Artykuł metodologiczny

Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

DOI:

10.3791/55726

⸱

29 maja 2017

 ,  ,  , 
1Krasnow Institute for Advanced Study, George Mason University, 2Neural Engineering, Bioengineering, George Mason University, 3Neural Engineering, Computer Science, George Mason University, 4Electrical and Computer Engineering, George Mason University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki neuronalne myszy hodowane na układach wieloelektrodowych wykazują zwiększoną reakcję po stymulacji elektrycznej. Protokół ten pokazuje, jak hodować neurony, jak rejestrować aktywność i jak ustanowić protokół trenowania sieci w celu reagowania na wzorce stymulacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matryce mikroelektrod (MEA) mogą być używane do badania toksyczności leków, projektowania paradygmatów dla medycyny spersonalizowanej nowej generacji oraz badania dynamiki sieci w kulturach neuronalnych. W przeciwieństwie do bardziej tradycyjnych metod, takich jak zaciskanie krosowe, które mogą rejestrować aktywność tylko z jednej komórki, MEA mogą rejestrować jednocześnie z wielu miejsc w sieci, bez konieczności żmudnego umieszczania każdej elektrody z osobna. Co więcej, wiele konfiguracji sterowania i stymulacji może być łatwo zastosowanych w tej samej konfiguracji eksperymentalnej, co pozwala na zbadanie szerokiego zakresu dynamiki. Jedną z kluczowych dynamik zainteresowania w tych badaniach in vitro był stopień, w jakim sieci hodowlane wykazują właściwości wskazujące na uczenie się. Komórki neuronalne myszy hodowane na MEA wykazują zwiększoną odpowiedź po treningu wywołanym stymulacją elektryczną. Protokół ten pokazuje, jak hodować komórki neuronalne na MEA; z powodzeniem nagrywaj z ponad 95% platerowanych potraw; ustanowić protokół szkolenia sieci w zakresie reagowania na wzorce stymulacji; oraz sortować, kreślić i interpretować wyniki takich eksperymentów. Zademonstrowano zastosowanie autorskiego systemu do stymulacji i rejestracji kultur neuronalnych. Pakiety oprogramowania są również używane do sortowania jednostek neuronalnych. Specjalnie zaprojektowany graficzny interfejs użytkownika służy do wizualizacji histogramów czasu po bodźcu, interwałów między seriami i czasu trwania serii, a także do porównywania odpowiedzi komórkowej na stymulację przed i po protokole treningowym. Na koniec omówiono reprezentatywne wyniki i przyszłe kierunki tych prac badawczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matryce mikroelektrod (MEA) mogą być używane do badania toksyczności leków, projektowania paradygmatów dla medycyny spersonalizowanej nowej generacji oraz badania dynamiki sieci w kulturach neuronalnych1. W przeciwieństwie do bardziej tradycyjnych metod, takich jak zaciskanie krosowe, które może rejestrować aktywność tylko z pojedynczej komórki, lub nagrywanie w terenie za pomocą szklanej pipety, która może rejestrować odpowiedzi zewnątrzkomórkowe z neuronów otaczających elektrodę w jednym miejscu - MEA mogą jednocześnie rejestrować z wielu miejsc w hodowli komórkowej bez konieczności żmudnego zadania umieszczania każdej elektrody z osobna. Pozwala to na badanie dynamicznych interakcji między grupami komórek, które tworzą sieć w tej hodowli. Co więcej, wpływ stymulacji elektrycznej na wzorce uruchamiania sieci2,3,4,5 i network control6 w hodowlach neuronalnych zostały dobrze udokumentowane, a liczne konfiguracje stymulacji elektrycznej i kontroli mogą być łatwo zastosowane w ramach tej samej konfiguracji eksperymentalnej, co pozwala na szeroki zakres dynamiki czasoprzestrzennej Zbadać.

Jedną z kluczowych dynamik zainteresowania w tych badaniach in vitro był stopień, w jakim sieci hodowlane wykazują właściwości wskazujące na uczenie się7,8,9,10,11,12,13. Laboratorium Peixoto wcześniej badało wpływ sygnałów treningowych o wysokiej częstotliwości, jak opisano w Ruaro i wsp.14, o sieciach mysich neuronów pokrytych układami mikroelektrod15. W tych eksperymentach sieci wykazały wzrost odpowiedzi po treningu wywołanym stymulacją elektryczną. Zwiększona reakcja została uznana za formę uczenia się poprzez rozpoznawanie bodźców, przy czym sieci reagowały w spójny sposób na zmianę bodźca po zastosowaniu określonego protokołu stymulacji (tj. treningu).

Ten protokół pokazuje, jak hodować komórki neuronalne na MEA, skutecznie rejestrować z ponad 95% podanych naczyń, ustanowić protokół do trenowania sieci reagowania na wzorce stymulacji, sortować aktywność pojedynczej jednostki, wykreślać histogramy i interpretować wyniki takich eksperymentów. Przedstawiono wykorzystanie zastrzeżonego systemu (patrz Spis materiałów) do stymulacji i rejestrowania kultur neuronalnych, a także zastosowanie pakietów oprogramowania (patrz Spis materiałów) do sortowania jednostek neuronalnych. Specjalnie zaprojektowany graficzny interfejs użytkownika (patrz tabela materiałów) służy do wizualizacji histogramów czasu po bodźcu, interwałów między impulsami i czasu trwania serii, a także do porównywania odpowiedzi komórkowej na stymulację przed i po protokole treningowym.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach są zgodne z wytycznymi NIH i/lub Polityką Publicznej Służby Zdrowia w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz podlegają instytucjonalnie zatwierdzonemu protokołowi opieki i użytkowania zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie George'a Masona.

1. Przygotowanie materiału

  1. Autoklaw z następujących materiałów: szklane pipety o długości 5,75 cala ułożone pionowo w (2) zlewkach o pojemności 500 ml, około 24 kawałki bibuły filtracyjnej (o średnicy 150 mm, każdy pocięty na 8 klinów; wielkość porów nie ma znaczenia), 1 000 μl filtrowanych końcówek do pipet, 200 μl filtrowanych końcówek do pipet, 10 μl filtrowanych końcówek do pipet i woda dejonizowana (DI) do płukania (co najmniej 200 ml).
  2. Przygotować odczynniki i pożywkę.
    1. Przygotuj wszystkie odczynniki i pożywki w biokapturze przy użyciu technik aseptycznych.
    2. Przygotować poli-D-lizynę (PDL) zgodnie z tabelą 1.
      1. Wymieszać PDL ze sterylną wodą demineralizowaną do końcowego stężenia 50 μg/ml w następujący sposób. Użyj sterylnej pipety serologicznej, aby przenieść 96 ml sterylnej wody demineralizowanej do autoklalawowanej szklanej butelki z odczynnikiem.
      2. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej dodać 4 ml sterylnej wody demineralizowanej do fiolki producenta zawierającej PDL. Rozpuścić PDL przez pipetowanie. Za pomocą tej samej pipety przenieś roztwór PDL do szklanej butelki z odczynnikiem zawierającej 96 ml sterylnej wody demineralizowanej.
      3. Szczelnie zakręć butelkę przed wyjęciem jej z biokaptura i zmieszaj roztwór. W kapturze biologicznym podzielić roztwór na 5 ml podwielokrotności; zamrozić niewykorzystany roztwór w temperaturze -20 °C. Rozmrożony PDL można jednokrotnie ponownie zamrozić. Wyrzuć rozmrożony roztwór, jeśli został wcześniej ponownie zamrożony.
    3. Przygotować roztwór lamininy zgodnie z tabelą 2.
      1. Wymieszać lamininę z PBS do końcowego stężenia 20 μg/ml w następujący sposób. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieść 49 ml PBS do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
      2. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej dodać 1 ml PBS do fiolki producenta zawierającej lamininę o odpowiedniej masie. Rozpuścić lamininę przez pipetowanie. Za pomocą tej samej pipety przenieść roztwór lamininy do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 49 ml PBS.
      3. Szczelnie zakryj probówkę przed wyjęciem jej z kaptura biologicznego i zmieszaj roztwór. W kapturze biologicznym podzielić roztwór na 5 ml podwielokrotności; zamrozić niewykorzystany roztwór w temperaturze -20 °C. Rozmrożonej lamininy nie można ponownie zamrozić; Wyrzuć wszelkie niewykorzystane rozmrożone roztwory.
    4. Przygotować nośnik pamięci zgodnie z tabelą 3.
      UWAGA: Pożywka magazynująca służy do przechowywania tkanek przez okres do miesiąca na poziomie CO2 w otoczeniu. Można go zakupić (patrz tabela materiałów) lub można go przygotować według ogólnej receptury: pożywka do przechowywania komórek CO2 w otoczeniu + 2% suplement bez surowicy do hodowli komórek nerwowych + 0,5 mM pożywka do hodowli komórkowych zawierająca stabilizowaną formę L-glutaminy (patrz tabela materiałów).
      1. Aby uzyskać 10 ml pożywki do przechowywania, należy przenieść 10 ml pożywki do przechowywania tkanek embrionalnych bez CaCl2 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodaj 210 μl bezsurowicowego suplementu do hodowli komórek nerwowych i 55 μl stabilizowanej formy L-glutaminy. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.
      2. Ponieważ podłoże do przechowywania jest wrażliwe na światło, należy je chronić, przykrywając probówki wirówkowe o pojemności 15 ml folią aluminiową. Podwielokrotność 2 ml pożywki do przechowywania w probówce, co daje w sumie 5 podwielokrotności. Przechowywać w lodówce do 2 tygodni lub do momentu, gdy będzie gotowy do użycia, ale nie zamrażać.
    5. Przygotować podłoże DMEM 5/5, zgodnie z tabelą 4.
      1. Rozmrozić porcje bezsurowicowego suplementu do hodowli komórek nerwowych, surowicy końskiej (HS), płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i kwasu askorbinowego. W razie potrzeby rozmrozić podwielokrotność paciorkowca w celu kontroli skażenia bakteryjnego. Odpipetować każdy składnik do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Upewnij się, że końcówki pipet nie dotykają żadnych powierzchni ani przedmiotów.
      2. Wewnątrz okapu podłącz filtr do rurki próżniowej, gdy próżnia jest nadal wyłączona. Wlej mieszaninę do górnej części filtra i zamknij ją. Włącz próżnię w biokapturze i pozwól pożywce przefiltrować się na dno pojemnika. Odłącz filtr od odkurzacza przed wyłączeniem odkurzacza.
      3. Dokręcić pokrywkę pojemnika na sterylne podłoże, oznaczyć je etykietą i przechowywać niewykorzystane podłoże w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca. Otwórz pojemnik wewnątrz biokaptura, aby utrzymać sterylność podłoża.
    6. Przygotować pożywkę DMEM+, zgodnie z tabelą 5.
      1. Rozmrozić porcje bezsurowicowego suplementu do hodowli komórek nerwowych i kwasu askorbinowego (i paciorkowca, jeśli to konieczne). Odpipetować każdy składnik do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Powtórz kroki 1.2.5.2-1.2.5.3 dla pozostałego procesu.

