Artykuł metodologiczny

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

DOI:

10.3791/55818

⸱

30 czerwca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Large Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji populacji komórek progenitorowych adipocytów (APC) z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS). Metoda ta pozwala na zwiększoną izolację APC na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspansja okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT), głównego regulatora funkcji naczyń krwionośnych poprzez sygnalizację parakrynną, jest bezpośrednio związana z rozwojem nadciśnienia podczas otyłości. Zakres przerostu i hiperplazji zależy od lokalizacji magazynu, płci i rodzaju obecnych fenotypów komórek progenitorowych adipocytów (APC). Techniki stosowane do izolacji APC i preadipocytów w ciągu ostatnich 10 lat drastycznie poprawiły dokładność, z jaką można identyfikować poszczególne komórki na podstawie określonych markerów powierzchniowych komórek. Jednak izolacja APC i adipocytów może być wyzwaniem ze względu na kruchość komórki, zwłaszcza jeśli nienaruszona komórka musi zostać zachowana do zastosowań w hodowli komórkowej.

Magnetycznie aktywowane sortowanie komórek (MCS) zapewnia metodę izolowania większej liczby żywotnych APC na jednostkę masy tkanki tłuszczowej. APC pozyskany przez MCS może być wykorzystany do protokołów in vitro w celu namnażania preadipocytów i różnicowania ich w adipocyty poprzez zastosowanie koktajli czynników wzrostu, co pozwala na analizę potencjału płodnego i adipogennego zatrzymywanego przez komórki. Eksperyment ten koncentrował się na magazynach PVAT aorty i krezki, które odgrywają kluczową rolę w rozwoju chorób sercowo-naczyniowych podczas ekspansji. Protokoły te opisują metody izolacji, rozszerzania i różnicowania zdefiniowanej populacji APC. Ten protokół MCS pozwala na zastosowanie izolacji w każdym eksperymencie, w którym potrzebne jest sortowanie komórek, przy minimalnym sprzęcie lub szkoleniu. Techniki te mogą pomóc w dalszych eksperymentach mających na celu określenie funkcjonalności określonych populacji komórek w oparciu o obecność markerów na powierzchni komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Okołonaczyniowa tkanka tłuszczowa (PVAT), ze względu na bliskie sąsiedztwo naczyń krwionośnych, jest głównym elementem sygnalizacji parakrynnej w funkcji naczyń krwionośnych1. Ekspansja tej tkanki tłuszczowej jest zależna od fenotypu obecnych komórek progenitorowych adipocytów (APC)2,3. Izolacja komórek z tkanki tłuszczowej jest trudna, ponieważ pierwotne adipocyty są kruche, wyporne i mają różną wielkość. Niektóre techniki izolacji mogą również zmieniać fenotyp i morfologię komórek poprzez zwiększenie syntezy białek zapalnych i zmniejszenie ekspresji genów adipogennych4, podkreślając znaczenie protokołu, który utrzymuje integralność komórek.

Hodowla komórek pierwotnych i specyficznych subpopulacji preadipocytów daje redukcjonistyczne podejście do wzrostu in vivo i utrzymuje równoważny skład genetyczny komórek5, chociaż czas pracy z tymi komórkami jest ograniczony ze względu na pogorszenie wraz ze starzeniem się, czyli starzenie6. Preadipocyty z różnych magazynów tkanki tłuszczowej, w tym podskórnych i omentalnych, również wykazują różnice w proliferacji7, co podkreśla znaczenie pobierania komórek z określonych miejsc anatomicznych. Komórki prekursorowe z białych magazynów tłuszczowych innych niż PVAT zostały scharakteryzowane w poprzednich badaniach7,8,9, ale mniej wiadomo o fenotypach PVAT APC.

Techniki opisane tutaj pozwalają na analizę specyficznych i zdefiniowanych populacji APC przy minimalnym wpływie na ich morfologię, żywotność oraz potencjał do proliferacji i różnicowania. Sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MCS) jest podatne na dalsze zastosowania, takie jak hodowla, ponieważ kulki rozpuszczają się bez zmiany komórki. MCS jest również ekonomiczny, a po standaryzacji stężeń przeciwciał potrzeba przeprowadzania testów cytometrii przepływowej jest minimalna. Badania in vitro z prekursorami PVAT mogą również dać wgląd w potencjał, jaki mogą mieć te pierwotne komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opisane w tym artykule są zgodne z wytycznymi ustanowionymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Michigan. Wszystkie i media należy chronić przed światłem.

