Artykuł metodologiczny

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

DOI:

10.3791/55812

⸱

14 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UCLA AIDS Institute, University of California at Los Angeles (UCLA), 2Department of Microbiology, Immunology, & Molecular Genetics, University of California at Los Angeles (UCLA), 3Departments of Biomathematics and Mathematics, University of California at Los Angeles (UCLA), 4Personalized Genomic Medicine Research Center, Division of Strategic Research Groups, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 5Department of Medicine, University of California at Los Angeles (UCLA), 6Department of Veterinary Biosciences, College of Veterinary Medicine, The Ohio State University (OSU)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy Integration Site (IS) są kluczowym elementem badania miejsc integracji retrowirusowej i ich znaczenia biologicznego. W ostatnich badaniach nad retrowirusową terapią genową testy IS, w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji, były wykorzystywane jako narzędzie do śledzenia komórek w celu scharakteryzowania populacji klonalnych komórek macierzystych o tej samej stabilizacji obrazu. W celu dokładnego porównania repopulacji klonów komórek macierzystych w różnych próbkach i między nimi, czułość wykrywania, odtwarzalność danych i wysoka przepustowość testu należą do najważniejszych cech testu. Ta praca zapewnia szczegółowy protokół i przepływ pracy analizy danych dla dwukierunkowej analizy IS. Test dwukierunkowy może jednocześnie sekwencjonować zarówno przed, jak i za węzłami wektor-gospodarz. W porównaniu z konwencjonalnymi jednokierunkowymi metodami sekwencjonowania IS, podejście dwukierunkowe znacznie poprawia wskaźniki wykrywania IS i charakterystykę zdarzeń integracji na obu końcach docelowego DNA. Opisany tutaj potok analizy danych dokładnie identyfikuje i zlicza identyczne sekwencje IS za pomocą wielu etapów porównania, które mapują sekwencje IS na genom referencyjny i określają błędy sekwencjonowania. Korzystając ze zoptymalizowanej procedury testowej, opublikowaliśmy niedawno szczegółowe wzorce ponownego zasiedlania tysięcy klonów hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) po przeszczepie u makaków rezusów, pokazując po raz pierwszy dokładny punkt czasowy ponownego zasiedlenia HSC i funkcjonalną heterogeniczność HSC w układzie naczelnych. Poniższy protokół opisuje krok po kroku procedurę eksperymentalną i proces analizy danych, który dokładnie identyfikuje i określa ilościowo identyczne sekwencje IS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retrowirusy wprowadzają swoje genomowe DNA do genomu gospodarza w różnych miejscach. Ta unikalna właściwość, która może przyczyniać się do rozwoju nowotworów i innych form patogenezy wirusów, ma ironiczną zaletę polegającą na tym, że wirusy te są wysoce podatne na inżynierię komórkową w terapii genowej i podstawowych badaniach biologicznych. Miejsce integracji wirusa (IS) – miejsce w genomie gospodarza, w którym integruje się obce DNA (wirus) – ma ważne implikacje dla losu zarówno zintegrowanych wirusów, jak i komórek gospodarza. Testy IS były wykorzystywane w różnych biologicznych i klinicznych warunkach badawczych do badania wyboru i patogenezy miejsca integracji retrowirusowej, rozwoju raka, biologii komórek macierzystych i biologii rozwoju1,2,3,4. Niska czułość wykrywania, słaba odtwarzalność danych i częste zanieczyszczenie krzyżowe to jedne z kluczowych czynników ograniczających zastosowanie testów IS do obecnych i planowanych badań.