2. Przygotowanie tablicy/potrawy

UWAGA: MEA używane w procedurze to 60-kanałowe tablice zorganizowane w kwadrat 8 x 8. Odległość między elektrodami wynosi 200 μm, a każda elektroda ma średnicę 10 μm. Materiałem przewodzącym ścieżki jest tytan, a same elektrody wykonane są z TiN. Szklany pierścień wokół elektrod ma wysokość 6 mm i średnicę zewnętrzną 24 mm. Do pokrycia MEA stosuje się nasadkę wykonaną z polioksymetylenu (POM), a w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu podczas sesji nagrywania i stymulacji stosuje się przepuszczalną dla gazu/cieczy folię z fluorowanego etylenu i propylenu (FEP).

  1. Dzień przed poszyciem.
    1. Spraw, aby niewykorzystane MEA stały się hydrofilowe, wystawiając je na działanie plazmy; zwykle nie jest to konieczne po pierwszym użyciu. Upewnić się, że szkiełka nakrywkowe używane do hodowli kontrolnych są również poddawane działaniu plazmy.
      UWAGA: Plastikowe szalki Petriego (35 mm) mogą być również używane jako szalki kontrolne i nie wymagają żadnej obróbki wstępnej.
      1. Zabieg plazmowy należy przeprowadzić za pomocą wytrawiacza plazmowego przez 40-60 s przy połowie mocy (50 W), przy ciśnieniu w komorze ustawionym na 100-150 mT.
    2. Natychmiast napełnij MEA wodą DI. Zanurz szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego wypełnionej wodą demineralizowaną. Pozostawić wodę DI w kontakcie z obrabianymi powierzchniami na około 15 minut.
    3. Wewnątrz okapu biologicznego odessać wodę DI. Napełnij MEA aż do obręczy 70% etanolem. Usunąć wodę demineralizowaną z płytki Petriego zawierającej szkiełka nakrywkowe i napełnić płytkę Petriego etanolem, aż szkiełka nakrywkowe zostaną całkowicie zanurzone. Pozostaw na 10-15 minut.
    4. Oznacz wszystkie szalki Petriego i szalki kontrolne identyfikatorem MEA#, datą operacji, typem komórki i inicjałami. Następnie umieść każdy MEA na oznaczonej szalce Petriego.
    5. Umieścić MEA na indywidualnych szalkach Petriego i usunąć etanol za pomocą odsysania próżniowego. Napełnij MEA sterylną wodą demineralizowaną, aby usunąć resztki etanolu. Użyj ssania próżniowego, aby usunąć wodę DI. Pozwól MEA wyschnąć na powietrzu wewnątrz biokaptura.
    6. Dodać 40-70 μl 50 μg/ml poli-D-lizyny (PDL; wysoka masa cząsteczkowa, co najmniej 50 kDa) do środka każdego MEA i 0,2 ml do kontroli za pomocą sterylnych końcówek do pipet.
      UWAGA: Pamiętaj, aby nie dotykać środka MEA końcówką pipety, ponieważ może to spowodować uszkodzenie elektrod. Dokładna ilość dozowanego PDL zależy od hydrofilowości powierzchni.
    7. Umieść mały kawałek bibuły laboratoryjnej w każdym naczyniu i zwilż go sterylną wodą, aby uniknąć parowania PDL przez noc. Przykryj wszystkie naczynia przed wyjęciem ich z biokaptura. Umieścić naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc.
  2. Dzień poszycia.
    1. W dniu posiewu rozmrozić 1 porcję lamininy (20 μg/ml); każda MEA wymaga 40-50 μl lamininy, a każde naczynie kontrolne wymaga 0,2 ml lamininy. Obliczyć potrzebną objętość lamininy w oparciu o liczbę MEA i kontroli, które mają być użyte.
    2. Przenieś wszystkie naczynia z inkubatora do biokaptura.
    3. Napełnij wszystkie MEA sterylną wodą demineralizowaną za pomocą sterylnej pipety serologicznej i pozostaw je na 10 - 15 minut. Zassaj wodę demineralizowaną za pomocą sterylnych pipet Pasteura i powtórz proces dwukrotnie.
    4. Dodać 40 - 50 μl rozmrożonej lamininy do środka każdego MEA i 0,2 ml lamininy do płytek kontrolnych za pomocą sterylnych końcówek do pipet. Przykryć wszystkie MEA i płytki kontrolne do biokaptura i przenieść je do inkubatora w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
      1. Ostrożnie usuń nadmiar lamininy ze środka MEA za pomocą odsysania sterylnymi pipetami Pasteura i pozostaw powierzchnię do wyschnięcia na powietrzu przed posiewem.
    5. Pozostaw naczynia w biokapturze lub umieść je w inkubatorze, aż będą gotowe do umieszczenia komórek na płytce.
      UWAGA: Naczynia mogą pozostać w inkubatorze do następnego dnia. Jeśli jednak potrzeba więcej czasu, zaleca się umycie naczyń i rozpoczęcie od nowa od etapu poli-D-lizyny (PDL) (krok 2.1.6).

