Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych

Wewnątrzkomórkowy recykling wapnia ([Ca²⁺]_i) odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji skurczowej i rozkurczowej w kardiomiocytach¹. Jak wiemy, wywołane wapniem uwalnianie Ca²⁺ inicjuje sprzężenie wzbudzenia-skurczu, które przekształca sygnał elektryczny na skurcz. Depolaryzacja błony aktywuje sarkolemmalne kanały Ca^{2 +} typu L, które indukują uwalnianie Ca^{2 +} z SR do cytoplazmy za pośrednictwem receptorów ryanodine 2 (RyR2). Przemijające podwyższone cytoplazmatyczne Ca^{2 +} inicjuje skurcz miofibryli. Podczas rozkurczu cytoplazmatyczny Ca²⁺ jest regenerowany do SR za pomocą SR Ca²+-ATPazy 2 (SERCA2) i wypompowywany z kardiomiocytu przez wymiennik Na⁺-Ca²⁺ (NCX)². Proces ten prowadzi do recyklingu skurczowo-relaksacyjnego w kardiomiocytach.

SR serca to wewnątrzkomórkowa sieć błonowa, która otacza kurczliwą maszynerię. Służy jako rezerwuar Ca²⁺ do skurczu i ponownie wchłania wewnątrzkomórkowy Ca²⁺ podczas relaksacji. Rezerwa SR Ca²⁺ dostępna dla uderzeń jest określona dla kurczliwości serca. Tymczasem usunięcie wewnątrzkomórkowego Ca^{2 +} ma kluczowe znaczenie dla rozkurczu serca. W niektórych stanach patofizjologicznych, takich jak cukrzyca i niewydolność serca, upośledzony klirens Ca^{2 +} i obniżony magazyn Ca^{2 +} w kardiomiocytach mogą być zaangażowane w proces dysfunkcji serca^2,3,4.

Do pomiaru uwalniania SR Ca²⁺ i rozkurczowego usuwania Ca²⁺ w kardiomiocytach, istnieją dwa szeroko stosowane podejścia: integralność prądu NCX oparta na patch-clamp^5,6, oraz impuls Ca²⁺ wywołany kofeiną na podstawie obrazowania fluorescencyjnego Ca^2+7,8,9. Pierwsze podejście opiera się na fakcie, że Ca²⁺ uwalniany z SR jest w dużej mierze wypompowywany z komórki przez NCX. Podejście to jest jednak ograniczone przez wymóg zaawansowanego sprzętu i umiejętnego działania. W niniejszym badaniu opisano wygodne podejście do oceny rezerwy Ca^{2 +} SR i usuwania Ca^{2 +} w miocytach poprzez pomiar impulsu Ca^{2 +} wywołanego kofeiną w oparciu o system obrazowania fluorescencji Ca^{2 +}. Krótko mówiąc, wewnątrzkomórkowa fluorescencja Ca^{2 +} jest wskazywana przez Fura-2. Łącząc ze sobą system stymulacji i system perfuzji, przedstawiamy program do automatycznego przełączania systemu perfuzji i stymulacji. 10 mM kofeiny zastosowano w celu szybkiego wywołania całkowitego uwalniania Ca^{2 +} w SR. Wykładnicze stałe czasu rozpadu (Tau) stanów przejściowych wapnia i impulsów wapnia wywołanych kofeiną uzyskano z dopasowania krzywej monowykładniczej, które odzwierciedlają udział SERCA i NCX w rozkurczowym usuwaniu Ca²⁺.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Eksperymentalnym Centrum Badawczym, Chińskiej Akademii Chińskich Nauk Medycznych i Uniwersytecie Zhejiang.

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotować wszystkie roztwory zgodnie z opisem w Tabeli 1.

2. Izolacja kardiomiocytów lewej komory (LV)

UWAGA: Kardiomiocyty LV są izolowane enzymatycznie za pomocą systemu perfuzji Langendroffa, jak opisano wcześniej7^,8,9,10,11.

