To badanie demonstruje technikę tworzenia minimalnie inwazyjnego i łatwego do odtworzenia modelu niedokrwienia rdzenia kręgowego u szczurów. Różne stopnie deficytu motorycznego kończyn tylnych mogą być wytwarzane przez kontrolowanie czasu zgryzu aorty.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Powtarzalny deficyt motoryczny po niedrożności aorty w szczurzym modelu niedokrwienia rdzenia kręgowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niedokrwienie rdzenia kręgowego jest śmiertelnym powikłaniem po operacji tętniaka aorty piersiowo-brzusznej. Naukowcy mogą badać strategie zapobiegania i leczenia tego powikłania za pomocą eksperymentalnych modeli niedokrwienia rdzenia kręgowego. Opisany tutaj model pokazuje różne stopnie paraplegii, które odnoszą się do długości okluzji po zamknięciu aorty piersiowej w modelu niedokrwienia rdzenia kręgowego szczura.
Cewnik z balonem o średnicy 2 stopni był wprowadzany przez tętnicę udową do zstępującej aorty piersiowej, aż końcówka cewnika została umieszczona na lewej tętnicy podobojczykowej u znieczulonych samców szczurów Sprague-Dawley. Niedokrwienie rdzenia kręgowego zostało wywołane przez napompowanie balonu cewnika. Po określonym czasie okluzji (9, 10 lub 11 minut) balon został opróżniony. Ocenę neurologiczną wykonano za pomocą wskaźnika deficytu ruchowego po 24 godzinach od zabiegu chirurgicznego, a rdzeń kręgowy pobrano do badania histopatologicznego.
Szczury, które przeszły 9-minutową niedrożność aorty, wykazały łagodne i odwracalne upośledzenie motoryczne kończyny tylnej. Szczury poddane 10-minutowej niedrożności aorty wykazywały umiarkowane, ale odwracalne upośledzenie motoryczne. Szczury poddane 11-minutowej niedrożności aorty wykazywały całkowity i trwały paraliż. Neurony ruchowe w odcinkach rdzenia kręgowego były bardziej zachowane u szczurów poddanych krótszemu czasowi niedrożności aorty.
Badacze mogą osiągnąć powtarzalny deficyt motoryczny kończyn tylnych po zamknięciu aorty piersiowej za pomocą tego modelu niedokrwienia rdzenia kręgowego.
Wprowadzenie
Paraplegia jest śmiertelnym powikłaniem operacji tętniaka aorty piersiowo-brzusznej. Wynika to z uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego rdzenia kręgowego, do którego dochodzi podczas krzyżowego zaciskania i odpinania aorty. 1 Wprowadzono kilka strategii, w tym ogólnoustrojową hipotermię i drenaż mózgowo-rdzeniowy, aby chronić rdzeń kręgowy,2,3,4 ale wielu pacjentów nadal odczuwa skutki urazu.
Wprowadzono kilka modeli niedokrwienia rdzenia kręgowego u zwierząt, aby zbadać jego patogenezę i opracować strategie ochronne przed urazem. W niniejszym badaniu przedstawiamy szczurzy model niedokrwienia rdzenia kręgowego oparty na metodzie Tairy i Marsali. 5 System krążenia rdzeniowego u szczurów jest bardzo podobny do układu naczyniowego i pobocznego rdzenia kręgowego u ludzi, chociaż istnieją pewne różnice w wielkości i lokalizacji. 6,7 Tak więc, szczur jest anatomicznie odpowiednim zwierzęciem do wykorzystania w eksperymentalnym modelu badającym patogenezę, powikłania i leczenie niedokrwienia rdzenia kręgowego. Co więcej, ten model niedokrwienia rdzenia kręgowego zapewnia niezawodną okluzję aorty przy minimalnej interwencji dzięki wykorzystaniu wewnątrznaczyniowej okluzji balonowej aorty piersiowej.
W tym badaniu wykazaliśmy, że ten szczurzy model niedokrwienia rdzenia kręgowego wywołuje powtarzalne deficyty motoryczne w kończynach tylnych, które różnią się nasileniem w zależności od czasu zamknięcia aorty.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Bundang Uniwersytetu Narodowego w Seulu. Opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia Stanów Zjednoczonych dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie chirurgiczne
- Przed zabiegiem należy przepłukać cewniki sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby zapewnić drożność.