3. Usuwanie zarodków i ekstrakcja mózgu

  1. Wlać pożywkę L-15 (Leibovitz) do 4 szalek Petriego o średnicy 100 mm. Przykryj je i umieść w zamrażarce o temperaturze -20 °C, aż podłoże będzie miało konsystencję brei, ale nie zostanie zamrożone w postaci stałej (~40-60 min).
  2. Zrób to około 40 minut do 1 godziny przed preparacją.
    UWAGA: Spowoduje to szybkie schłodzenie zarodków i mózgów, dzięki czemu będą miały mocną konsystencję i nie rozpadną się po ekstrakcji.
  3. Przygotuj obszar sekcji do usunięcia zarodków.
    1. Umieść tacę z lodem w pobliżu zlewu i rozłóż narzędzia chirurgiczne oraz materiały do usuwania zarodków. Należą do nich 4 szalki Petriego z zimnym "błotem pośniegowym" L-15, ręczniki papierowe, butelka z rozpylaczem z 70% etanolem, kleszczyki do nosa, cienkie kleszcze, małe nożyczki chirurgiczne i duże nożyczki (Rysunek 1).
  4. Przygotuj obszar sekcji do ekstrakcji mózgu.
    1. Umieść szklaną szalkę Petriego zadrukowaną stroną do dołu na tacy pełnej lodu.
    2. Rozłóż narzędzia chirurgiczne i materiały do ekstrakcji mózgu, w tym ręczniki papierowe, małe nożyczki chirurgiczne, cienką dwustronną szpatułkę, butelkę z rozpylaczem wypełnioną 70% etanolem i plastikową torbę do usuwania tuszy (Rysunek 2).
  5. Załóż fartuch laboratoryjny, maskę na twarz i rękawiczki. Spryskaj wszystkie powierzchnie robocze, w tym rękawice, 70% etanolem.
    UWAGA: Chociaż nie jest to procedura sterylna, najlepiej jest jak najbardziej zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
  6. Poddaj eutanazji mysz w ciąży E17 zgodnie z wytycznymi NIH16 i/lub Polityką Publicznej Służby Zdrowia dotyczącą Humanitarnej Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych oraz zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem opieki i wykorzystania zwierząt (IACUC) w przypadku uduszenia CO2. Pamiętaj, aby powoli uwalniać gaz CO2 do komory przez okres od 3 do 5 minut, aby uniknąć wywoływania paniki lub dyskomfortu u myszy.
  7. Odetnij głowę myszy i połóż ją na ręczniku papierowym, brzuszną stroną do góry. Spryskaj jego dolną część brzucha 70% etanolem. Za pomocą małych nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w kształcie litery V przez skórę i podskórną tkankę tłuszczową dolnej części brzucha, przedłużając cięcie do dystalnych końców klatki piersiowej i odsłaniając macicę.
  8. Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś macicę między zarodkami. Odetnij tkankę łączną nożyczkami do preparowania, aż cała macica będzie wolna. Krótko przepłucz macicę 70% etanolem, aby usunąć krew i umieść ją na jednej z 4 szalek Petriego wypełnionych zimnym L-15.
  9. Uwolnij każdy zarodek z macicy i wewnętrznego worka embrionalnego za pomocą pary kleszczyków z cienką końcówką. Upewnij się, że pępowina została przecięta, a worek łożyskowy usunięty. Umieść uwolnione zarodki w drugim naczyniu pełnym zimnego L-15. Odetnij głowy zarodkom kleszczami i nożyczkami. Za pomocą kleszczy przenieś głowy na trzecią szalkę Petriego, a ciała na czwartą, obie pełne zimnego L-15.

4. Usunięcie kory czołowej

  1. W biokapturze umieść klin autoklawowanej bibuły filtracyjnej na schłodzonej szklanej szalce Petriego. Umieść pojedynczą główkę zarodka na bibule filtracyjnej. Chwyć czaszkę, umieszczając parę kleszczy w jamach ocznych ręką niedominującą. Usuń skórę i leżącą pod nią tkankę mięśniową za pomocą nożyczek do tęczówki.
  2. Umieść krawędź tnącą dolnej krawędzi nożyczek tęczówki w podstawie czaszki. Trzymając dolną przeziębienie na wewnętrznej powierzchni czaszki, z dala od mózgu, przeciąć płytkę potyliczną, a następnie wzdłuż linii środkowej między płytkami ciemieniowymi. Kontynuuj cięcie rostralnie, między chrzęstnymi czołowymi płytkami czaszki.
  3. Zaczynając od środka płytki potylicznej, wykonaj prostopadłe cięcie po lewej i prawej stronie środkowego cięcia.
  4. Usuń mózg, ostrożnie wsuwając małą szpatułkę między brzuszną powierzchnię mózgu a dolną płytką czaszki, aż znajdzie się całkowicie pod mózgiem. Podnieś szpatułkę do góry; Cały mózg wyjdzie nienaruszony.
  5. Umieść kilka kropli pożywki L-15 na bibule filtracyjnej, aby mózg nie przyklejał się do bibuły i delikatnie wsuń mózg ze szpatułki na bibułę filtracyjną, brzuszną stroną do dołu. Ostrożnie odetnij opuszkę węchową końcówką szpatułki.
  6. Za pomocą czystej szpatułki rozetnij płat czołowy w kształcie trapezu. Przenieść tkankę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej pożywkę do przechowywania. Powtórz powyższe z pozostałymi zarodkami. Pamiętaj, aby za każdym razem używać świeżego kawałka bibuły filtracyjnej (tj. jednego klina bibuły filtracyjnej na głowę).

5. Dysocjacja komórek

  1. W biokapturze zmontuj elementy wymienione w tabeli 6.
  2. Użyj sterylnej pipety serologicznej, aby dodać 5 ml DMEM+ do fiolki z papainą; podgrzany DMEM+ może być użyty do lepszego rozpuszczenia papainy. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać roztwór.
  3. Użyj sterylnej mikropipety, aby dodać 0,5 ml DMEM+ do fiolki z DNazą. Podczas przygotowywania roztworu DNazy należy unikać intensywnego pipetowania, ponieważ DNaza jest wrażliwa na denaturację przy ścinaniu.
  4. Przenieść 2,5 ml roztworu papainy do sterylnej probówki wirówkowej i dodać 125 μl DNazy do tej samej probówki. Wymieszaj roztwór, delikatnie odwracając zakorkowaną probówkę wirówkową około 8 razy.
  5. Za pomocą sterylnej pipety o szerokim otworze wyjmij tkankę z probówki zawierającej pożywkę i umieść ją na sterylnej szalce Petriego o średnicy 35 mm. Zbierz jak najmniej podłoża. Użyj sterylnej pipety, aby usunąć jak najwięcej nadmiaru podłoża bez usuwania tkanki. Tkanka nie powinna unosić się na podłożu, ale powinna być wilgotna.
  6. Użyj dwóch sterylnych ostrzy skalpela, aby zmielić tkankę. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej dodać 2,5 ml mieszaniny DNazy/papainy do tkanki mielonej na szalce Petriego. Delikatnie obracaj szalką Petriego, aby upewnić się, że cała tkanka jest wolna w roztworze i nie przylega do dna szalki. Umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 15 minut.
  7. W kapturze biologicznym użyj sterylnej pipety transferowej o szerokim otworze, aby przenieść wszystkie pożywki i tkanki do sterylnej probówki kriogenicznej o pojemności 5 ml. Umieść końcówkę tej samej pipety do przenoszenia o szerokim otworze blisko dna probówki. Delikatnie rozcierać, powoli pipetując w górę i w dół 10-15 razy.
  8. Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas pipetowania. Powtórz proces za pomocą pipety transferowej o małym otworze, aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Jeśli tkanka nie jest zdysocjowana, rozcierać za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
  9. Dodaj 2 ml podgrzanego DMEM 5/5 do zdysocjowanej mieszaniny komórek. Zakryj probówkę wirówkową, gdy jest jeszcze w biokapturze. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Wirować przy ciśnieniu około 573 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (20-25 °C).
  10. W kapturze biologicznym użyć sterylnej pipety serologicznej, aby usunąć i wyrzucić cały supernatant, nie rozbijając osadu. Użyj sterylnej pipety, aby dodać 1 ml podgrzanego DMEM 5/5 do osadu w probówce, aby ponownie zawiesić komórki. Użyj sterylnej pipety transferowej o małym otworze, aby rozdrobnić granulki, delikatnie pipetując w górę i w dół, aż mieszanina będzie jednorodna.
    UWAGA: Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza podczas pipetowania. Jeśli pobrano bardzo mało tkanki, dodaj tylko 0,5 ml DMEM 5/5.
  11. Za pomocą sterylnej pipety przenieś 10 μl zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówkowej. Na zewnątrz okapu biologicznego dodać 10 μl błękitu trypanowego do 10 μl zawiesiny komórkowej w probówce do mikrowirówki.
    UWAGA: Ten krok nie wymaga sterylności.
  12. Załadować 10 μl zawiesiny niebieskich krwinek trypanowych do jednorazowego chipa hemocytometru w celu zliczenia komórek.