1. Skonfiguruj system perfuzyjny Langendroffa. Napełnij system perfuzyjny roztworem Normal Tyrode (NT), ustaw temperaturę na 36,5 °C i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza w probówce.
2. Zważyć i znieczulić szczura Sprague-Dawley przez dootrzewnowe wstrzyknięcie (ip) wodzianu chloralu (400 mg/kg). Potwierdź stan znieczulenia, oceniając reakcję na uszczypnięcie ogona lub palca u nogi po 5 minutach.
3. Otwórz jamę brzuszną pod wyrostkiem mieczykowatym nożyczkami chirurgicznymi, podnieś wyrostek mieczykowaty i otwórz klatkę piersiową nożyczkami. Usuń osierdzie, lekko unieś serce zakrzywionymi kleszczami, zidentyfikuj łuk aorty i odetnij serce nożyczkami od nasady aorty.
4. Przełóż serce do naczynia o średnicy 60 mm i umyj je roztworem NT. Przytrzymaj aortę za pomocą dwóch kleszczy do mikropreparacji i zamontuj ją na kaniuli perfuzyjnej Langendorffa, a następnie mocno podwiąż aortę do kaniuli za pomocą szwów chirurgicznych.
   UWAGA: Wykwalifikowany operator może zakończyć ten proces w ciągu 15 sekund.
5. Wykonaj perfuzję serca za pomocą 30 ml roztworu NT, aby przywrócić krążenie w tętnicach wieńcowych. Następnie zmień perfuzat na 30 ml roztworu tylody wolnego od Ca²⁺ (10 mM tauryny, 1 mg/ml BSA), aby zatrzymać bicie serca. Następnie zmień perfuzat na roztwór izolacyjny kolagenazy A (0,6 mg/ml) w celu trawienia enzymatycznego.
   UWAGA: Kolagenazę A należy stosować do eksperymentów na szczurach z cukrzycą lub kolagenazę II do eksperymentów bez szczurów z cukrzycą.
6. Po trawieniu przez 20-25 minut szybko zmień roztwór perfuzyjny na roztwór Tyrode wolny od Ca²⁺, aby zatrzymać dalsze trawienie. Następnie przytrzymaj serce kleszczami, odetnij je od kaniuli i umieść serce w 35-milimetrowym naczyniu zawierającym roztwór KB (patrz Tabela 1).
7. Wytnij ścianę LV nożyczkami i kleszczami. Odetnij przedsionek, prawą komorę i obszar połączenia przedsionkowo-komorowego. Pozostała tkanka to LV; przenieść go do nowej płytki o średnicy 35 mm z roztworem KB. Tkankę LV rozdrobnić na małe kawałki.
8. Delikatnie odpipetować kawałki za pomocą plastikowego zakraplacza z filtrem i ponownie zawiesić w 10 ml roztworu KB.
9. Przefiltrować komórki za pomocą filtra ze stali nierdzewnej o aperturze 150 μm i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 150 x g przez 30 s i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić miocyty w 10 ml roztworu KB, swobodnie osiąść na 6 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml roztworu KB.
   UWAGA: Wszystkie etapy wykonano w temperaturze 36 °C w roztworach zagazowanych 100%_O2.

3. Reintrodukcja wapnia

1. Po osadzeniu się przez 20 minut w roztworze KB wyrzuć supernatant i ponownie zawieś miocyty za pomocą roztworu do reintrodukcji wapnia A (0,3 mM Ca²⁺, 4,5 ml roztworu tyrodu wolnego od Ca²⁺, 1,5 ml roztworu NT) przez 10 minut.
2. Powtórzyć powyższą procedurę z roztworem B do ponownego wprowadzania wapnia (0,3 mM Ca²⁺, 3 ml roztworu tyrodu wolnego od Ca²⁺, 3 ml roztworu NT).
3. Powtórz powyższą procedurę z roztworem NT (1,2 mM Ca²⁺) w celu oczyszczenia dostępnych miocytów. Przechowuj wyizolowane miocyty LV w tym roztworze i badaj je w ciągu 4-6 godzin.

