Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55732

⸱

1 czerwca 2017

 , 
1Department of Biology, Lake Forest College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca przedstawia metodę szybkiego i precyzyjnego ilościowego określenia pigmentacji brzucha Drosophila melanogaster za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Metoda ta usprawnia procedury między akwizycją fenotypu a analizą danych i obejmuje montowanie próbek, akwizycję obrazu, ekstrakcję wartości pikseli i pomiar cech.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pigmentacja jest morfologicznie prostą, ale bardzo zmienną cechą, która często ma znaczenie adaptacyjne. Służył on szeroko jako model do zrozumienia rozwoju i ewolucji fenotypów morfologicznych. Pigmentacja jamy brzusznej u Drosophila melanogaster okazała się szczególnie przydatna, umożliwiając naukowcom zidentyfikowanie loci, które leżą u podstaw między- i wewnątrzgatunkowych różnic w morfologii. Do tej pory jednak pigmentacja jamy brzusznej D. melanogaster była w dużej mierze badana jakościowo, poprzez punktację, a nie ilościowo, co ogranicza formy analizy statystycznej, które można zastosować do danych dotyczących pigmentacji. W pracy opisano nową metodologię, która pozwala na ilościowe określenie różnych aspektów wzorca pigmentacji jamy brzusznej dorosłego osobnika D. melanogaster. Protokół obejmuje montowanie próbek, przechwytywanie obrazów, ekstrakcję i analizę danych. Całe oprogramowanie używane do przechwytywania i analizy obrazów zawiera makra napisane do analizy obrazów typu open source. Zaletą tego podejścia jest możliwość precyzyjnego pomiaru cech pigmentacji przy użyciu metodologii, która jest wysoce odtwarzalna w różnych systemach obrazowania. Chociaż technika ta została wykorzystana do pomiaru zmienności wzorów pigmentacji tergalu u dorosłych osobników D. melanogaster, metodologia ta jest elastyczna i ma szerokie zastosowanie do wzorów pigmentacji u niezliczonych różnych organizmów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pigmentacja pokazuje ogromne zróżnicowanie fenotypowe między gatunkami, populacjami i osobnikami, a nawet wewnątrz osobników podczas ontogenezy1,2,3,4,5,6. Chociaż istnieje niezliczona ilość badań nad pigmentacją u wielu różnych zwierząt, pigmentacja została prawdopodobnie najlepiej zbadana u Drosophila melanogaster, gdzie wykorzystano pełną moc genetyki molekularnej do wyjaśnienia rozwojowych i fizjologicznych mechanizmów regulujących pigmentację oraz ewolucji tych mechanizmów1,6. Wiele wiadomo o genach regulujących biochemiczną syntezę pigmentów u D. melanogaster7,8 oraz genach kontrolujących czasowy i przestrzenny rozkład tej biosyntezy9,10,11,12,13. Co więcej, mapowanie genetyczne zidentyfikowało loci genetyczne leżące u podstaw wewnątrz- i międzygatunkowych różnic w pigmentacji u D. melanogaster14,15,16,17. Zbadano również związki między pigmentacją a cechami plejotropowymi, takimi jak zachowanie18,19 i immunity19,20, podobnie jak adaptacyjne znaczenie wzorców pigmentacji15,21,22. W związku z tym pigmentacja u D. melanogaster stała się potężnym, ale prostym modelem rozwoju i ewolucji złożonych fenotypów.