6. Komórki poszycia

  1. W kapturze biologicznym użyj sterylnej mikropipety, aby przenieść 50 μl zawiesiny komórkowej do środka każdej matrycy i każdej kontrolnej szalki Petriego. Użyj jednej końcówki pipety na każde naczynie. Upewnij się, że komórki znajdują się dokładnie na środku tablicy. Ponownie zwilż bibułę laboratoryjną, która znajdowała się w naczyniu, sterylną wodą lub umieść nową bibułę w każdym naczyniu. Przykryj naczynia.
  2. Umieścić przykryte szalki Petriego w inkubatorze nastawionym na 37 °C i 10% CO2 na 3-4 godziny.
  3. W biokapturze delikatnie dodaj 1 ml podgrzanego DMEM 5/5 do każdego MEA.
    UWAGA: Unikaj mycia komórek z dala od środkowej tablicy podczas dodawania pożywki (ważne!). Bardzo ostrożnie użyj sterylnej mikropipety, aby dodawać po jednej kropli na raz wokół wewnętrznych krawędzi.
  4. Umieść nasadkę zawierającą przepuszczającą gaz membranę FEP na każdym MEA. Włóż je z powrotem do inkubatora na dwa dni.
    UWAGA: Nasadka zapobiega zanieczyszczeniu i parowaniu. Postępuj zgodnie z techniką aseptyczną, susząc nakrętki w biokapturze 100% etanolem przed umieszczeniem ich na MEA. Kultury muszą być zamknięte w obrębie biokaptura i muszą pozostać zamknięte przez cały czas.

7. Utrzymanie kultur

  1. Po dwóch dniach należy przeprowadzić całkowitą wymianę podłoża na podgrzany DMEM+.
    1. Przenieś tylko kilka naczyń z inkubatora do biokaptura na raz, aby uniknąć zbyt długiego stresowania kultur.
    2. Użyj sterylnej mikropipety o pojemności 1 ml, aby wyciągnąć całe podłoże z naczynia, ostrożnie umieszczając końcówkę pipety na wewnętrznej ściance naczynia, unikając dotykania komórek pośrodku. Używaj tylko jednej końcówki pipety na naczynie, aby uniknąć rozprzestrzeniania się zanieczyszczeń.
    3. Użyj sterylnej mikropipety, aby dozować 1 ml ciepłego DMEM+, ostrożnie umieszczając końcówkę pipety na wewnętrznej ściance naczynia.
  2. Wykonuj 50% zmian pożywki z podgrzanym DMEM+, jak opisano powyżej, 2-3 razy w tygodniu i nie więcej niż 4 dni między karmieniami.
    1. Użyj sterylnej mikropipety o pojemności 1 ml, aby pobrać 500 μl pożywki z naczynia. Za pomocą sterylnej mikropipety dozuj 500 μl ciepłego DMEM+.

8. Oględziny i zapisy

  1. Sprawdzaj próbki naczyń co drugi dzień pod mikroskopem, aby poszukać pokrycia komórek na matrycy (przy użyciu 4-krotnego i 10-krotnego powiększenia) oraz zanieczyszczeń (przy użyciu 20-krotnego powiększenia), bakteryjnych lub grzybiczych.
    UWAGA: Rysunek 3a pokazuje przykład optymalnego pokrycia komórek, natomiast Rysunek 3b pokazuje hodowlę o niskiej gęstości komórek.
  2. Dwa tygodnie po posiewie przetestuj próbkę szalek MEA pod kątem spontanicznej aktywności. Nagrywaj z MEA, jak opisano poniżej, przez 3-5 minut. Skoki zostaną wykryte, jeśli aktywność jest obecna (Rysunek 4).
    UWAGA: To od eksperymentatora zależy, kiedy rozpocząć testowanie w oparciu o rodzaj badanego eksperymentu i hipotezy.
    1. Aby rejestrować aktywność w MEA, użyj następującego sprzętu: zasilacza, wzmacniacza, sceny czołowej/przedwzmacniacza, regulatora temperatury i generatora stymulacji (patrz tabela materiałów i Rysunek 5).
    2. Przed wyjęciem kultur z inkubatora należy podłączyć regulator temperatury i włączyć system, włączając zasilanie (zgodnie z instrukcją producenta), pozwalając, aby podgrzewana płyta podstawy przedwzmacniacza osiągnęła 35 °C.
    3. Umieść zaślepioną kulturę w przedwzmacniaczu tak, aby linia w studni MEA pokrywała się z masą odniesienia. Upewnij się, że piny przedwzmacniacza są wyrównane, że górna część przedwzmacniacza jest zabezpieczona, a nasadka kulturowa jest nadal założona.
    4. Po umieszczeniu kultury na płytce odznacz opcję "Zmień MEA" w oprogramowaniu do akwizycji danych (patrz tabela materiałów z nazwami oprogramowania i instrukcjami obsługi). Dodatkowo odznacz pole "Wygaszanie" przed wykonaniem jakichkolwiek nagrań.
    5. Wybierz "Pobierz" w "MEA_Select" po umieszczeniu kultury w systemie. Sprawdź, czy program wyświetla komunikat "Pobierz OK", zanim przejdziesz dalej.
    6. Naciśnij "Start" w środowisku oprogramowania, aby rozpocząć wizualizację sygnałów. W oknie głównym wybierz: "Skoki" → "Wykrywanie" → "Automatycznie", zmień wartość "Std Dev" na "5" i kliknij "odśwież", aby zresetować próg.
      UWAGA: Okno "Skoki" pokazuje skoki, które przekroczyły próg.
    7. W oknie głównym wybierz "Rejestrator" → "Rejestrator" → "Przeglądaj". Zmień ścieżkę i nazwę pliku, aby zidentyfikować datę, godzinę, danie i eksperyment. Ustaw limit czasu (np. na 5 minut). Kliknij "Zatrzymaj", "Nagrywaj" i "Odtwórz". Pamiętaj, że nagrywanie zatrzymuje się automatycznie.
    8. Otwórz oprogramowanie do stymulacji. Wybierz "Rejestrator" → "Rejestrator" → "Przeglądaj", aby utworzyć plik i ustawić limit czasu. Kliknij "Zatrzymaj", "Nagrywaj" i "Odtwórz", aby nagrać ponownie. Kliknij "Pobierz i Uruchom" (w oprogramowaniu do stymulacji), aby stymulacja została dostarczona do naczynia.
    9. Wybierz przycisk "Zmień MEA" w oprogramowaniu, aby zmienić naczynia.
      UWAGA: Nie należy trzymać kultury poza inkubatorem na dłużej niż 30 minut bez systemu utrzymującego atmosferę CO2 wokół kultury. Jeśli wymagane są dłuższe sesje nagraniowe, użyj dostępnego w handlu adaptera do dostarczania CO2.

9. Sieci szkoleniowe

UWAGA: Rysunek 6 pokazuje przegląd kroków 9.1-9.3, opisanych poniżej.

  1. Zapisz 5-minutową wartość wyjściową spontanicznej aktywności z hodowli komórkowej (zgodnie z opisem w kroku 8). Po ustaleniu linii bazowej podaj 5-minutową stymulację sondującą przed treningiem, składającą się z dwufazowego impulsu 0,5 Hz o czasie trwania impulsu 200 μs i amplitudy impulsu 900 mV (Rysunek 7a) przez wybrane elektrody stymulacyjne, jak pokazano w Rysunek 8 (szczegółowe informacje na temat wyboru elektrod stymulacyjnych można znaleźć w instrukcji oprogramowania w tabeli materiałów).
  2. Po zakończeniu stymulacji przedtreningowej należy podać sieciom protokół "treningowy" przy użyciu tych samych elektrod, co w stymulacji sondującej. Dostarczaj pociągi o wysokiej częstotliwości raz na 2 sekundy, zgodnie z opisem w Hamilton i wsp.15 (Rysunek 7b i Rysunek 7c).
    UWAGA: Sygnał treningowy składa się z 40 ciągów impulsów. Każdy ciąg impulsów składa się ze 100 impulsów dwufazowych, z 4 ms między impulsami, czasem trwania impulsu 200 μs i amplitudą impulsu 900 mV.
  3. Po zakończeniu okresu treningowego należy wykonać 5-minutową stymulację potreningową komórek, identyczną jak w przypadku stymulacji przedtreningowej. Po zakończeniu stymulacji potreningowej zapisz 5 minut spontanicznej aktywności po stymulacji z sieci (zgodnie z opisem w kroku 8).
  4. Należy użyć oddzielnej grupy kontrolnej MEA, aby uwzględnić możliwe zmiany w odpowiedzi sieci spowodowane naturalnymi fluktuacjami lub niestacjonarnością systemu. Tym grupom kontrolnym należy podać ten sam protokół eksperymentalny, który opisano powyżej, z wyjątkiem sytuacji, w której grupy kontrolne otrzymują pozorowany okres treningowy, w którym nie podaje się żadnego rzeczywistego sygnału treningowego.