4. Konfiguracja systemu perfuzji

1. Podłącz rurkę dopływową z roztworem NT do perfuzji w komorze (Rysunek 1A).
2. W celu perfuzji igłowej docelowego miocytu podłącz wielolufową końcówkę kolektora (np. ołówek perfuzyjny, zwany dalej ołówkiem), zamocowaną w mikromanipulatorze, do systemu perfuzyjnego sterowanego zaworem. Dodaj roztwór NT i 10 mM roztworu kofeiny do każdej kolumny ołówka (Rysunek 1A).
3. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z rur, aby uniknąć zablokowania powietrza.
4. Policz liczbę kropli z mikronowej końcówki ołówka przez 10 s i ręcznie wyreguluj regulator przepływu, aby utrzymać prędkość przepływu na przybliżonym poziomie 3 kroplówki/10 s.

5. Pomiary wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ przejściowego i sarkomerowego skrócenia ^7,8,9

1. Odpipetować 10 μl zawiesiny komórek na szkiełku, policzyć liczbę komórek za pomocą licznika komórek pod mikroskopem i obliczyć gęstość. Rozcieńczyć miocyty do przybliżonego stężenia 50 000 komórek/ml.
2. Dodać bulion Fura-2 acetoksymetylowy (AM) (barwnik wrażliwy na wapń) do 1 ml zawiesiny miocytów, aby doprowadzić końcowe stężenie do 2 μM. Przechowywać w ciemności przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
3. Wirować przy 150 g przez 30 s i ponownie zawiesić kardiomiocyty roztworem NT 2 razy.
4. Wyłącz światło i utrzymuj komórki w ciemności. Umieść miocyty w komorze perfuzyjnej na 15 minut. Następnie rozpocznij perfuzję w komorze (1,5 ml/min) roztworem NT. Stymulacja miocytów polem o częstotliwości 1 Hz za pomocą stymulatora (czas trwania fali 4,0 ms, amplituda impulsu 8,0 V) przez 5 minut.
5. Wybierz miocyt o dobrym kształcie (kształt pręcika, ostra krawędź i wyraźne prążki krzyżowe) i stabilnym stymulowanym skurczu (bez spontanicznego skurczu) pod mikroskopijną soczewką obiektywu 10x. Następnie zmień powiększenie mikroskopowe na 40x i obróć orientację kamery CCD, aby utrzymać miocyt w pozycji poziomej.
6. Opraw pojedynczy miocyt, regulując adapter ramki komórkowej. Upewnij się, że tło jest czyste.
7. Wystaw miocyty na działanie światła emitowanego przez lampę ksenonową z filtrami wzbudzenia o długości fali 340 lub 380 nm i zobrazuj miocyty przez obiektyw 40x. Wykrywanie sygnału fluorescencji przy długości fali 510 nm. W międzyczasie zwróć uwagę na zmiany długości sarkomerów miocytów i jednocześnie rejestruj za pomocą modułu miękkiej krawędzi.
8. Rejestruj fluorescencję za pomocą systemu fotopowielacza fluorescencji z podwójnym wzbudzeniem. Uruchom program do nagrywania systemu obrazowania wapnia, kliknij "Plik/nowy plik", aby utworzyć nowy plik nagrania, a następnie kliknij przycisk "start", aby synchronicznie zarejestrować długość fluorescencji i sarkomeru.