1. Przygotowanie, mediów i instrumentów

  1. Przygotuj roztwór buforowany wodorowęglanem Krebsa Ringera (KRBB): 135 mM chlorku sodu, 5 mM chlorku potasu, 1 mM siarczanu magnezu, 0,4 mM dwuzasadowego fosforanu potasu, 5,5 mM glukozy, 1% antybiotyku/antybiotyku (10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny, 25 μg/ml amfoterycyny B) i 10 mM HEPES (pH = 7,4). Roztwór ten jest stabilny przez 3 tygodnie, jeśli jest przechowywany w sterylnej temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj roztwór kolagenazy typu 1: 1 mg/ml w KRBB z 4% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Roztwór ten należy przechowywać w temperaturze 37 °C i jest stabilny przez 4 godziny.
  3. Przygotuj roztwór buforowy do lizy erytrocytów: 154 mM chlorku amonu, 10 mM wodorowęglanu potasu i 0,1 mM EDTA. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
  4. Przygotuj bufor blokujący MCS: baza pożywki DMEM / F12, 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), 5% normalna surowica osła, 40 μl / ml F (ab) Fragment osła IgG przeciw szczurom. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
  5. Przygotować roztwór buforowy MCS: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH = 7,5), 0,5% BSA i 2 mM EDTA. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca. Roztwór odgazowujący poprzez podgrzanie do temperatury 37 °C w szklanym pojemniku, a następnie zastosowanie próżni przez 15 s. Pozostawić niewykorzystany bufor szczelnie zamknięty.
  6. Przygotuj podłoże podstawowe frakcji naczyniowej zrębu (SVF): Pożywka Eagles-Modified Dulbecco (DMEM): F12, 15% płodowa surowica cielęca (FCS), 1% antybiotyk/antybiotyk przeciwgrzybiczy (10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny, 25 μg/ml amfoterycyny B), 44,05 mM wodorowęglan sodu, 100 μM kwas askorbinowy, 33 μM biotyna, 17 μM pantotenian, 2 mM L-glutamina, i 20 mM HEPES. Przechowywać w sterylnej temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  7. Przygotuj pożywkę APC: Pożywkę podstawową z dodatkowymi czynnikami wzrostu, w tym naskórkowym czynnikiem wzrostu 10 ng / ml), czynnikiem hamującym białaczkę (10 ng / ml), płytkowym czynnikiem wzrostu BB (10 ng / ml) i podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (5 ng / ml). Przechowywać w sterylnej temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  8. Przygotuj pożywkę indukcyjną APC: pożywkę APC z 10% FBS, 2,5 μg/ml insuliny, 0,5 mM 2-izobutylo-1-metylolaksantyny (IBMX), 1 μM deksametazonu i 200 pM T3 (trójjodotyroninowy hormon tarczycy). Przechowywać w sterylnej temperaturze 4 °C do 2 tygodni.

2. Izolacja prekursorów adipocytów

  1. Znieczulić szczura zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Umieść szczura w pozycji leżącej grzbietowej. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez uszczypnięcie palca u nogi i utratę odruchowej reakcji na ten bolesny bodziec.
    UWAGA: W tym protokole wykorzystuje się 10-tygodniowe szczury Sprague Dawley i 70 mg/kg pentobarbitalu podawanego we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
  2. Wykonaj pionowe nacięcie linii środkowej nożyczkami wzdłuż mostka w okolicy klatki piersiowej i w okolicy krocza. Uzyskaj dostęp do jamy brzusznej i odsłoń tętnicę krezkową górną, małe naczynia oporowe krezki (mPVAT) i aortę piersiową (aPVAT).
    1. Odetnij wszystkie połączenia z krezką i aortą i usuń naczynia ze zwierzęcia. Wyizolować PVAT za pomocą mikroskopu preparacyjnego i szalki Petriego wypełnionej KRBB do oglądania naczyń i izolowania PVAT.
    2. W tym eksperymencie zbierz gonadalną (GON) tkankę tłuszczową, aby reprezentować magazyn tłuszczu niebędący PVAT. Umieść izolowane poduszeczki tłuszczowe na lodzie w KRBB z 10 mM HEPES (pH = 7,4).
    3. W kapturze bezpieczeństwa biologicznego przenieś około 50 mg tkanki do probówki o pojemności 1,7 ml z 1 ml roztworu kolagenazy typu I i zmiel nożyczkami do tkanek (kawałki 1 - 3 mm).
  3. Próbki trawić przez inkubację w temperaturze 37 °C w inkubatorze z rożnem (lub inkubatorze z wytrząsarką orbitalną) przez 1 godzinę. W okapie bezpieczeństwa biologicznego sekwencyjnie filtruj strawiony materiał przez sitka komórkowe o pojemności 100 i 40 μm do probówki o pojemności 50 ml. Odwirować powstały filtrat w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 300 × g.
    UWAGA: Wszystkie kroki w protokole od tego momentu należy wykonywać w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylność komórek.
  4. Odlać supernatant i ponownie zawiesić granulki zawierające komórki SVF w 1 ml 1X roztworu buforowego do lizy erytrocytów i przenieść do probówki do mikrofuzy o pojemności 1,7 ml. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem i wirować w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 300 x g.
  5. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić pozostały osad komórkowy w pożywce SVF Basal Media. Pobrać podpróbkę o objętości 20 μl, aby policzyć żywe komórki za pomocą roztworu błękitu trypanowego.
    UWAGA: Liczba komórek SVF, które można wyizolować, będzie się różnić w zależności od miejsca. Średnia liczba pobranych SVF na mg tkanki wynosi: aPVAT = 5,0 ±2,0x103, mPVAT = 1,04 ±0,62x104, GON = 2,4 ±1,2x105.