10. Analiza danych

Uwaga: Pliki danych są zapisywane, a następnie sortowane na jednostki neuronalne za pomocą zastrzeżonego oprogramowania do sortowania (zobacz tabelę materiałów). Dostosowany graficzny interfejs użytkownika (GUI) służy do ładowania jednostek i analizowania wzorców aktywności w kulturach, interwałów między serią, czasu trwania serii i histogramu czasu po bodźcu (PSTH) (patrz tabela materiałów). PSTH jest najważniejszym wykresem do analizy, ponieważ wyświetla aktywność sieci w rozmiarach pojemników (o zmiennej długości), zapewniając w ten sposób wizualną reprezentację odpowiedzi sieci na prezentowaną stymulację.

  1. Przekonwertuj pliki danych .mcd do formatu .plx za pomocą zastrzeżonego oprogramowania sortującego (zobacz tabelę materiałów z nazwami oprogramowania i podręcznikami użytkownika). Wyeksportuj plik .plx do nowego pliku .plx w tym samym programie. Posortuj kanały w jednostki neuronalne (Rysunek 9). Po zakończeniu sortowania wyeksportuj dane jako plik .nex.
  2. Otwórz plik .nex w odpowiednim oprogramowaniu (patrz Tabela materiałów) i zapisz go jako plik .mat do analizy za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika, który jest dostępny bezpłatnie (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Graficzny interfejs użytkownika (patrz tabela materiałów) wykreśla PSTH zgodnie z danymi wejściowymi użytkownika (tj. PSTH populacji, odchyloną średnią PSTH lub PSTH pojedynczego kanału), co pozwala na przegląd eksperymentu stymulacji i natychmiastowe porównanie plików po i przed bodźcem. Kreśli również początkowe i końcowe PSTH, co porównuje reakcję sieci na pierwsze 6 i ostatnie 6 bodźców. Graficzny interfejs użytkownika wykonuje kilka innych funkcji, takich jak częstotliwość skoków, interwał skoków, skoki na serię, interwał między seriami i czas trwania serii, zarówno dla plików stymulacji, jak i plików o spontanicznej aktywności.
  3. Najpierw wybierz plik .mat ze zmiennymi zawierającymi ciągi szczytów i jedną zmienną zawierającą artefakt stymulacji; skrypt przeanalizuje dane, a główny graficzny interfejs użytkownika pojawi się z wykresem średniej PSTH po prawej stronie (Rysunek 10).
    1. Kliknij przyciski elektrod aktywnych, aby zobaczyć poszczególne PSTH (na niebiesko) w porównaniu ze średnim PSTH (na czerwono).
      UWAGA: Aktywne elektrody będą pokolorowane, aby pokazać mapę cieplną, gdzie wyższe wartości (bardziej czerwone) reprezentują większe szczytowe wartości PSTH, wskazując na silniejszą reakcję na stymulację.
    2. Wybierz opcję analizy za pomocą menu podręcznego. Wybierz przycisk "Uśrednienie odchylenia", aby wybrać podzbiór elektrod i wykreślić średnią z tego podzbioru; Jest to przydatne do porównywania zachowań podsieci w obrębie kultury.
      UWAGA: Za pomocą menu podręcznego można wybrać wiele różnych opcji analizy, a wszystkie są wyjaśnione w przycisku "pomoc" w oprogramowaniu.
    3. Wybierz przycisk "Zapisz wykres", aby zapisać aktualnie wyświetlany wykres jako plik jpeg o wysokiej rozdzielczości. Wybierz przycisk "Tabela danych", aby wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z przedstawionej tutaj procedury (Rysunek 11), 60-kanałowe MEA posiane mysimi komórkami neuronalnymi E17 inkubowano, aż kultury pokryły matryce zdrowym dywanem komórek (Rysunek 12 i Rysunek 3a). Po 3 tygodniach inkubacji w temperaturze 10% CO2 i temperaturze 37 °C kultury sprawdzono pod kątem spontanicznej aktywności za pomocą komercyjnego systemu rejestracji (patrz tabela materiałów). Temperatura była utrzymywana na poziomie 37 °C podczas procedury rejestracji za pomocą regulatora temperatury, ponieważ temperatura wpływa na aktywność neuronów i szybkość wypalania.

Testowanie aktywności
Sieci aktywne spontanicznie zwykle wykazują różne wzorce sygnałów. Przeciętna aktywna kultura może rejestrować aktywność w około 40% elektrod. Spośród tych aktywnych miejsc elektrod prawie połowa rejestruje sygnały spontaniczne, z szybkością zapłonu w zakresie 5 - 10 Hz. Reprezentatywny wykres rastrowy spontanicznej aktywności jest pokazany w Rysunek 4a. Znaczniki wskazują znaczniki czasowe potencjałów czynnościowych zarejestrowanych z 9 aktywnych elektrod w oknie 20 s, z szybkością akwizycji 25 kHz i zakresem filtra pasmowoprzepustowego od 300 Hz do 3 kHz. Rysunek 4b pokazuje podstawowy szum i przefiltrowany surowy sygnał zewnątrzkomórkowy podczas 8 impulsów aktywności przed procedurą sortowania. Aby oddzielić potencjały czynnościowe od szumu, progi dla każdego kanału są ustawiane na 5-krotność odchylenia standardowego szumu bazowego i są obliczane w oknie 500 ms15.

Przed analizą, zarejestrowane skoki dla każdej elektrody były sortowane offline, aby odróżnić aktywność fizjologiczną od artefaktów stymulacji za pomocą algorytmu k-średnich i analizy głównych składników. Sygnały, które zostały zidentyfikowane jako reakcje fizjologiczne, zostały zgrupowane razem, aby utworzyć odpowiedź populacyjną dla każdej elektrody (Rysunek 13 i Rysunek 9)15.

Szkolenie sieci neuronowych za pomocą stymulacji elektrycznej
Sieci trenowano za pomocą stymulacji elektrycznej nakładanej na hodowlę bezpośrednio przez elektrody MEA za pomocą generatora bodźców (patrz tabela materiałów). W tym zestawie reprezentatywnych wyników użyto konfiguracji w kształcie litery "L" składającej się z 13 elektrod (Rysunek 8), chociaż można zastosować wiele innych konfiguracji. Stymulację sondowania i treningu oparto na parametrach zdefiniowanych w Ruaro i wsp.14.

Początkowo ustalono punkt odniesienia poprzez zarejestrowanie 5 minut spontanicznej aktywności przed stymulacją. Po ustaleniu linii bazowej, 5-minutowa stymulacja sondowania przed treningiem, składająca się z dwufazowego impulsu 0,5 Hz o czasie trwania impulsu 200 μs i amplitudy impulsu 900 mV (Rysunek 7a) podawano przez wybrane miejsca stymulacji (tj. w kształcie litery "L"). Protokół treningowy był następnie podawany do sieci co 2 sekundy przy użyciu tego samego zestawu elektrod. Sygnał treningowy składał się z 40 ciągów impulsów, z których każdy zawierał 100 impulsów dwufazowych, z okresem międzyimpulsowym 4 ms, czasem trwania impulsu 200 μs i amplitudą impulsu 900 mV (Rysunek 7b i Rysunek 7c). Po tym okresie treningowym następowała 5-minutowa faza potreningowa, podobna do stymulacji przedtreningowej. Protokół został następnie zakończony 5-minutowym zapisem spontanicznej aktywności po stymulacji.

Ten sam protokół eksperymentalny zastosowano do grupy kontrolnej kultur, aby uwzględnić naturalne fluktuacje w odpowiedzi sieci. Jedyną różnicą w protokole kontrolnym było jednak zastosowanie pozorowanego okresu treningowego, podczas którego nie podawano żadnego rzeczywistego sygnału treningowego.