6. Ocena funkcji usuwania rezerwy i rozkurczu Ca²⁺ SR Ca²+ ^7,8,9

1. Połącz port "Aux Out" w stymulatorze z portem "Analog In" w systemie sterowania zaworem (np. sterownikiem zaworu, patrz Tabela materiałów) za pomocą BNC (w celu synchronizacji sygnału TTL).
2. Zaprogramuj program do automatycznego przełączania zaworów perfuzyjnych, jak opisano wcześniej^8,9; Szczegółowe kroki obsługi są wymienione poniżej.
   1. Ustaw parametry w oprogramowaniu sterującym zaworem zgodnie z tabelą 2 i kliknij przycisk "Pobierz", aby pobrać sekwencję załadowaną w programie. Kliknij przycisk "Wyzwalacz", aby włączyć funkcję wyzwalania.
      UWAGA: System sterowania zaworem może wykonać sekwencję po otrzymaniu sygnału TTL.
   2. Ustaw stymulator w trybie sekwencyjnym i ustaw parametry zgodnie z tabelą 3.
3. Ustaw stymulator na "kroku S1", aby nadać tempo miocytom LV przy 1 Hz. Rozpocznij perfuzję igły z prędkością 1,5 ml/min z roztworem NT.
   UWAGA: Ponieważ prędkość strumienia igły jest większa niż perfuzja w komorze, załamanie światła strumienia igły różni się od załamania światła perfuzji w komorze. Różnica załamania światła wskazuje na zakres efektywnej perfuzji igły, która otacza docelowe miocyty.
4. Wybierz docelowy miocyt w widoku mikroskopowym o małej mocy (w kolejności od dołu do góry) i upewnij się, że można do niego dotrzeć za pomocą mikrokońcówki ołówka. Zmień powiększenie mikroskopu na 400x. Obróć orientację kamery CCD, aby utrzymać miocyty w pozycji poziomej. Dostosuj prostokątny otwór pod adapterem ramki komórkowej do odpowiedniego okna, które wypełnia się miocytami. Upewnij się, że tło jest minimalne; Nie pozwól, aby w tym oknie znalazły się inne miocyty lub resztki martwych komórek.
5. Dostosuj położenie ołówka zamocowanego na mikromanipulatorze i ostrożnie umieść mikrokońcówkę w odległości promienia pola widzenia od docelowego miocytu pod 400-krotnym powiększeniem mikroskopu.
6. Dostosuj zakres strumienia igły tak, aby obejmował głównie docelowy miocyt i upewnij się, że miocyt nie może zostać zmieciony przez przepływ igły.
7. Po 60 s podstawowego tempa przesuń kursor stymulatora do "kroku D2".
   UWAGA: Reszta protokołu zostanie wykonana automatycznie przez stymulator i system sterowania zaworem. W oparciu o powyższe ustawienie, protokół może być wykonywany automatycznie, jak w Rysunek 2A, podstawowa stymulacja 1 Hz z roztworem NT przez 60 s. Następnie wstrzymaj stymulację i opóźnij na 2 s, szybko przełącz się na 10 mM perfuzji kofeiny na 15 s (aby funkcjonalnie uwolnić zapas Ca²⁺ w SR), a następnie przełącz się z powrotem na roztwór NT.
8. Na końcu nagrania wykryj fluorescencję tła dla poszczególnych miocytów. Kliknij przycisk "pauza", aby wstrzymać nagrywanie pliku, przesuń widok mikroskopowy do pobliskiego pustego obszaru. Kliknij przycisk "nagraj", aby wznowić nagrywanie na sekundy i nagrać numeryczne wartości intensywności 340 i 380 nm w celu korekcji tła.
9. Otwórz okno dialogowe "Operacja/Stała" i wprowadź odpowiednio wartości w formularzu "tło"; oprogramowanie może skorygować wartości współczynnika Fura 2, odejmując tło.

7. Analiza danych ⁹

1. W celu pomiarów stanów przejściowych wapnia i skrócenia sarkomeru na podstawowym etapie stymulacji, należy uśrednić impulsy drgawkowe, a następnie przeanalizować parametry dynamiczne, takie jak stany przejściowe wapnia, stała czasowa przejściowego rozpadu wapnia (Tau-1 Hz), korzystając z oprogramowania automatycznie.
   UWAGA: Jeśli oprogramowanie nie pasuje dobrze do segmentu zaniku, wyeksportuj ślad spadku w celu ręcznego dopasowania krzywej monowykładniczej.
2. W przypadku impulsów wapniowych wywołanych kofeiną wybierz tylko impuls o stromej fali do analizy funkcji usuwania wapnia. Wyklucz komórki z zakłóceniami sygnału, nieprawidłowym impulsem lub tymi, które odpłynęły w połowie.
3. Zmierz amplitudę impulsu wapniowego wywołanego kofeiną (Ca-kofeina, wskaźnik rezerwy^{SRCa 2+}).
4. Uzyskaj stałą czasu zaniku impulsu wapnia indukowanego kofeiną (Tau-kofeina) przez dopasowanie krzywej monowykładniczej (czas trwania 10 s) ręcznie z oprogramowania (Rysunek 2C).