Wiele technologii analizy IS zostało opracowanych. Najczęściej stosowane są testy miejsca integracji oparte na enzymach restrykcyjnych, w tym reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) za pośrednictwem łącznika (LM) 5, odwrócona klasa PCR6 i PCR7. Użycie enzymów restrykcyjnych specyficznych dla miejsca generuje jednak odchylenie podczas pobierania IS, umożliwiając odzyskanie tylko podzbioru integromów (obcego DNA zintegrowanego z genomem gospodarza) w pobliżu miejsca restrykcji4. W ostatnich latach wprowadzono również technologie testów, które w bardziej kompleksowy sposób oceniają wektorowe SI. Testy te wykorzystują różne strategie, w tym PCR8, nierestrykcyjną (nr)-LAM PCR9, trawienie za pośrednictwem enzymu restrykcyjnego typu II10, mechaniczne ścinanie11 oraz losowy PCR oparty na heksamerze (Re-free PCR)12, w celu fragmentacji genomowych DNA i amplifikacji IS. Obecne technologie charakteryzują się różnymi poziomami czułości wykrywania, pokrycia genomu, swoistości celu, wysokiej przepustowości, złożoności procedur testowych i błędów w wykrywaniu względnych częstości miejsc docelowych. Biorąc pod uwagę różną jakość istniejących testów i różnorodność celów, do których mogą być one stosowane, należy starannie dobrać optymalne podejście do testów.

Ta praca dostarcza szczegółowych procedur eksperymentalnych i przepływu pracy obliczeniowej analizy danych dla dwukierunkowego testu, który znacznie poprawia wskaźniki wykrywania i dokładność kwantyfikacji sekwencji poprzez jednoczesną analizę IS przed i za zintegrowanym docelowym DNA (zobacz Rysunek 1, aby zobaczyć schematyczny widok procedur testowych). Podejście to zapewnia również środki do scharakteryzowania procesu integracji retrowirusowej (na przykład wierności duplikacji miejsca docelowego i zmian w sekwencjach genomowych insercji przed i po niej). Inne metody dwukierunkowe zostały użyte głównie do klonowania i sekwencjonowania obu końców docelowego DNA11,13,14. Test ten jest szeroko zoptymalizowany pod kątem wysokoprzepustowej i powtarzalnej kwantyfikacji klonów znakowanych wektorami, przy użyciu dobrze znanej metody LM-PCR i mapowania analizy obliczeniowej, a także do ilościowego oznaczania zarówno przed, jak i za złączami. Dwukierunkowa analiza z użyciem enzymu TaqαI okazała się przydatna do wysokoprzepustowej klonalnej kwantyfikacji w badaniach przedklinicznych terapii genowej komórkami macierzystymi2,15. W artykule opisano zmodyfikowaną metodę wykorzystującą częstszy nóż (RsaI/CviQI - motyw: GTAC), który podwaja szanse na wykrycie integromów w porównaniu z testem opartym na TaqαI. Opisano szczegółowe procedury eksperymentalne i analizy danych, które wykorzystują enzymy motywowe GTAC do analizy IS wektorów lentiwirusowych (NL4.3 i jego pochodnych) i gamma-retrowirusowych (wektory pMX). Oligonukleotydy użyte w teście wymieniono w tabeli 1. Wewnętrzny skrypt programistyczny do analizy sekwencji IS znajduje się w dokumencie uzupełniającym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie bibliotek sekwencji połączeń w górę (po lewej) i w dół (po prawej)