Pigmentacja u dorosłego D. melanogaster charakteryzuje się wyraźnymi wzorcami melanizacji na całym ciele, szczególnie na skrzydłach i grzbietowej klatce piersiowej oraz brzuchu. Najwięcej uwagi badań poświęcono jednak pigmentacji każdej płytki naskórka (tergitu) na grzbietowej części brzucha. Istnieje znaczna zmienność w tej pigmentacji (Rysunek 1A-F), zarówno ze względu na czynniki genetyczne17,23, jak i environmental24,25. Naskórek tergitu brzusznego składa się z przednich i tylnych przedziałów rozwojowych (Ryc. 1G), z których każdy można dalej podzielić w zależności od pigmentacji i ornamentacji26. Przedział przedni obejmuje sześć typów naskórka (a1-a6), a przedział tylny zawiera trzy (p1-p3) (Rysunek 1G). Spośród nich naskórek p1, p2 i a1 jest zwykle zawinięty pod tergitem w nierozciągnięte brzuchy, tak aby były ukryte. Niezawodnie widoczny naskórek charakteryzuje się pasmem ciężkiej pigmentacji, tutaj określanym jako "pasmo pigmentowe", składającym się z typów naskórka a4 (owłosione z umiarkowanym włosiem) i a5 (owłosione z dużym włosiem), przy czym tylna krawędź pasma jest intensywniej pigmentowana niż przednia krawędź (Ryc. 1G). Przed tym pasmem znajduje się obszar lekko pigmentowanej, owłosionej naskórka, która ma włosie z tyłu (a3), ale nie z przodu (a2). Różnice w pigmentacji między muszkami obserwuje się zarówno w intensywności pigmentacji, jak i w szerokości pasma pigmentowego. Ogólnie rzecz biorąc, zmienność jest największa w najbardziej tylnych segmentach (segmenty brzuszne 5, 6 i 7), a mniejsza w bardziej przednich segmentach (segmenty brzuszne 3 i 4)24. Co więcej, występuje dymorfizm płciowy w pigmentacji D. melanogaster, przy czym samce na ogół mają całkowicie pigmentowane piąte i szóste tergity brzuszne (Ryc. 4C).

W większości badań nad pigmentacją jamy brzusznej u D. melanogaster, pigmentacja była traktowana jako cecha kategoryczna lub porządkowa, a wzór mierzony jakościowo27,28,29 lub częściowo ilościowo na skali14,15,16,17,24,30,31,32,33,34,35,36,37. Metody te nieuchronnie cierpią z powodu braku precyzji, a ponieważ opierają się na subiektywnej ocenie pigmentacji, trudno jest porównać dane z różnych badań. Kilku autorów określiło ilościowo wymiary przestrzenne pigmentacji38,39, intensywność pigmentacji określonego typu naskórka23,25,39,40, czyli średnia intensywność pigmentacji na całym tergicie brzusznym41,42,43. Niemniej jednak te metody kwantyfikacji nie mierzą jednocześnie zarówno intensywności, jak i rozkładu przestrzennego pigmentacji brzucha, a zatem nie wychwytują niuansów zmian pigmentacji w tergicie brzusznym. Co więcej, kilka z tych metod kwantyfikacji38,41,42,43 wymaga sekcji i zamontowania naskórka brzusznego. Jest to zarówno czasochłonne, jak i niszczy próbkę, uniemożliwiając jej przeprowadzenie dodatkowych analiz morfologicznych. Wraz z pogłębianiem się wiedzy na temat rozwoju i ewolucji pigmentacji jamy brzusznej potrzebne będą bardziej wyrafinowane narzędzia do szybkiego i precyzyjnego pomiaru zarówno rozkładu przestrzennego, jak i intensywności pigmentacji.

Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie cyfrowej analizy obrazu do uzyskania powtarzalnego i bardziej precyzyjnego pomiaru pigmentacji brzucha u D. melanogaster. Metodologia składa się z trzech etapów. Najpierw dorosła mucha jest nieniszcząco dosiadana i wykonywane jest cyfrowe zdjęcie grzbietowego brzucha. Po drugie, za pomocą makra ImageJ, użytkownik definiuje przednio-tylny pasek pikseli, który rozciąga się od przedniej części naskórka a2 do tylnej części naskórka a5 (zielona ramka, Rysunek 1G) zarówno na trzecim, jak i czwartym segmencie brzucha. Średnia wartość piksela na całej szerokości tego paska jest następnie wyodrębniana wzdłuż jego długiej osi, generując profil, który oddaje rozkład przestrzenny i intensywność pigmentacji podczas zmiany z przedniej na tylną część tergitu. Po trzecie, skrypt R służy do matematycznego opisu profilu pigmentacji za pomocą sześciennego splajnu. Skrypt R następnie wykorzystuje splajn oraz jego pierwszą i drugą pochodną do wyodrębnienia szerokości naskórka a2-a5, szerokości pasma pigmentu oraz maksymalnego i minimalnego poziomu pigmentacji. W związku z tym metoda określa ilościowo zarówno charakterystykę przestrzenną, jak i głębokość pigmentacji jamy brzusznej.