3. Sortowanie komórek aktywowane magnetycznie

UWAGA: Wyizoluj APC z SVF na podstawie markerów powierzchni komórek CD34 i PDGFRα, wykonując wszystkie kroki w temperaturze 4 °C.

  1. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 300 x g. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze blokującym MCS przy 1 x 106 komórek/ml i inkubować przez 20 min.
    UWAGA: Zawiesiny komórek 1 x 106 - 2 x 108 komórek/ml można skutecznie oddzielić.
  2. Inkubować komórki z 5 μl mysiego anty-CD34 sprzężonego z FITC (1 μg/1 x 106 komórek) przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Obracać komórki przez 5 minut w temperaturze 300 x g i w temperaturze 4 °C.
    1. Inkubować z 4 μl mikrogranulek anty-FITC i 96 μl buforu MCS (całkowita objętość 100 μl) przez 5 minut w temperaturze 4 °C w ciemności w celu oddzielenia komórek CD34+ i CD34-.
  3. Przymocuj separator magnetyczny do stojaka i umieść kolumnę MultiSort (MS) ze skrzydłami kolumny do przodu, w separatorze. Umieść probówkę zbiorczą o pojemności 5 ml pod kolumną MS w górnym uchwycie probówki.
  4. Przygotować kolumnę MS, przepłukując ją roztworem buforowym MCS. Nanieść 500 μl buforu MCS na wierzch kolumny i pozwolić buforowi przepłynąć. Wyrzuć ścieki i wymień rurkę zbiorczą.
  5. Załadować zawiesinę komórek znakowaną przeciwciałami na przygotowaną kolumnę MS. Zbierz przepływ zawierający nieoznakowane komórki.
  6. Przemyć kolumnę MS 500 μl odgazowanego buforu MCS 3x. Zebrać nieoznakowane komórki, które przechodzą i łączą się z przepływem z poprzedniego kroku.
  7. Wyjmij kolumnę MS z separatora magnetycznego i umieść ją na nowej probówce zbiorczej. Odpipetować 1 ml buforu MCS na kolumnę MS. Natychmiast wypłukać frakcję z magnetycznie znakowanymi komórkami, zdecydowanie, ale powoli, nakładając tłok dostarczony z kolumną, aby nie dopuścić do przedostania się nadmiaru gazu do kolumny.
    UWAGA: Numery izolowanych komórek różnią się w zależności od lokalizacji. Średnia liczba CD34+ APC wyizolowanego z populacji SVF na mg tkanki wynosi: aPVAT = 2,6 ±0,43x102, mPVAT = 9,6 ±1,4x102, GON = 1,3 ±0,22x103.
  8. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 300 × g w temperaturze 4 °C. Inkubować frakcję CD34+ zebraną w 10 μl roztworu 1:200/1 x 106 komórek anty-PDGFRα królika przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    1. Ponownie odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C. Inkubować znakowane komórki z 4 μl mikrogranulek anty-króliczych IgG i 96 μl buforu MCS, powtarzając kroki od 3.3 do 3.7 w celu wyizolowania.
      UWAGA: Numery izolowanych komórek różnią się w zależności od lokalizacji. Średnia liczba PDGFRα+ APC wyizolowanego z populacji CD34+ na mg tkanki wynosi: aPVAT = 2,4 ±0,64, mPVAT = 8,4 ±2,4, GON = 10,4 ±1,9, co stanowi 0,5 - 10% wcześniej izolowanej populacji.