- Połóż koc grzewczy na stole operacyjnym i przykryj stół sterylną serwetą.
- Umieść samce szczurów Sprague−Dawley (270-330 g) w akrylowym pudełku z 3,0%-4,0% izofluranu w 100% tlenu.
- Nałóż smar na oczy szczura.
- Ułóż szczura na stole operacyjnym w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na twarz z ciągłym podawaniem wziewnego izofluranu (1,0%-2,5% obj.).
- Umieść sondę doodbytniczą, aby monitorować i utrzymywać temperaturę ciała w zakresie 37,0-38,0 °C.
2. Cewnikowanie tętnicy udowej
- Delikatnie wyszoruj prawą okolicę pachwinową za pomocą Betadine i 70% etanolu.
- Wykonaj 2-centymetrowe poziome nacięcie skóry za pomocą nożyczek w prawej okolicy pachwinowej.
- Za pomocą retraktora odsłoń pole operacyjne.
- Wyciąć tętnicę udową z otaczającej żyły i nerwu. Odizoluj 1-centymetrowy odcinek tętnicy za pomocą zakrzywionych kleszczy i stępionych kleszczy.
- Używając czarnego jedwabnego szwu 4.0, umieść luźny krawat zarówno na bliższym, jak i dalszym końcu tętnicy, aby zmaksymalizować ekspozycję.
- Wykonaj nacięcie na tętnicy udowej za pomocą mikronożyczek.
- Wprowadzić cewnik z końcówką balonową 2 Fr. do tętnicy udowej za pomocą mikrokleszczy. Przymocuj cewnik do naczynia w odległości około 1 cm od główki cewnika za pomocą podwiązania bliższego, a następnie zawiąż dystalną ligaturę.
3. Cewnikowanie tętnicy szyjnej
- Wyszoruj prawą przednią część szyi za pomocą betadyny i 70% etanolu, a następnie wykonaj nacięcie skóry.
- Za pomocą retraktora odsłoń pole operacyjne. Odizoluj 1-centymetrowy odcinek tętnicy i zawiąż go luźno za pomocą jedwabnego szwu zarówno na bliższym, jak i dalszym końcu tętnicy, aby zmaksymalizować ekspozycję.
- Nakłuć tętnicę szyjną za pomocą cewnika dożylnego 24 G i przesunąć proksymalny 1 cm cewnika w kierunku serca.
- Zabezpiecz cewnik za pomocą podwiązania proksymalnej, a następnie zawiąż ligaturę dystalną.
- Za pomocą 3-drogowego kranu podłącz dystalny koniec cewnika do mikrorurki wypełnionej solą fizjologiczną i zewnętrznego zbiornika.
4. Cewnikowanie tętnicy ogonowej
- Wyszoruj brzuszną część ogona za pomocą betadyny i 70% etanolu i wykonaj 2-centymetrowe nacięcie skóry.
- Wytnij tętnicę ogonową od otaczających struktur i odizoluj 1 cm odcinek tętnicy za pomocą zakrzywionych kleszczy i kleszczy.
- Używając czarnego jedwabnego szwu 4.0, umieść luźny krawat zarówno na bliższym, jak i dalszym końcu tętnicy, aby zmaksymalizować ekspozycję.
- Nakłuć tętnicę ogonową za pomocą cewnika dożylnego 24 G i wprowadzić cewnik do tętnicy.
- Przymocuj cewnik do naczynia (około 1 cm od główki cewnika) za pomocą bliższej ligatury i zawiąż dystalną ligaturę.
- Podłącz dystalną część cewnika do urządzenia monitorującego ciśnienie tętnicze.
5. Indukcja niedokrwienia rdzenia kręgowego
- Po zakończeniu cewnikowania wsuń cewnik z 2 fr. zakończony balonem do zstępującej aorty piersiowej tak, aby końcówka cewnika dotarła do lewej tętnicy podobojczykowej.
- Włożyć na głębokość 10 cm od miejsca wkłucia.
- Wstrzyknąć 150 jednostek heparyny w stężeniu 100 jednostek/ml do cewnika tętnicy szyjnej.
- Napełnij balon cewnika 0,05 ml soli fizjologicznej.