Ta metodologia określa ilościowo pigmentację trzeciego i czwartego tergitu brzusznego, które były przedmiotem wielu poprzednich badań1,15,23,24,25,28,33,39,42, wyłącznie lub w połączeniu z bardziej tylnymi tergitami. Chociaż mniej zmienne niż piąty i szósty tergit brzuszny, trzeci i czwarty tergit nie są całkowicie pigmentowane u samców, więc protokół ten można zastosować zarówno u mężczyzn, jak i kobiet. Niemniej jednak, jak pokazano tutaj, protokół może być stosowany do pomiaru pigmentacji w piątym i szóstym tergicie brzusznym u samic. Ponadto niewielkie modyfikacje skryptów stosowanych do wyodrębnienia cech profilu pigmentacji powinny pozwolić na zastosowanie metody do ilościowego określenia zmienności pigmentacji w wielu różnych innych organizmach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Montaż próbki

UWAGA: Przechowuj martwe muchy w 70% etanolu w wodzie przed obrazowaniem.

  1. Wlać 10 ml 1,25% agaru rozpuszczonego we wrzącej wodzie na szalce Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm i pozostawić do zastygnięcia.
  2. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj pary cienkich kleszczyków, aby wykonać rowek o szerokości ~20 mm i głębokości 1 mm na powierzchni żelu. Za pomocą cienkich kleszczy osadź brzuszną stronę dorosłej muchy w rowku, tak aby grzbietowa strona muchy wystawała ponad żel.
    UWAGA: Luźność żelu pozwala na łatwą zmianę położenia bez uszkodzenia próbki. Ten sam rowek może być używany do wielu próbek, chociaż z czasem stanie się brudny, pokruszony i bezużyteczny. Użytkownik może następnie wykonać kolejny rowek w tym samym żelu. Każda płytka może być użyta do zobrazowania ~200 much.
  3. Całkowicie pokryj próbkę 70% etanolem w wodzie, aby zmniejszyć wszelkie odbicia światła od woskowego naskórka i zapobiec uszkodzeniu skrzydeł podczas manipulacji próbką.

2. Konfiguracja mikroskopu

UWAGA: Obrazy są pozyskiwane za pomocą lunety sekcyjnej, bazy światła przechodzącego, aparatu cyfrowego i źródła zimnego światła na gęsiej szyi podłączonego do komputera z uruchomionym oprogramowaniem do kontroli akwizycji obrazów. Instrukcje dotyczące oprogramowania są specyficzne dla Micro-Manager v1.4.2044, który jest oprogramowaniem typu open source, które zawiera ImageJ45.