  1. Przygotowanie łącznika DNA:
    1. Przygotować 10 μl roztworu DNA łącznikowego, dodając 2 μl 100 μM LINKER_A oligonukleotydów (ostatecznie: 20 μM), 2 μl 100 μM LINKER_B oligonukleotydów (ostatecznie: 20 μM), 2 μl 5 M NaCl (ostatecznie: 1M) i 4 μl wody wolnej od nukleaz do probówki PCR. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z sekwencjami konsolidatora.
    2. Inkubować roztwór DNA łącznika w temperaturze 95 °C przez 5 minut w aparacie do PCR, zatrzymać uruchomiony program i wyłączyć zasilanie urządzenia do PCR. Pozostaw roztwór łącznika w instrumencie na 30 minut, aby powoli schłodzić DNA łącznika. Roztwór DNA łącznikowego może być przechowywany w temperaturze 4 °C.
  2. Rozszerzenie podkładu biotynowego specyficzne dla LTR:
    1. Użyć spektrofotometru UV-Vis do określenia stężenia DNA i wartości 260/280 nm genomowego DNA z eksperymentów in vivo lub in vitro. Rozcieńczyć 1-2 μg próbki genomowego DNA do końcowej objętości 170 μl roztworu genomowego DNA, używając wody wolnej od nukleaz.
    2. Przygotować 200 μl reakcji PCR, mieszając po 2,5 μl z 10 μM starterów biotyny specyficznych dla HIV-1 (L-BP i R-BP w tabeli 1: łącznie 10 μl dla czterech starterów specyficznych dla lentiwirusa), 20 μL termostabilnego buforu polimerazy DNA 10X, 4 μL 10 mM dNTP (finał: 200 μM każdego dNTP), 3 μl termostabilnej polimerazy DNA o stężeniu 2,5 μl i 163 μl genomowego DNA.
      UWAGA: W przypadku wektorów gammaretrowirusowych (wektorów pMX) należy użyć po 5 μl każdego z dwóch 10 μM swoistych dla pMM STARTERÓW BIOTYNY (L-BP i R-BP: łącznie 10 μL) zamiast czterech powyższych starterów biotyny specyficznych dla HIV-1.
    3. Podzielić roztwór na cztery probówki do PCR (każda o pojemności 50 μl) i przeprowadzić pojedynczy cykl przedłużania w następujących warunkach: 94 °C przez 5 minut, 56 °C przez 3 minuty, 72 °C przez 5 minut i 4 °C podczas przechowywania.
    4. Umieść wszystkie cztery reakcje PCR w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i postępuj zgodnie z procedurą oczyszczania PCR zestawu do oczyszczania PCR. Eluować za pomocą 50 μl buforu elucyjnego (5-krotny bufor elucyjny rozcieńczony wodą znajduje się w zestawie). Natychmiast przejść do kroku 1.3.1 lub przechowywać wymyte DNA w temperaturze -20 °C.
  3. Trawienie RsaI i CviQI
    1. Przygotować 100 μl reakcji trawienia, dodając 50 μl DNA (z kroku 1.2.4), 10 μl 10x buforu A i 2 μl (20 U) enzymu RsaI. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w aparacie do PCR.
    2. Dodać 1 μl (10 j.) enzymu CviQI do reakcji i inkubować w temperaturze 25 °C przez 30 minut w przyrządzie do PCR. Natychmiast przejdź do kroku 1.4.1
  4. zakończenie:
    1. Przygotuj 4,5-μl mieszaniny zawierającej 2,5 μl dużego fragmentu polimerazy DNA I (klenow) i 2 μl 10 mM dNTP. Przenieść 1 μl mieszaniny do próbki DNA z etapu 1.3.2. Całkowita objętość wynosi 102 μl. Dobrze wymieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę w aparacie do PCR. Natychmiast przejdź do kroku 1.6.1.
  5. Przygotowanie kulek streptawidyny:
    1. Krótko zmieszać roztwór kulki streptawidyny i przenieść 50 μl do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Usunąć supernatant za pomocą podstawki magnetycznej i umyć kulki 200 μl roztworu wiążącego.