Analizy statystyczne zestawów danych (tj. trening kontra kontrola) zostały przeprowadzone za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA, ze zmienną "szkolenie" jako czynnikiem pośrednim. Opóźnienie zostało użyte jako czynnik wewnątrzobiektowy. Jeśli stwierdzono istotną interakcję, wykonywano procedurę post hoc Tukeya. Wyniki wykazały reakcję przedtreningową w ciągu 20 ms po bodźcu, chociaż zakres aktywności był niespójny po pierwszej reakcji. Jednak aktywność potreningowa wykazywała nie tylko reakcję w ciągu pierwszych 20 ms po bodźcu, co widać podczas treningu przedtreningowego, ale także wykazywała znaczącą aktywność 30-50 ms po bodźcu (Rysunek 14 i Rysunek 15)15. Stwierdzono również statystycznie istotną korelację między "częstotliwością skoków" a "czasem po bodźcu" oraz między "niezawodnością skoków" a "czasem po bodźcu". "Niezawodność skoku" można zdefiniować jako prawdopodobieństwo zaobserwowania odpowiedzi sieci na stymulację, gdzie odpowiedź na każdy bodziec ma przypisaną maksymalną wartość 1. Rysunek 16 pokazuje prawie 50% wzrost częstotliwości skoków, jak również 30-50% wzrost niezawodności skoków dla sieci wytrenowanych w porównaniu z kontrolą w zakresie 20-50 ms po bodźcu. Wyniki te sugerują, że szkolenie zasadniczo zmieniło dynamikę sieci.

figure-results-1
Rysunek 1: Narzędzia i materiały używane do usuwania zarodków. (A) Tacka wypełniona lodem. (B) Szalki Petriego wypełnione zimnym "błotem pośniegowym" L-15. (C) Ręcznik papierowy. (D) Butelka z rozpylaczem zawierającym 70% etanolu. (E) Cienkie kleszcze (x2). (F) Małe nożyczki chirurgiczne. (G) Kleszcze do kciuków z nosem. (H) Duże nożyczki. (I) Worek na zwłoki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Narzędzia i materiały używane do ekstrakcji mózgu. (A) Taca wypełniona lodem. (B) Szalka Petriego zawierająca głowy zarodków. (C) Pokryta folią probówka wirówkowa z pożywką do przechowywania. (D) Odwrócona szklana szalka Petriego. (E) Autoklawowana bibuła filtracyjna. (F) Zlewka zawierająca 70% etanolu. (G) Pipeta z tworzywa sztucznego. (H) Nożyczki do przysłony. (I) Cienkie kleszcze. (J) Cienka dwustronna szpatułka. (K) Ręcznik papierowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Kultury optymalne kontra nieoptymalne. (A) pokazuje zdrowy dywan komórek pokrywających matryce, w przeciwieństwie do (B), w którym występuje słaba proliferacja komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki spontanicznej aktywności. (A) Reprezentatywny wykres rastrowy spontanicznej aktywności. Znaczniki wskazują potencjały czynnościowe zarejestrowane z 9 aktywnych elektrod w oknie 20 s z szybkością akwizycji 25 kHz i zakresem filtra pasmowoprzepustowego od 3 kHz do 300 Hz. (B) Reprezentatywny przefiltrowany zewnątrzkomórkowy potencjał czynnościowy z miejsca aktywnego. Rysunek zmodyfikowany na podstawie reference15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Ustawienia nagrywania. (A) Generator stymulacji. (B) Regulator temperatury. (C) Zasilanie. (D) Wzmacniacz. (E) Scena główna/przedwzmacniacz. (F) Ograniczony MEA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Schematyczne przedstawienie protokołu szkolenia elektrycznego. Rejestruj początkową linię bazową przez 5 minut i stymulację sondą przez 3 minuty. Stosuj stymulację tężcową przez 90 sekund, która nie jest rejestrowana. Zastosuj i zapisz drugą stymulację sondą przez 3 minuty i końcową linię bazową przez 5 minut. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Parametry sondowania i sygnału treningowego. (A) Stymulacja sondowania składa się z dwufazowych impulsów o napięciu ±900 mV podawanych z częstotliwością 0,5 Hz. (B) Ciągi impulsów składają się ze 100, ±900 mV dwufazowych impulsów o częstotliwości 250 Hz. (C) Sygnał treningowy składa się z 40 ciągów impulsów podawanych co 2 s. Rysunek zmodyfikowany na podstawie reference15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Reprezentacja konfiguracji w kształcie litery "L". Kwadraty reprezentują poszczególne elektrody z MEA. Niebieskie kwadraty oznaczają elektrody używane do stymulacji, podczas gdy wszystkie inne służą do nagrywania. Rysunek zmodyfikowany z odniesienia15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Odróżnianie jednostek od artefaktów szumu i stymulacji. Kilka górnych paneli (A-C) na tym rysunku pokazuje przykłady hałasu w celu wyjaśnienia, czym powinna być "jednostka". (D) Żółty przebieg jest jedyną wykrytą tutaj jednostką. (E) Zielona fala jest jedyną jednostką. (F) Przykład kanału, który został nagrany z elektrody, która była również używana do stymulacji, w przypadku gdy nie można racjonalnie wykryć żadnych jednostek ze względu na nasycenie wzmacniacza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Histogram czasu po bodźcu (PSTH). Graficzny interfejs użytkownika (patrz Tabela materiałów) wykreśla PSTH zgodnie z danymi wejściowymi użytkownika (tj. PSTH populacji, odchylona średnia PSTH lub PSTH pojedynczego kanału), co pozwala na przegląd eksperymentu stymulacji i natychmiastowe porównanie plików po i przed bodźcem. Kreśli również początkowe i końcowe PSTH; Porównuje to reakcję sieci na pierwsze 6 i ostatnie 6 bodźców. Graficzny interfejs użytkownika wykonuje kilka innych funkcji, takich jak częstotliwość skoków, interwał skoków, skoki na serię, interwał między seriami i czas trwania serii, zarówno dla plików stymulacji, jak i plików o spontanicznej aktywności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 11: Przegląd przygotowania i posiewu komórek. (A) Ciężarna mysz E17 jest poddawana eutanazji za pomocą CO2 . (B) Mysz zostaje pozbawiona głowy, a macica usunięta. (C) Zarodki są uwalniane i pozbawiane głów. (D) Z każdego zarodka pobiera się mózg i usuwa płaty czołowe. (E) Komórki są zdysocjowane. (F) Zdysocjowane komórki są zawieszone w pożywce. (G) Zawieszone ogniwa są platerowane na 60-kanałowych układach wieloelektrodowych (MEA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-12
Rysunek 12: Hodowle neuronów platerowane na matrycach mikroelektrod. Embrionalne neurony myszy są umieszczone na 60-kanałowych MEA, które pozwalają na jednoczesne rejestrowanie aktywności neuronalnej w całej sieci z każdej elektrody. (Rysunek zmodyfikowany na podstawie reference15). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-13
Rysunek 13: Program sortujący używany do sortowania przebiegów z każdego kanału. Program sortujący (patrz Tabela materiałów) ładuje plik danych i wyświetla wszystkie jednostki początkowo pozyskane dla każdego kanału. Wybiera się jedną z kilku metod przypisywania sygnałów do określonych jednostek. W tym przykładzie wybrano algorytm grupowania k-średnich i zidentyfikowano żółtą jednostkę (oznaczoną jako "jednostka a" w dolnym oknie). Inny program (patrz Tabela materiałów) jest następnie używany do eksportowania pliku .nex do pliku .mat, który jest plikiem wejściowym dla niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika (patrz Tabela materiałów i Rysunek 10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-14
Rysunek 14: Zmieniona aktywność sieci w odpowiedzi na stymulację po okresie treningu. Reprezentatywny wykres rastrowy aktywności z ośmiu elektrod. Pionowa czerwona linia wskazuje czas bodźca, a czarne znaczniki wskazują potencjały czynnościowe. W treningu wstępnym (A) następuje natychmiastowa reakcja na impuls bodźca w różnych kanałach. Po treningu (B) sieć wykazuje bardziej przedłużoną reakcję na aktywność, a także natychmiastową reakcję na stymulację15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-15
Rysunek 15: Wytrenowane sieci mają znacząco zmienione częstotliwości skoków. Częstotliwość skoków sieci dla sieci kontrolnych oblicza się poprzez całkowanie liczby skoków w ciągu 50 ms bezpośrednio po każdej stymulacji i dzielenie przez ten okres. Pokazana jest średnia z 12 trenowanych sieci i 10 sieci kontrolnych (słupki błędu wskazują błąd standardowy średniej). Gwiazdka (*) oznacza różnicę statystyczną (wartość p <0,05) między dwoma zestawami danych. Rysunek zmodyfikowany na podstawie reference15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-16
Rysunek 16: Odpowiedzi zapośredniczone przez synaptycznie są znacząco modyfikowane w sieciach wytrenowanych. (A) Niezawodność skoku, mierzona w przedziałach 10 ms i znormalizowana do sieci kontrolnych, nie wykazuje zmian w bezpośredniej aktywacji neuronów w pobliżu elektrod (0-20 ms). W związku z tym nie ma statystycznej różnicy między kontrolami a przeszkolonymi sieciami dla tych pojemników. Z drugiej strony, odpowiedzi o dłuższym opóźnieniu (30-50 ms) są zapośredniczone synaptycznie, co wskazuje, że ta metoda zapewnia bardziej szczegółowe badanie niezawodności niż w Rysunek 15, powyżej. (B) Częstość skoków populacji powtarza zachowanie niezawodności i nie wykazuje modyfikacji dla bezpośredniej aktywacji (0-20 ms), podczas gdy statystycznie istotną różnicę stwierdzono dla odpowiedzi długoterminowych (30-50 ms). To zachowanie jest zgodne z uśrednionymi wynikami na poprzednim rysunku15. Słupki błędów są błędem standardowym średniej, obliczonym dla 10 sieci sterowania i 12 sieci wytrenowanych. (*) wartość p <0,05; (**) Wartość p <0,001. Rysunek zmodyfikowany na podstawie reference15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ilość przedmiot 1 Autoklawizowana szklana butelka z odczynnikiem (o pojemności co najmniej 100 ml) 20 Sterylne probówki wirówkowe o pojemności 15 ml 1 10 ml sterylnej pipety serologicznej 4 25 ml sterylnej pipety serologicznej cyfra arabska 50 ml sterylnej pipety serologicznej 1 Stojak na probówki wirówkowe 150 ml Sterylna woda DI 5 mg tabletki powlekania Fiolka z poli-D-lizyną