4. Hodowla komórkowa i indukcja adipogenezy

  1. Hodować SVF i APC na 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych w pożywkach podstawowych z wymianą co 2 dni. Po 3 sekwencyjnych pasażach, płytka w czarnych 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych 1x102 komórki / dołek do testów proliferacji, które są oceniane po 8, 24, 48 i 96 godzinach, oraz przy 50 000 komórek / basenie na płytkach 24-dołkowych lub 10 000 komórek / dołku w 48-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych 48-dołkowych do testów adipogenezy, które są jakościowe i ilościowe.
  2. Uzupełnij podłoża podstawowe APC przez 48 godzin po konfluencji i przed indukcją białkiem morfogennym kości 4 (3,3 nmol/L), jak wskazano10 w celu różnicowania. Indukuj komórki po 48 godzinach 100% konfluencji (dzień 0) za pomocą pożywki indukcyjnej APC do inkubacji komórek.
  3. Po 48 godzinach zmień pożywkę, aby utrzymać komórki w pożywce indukcyjnej APC bez IBMX i deksametazonu, przez 14 dni ze zmianą pożywki co 48 godzin.
  4. Izolacja MCS zwalidowana przez FACS.
    1. Pobrać podpróbkę o objętości 50 μl (50 000 komórek) z magnetycznie oddzielonych komórek i przemyć roztworem FACS.
    2. Odwirować komórki i ponownie zawiesić w 100 μl roztworu 1:1,000 anty-króliczej IgG Dylight 405 w celu znakowania komórek PDGFRα+. Inkubować przez 30 minut, chroniąc przed światłem i w temperaturze 4 °C.
    3. Umyć komórki i ponownie zawiesić w 200 μl 2% roztworu formaldehydu do czasu analizy za pomocą filtrów 488 nm (FITC) i 405 nm (Dylight 405) na cytometrze przepływowym.
      UWAGA: Akumulacja lipidów przez hodowane komórki ocenia się ilościowo za pomocą lipofilowego testu fluorescencji adipogenezy w czytniku mikropłytek mierzącym fluorescencję i wykorzystującym preadipocyty jako kalibratory akumulacji lipidów. Akumulacja lipidów jest również mierzona jakościowo za pomocą barwienia barwnikiem lipidowym i obrazowania wykonanego na odwróconym mikroskopie wyposażonym w kamerę, dzięki czemu można zaobserwować procent wszystkich komórek, które zawierają lub nie zawierają lipidów. Do analizy nadaje się każdy czytnik płytek, który jest w stanie zmierzyć fluorescencję ze wzbudzeniem przy 485 nm i emisją przy 572 nm, podobnie jak każdy mikroskop z kamerą zdolną do rejestrowania obrazów cyfrowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność proliferacyjna preadipocytów i potencjał adipogenny prekursorów adipocytów to cechy, które są utrzymywane in vitro11. Proliferację in vitro wyizolowanych SVF i APC z aPVAT, mPVAT i GON samców szczurów oceniano po 8, 24, 48 i 96 godzinach od posiewu przy użyciu ilościowego testu DNA. W żadnym punkcie czasowym nie zaobserwowano różnic w tempie ekspansji SVF, z wyjątkiem APC z aPVAT, który miał mniejszą proliferację o 96 godzin w porównaniu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem niniejszego eksperymentu jest izolacja, ekspansja i indukcja adipogeniczna APC z magazynów PVAT. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji APC oparty na identyfikacji komórek wykazujących ekspresję markerów powierzchniowych CD34 i PDGFRα. Te białka powierzchniowe zostały wcześniej zidentyfikowane na APC o wysokich wskaźnikach proliferacji i potencjale do różnicowania się w białe lub brązowe adipocyty w różnych magazynach tłuszczowych14,15. Wybie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratoria Contreras i Watts oraz dr William Raphael. Eksperymenty te były wspierane przez NHLBI F31 HL128035-01 (standaryzacja protokołu trawienia tkanek), NHLBI 5R01HL117847-02 i 2P01HL070687-11A1 (zwierzęta) oraz NHLBI 5R01HL117847-02 (izolacja i hodowla komórek).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sekcja tkanek< / strong>
Naczynia preparacyjneRęcznie robione z kulturą silikonową
Szalka PetriegoPyrex7740 Szklany
elastomer silikonowyDow CorningSylgard 170Zestaw
plecionych szwów jedwabnychAparat Harvard51-7615SP104
Mikroskop stereoskopowy MZ6Leica10447254
Mikroskop Stereomaster Światłowodowe źródło światłaFisher Scientific12562-36
Vannas NożyczkiGeorge Tiemann & Co160-150
Kleszcze do odłamkówGeorge Tiemann & Co160-55
Nożyczki do tkanekGeorge Tiemann & Co105-400