    2. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl roztworu wiążącego i umieścić probówkę z dala od stojaka magnetycznego. Natychmiast przejdź do kroku 1.6.1.
  6. Wiązanie koralików streptawidyny:
    1. Przenieść 100 μl próbki DNA (etap 1.4.1) do 100 μl roztworu ponownie zawieszonych kulek (etap 1.5.2) i ostrożnie wymieszać pipetując, aby uniknąć pienienia się roztworu. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 3 godziny na obracającym się kole lub wałku.
    2. Użyj podstawki magnetycznej, aby uchwycić koraliki i wyrzucić supernatant. Przemyć kulki dwukrotnie w 400 μl roztworu myjącego i dwukrotnie w 400 μl 1x buforu ligazy DNA T4 (rozcieńczonego z 10-krotnego roztworu przy użyciu wody wolnej od nukleaz).
    3. Ponownie zawieś kulki w 200 μl 1x buforu ligazy DNA T4 (rozcieńczonego z roztworu 10X przy użyciu wody wolnej od nukleaz) i umieść go z dala od podstawki magnetycznej. Natychmiast przejdź do kroku 1.7.1.
  7. Podwiązanie łącznika:
    1. Przygotować 400 μl roztworu reakcyjnego ligacji w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml, mieszając 0,5 μl łącznika DNA (krok 1.1.2), 10 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 20 μl buforu ligazy DNA 5X T4 (zawierającego 25% glikolu polietylenowego), 5 μl ligazy DNA T4, 164,5 μl wody wolnej od nukleaz, i 200 μl ponownie zawieszonych kulek (krok 1.6.3). Umieścić probówkę reakcyjną na obracającym się kole i inkubować w temperaturze pokojowej (22 °C) przez 3 godziny (lub 16 °C O/N).
    2. Umyj kulki dwukrotnie roztworem myjącym i dwukrotnie 1X termostabilnym buforem polimerazy DNA (rozcieńczonym z 10x roztworu przy użyciu wody wolnej od nukleaz) za pomocą podstawki magnetycznej.
    3. Ponownie zawieś kulki w 50 μl 1x termostabilnego buforu PCR polimerazy DNA i umieść go z dala od podstawki magnetycznej. Natychmiast przejść do kroku 1.8.1 lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego dnia.
  8. Wstępna amplifikacja DNA zarówno lewego, jak i prawego złącza:
    1. Przygotować 200 μl reakcji PCR, dodając 10 μL 10 μM 1L-startera, 10 μL 10 μM 1R-starter, 20 μL 10 μM startera Link1 (Tabela 1), 10 μL 10X termostabilnego buforu polimerazy DNA, 4 μL 10 mM dNTP (finalnie: 200 μM każdego dNTP), 8 μl (20 U) termostabilnej polimerazy DNA i 88 μl wody wolnej od nukleaz do ponownie zawieszonych kulek (50 μl) z kroku 1.7.3.
    2. Mieszaninę reakcyjną rozdzielić na 4 probówki do PCR (każda o pojemności 50 μl) i przeprowadzić PCR w następujących warunkach: inkubacja w temperaturze 94 °C przez 2 minuty, 25 cykli w temperaturze 94 °C przez 20 s, 56 °C przez 25 s i 72 °C przez 2 minuty, a końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut.
    3. Połącz wszystkie 4 reakcje PCR w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i postępuj zgodnie z procedurą oczyszczania PCR zestawu do oczyszczania PCR. Eluować za pomocą 50 μl buforu elucyjnego.
    4. Oznaczyć stężenie DNA i wartości 260/280 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis; DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania do następnego etapu. Wykonaj kroki 1.9.1/1.10.1 (opcjonalnie) lub bezpośrednio wykonaj kroki 1.11.1/1.12.1.
