna metoda wykorzystująca konkurencję peptydów. Ustalono motyw rozpoznawania konsensusu kinazy białkowej aktywowanej monofosforanem adenozyny (AMPK) ¹ i został zweryfikowany za pomocą pozycyjnego skanowania biblioteki peptydów². W ten sposób miejsca fosforylacji AMPK dla nowego substratu można było przewidzieć i potwierdzić za pomocą testów konkurencji peptydów. W tym raporcie opisujemy szczegółowe etapy i procedury testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro, ilustrując fosforylację czynnika 2 związanego z erytroidem 2 (Nrf2) za pośrednictwem AMPK. Aby uwierzytelnić miejsce fosforylacji, przeprowadziliśmy sekwencyjny test kinazy in vitro przy użyciu mutanta specyficznego dla miejsca. Ogólnie rzecz biorąc, test konkurencji peptydów zapewnia metodę badania przesiewowego wielu potencjalnych miejsc fosforylacji i identyfikacji miejsc do walidacji przez mutanty miejsca fosforylacji.

Wprowadzenie

Fosforylacja białek w określonej reszcie odgrywa znaczącą rolę w szerokim zakresie procesów komórkowych. W związku z tym zrozumienie sieci sygnalizacyjnych wymaga identyfikacji określonych miejsc fosforylacji. Ponadto miejsce fosforylacji określa wpływ na funkcję białka, ponieważ poszczególne domeny w białku mają różne struktury i funkcje. Aktywność czynnika jądrowego erytroidalnego 2 związanego z czynnikiem 2 (Nrf2), kluczowego przeciwutleniającego czynnika transkrypcyjnego, jest dwukierunkowo regulowana przez fosforylację w różnych miejscach. Nasze badania koncentrowały się na kinazach, które katalizują fosforylację Nrf2. Reakcja stresowa Nrf2 na prowokację oksydacy....