  1. Włącz mikroskop, aparat cyfrowy, podwójne źródło zimnego światła na gęsiej szyi i komputer.
  2. Uruchom oprogramowanie do przechwytywania obrazów, aby otworzyć okno Micro-Manager i okno ImageJ. W oknie ImageJ kliknij "Obraz" > "Typ" > "8-bitowy", aby ustawić wszystkie obrazy jako 8-bitowe. Kliknij "na żywo" w oknie Micro-Manager, aby otworzyć okno "Snap/Live" pokazujące podgląd w czasie rzeczywistym z kamery.
    1. W razie potrzeby zmaksymalizuj rozmiar okna "Snap/Live". Wybierz "Skala szarości" w rozwijanym menu "Tryb wyświetlania" w zakładce "Kontrast" w oknie Micro-Manager.
  3. Włącz zimne źródło światła do maksymalnej intensywności i umieść końcówki każdej gęsiej szyi w odległości około 120 mm od stage, jedna po lewej i jedna po prawej.
    UWAGA: Użytkownicy mogą również korzystać z oświetlacza pierścieniowego, chociaż może to generować pierścień odbitego światła wokół brzucha muchy.
  4. Ręcznie ustaw powiększenie mikroskopu na 60X, tak aby pole widzenia obejmowało obszar o średnicy około 3 mm na stoliku.
  5. Umieść na stoliku mikrometr o średnicy 2 mm (w razie potrzeby zmieniając tło na białe). Patrząc na podgląd na żywo, skup się na mikrometrze stolika i dostosuj ekspozycję w oknie Micro-Manager, wprowadzając czas ekspozycji w ms w polu "Ekspozycja".
  6. Aby skalibrować przestrzennie kamerę, wybierz narzędzie "linia prosta" w oknie ImageJ i narysuj linię o długości mikrometru stolika. W oknie ImageJ kliknij "Analizuj" > "Ustaw skalę", aby otworzyć okno "Ustaw skalę", wprowadź długość mikrometru w μm w polu "Znana odległość" i wprowadź "μm" w polu "Jednostka długości".
    1. Zobacz, że okno "Ustaw skalę" wyświetla skalę w "pikselach/μm". Zanotuj skalę i kliknij "OK".
  7. W oknie "Snap/Live" kliknij "Stop", a następnie "Snap", aby przechwycić obraz mikrometru stolika.
  8. Zapisz obraz jako 8-bitowy plik TIFF w skali szarości, aby w razie potrzeby zapewnić możliwość ponownej kalibracji przestrzennej obrazów. W oknie ImageJ kliknij "Plik" > "Zapisz jako" > "Tiff..." Określ miejsce zapisania pliku w przeglądarce plików, nazwij plik i kliknij "Zapisz".
  9. Zmień scenę na czarną i umieść na niej szalkę Petriego z muchą zamontowaną w agarze (kroki 1.1-1.2).
  10. Spójrz przez mikroskop i ustaw muchę tak, aby upewnić się, że grzbietowa linia środkowa jest prosta do góry, aby jak najlepiej zobaczyć wzór pigmentacji. Poruszaj skrzydłami i przydatkami, aby upewnić się, że widok brzucha jest niezakłócony. Jeśli pigmentowany naskórek (a2-a5) nie jest widoczny, ściśnij brzuch na boki, aż stanie się (chociaż brzuch much zmagazynowanych w 70% etanolu w wodzie rozciąga się, więc zwykle nie jest to konieczne).
    UWAGA: Podczas ustawiania muchy użytkownik może być zmuszony do użycia mniejszego powiększenia (20X). Przed kontynuowaniem należy przywrócić powiększenie do 60X.
  11. Ręcznie skoncentruj się na grzbietowym odwłoku muchy. Ręcznie wyreguluj końcówki źródła światła, aby zminimalizować cienie i odbicia na grzbietowej części brzucha.
  12. Patrząc na podgląd na żywo na ekranie komputera i korzystając z histogramu wartości pikseli w zakładce "Kontrast" w oknie Micro-Manager, dostosuj ekspozycję zgodnie z opisem w kroku 2.4, aby zmaksymalizować zakres wartości pikseli obrazu podglądu.
  13. Usuń muchę i szalkę Petriego i zastąp je diodą LED (wyjście widmowe 430-660 nm) podłączoną do miernika napięcia, wyśrodkowaną w polu view w tej samej pozycji co mucha. Użyj diody LED i miernika napięcia jako światłomierza46 i zapisz napięcie generowane przez światło padające na diodę LED (~125 mV).
    UWAGA: Dioda LED i miernik napięcia służą do zapewnienia, że poziomy światła są stałe podczas wielu sesji obrazowania w ramach jednego eksperymentu.
  14. Przez cały czas trwania eksperymentu nie należy dalej zmieniać położenia ani intensywności źródła światła, powiększenia mikroskopu ani ekspozycji aparatu.

3. Obrazowanie próbek

  1. Umieścić szalkę Petriego z muchą zamontowaną w agarze (kroki 1.1-1.3) na czarnym stoliku mikroskopu. Dostosuj pozycję muchy tak, aby trzeci i czwarty segment brzucha były widoczne, a grzbietowa linia środkowa była wyprostowana do góry, jak opisano w kroku 2.9. Zanim przejdziesz dalej, upewnij się, że powiększenie wynosi 60x.
  2. Ręcznie ustaw ostrość mikroskopu tak, aby trzeci i czwarty grzbietowy tergit brzuszny były ostre. Użyj oprogramowania do przechwytywania obrazu, aby uzyskać obraz w formacie TIFF 8-bitowej skali szarości, zgodnie z opisem w kroku 2.6.
    UWAGA: Obraz można uchwycić w kolorze, a następnie przekonwertować na skalę szarości w celu analizy.
  3. Zapisz obraz jako "SESH000_sampleID.tiff", zgodnie z opisem w kroku 2.7.
    UWAGA: W tym przypadku [SESH] jest stały, [000] jest numerem sesji i jest zmienny, ale musi mieć długość trzech cyfr, a [sampleID] jest tym, czego życzy sobie użytkownik, chociaż nie może zawierać żadnych dodatkowych znaków podkreślenia (_) i musi mieć stałą długość. [sampleID] powinien zawierać szczegółowe informacje na temat czynników użytych w analizie danych dotyczących pigmentacji (np. temperatura lub pochodzenie), oddzielone charakterystycznym znakiem niealfabetycznym, takim jak łącznik (-). Dzięki temu czynniki te można łatwo przeanalizować z [sampleID] przy użyciu standardowego oprogramowania statystycznego.
  4. Usuń szalkę Petriego ze sceny i zastąp muchę następnym okazem. Powtarzaj kroki 3.1-3.3, aż wszystkie próbki zostaną zobrazowane, bez dalszej regulacji poziomów oświetlenia, powiększenia lub ekspozycji.