  9. Usunięcie wewnętrznego amplikonu DNA po lewej stronie (opcjonalnie):
    1. Przenieść do 100 ng produktu DNA PCR z kroku 1.8.4 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i dostosować objętość do 10 μl za pomocą wody wolnej od nukleaz.
    2. Przygotuj reakcję enzymu restrykcyjnego ukierunkowaną specjalnie na wewnętrzny amplikon DNA po lewej stronie.
      UWAGA: Warunki reakcji mogą się różnić w zależności od wyboru enzymu. Na przykład, usuwając wewnętrzne DNA po lewej stronie z wektorów lentiwirusowych na bazie NL4.3, dodaj 1 μl pvuII, 2 μl buforu B i 7 μl wody wolnej od nukleaz. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w aparacie do PCR. Natychmiast przejdź do kroku 1.11.1 lub przechowuj w temperaturze -20 °C.
  10. Usunięcie prawego wewnętrznego amplikonu DNA (opcjonalnie):
    1. Postępuj tak samo, jak w kroku 1.9.1.
    2. Przygotować reakcję enzymu restrykcyjnego ukierunkowaną specjalnie na wewnętrzny amplikon DNA po prawej stronie.
      UWAGA: Na przykład, usuwając wewnętrzne DNA po prawej stronie z wektorów lentiwirusowych na bazie NL4.3, dodaj 1 μl sfoI, 2 μl buforu B i 7 μl wody wolnej od nukleaz. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w aparacie do PCR. Natychmiast przejść do kroku 1.12.1 lub przechowywać w temperaturze -20 °C.
  11. Wzmocnienie specyficzne dla lewego złącza:
    1. Przygotować 50 μl reakcji PCR, mieszając 5 μl DNA z kroku 1.8.4 (lub z opcjonalnego kroku 1.9.2), 5 μL 10 μM startera 2L (końcowy: 1 μM), 5 μL startera 10 μM Link2 (końcowy: 1 μM), 5 μL 10x termostabilnego buforu polimerazy DNA, 1 μl 10 mM dNTP (ostatecznie: 200 μM każdego dNTP), 2 μL (5 U) termostabilnej polimerazy DNA i 27 μl wody wolnej od nukleaz.
    2. Przeprowadzić PCR w następujących warunkach: inkubacja w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, 8-15 cykli w temperaturze 94 °C przez 20 s, 56 °C przez 25 s i 72 °C przez 2 minuty, a końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut
      UWAGA: Amplifikowane DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C. *Sugerowana jest optymalizacja liczby cyklu.
    3. Postępuj zgodnie z procedurą oczyszczania PCR zestawu do oczyszczania PCR. Eluować za pomocą 50 μl buforu elucyjnego. Określ stężenie DNA i wartości 260/280 nm.
  12. Wzmocnienie specyficzne dla prawego złącza:
    1. Wszystkie procedury są identyczne jak w przypadku "wzmocnienia specyficznego dla lewego złącza" (kroki 1.11.1-1.11.3), z wyjątkiem użycia różnych starterów; w tym kroku należy użyć startera specyficznego dla prawego złącza (starter 2R, patrz Tabela 1).
  13. Test zmienności długości amplikonu PCR:
    1. Przeanalizuj zmiany długości amplikonu PCR, wykonując 2% elektroforezę w żelu agarozowym lub elektroforezę kapilarną (Rysunek 2).
      UWAGA: Jest to niezbędny krok w celu potwierdzenia zakończenia procedur testowych i dokonania przybliżonej oceny wzorców SI w oparciu o wzorce pasm PCR. Oczyszczony amplikon PCR z kroków 1.11.3 i 1.12.3 może być używany do różnych platform sekwencjonowania DNA. Postępuj zgodnie z odpowiednimi procedurami przygotowania próbki do klasycznego sekwencjonowania z zakończeniem łańcucha (Sanger) lub sekwencjonowania nowej generacji. DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C.