Tabela 1: Przygotowanie PDL - Lista materiałów i odczynników.

Ilość przedmiot 1 50 ml sterylnych probówek wirówkowych 10 Sterylne probówki wirówkowe o pojemności 15 ml cyfra arabska 1 ml sterylnej pipety serologicznej cyfra arabska 50 ml sterylnej pipety serologicznej 1 Stojak na probówki wirówkowe 1 ml Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) 1 mg tabletki powlekania Laminina

Tabela 2: Przygotowanie lamininy - Lista materiałów i odczynników.

Ilość przedmiot 1 Autoklawizowana szklana butelka z odczynnikiem (o pojemności co najmniej 100 ml) 20 Sterylne probówki wirówkowe o pojemności 15 ml 1 10 ml sterylnej pipety serologicznej 4 25 ml sterylnej pipety serologicznej cyfra arabska 50 ml sterylnej pipety serologicznej 1 Stojak na probówki wirówkowe 150 ml Sterylna woda DI 5 mg tabletki powlekania Fiolka z poli-D-lizyną

Tabela 3: Przygotowanie nośnika do przechowywania - Lista materiałów i odczynników.

Ilość przedmiot 44 ml DMEM ze stabilizowaną formą L-glutaminy (patrz tabela materiałów) 1 ml Suplement bez surowicy do hodowli komórek nerwowych (patrz tabela materiałów) 2,5 ml Surowica konia 100 μL Kwas askorbinowy [4 mg/mL] 2,5 ml Surowica płodowa bydlęca (FBS) 0,5 ml Paciorkowiec pióra (opcjonalnie) 1 50 ml sterylnych probówek wirówkowych cyfra arabska 25 ml sterylnej pipety serologicznej cyfra arabska 10 ml sterylnej pipety serologicznej cyfra arabska 1 ml sterylnej pipety serologicznej 1 Filtr 250 ml

Tabela 4: Przygotowanie podłoża DMEM 5/5 - Lista materiałów i odczynników.

Ilość przedmiot 49 ml DMEM ze stabilizowaną formą L-glutaminy (patrz tabela materiałów) 1 ml Suplement bez surowicy do hodowli komórek nerwowych (patrz tabela materiałów) 100 μL Kwas askorbinowy [4 mg/mL] 0,5 ml Paciorkowiec pióra (opcjonalnie) 1 50 ml sterylnych probówek wirówkowych cyfra arabska 25 ml sterylnej pipety serologicznej cyfra arabska 1 ml sterylnej pipety serologicznej 1 Filtr 250 ml

Tabela 5: Przygotowanie DMEM+ Medium - Lista materiałów i odczynników.

Ilość przedmiot 1 Papaina 140 U/fiolkę 1 Dnaza 1,260 U/fiolkę 7 ml DMEM+ (schłodzony) 5 ml DMEM 5/5 (rozgrzany) 10 μL Trypan niebieski cyfra arabska Ostrza skalpela 1 Sterylna szalka Petriego 35 mm 4 Sterylne probówki wirówkowe o pojemności 15 ml cyfra arabska Sterylne probówki kriogeniczne 5 ml cyfra arabska 2 ml sterylnych probówek kriogenicznych 1 50 ml sterylnych probówek wirówkowych 1 Probówka do mikrowirówek cyfra arabska Pipeta transferowa o dużym otworze 3 Pipeta transferowa o małym otworze 5 2 ml sterylnej pipety serologicznej 5 1 ml sterylnej pipety serologicznej cyfra arabska 10 μl sterylnych końcówek do mikropipet 1 1000 μl sterylne końcówki do mikropipet 1 Chip hemocytometru

Tabela 6: Dysocjacja komórek - Lista materiałów i odczynników.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki opisane w tym protokole dostarczają początkującym wystarczających szczegółów, aby umieścić swoje własne kultury neuronalne na MEA i zarejestrować aktywność sieci. Protokół ten pomoże zapewnić, że kultury prawidłowo przylegają, tworząc warstwę dywanową komórek na układach elektrod i pozostają zdrowe i wolne od zanieczyszczeń przez wiele miesięcy.

Chociaż najlepiej jest przestrzegać wszystkich części protokołu, w trakcie procesu istnieją kroki, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku. Stosowanie techniki aseptycznej w całym procesie jest konieczne, aby zapobiec zanieczyszczeniu kultur. Nowe MEA muszą być hydrofilowe, jak opisano w protokole, w przeciwnym razie dojdzie do słabej adhezji komórek. Unikanie ostrego pipetowania i tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas dysocjacji zmniejszy liczbę uszkodzonych komórek i doprowadzi do wyższej i zdrowszej wydajności. Ważne jest również przejście z DMEM 5/5 na DMEM+ po pierwszym karmieniu. DMEM 5/5 zawiera surowicę końską, która spowoduje, że komórki glejowe zdominują hodowlę, jeśli będą stosowane w sposób ciągły i spowodują słabą aktywność neuronalną, chociaż kultury będą wyglądać na zdrowe17. Kluczowe znaczenie ma również karmienie kultur zgodnie z planem i utrzymywanie ich w odpowiednich warunkach inkubacji.

Posiewanie kultur komórkowych na MEA wiąże się z wieloma zmiennymi, które mogą prowadzić do nieoptymalnych wyników. Chociaż celem jest stworzenie idealnego "dywanu" komórek, niezastosowanie się do krytycznych kroków wymienionych powyżej spowoduje słabe dojrzewanie komórek lub zanieczyszczenie. Problemem jest również słaba adhezja komórek, która różni się od słabego dojrzewania komórek. Może to być spowodowane kilkoma czynnikami, w tym złym przygotowaniem MEA przed posiewem lub użyciem starego podłoża. Jeśli użyjesz starej pożywki zawierającej stabilizowaną formę L-glutaminy i bezsurowicowego suplementu do hodowli komórek nerwowych (patrz tabela materiałów), komórki początkowo przylegają, ale następnie odlatują po około dwóch tygodniach. Jeśli zanieczyszczenie bakteryjne jest uporczywym problemem, do pożywki można dodać antybiotyk, taki jak ampicylina lub paciorkowce. Dostępne są również fungicydy do leczenia zanieczyszczenia grzybiczego. Są to niektóre z bardziej powszechnych zmiennych, które mogą wpływać na wyniki kultur. Jest wiele innych, z którymi spotkasz się dopiero po czasie i doświadczeniu.

W porównaniu z zastosowaniem mikroelektrod szklanych, technika ta doskonale nadaje się do badania dynamiki sieci i reakcji farmakologicznych. Umożliwia wykorzystanie wielu różnych wzorców stymulacji czasoprzestrzennej i pozwala na rejestrację odpowiedzi neuronalnych z wielu obszarów jednocześnie. Poprzednie grupy wykazały interesujące wyniki przy użyciu protokołów podobnych do tych opisanych tutaj18. Ponieważ kultury utrzymują się przez tygodnie lub miesiące i te same kultury mogą być ponownie wykorzystane, technika ta pozwala również na wiele eksperymentów w czasie w tej samej sieci.