Tutaj ilustrujemy na przykład szczury z cukrzycą (DM) indukowane streptozotocyną (STZ) i szczury Sprague-Dawley (SD) w tym samym wieku. 8-tygodniowe samce szczurów SD (200 ± 20 g) otrzymały pojedyncze dootrzewnowe wstrzyknięcie STZ (70 mg/kg, ip) dla grupy DM lub buforu cytrynianu dla grupy kontrolnej. Tydzień po podaniu STZ szczury z poziomem glukozy we krwi > 16,7 mmol/l uznano za cukrzyca. Po 8 tygodniach miocyty lewej komórki wyizolowano enzymatycznie. Po reintrodukcji wapnia pozostaje około 70 - 80% miocytów, które pozostają w stanie przeżycia. Do rejestracji wybrano tylko miocyty o kształcie pręcika, wyraźnych prążkach i stabilnych skurczach (Figura 1B). Jak pokazano w Rysunek 1A, ustawiamy perfuzję komory i perfuzję igłową dla miocytów. Zawory perfuzyjne i system stymulacji były automatycznie przełączane przez wstępnie ustawiony program, zgodnie z opisem w Rysunek 2A. Wewnątrzkomórkową fluorescencję wapnia zarejestrowano za pomocą systemu obrazowania wapnia. Wartości podawano jako średnią ± SEM.

W porównaniu z grupą SD, grupa DM wykazała znacznie niższą amplitudę impulsu wapniowego (Ca-kofeina) wywołanego kofeiną (0,332 ± 0,008 vs. 0,276 ± 0,008, t-test: p < 0,05) oraz niższy frakcyjny uwalnianie wapnia SR (Ca-1 Hz/Ca-kofeina) (78,5 ± 1,5% vs. 72,1 ± 1,0%, test t: p < 0,05) (Rysunek 2B). Tau-1 Hz i Tau-kofeinę uzyskano z dopasowania krzywej monowykładniczej; grupa DM wykazała niezwykłe dłuższe stałe czasu rozpadu impulsu wapniowego indukowanego kofeiną (Tau-kofeina) (1,822 ± 0,07 ms vs. 2,896 ± 0,088 ms, test t, p < 0,05) oraz wyższy poziom stosunku Tau-1 Hz/Tau-kofeina (0,076 ± 0,003 vs. 0,086 ± 0,003, test t, p < 0,05) niż grupa SD (Rysunek 2D). Wyniki te wskazywały na obniżoną rezerwę Ca2 + SR i upośledzony klirens Ca2 + w kardiomiocytach cukrzycowych.

Rysunek 1. Ilustracja układu perfuzyjnego i izolowanych miocytów LV. (A) Ilustracja perfuzji komory i perfuzji ołówkowej. Strzałki wskazują kierunek przepływu roztworu NT w komorze perfuzyjnej. Ołówek zapewnia perfuzję otaczającą docelowe miocyty roztworem NT lub kofeiny. Końcówką mikronową można swobodnie manipulować nad komorą. (B) Mikroskopowy widok izolowanych miocytów LV o kształcie pręcika i wyraźnych prążkach krzyżowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Ocena rezerwy wapnia SR i funkcji usuwania wapnia. (A) Ilustracja protokołu automatycznego przełączania zaworów perfuzyjnych i systemu stymulacji. (B) Wartości statystyczne rezerwy SR Ca2+ i ułamkowego uwalniania Ca2+ SR dla drgawek stymulowanych 1 Hz w grupach DM i SD. Grupa DM wykazała znacznie zmniejszoną rezerwę SRCa 2+ i frakcyjne uwalnianie Ca2 + SR niż grupa SD. (C) Panel oprogramowania przedstawiający ręcznie monowykładniczą krzywą dopasowaną do stałej czasu zaniku impulsu wapniowego wywołanego kofeiną (Tau-kofeina). (D) Wykresy słupkowe porównujące Tau-kofeinę i Tau-1 Hz/Tau-kofeinę między grupami DM i SD. Grupa DM wykazała znacznie wyższe wartości Tau-kofeiny i Tau-1 Hz/Tau-kofeiny niż grupa SD. Wartość = średnia ± SEM, przeprowadzono test t, *p < 0,05 w porównaniu z grupą SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Rozwiązania do izolacji miocytów LV i perfuzji komórkowej.

Tabela 2. Preset parametrów w układzie sterowania zaworem (sterownik zaworu).

Tabela 3. Ustawienie parametrów w stymulatorze.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.