- Jednocześnie spuść krew do zewnętrznego pojemnika na krew z tętnicy szyjnej, aby wyregulować ciśnienie w tętnicy proksymalnej do 80 mmHg.
- Podłącz system monitorowania ciśnienia tętniczego do pozostałego światła 3-kierunkowego kurka odcinającego i kontroluj ilość drenażu krwi, monitorując ciśnienie tętnicze.
- Potwierdź powodzenie niedrożności aorty przez nagłe zmniejszenie i ciągłą utratę dystalnego ciśnienia tętniczego.
- Po niedrożności aorty trwającej 9, 10 lub 11 minut opróżnij balon cewnika Fogarty'ego i ponownie wlej odsączoną krew.
6. Opieka pooperacyjna i ocena neurologiczna
- Monitorując ciśnienie tętnicze przez tętnicę ogonową, usuń cewniki z tętnic udowych i szyjnych i zamknij rany szwami jedwabnymi.
- Po potwierdzeniu, że ciśnienie tętnicze zostało przywrócone do normalnego zakresu, usuń cewnik z tętnicy ogonowej i zamknij ranę.
- Po wyzdrowieniu ze znieczulenia włóż szczura z powrotem do klatki.
- Oceń funkcję motoryczną kończyn tylnych po 24 godzinach od operacji za pomocą wskaźnika deficytu motorycznego (tab. 1). Wskaźnik deficytu motorycznego definiuje się jako sumę wyniku poruszania się i wyniku odruchu stawiania/kroku. Wskaźnik deficytu motorycznego równy 6 oznacza maksymalny deficyt.
7. Ocena histopatologiczna
- Po ocenie neurologicznej znieczulij szczury izofluranem dostarczanym w masce, uświdź je przez perfuzję przezsercową ze 100 ml heparynizowanej soli fizjologicznej w znieczuleniu i usuń rdzeń kręgowy. 8
- Odcinki sznura od poziomu kręgów lędźwiowych 3-5 zatopić w parafinie.
- Zabarwić przekroje poprzeczne hematoksyliną i eozyną (H i E).
- Obserwuj uszkodzenie neuronu ruchowego pod mikroskopem. 9
8. Analiza statystyczna
- Przeprowadzanie analiz statystycznych przy użyciu Pakietu Statystycznego dla Nauk Społecznych w wersji 20. Wskaźnik deficytu motorycznego w trzech grupach porównano za pomocą testu Kruskala-Wallisa, a następnie testu U-Manna-Whitneya. Wartość P <0,05 uznano za statystycznie istotną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W trakcie okresu niedokrwienia rdzenia kręgowego przeprowadzono zamknięcie aorty na 9 min (n=3), 10 min (n=3) lub 11 min (n=3). Wskaźnik deficytu motorycznego u szczurów przedstawiono w Tabeli 2. Szczury, u których zastosowano 9-minutowe zamknięcie aorty, wykazywały łagodne i odwracalne upośledzenie motoryczne kończyn tylnych. Szczury poddane 10-minutowemu zamknięciu aorty wykazywały umiarkowany deficyt motoryczny, lecz nie całkowity paraliż. Szczury, u których czas zamknięcia wynosił 11 min, wykazywały całkowity i trwał...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W obecnym badaniu wykazaliśmy szczurzy model niedokrwienia rdzenia kręgowego oparty na metodzie Taira i Marsali5 , który indukuje różne stopnie deficytu motorycznego kończyny tylnej w zależności od czasu zgryzu aorty.