4. Obrazowanie w wielu sesjach

  1. Jeśli zdjęcia muszą być robione w wielu sesjach, utrzymuj intensywność światła, ekspozycję i powiększenie między sesjami. Na początku każdej sesji sprawdź kalibrację przestrzenną kamery (krok 2.4) i natężenie światła na scenie (mierzone przez miernik LED/voltage, krok 2.12).
  2. Uchwyć i zapisz obraz mikrometru stolika (kroki 2.5-2.7), aby w razie potrzeby zapewnić możliwość ponownej kalibracji przestrzennej obrazów.
  3. Użyj co najmniej 15 próbek kontrolnych i losowo zobrazuj je ponownie w każdej sesji, aby umożliwić wykrycie i wyeliminowanie efektów sesji. Upewnij się, że zduplikowane próbki kontrolne między sesjami mają ten sam [sampleID], ale inny [SESH000].
    UWAGA: Próbki kontrolne są muchami zebranymi, przechowywanymi i zamontowanymi identycznie jak próbki eksperymentalne, ale są ponownie obrazowane w trakcie sesji. Dokładna liczba próbek kontrolnych będzie zależeć od konfiguracji eksperymentalnej użytkownika. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.

5. Analiza obrazu

UWAGA: Analiza obrazu jest przeprowadzana w ImageJ45 i korzysta z makra "Measurement of Pigmentation.ijm", dostarczonego jako plik uzupełniający.