KRBB Rozwiązanie
Chlorek soduSigma-Aldrich7647-14-5
Chlorek potasuSigma-Aldrich7447-40-7
Siarczan magnezuSigma-Aldrich7487-88-9
Fosforan potasu dwuzasadowySigma-Aldrich7758-114
GlukozaSigma-Aldrich50-99-7
Antybiotyk/AntybiotykCorning30-004-CI
HEPESCorning25-060-CI
silny>Trawienie tkankowe
Kolagenaza typu 1Worthington BiochemicznaLS004196
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher Scientific9048-46-8
Bufor do lizy czerwonych krwinekBioLegend4203011X Roztwór roboczy
do kąpieli wodnejThermo-Fisher Scientific2876kąpieli z wzajemnym wytrząsaniem
Thermo-Fisher Scientific1385
Inkubator z rożnaDaiggerEF4894C
100 & Mikro; m Sitko do komórekThermo-Fisher Scientific22-363-549Żółty
40 µ m Sitko do komórekThermo-Fisher Scientific22-363-547Niebieski
hemocytometrCole-ParmerUX-79001-00
Trypan BlueSigma-Aldrich93595
Cell Isolation
OctoMACS KitMiltenyi Biotech130-042-108
(DMEM):F12 MediumCorning90-090Średniobazowa
płodowa surowica bydlęca (FBS)Corning35016CVUSA Origins
Normalna surowica osłaAbCamAB7475
Anty-CD34Santa CruzSC-7324FITC-sprzężona
z anty-PDGFRαThermo-Fisher ScientificPA5-17623
Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch712-007-003
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10XCorning46-013-CM1X Roztwór roboczy
EDTAFisher Scientific15575020
Cell Culture
CO 2 Inkubator komórkowyThermo-Fisher Scientific51030285Heracell 160i 
Płytki 6-dołkoweCorning3516
Płytki 48-dołkowePłytki 96-dołkowe Corning3548poddane TC
, czarne ściankiCorning353376
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich144-55-8potraktowana TC
(FCS)Corning35011CVUSA Origins
Kwas askorbinowySigma-Aldrich50-81-7
BiotynaSigma-Aldrich58-85-5
PantotenianSigma-Aldrich137-08-6
L-GlutaminaCorning61-030
Białko morfogenne kości 4 (BMP4)Prospec BioCYT-081
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)PeproTech400-25
Czynnik hamujący białaczkęPeproTech250-02
Płytkowy czynnik wzrostu BBProspec BioCYT-740
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)PeproTech450-33
InsulinaCorning25-800-CRRoztwór ITS
IBMXSigma-Aldrich28822-58-4
DeksametazonSigma-Aldrich50-02-2
T3 (trójjodotyronina)Sigma-Aldrich6893-023
Analiza komórek
CyQUANT Test proliferacjiThermo-FisherScientific C7026
AdipoRed Odczynnik do oznaczania fluorescencjiLonzaPT-7009
Odczynnik do barwników lipidowych Red OSigma-AldrichO1391In Solution
M1000 Czytnik mikropłytekTecan
Eclipse Mikroskop odwróconyNikon
Celownik cyfrowy Celownik cyfrowy DS-QilAparat fotograficzny Nikon
< Kabina bezpieczeństwa biologicznego do poddane działaniu TC poddany działaniu TC Surowica cielęca

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
  2. Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
  3. Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
  4. Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
  5. Stacey, G. in eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
  6. Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
  7. Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
  8. Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
  9. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
  10. Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
  11. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  12. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  13. Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
  14. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
  15. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
  16. Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
  17. Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
  18. Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
  19. Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034(2015).
  20. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
  21. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  22. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  23. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki progenitorowe adipocyt wfrakcja naczyniowo stromalnaprotoko y ekspansji kom rekizolacja markerem CD34kom rki PDGFR alfa dodatnietechniki hodowli tkankowejprotoko y test w proliferacji

Powiązane artykuły