Długość zgryzu aorty może wpływać na stopień deficytu motorycznego. Jeśli czas zgryzu aorty jest dłuższy, deficyt motoryczny staje się bardziej dotkliwy. W ten sposób naukowcy mogą osiągnąć pewien stopień deficytu motorycznego, kontrolując czas okluzji aor...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Prace te były wspierane przez grant 2012R1A1A3014010 z Narodowej Fundacji Badawczej Rządu Koreańskiego.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cewnik do embolektomii tętniczej Fogarty | Edward Life Sciences | 120602F | cewnik z końcówką balonową wprowadzany do tętnicy udowej |
| Cewnik dożylny BD Insyte-N Autoguard Shielded | BD | 381411 | Cewnik dożylny o rozmiarze 24 |
| strzykawka 50 ml | SZCZEPIONKA KOREA | KOVAX-SY-STRZYKAWKA 50 ml | Maska na twarz |
| 1 ml strzykawka | KOREA VACCINE | KOVAX-STRZYKAWKA 1ml | |
| Sonda Recal | APARAT HARVARD | 50-7221F | Sonda doodbytnicza do monitorowania temperatury |
| Mikro nożyczki sprężynowe do preparowania | Jeung do bio & Roślina co.LTD. | JD-S-10 | Nożyczki mikronożycowe |
| (ostre-ostre) | Jeung do bio & Roślina co.LTD. | S-51-12-S | Nożyce |
| Retraktor | Jeung do bio & Roślina co.LTD. | JD-S-74A | Retraktor |
| Mikro kleszcz | Jeung do bio & Roślina co.LTD. | JD-S-29 | Mikrokleszczyki |
| KLESZCZ DO KOMARÓW (zakrzywiony) | Jeung do bio & Roślina co.LTD. | S-44-CPK | Kleszcze zakrzywione |
| SZCZYPCE OPATRUNKOWEP | Jeung do bio & Roślina co.LTD. | S-37-16S | Kleszcze |
| 4/0 jedwab | Woori Medical | S431 | 4.0 jedwabny szew |
| 3-kierunkowy | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-kierunkowy zawór odcinający |
| Monitor pacjenta | PHILIPS | MP20 | Urządzenie do monitorowania ciśnienia tętniczego. |
| Koc grzewczy | Produkcja własna | Koc grzewczy | |
| Mikroprobówka i zbiornik zewnętrzny | Własna produkcja | Mikroprobówka i zbiornik zewnętrzny | |
| Heparyna | JW Heparyna farmaceutyczna | ||
| 0,9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Sól fizjologiczna | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
Bibliografia
- Greenberg, R. K., et al. Contemporary analysis of descending thoracic and thoracoabdominal aneurysm repair: a comparison of endovascular and open techniques. Circulation. 118 (8), 808-817 (2008).
- Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 59 (2), 79-90 (2011).
- Fleck, T. M., et al. Improved outcome in thoracoabdominal aortic aneurysm repair: the role of cerebrospinal fluid drainage. Neurocrit Care. 2 (1), 11-16 (2005).
- Kouchoukos, N. T., et al. Hypothermic bypass and circulatory arrest for operations on the descending thoracic and thoracoabdominal aorta. Ann Thorac Surg. 60 (1), 67-76 (1995).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Tveten, L. Spinal cord vascularity. III. The spinal cord arteries in man. Acta Radiol Diagn (Stockh). 17 (3), 257-273 (1976).
- Woollam, D. H., Millen, J. W. The arterial supply of the spinal cord and its significance. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 18 (2), 97-102 (1955).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Umehara, S., Goyagi, T., Nishikawa, T., Tobe, Y., Masaki, Y. Esmolol and landiolol, selective β1 adrenoreceptor antagonists, provide neuroprotection against spinal cord ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 110 (4), 1133-1137 (2010).
- De Ley, G., Nshimyumuremyi, J. B., Leusen, I. Hemispheric blood flow in the rat after unilateral common carotid occlusion: evolution with time. Stroke. 16 (1), 69-73 (1985).
- Coyle, P., Panzenbeck, M. J. Collateral development after carotid artery occlusion in Fischer 344 rats. Stroke. 21 (2), 316-321 (1990).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Prior, B. M., et al. Time course of changes in collateral blood flow and isolated vessel size and gene expression after femoral artery occlusion in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2434-H2447 (2004).
- Yang, H. T., Feng, Y., Allen, L. A., Protter, A., Terjung, R. L. Efficacy and specificity of bFGFincreased collateral flow in experimental peripheral arterial insufficiency. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (6), H1966-H1973 (2000).
- Kakinohana, M., Fuchigami, T., Nakamura, S., Sasara, T., Kawabata, T., Sugahara, K. Intrathecal administration of morphine, but not small dose, induced spastic paraparesis after a noninjurious interval of aortic occlusion in rats. Anesth Analg. 96 (3), 769-775 (2003).
- Horiuchi, T., et al. The effects of the delta-opioid agonist SNC80 on hind-limb motor function and neuronal injury after spinal cord ischemia in rats. Anesth Analg. 99 (1), 235-240 (2004).
- Griepp, R. B., Griepp, E. B. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. 83 (2), S865-S869 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