Technika ta ma jednak swoje ograniczenia. MEA są nieinwazyjne. W związku z tym mogą rejestrować tylko aktywność zewnątrzkomórkową, w przeciwieństwie do zaciskania plastrów lub rejestrowania wewnątrzkomórkowego za pomocą pipet. Co więcej, ponieważ każda elektroda w matrycy jest pokryta kilkoma komórkami, nie jest możliwe rozdzielenie aktywności pojedynczego neuronu. I odwrotnie, ponieważ są to kultury in vitro , nie mogą w pełni odtworzyć właściwości strukturalnych sieci w mózgu. Ponadto aktywność może być rejestrowana tylko przez mniej niż 30 minut na raz bez jakiegoś mechanizmu zapewniającego atmosferę CO2 dla komórek w celu utrzymania równowagi pH.

Po opanowaniu tej techniki można badać manipulacje farmakologiczne ze stymulacją elektryczną lub bez niej. Można również zaprojektować i przetestować nowe protokoły do badania uczenia się i tworzenia pamięci w sieciach neuronowych, a także protokoły dla sieci hipokampa lub rdzenia kręgowego. Protokoły stymulacji i szkolenia sieci zostały już wcześniej opublikowane, a niektóre z nich zostały następnie rozwinięte w protokoły in vivo, takie jak "selektywna adaptacja" zaproponowana przez Eytana i wsp.19. Przetestowano kilka protokołów. Przedstawiono tu jednak jedynie wyniki modyfikacji procedury leczenia tężca zaproponowanej przez Ruaro w 2005 r.14,20.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez grant Narodowej Fundacji Nauki CMMI-1300007. Chcielibyśmy podziękować poprzednim członkom laboratorium, którzy pomagali w projektowaniu tych protokołów i utrzymywaniu kultur przez ponad pięć lat na Uniwersytecie George'a Masona: dr Joseph J. Pancrazio, dr Hamid Charkhkar, dr Gretchen Knaack, dr Franz Hamilton, Michael Maquera i Robert Graham.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas askorbinowySigma AldrichA4403Make 4 mg / ml porcji
B-27Invitrogen17504-044Suplement bez surowicy do hodowli komórek nerwowych. Przygotuj 1 ml porcji i zamroź
Zlewki - szkło - 100 mlVWR13912-160
Zlewki - szkło - 500 mlVWR10754-956
Kleszczyki do kciuków z końcówkąWorld Precision Instruments500365-G
Fiolka kriogeniczna - sterylna, 2 mlFisher Scientific10-500-26
Fiolka kriogeniczna - sterylna, 5 mlFisher Scientific10-500-27
DMEM z technologią GlutamaxGibco Life10569-010Pożywka do hodowli komórkowych zawierająca stabilizowaną formę L-glutaminy
DNaseWorthington BiochemicalLK003172
EthanolFisher Scientific04-355-451
Płodowa surowica bydlęca (FBS)ATCC30-2030
Kleszczedo kciuków z cienką końcówkąWorld Precision Instruments501324-G
Pipety szklaneVWR14673-010
GlutaMAX -- I (100X)Gibco Life Technology35050-061Stabilizowana forma L-glutaminy stosowana jako suplement
Chip hemocytometruFisher Scientific22-600-101
Hibernate EB completeBrainBitsD00118Ambient CO2 nośniki pamięci komórkowej
Horse SerumAtlanta BiologicalsS12195H
LamininSigma AldrichL2020-1MG
Wzmacniacz filtrujący MCSSystem wielokanałowyFA60SBC
Matryca mikroelektrod MCSSystem wielokanałowy60MEA200/ Zasilacz 10iR-ITO
MCS SystemwielokanałowyPS20W
Dzielnik sygnału MCSSystem wielokanałowySDMEA
Generator bodźców MCSSystem wielokanałowySTG4002
Regulator temperatury MCSwielokanałowyTC02
Butelka do przechowywania nośników - szklana 500 mlVWR10754-818Probówki do mikrowirówek do autoklawu
- 0,4 mlThermo Fisher3485do autoklawu
- 2 mlThermo Fisher3434ECONOKońcówki do mikropipet do autoklawu
- 10 μ LVWR37001-166mikropipet do autoklawu
- 1 000 μ L VWR13503-464mikropipet do autoklawu
- 200 μ L VWR37001-596Autoklawowy
mikropipeter - 10 μ L Mikropipeter Thermo Fisher4641170N
- 1 000 μ L Mikropipeter Thermo Fisher4641210N
- 200 μ L Thermo Fisher4641230N
Papaina - 0,22 FiltrowanyWorthington BiochemicznyLK003178
Penicylina-Streptomycyna (Pen Strep)Thermo Fisher15070063
szalki Petriego -100 mm jednorazoweFisher Scientific08-757-100D
szalki Petriego -100 mm szkłoVWR10754-788
Petriego -35 mm Fisher Scientific08-757-100A
Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) (1x)Corning21-040-CV
System czyszczenia plazmowegoWytrawianie plazmowe, Inc.PE-50
Bromowodorek poli-D-lizyny (PDL)Sigma AldrichP6407-5MG
Polietylenowa stożkowa probówka (wirówka) -15 mlFisher Scientific05-527-90
Polipropylenowa stożkowa probówka (wirówka) -50 mlFalcon352070
Maski zabiegoweImco1530-imc
PirogronianSigma AldrichP4562-5G
Ostrza skalpela WorldPrecision Instruments  500237-G
Nożyczki - irisWorld Precision Instruments14111-G
Nożyczki - dużeWorld Precision Instruments14214
Nożyczki - małe chirurgiczneWorld Precision Instruments  501733-G
Pipeta serologiczna - sterylna, 1 mL VWR89130-892
Pipeta serologiczna - sterylna, 2 mL VWR89130-894
Pipeta serologiczna - sterylna, 25 mL VWR89130-900
Pipeta serologiczna - sterylna, 50 mL Oprogramowanie VWR89130-902
: Matlab GUIPeixoto Labnpeixoto@gmu.eduSłuży do analizy plików .mat.  Dostępne za darmo na żądanie.  Skontaktuj się z npeixoto@gmu.edu, aby poprosić o kopię.
Oprogramowanie: MCS MC_RackMultiChannel SystemN/ASłuży do akwizycji danych
Oprogramowanie: NeuroExplorerPlexon http://www.plexon.com/products/neuroexplorerSłuży do konwersji plików .nex na .mat
Oprogramowanie: Sortownik offlinePlexon http://www.plexon.com/products/offline-sorterSłuży do sortowania impulsów neuronowych i konwersji plików danych do formatu .plx, a następnie do .nex
Instrukcja oprogramowania: MCS MC_RackMultiChannel Systemhttps://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf
Instrukcja oprogramowania: NeuroExplorerPlexon 
https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf Instrukcja oprogramowania: Sortownik offlinePlexon www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf
Spatula - mała dwustronnaWorld Precision Instruments  503440
Stericup 0,22 &mikro; m filtr porowy - 250 mLPipeta transferowa MilliporeSCGVU02RE
- duży otwór Thermo Fisher335-1S
Pipeta transferowa - mały otwór Thermo Fisher242-1S
Trypan niebieskiSigma AldrichT8154-20ML
Bibuła filtracyjna WhatmanWhatman1442 150Pokrój na 8 ćwiartek ciasta i autoklaw w szklanej szalce Petriego
MCS Stacja główna/przedwzmacniacz System wielokanałowy MEA1060-INV System Probówki do mikrowirówek Końcówki do Końcówki do szalki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Charkhkar, H., Frewin, C., et al. Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing. Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).
  2. Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development. Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).
  3. Fröhlich, F., McCormick, D. A. Endogenous electric fields may guide neocortical network activity. Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).
  4. Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).
  5. Ozen, S., Sirota, A., et al. Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats. J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).
  6. Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).
  7. Shahaf, G., Marom, S. Learning in networks of cortical neurons. J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).
  8. Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
  9. Marom, S., Eytan, D. Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons. Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).
  10. Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors. Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).
  11. Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays. Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).
  12. Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. Network plasticity in cortical assemblies. Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).
  13. le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons. PloS one. 5 (1), 8871(2010).
  14. Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures. IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).
  15. Hamilton, F., Graham, R., et al. Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation. PloS one. 10 (11), 0142399(2015).
  16. Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf (2016).
  17. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells: Business Source. , MIT Press. Cambridge. (1998).
  18. Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array. J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).
  19. Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons. J. Neurosci. 23 (28), (2003).
  20. Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. Statistical properties of information processing in neuronal networks. Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neuronal Cell CulturesMicro electrode ArraysNetwork DynamicsElectrical StimulationTissue DissectionCell DissociationSpike DetectionPost stimulus HistogramBurst Duration AnalysisInter burst Interval

Powiązane artykuły