2. Obliczeniowa analiza sekwencji IS

  1. Przygotowanie plików danych:
    1. Przygotuj trzy pliki danych wejściowych: plik danych sekwencji w formacie fasta (Test_data.fa w danych uzupełniających), plik tsv dla motywów wyszukiwania dla sekwencji wektorowych i linkerów (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv w danych uzupełniających) oraz plik tsv dla informacji o enzymach restrykcyjnych (Enzyme.tsv w danych uzupełniających).
      UWAGA: Pliki te są wymagane do demultipleksowania, przycinania sekwencji wektorowych i linkerów oraz usuwania wewnętrznych sekwencji wektorowych (Rysunek 3A). Szczegółowe instrukcje krok po kroku dotyczące implementacji obliczeniowego przepływu pracy znajdują się w pliku README.txt w danych uzupełniających.
  2. Analiza obliczeniowa:
    1. Uruchom skrypty demultipleksowania i przycinania.
      UWAGA: Surowa sekwencja zostanie przetworzona w celu demultipleksowania i przycinania sekwencji wektora, konsolidatora i startera (patrz KROK-1 w pliku README.txt uzupełniającej).
    2. Uruchom polecenie mapowania (patrz KROK-2 w pliku README.txt), aby zmapować przetworzone sekwencje na genom referencyjny za pomocą narzędzia do wyrównywania podobnego do BLAST (BLAT; www.genome.ucsc.edu).
    3. Uruchom skrypt ilościowej analizy IS (patrz KROK-3 w pliku README.txt).
      UWAGA: Zostaną wygenerowane dwa pliki wyjściowe (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt i Final_count.txt). Więcej szczegółów na temat strategii mapowania i wyliczania sekwencji można znaleźć w pliku "README.txt w danych uzupełniających oraz w poprzednich publikacjach2,15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwukierunkowy test IS wygenerował różne rozmiary amplikonów PCR zarówno dla górnych (po lewej), jak i dalszych (prawych) węzłów wektorowych hostów (Rysunek 2). Wielkość amplikonu PCR zależy od położenia najbliższego motywu GTAC przed i za integromem. W teście uzyskano również wewnętrzne amplikony DNA PCR: sekwencje retrowirusowe w pobliżu drogi polipurynowej i miejsca wiązania starterów były jednocześnie amplifikowane odpowiednio podczas PCR lewego i prawego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test dwukierunkowy umożliwia jednoczesną analizę zarówno sekwencji połączeń DNA wektor-gospodarz przed (po lewej), jak i za (po prawej) wektora i gospodarza i jest przydatny w wielu zastosowaniach związanych z terapią genową, komórkami macierzystymi i badaniami nad rakiem. Zastosowanie enzymów z motywem GTAC (RsaI i CviQI) oraz dwukierunkowego podejścia PCR znacznie zwiększa szanse na wykrycie integromu (lub populacji klonalnej) w porównaniu z poprzednimi testami opartymi na enzymie motywu TCGA (TaqαI)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie zostało zapewnione przez National Institutes of Health Grants R00-HL116234, U19 AI117941 i R56 HL126544; National Science Foundation Grant DMS-1516675; National Research Foundation of Korea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); oraz program inicjatywy KRYBB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Termostabilna polimeraza DNAAgilent600424PicoMaxx Polymerase
Termostabilny bufor polimerazy DNAAgilent600424PicoMaxx Bufor polimerazy Mieszanina
roztworów deoksynukleotydów (dNTP)New England BiolabsN0447LdNTP mieszanina roztworów (10 mM każda)
Probówki PCRVWR International53509-304z indywidualnym Dołączone nakrętki
2 ml probówka do mikrowirówekMolecular Bioproducts3453probówki do mikrowirówek zestaw
oczyszczania PCRQiagen28106
RsaI New England BiolabsR0167Lrestrykcyjny
CviQINew England BiolabsR0639Lrestrykcyjny
Bufor ANew England BiolabsB7204SNEB CutSmart bufor
DNA Polimeraza I duży (klenow) fragment New England BiolabsM0210L
roztwór kulek streptawidynyInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
Roztwór wiążącyInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
Roztwór myjącyInvitrogen 60101Zestaw Dynabeads kilobaseBINDER
stojak magnetycznyThermoFisher12321DDynaMag™-2 Magnes
T4 Ligaza DNANew England BiolabsM0202LLigaza DNA T4
10X bufor ligazy DNAT4 New England BiolabsB0202SBufor reakcji ligazy DNA T4
5X Bufor ligazy DNA T4Invitrogen 46300-018Bufor ligazy DNA T4 z glikolem polietylenowym-8000
Spektrofotometr UV-VisFisher ScientificS06497Nanodrop 2000
pvuIInew England BiolabsR0151Lenzym restrykcyjny
sfoInowa Anglia BiolabsR0606Lrestrykcyjny
Bufor Bnew England BiolabsB7203SNEB buffer 3.1
Woda wolna od nukleazZintegrowane technologie DNA11-05-01-14
Elektroforeza kapilarnaQiagen9001941QIAxcel Elektroforeza kapilarna
Veriti 96-dołkowy szybki termocyklerThermo Fisher Scientific4375305Przyrząd do PCR
Obracające się koło (lub rolka)EppendorfM10534004Cell Culture Roller Drums
Rozmiar DNA markerQiagen929559Marker wielkości QX (100 - 2,500 pz)
Marker wielkości DNAQiagen929554Marker wielkości QX (50 - 1,500 pz)
Markery dopasowania DNAQiagen929524QX Marker wyrównania genomu
DNANiedostępneNiedostępne Próbka genomowego DNA z eksperymentów in vivo lub in vitro
do enzym enzym enzym

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
  2. Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
  3. Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
  4. Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
  5. Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
  6. Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150(1990).
  7. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
  8. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72(2011).
  9. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  10. Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
  11. Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  12. Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
  13. Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
  14. Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543(2014).
  15. Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
  16. Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234(2004).
  17. Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  18. Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284(2013).
  19. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
  22. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
  23. Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metodyka dwukierunkowej reakcji PCRanaliza miejsca integracjischemat kwantyfikacji klonalnejhematopoetyczna kom rka macierzystaz cza wektor gospodarzelektroforeza kapilarnapotok analizy danychzestaw do oczyszczania produkt w PCRwi zanie do kulek streptawidynowych

Powiązane artykuły