  1. Umieść wszystkie obrazy do analizy w tym samym folderze.
  2. Uruchom ImageJ i uruchom makro "Pomiar pigmentacji.ijm", klikając "Wtyczki" > "Makro" > "Uruchom", wybierając "Pomiar pigmentacji.ijm" w przeglądarce plików i klikając "otwórz".
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki znajdują się w makrze. Każdy krok jest indywidualnym poleceniem makra.
  3. Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe "Wymagane działanie" z informacją "Wybierz folder, w którym przechowywane są obrazy". Kliknij "OK" i użyj przeglądarki plików, aby wybrać folder zawierający obrazy, a następnie kliknij "wybierz".
  4. Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe "Wymagane działanie" z informacją "Wybierz folder, w którym chcesz przechowywać dane". Kliknij "OK" i użyj przeglądarki plików, aby wybrać żądany folder do zapisania profili pigmentacji. Kliknij "wybierz".
  5. Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe z pytaniem "Ile znaków znajduje się w identyfikatorze próbki?" W polu wprowadzania danych wprowadź liczbę znaków w polu [SampleID], jak określono w kroku 3.3, a następnie kliknij "OK".
  6. Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe z pytaniem "Jak szeroki jest Twój zwrot z inwestycji?" W polu wprowadzania danych wprowadź szerokość piksela paska przednio-tylnego, wzdłuż którego ma być odczytywany profil pigmentacji (zielony prostokąt, Rysunek 1G, Rysunek 2A i 2A'). Kliknij "OK; " wartość domyślna to 20 pikseli.
    UWAGA: Profil pigmentacji jest odczytywany w poprzek paska naskórka, a nie linii, aby zredukować szumy spowodowane włosami i włosiem. Szerokość tego paska będzie zależeć od rozdzielczości obrazu, ale powinna wynosić ~1/20 szerokości brzucha w pikselach.
  7. Zauważ, że makro otworzy obraz pierwszej muchy, a okno dialogowe zapyta, czy zmierzyć bieżący lot (kliknij "Tak"), przejść do następnego lotu (kliknij "Nie"), czy wyjść z makra (kliknij "Anuluj").
  8. Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe z informacją "Zdefiniuj linię środkową grzbietowego brzucha, od PRZEDNIEGO do TYLNEGO". Narzędzie "linia prosta" będzie już wybrane. Narysuj linię od przodu do tyłu, aby nakreślić linię środkową grzbietowej części brzucha. Kliknij "OK; " patrz Rysunek 2A i 2A', żółta linia.
    UWAGA: Służy do zmiany orientacji obrazu tak, aby grzbietowa linia środkowa leżała poziomo w poprzek ekranu, a przednia po lewej stronie, co ułatwia wykonywanie kolejnych kroków.
  9. Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe z informacją "Zdefiniuj TYLNĄ krawędź Tergite 4 tuż za pasmem pigmentu". Narzędzie "linia prosta" będzie już wybrane. Narysuj linię od tylnej krawędzi linii środkowej do prawej krawędzi bocznej, tak aby środek linii (oznaczonej białym kwadratem) znajdował się tuż z tyłu do tylnej krawędzi pasma pigmentowego (naskórek a5). Kliknij "OK; ". Zobacz Rysunek 2A i 2A′, magenta line.
    UWAGA: Skrypt R automatycznie wykryje tylną krawędź pasma pigmentu na podstawie profilu pigmentacji.
  10. Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe z informacją "Zdefiniuj ANTERIOR EDGE Tergite 4 na przedniej krawędzi pigmentowanego naskórka (a2)". Narzędzie "linia prosta" będzie już wybrane. Narysuj linię od przedniej krawędzi linii środkowej do prawej krawędzi bocznej, tak aby środek linii (oznaczonej białym kwadratem) znajdował się na przedniej krawędzi pigmentowanego naskórka (naskórek a2). Kliknij "OK; ". Zobacz Rysunek 2A i 2A', cyjan line.
    UWAGA: Skrypt R zdefiniuje ten punkt jako przednią krawędź pigmentowanego naskórka tergitu. Na obrazie makro pokaże obszar zainteresowania (ROI), wzdłuż którego odczytywany jest profil pigmentacji (zielony prostokąt, Rysunek 2A i 2A′, powiększony w Rysunek 2B i 2B′). Makro otworzy również drugie okno pokazujące profil pigmentacji dla ROI (Rysunek 2C i 2C′), gdzie oś x to pozycja wyrażona jako liczba pikseli od tylnej krawędzi profilu, a oś y to średnia wartość piksela w każdej pozycji.
  11. Wyświetl wykresy profilu pigmentacji, które zostaną otwarte przez makro. W razie potrzeby kliknij "Na żywo" w oknie profilu, aby dostosować położenie ROI tak, aby nie zawierało żadnych struktur (np. włosia), które miałyby wpływ na profil pigmentacji. Gdy profil będzie zadowalający, kliknij "OK".
  12. Powtórz kroki 5.8-5.11 dla Tergite 3.
    UWAGA: Następnie makro eksportuje profile pigmentacji jako dwa pliki CSV, z których każdy nosi nazwę "SESH000_samplename_TX_profile.csv", gdzie [SESH000_samplename] to nazwa obrazu, a [TX] to T3 lub T4 odpowiednio dla trzeciego i czwartego tergitu.
  13. Zwróć uwagę, że makro otwiera następny obraz. Powtarzaj kroki 5.7-5.13, aż wszystkie obrazy zostaną przeanalizowane.

6. Wstępne przetwarzanie, analiza i korekta sesji danych

UWAGA: Wszystkie analizy danych są przeprowadzane w R47 i korzystają z dostarczonego skryptu "Analysis of Pigmentation.R". Poniżej "L..." wskazuje, które wiersze skryptu mają być uruchamiane dla każdej części analizy. Zapoznaj się z informacjami uzupełniającymi, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat sposobu przeprowadzania analizy.

  1. Edytuj skrypt języka R, aby ustawić katalog roboczy (L6) i zdefiniować ścieżkę pliku do folderu zawierającego profile the.csv (L11).
  2. Uruchom L13-15, aby wygenerować listę profili pigmentacji przechowywanych w folderze profili.
  3. Załaduj i uruchom funkcje "reader" i "addPrimaryKey" (L17-41), aby odczytać profile do jednej ramki danych.
  4. Edytuj skrypt w L43, aby określić kalibrację przestrzenną obrazów w μm/pikselach, jak określono w kroku 2.5.
  5. Załaduj i uruchom funkcję "regulacje" (L46-58), aby przekonwertować pozycję profilu (oś x, Rysunek 2C i 2C′) z pikseli z-tylnej-krawędzi-ROI na μm od-przedniej-krawędzi ROI i wartość profilu (oś y, Rysunek 2C i 2C′) z wartości piksela (0 =, 255 = biały) na wartość pigmentacji (0 = brak pigmentu, 255 = maksymalna ilość pigmentu).
  6. Załaduj i uruchom funkcję "spline.der.er" (L60-71), aby wygenerować sześcienny splajn profili pigmentacji oraz jego pierwszej i drugiej pochodnej (Rysunek 2D-2F i 2D′-2F′).
  7. Załaduj i uruchom funkcje "coord" i "assmbly.coord" (L74-163), najpierw, aby wyodrębnić pozycję tylnej (T3) i przedniej (T2) krawędzi pasma pigmentu (Rysunek 2D i 2D′) oraz tylną krawędź naskórka a2 (T1, Rysunek 2D i 2D′), a następnie wyodrębnij maksimum (Pmax) i minimum (Pmin) wartości pigmentacji, przyjęte odpowiednio dla T3 i T1.
    UWAGA: Przednia krawędź naskórka a2 została już zdefiniowana w kroku 5.9.
  8. Opcjonalnie: Załaduj i uruchom funkcję "chek" (L165-175), aby sprawdzić, czy funkcja "koordynacja" prawidłowo identyfikuje pozycje T1-3 dla losowo wybranego profilu pigmentacji.
  9. Załaduj i uruchom funkcje indeksu i metryk (L178-193), aby wygenerować tabelę danych z nagłówkami "Sesja", "Próbka", "Tergite", "id" (konkatenacja Sample i Tergite), "Pmax", "Pmin", "Wband" (szerokość pasma pigmentu, = T3 - T2) i "Wtergite" (szerokość pigmentowanych skórek a2-a5, = T3).
  10. Załaduj i uruchom funkcję "korekcji" (L196-234), aby wygenerować tabelę danych, która koryguje Pmax i Pmin o wszelkie uciążliwe czynniki powstające w wyniku efektów sesji. Użyj średniego wzrostu (lub spadku) P, max lub Pmin z próbek kontrolnych ponownie zobrazowanych w czasowo sąsiadujących sesjach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został wykorzystany do zbadania wpływu temperatury hodowli na pigmentację brzucha. Wcześniejsze badania wykazały, że wzrost temperatury rozwojowej powoduje zmniejszenie rozprzestrzeniania się pigmentacji jamy brzusznej u kilku gatunków Drosophila, w tym D. melanogaster30,32. W szczególności w tergitach brzusznych 3 i 4 zakres pigmentacji (szerokość pasma pigmentu) zmniejsza się z 17 °C do 25 °C i pozosta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologia ta pozwala na precyzyjne, szybkie i powtarzalne pozyskiwanie danych dotyczących pigmentacji w formie ilościowej odpowiedniej do wielu dalszych analiz. Metodę wykorzystano do pozyskania danych na temat wpływu temperatury na pigmentację jamy brzusznej w izogenicznej linii much. Jednak metodologia ta może być wykorzystana w badaniach genetyki przyszłościowej w celu identyfikacji genów, które leżą u podstaw różnic pigmentacyjnych między osobnikami, populacjami lub gatunkami, lub w badaniach genetyki odwrotnej w c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez National Science Foundation przyznaje IOS-1256565 i IOS-1557638 AWS. Dziękujemy Patricii Wittkopp i trzem anonimowym recenzentom za ich pomocne komentarze do wcześniejszej wersji tego artykułu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dumont #5 Szczypce biologiczneFST11252-30
AgarSigma-Aldrich5040
Luneta sekcyjnaLeicaMZ16FA
PodstawaLeicaMDG41
AparatLeicaDFC280
Gęsia szyja Źródło zimnego światłaSchottACE 1
Obraz Oprogramowanie do kontroli akwizycjiMicro-Manager v1.3.20https://micro-manager.org/
Oprogramowanie do analizy obrazuImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
Oprogramowanie do analizy danychR 3.3.2https://www.r-project.org/
LEDMultimetr Thor LabsLEDWE-15
Fluke Fluke75 Series II
Szalka Petriego 60 mm x 15 mmCelltreat Scientific Products229663
Mikrometr stopniowyKlarman Rulings, Inc.Zobacz materiał KR-867

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526(2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163(2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63(2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30(2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181(1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179(2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10(2014).
  45. U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza obrazumontowanie preparat wilo ciowe oznaczanie pigmentacjianaliza tergit wprotok makroskopowyzanurzenie w etanoluobrazowanie w skali szaro cimikrometr przedmiotowy

Powiązane artykuły