Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Testy oceniające tworzenie i rozrywanie naczyń przypominających siatkę bariery krew-mózg

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55846

⸱

20 czerwca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Illinois at Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Utrzymanie zasięgu bariery krew-mózg jest kluczowe dla homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje techniki in vitro w celu nakreślenia podstawowych i patologicznych procesów, które modulują pokrycie bariery krew-mózg

.

Streszczenie

Pokrycie bariery krew-mózg (BBB) odgrywa kluczową rolę w homeostazie ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Bariera krew-mózg jest dynamicznie utrzymywana przez astrocyty, perycyty i komórki śródbłonka mózgu (BEC). W tym miejscu szczegółowo opisujemy metody oceny pokrycia bariery krew-mózg przy użyciu pojedynczych kultur unieśmiertelnionych ludzkich BEC, pojedynczych kultur pierwotnych mysich BEC oraz humanizowanego modelu potrójnej hodowli (BEC, astrocyty i perycyty) BBB. Aby podkreślić możliwość zastosowania testów do stanów chorobowych, opisujemy wpływ oligomerycznego β amyloidu (oAβ), który jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do progresji choroby Alzheimera (AD), na pokrycie bariery krew-mózg. Ponadto wykorzystujemy naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), aby naświetlić potencjał przesiewowy leków tych technik. Nasze wyniki pokazują, że pojedyncze i potrójnie hodowane BEC tworzą struktury przypominające siatkę w warunkach podstawowych i że oAβ zakłóca tworzenie się siatki komórkowej i degeneruje wstępnie uformowane struktury siatki, ale EGF blokuje to zakłócenie. W związku z tym opisane techniki są ważne dla analizy podstawowych i istotnych dla choroby procesów, które modulują pokrycie bariery krew-mózg.

Wprowadzenie

Bariera krew-mózg (BBB) naczyń włosowatych mózgu jest największym interfejsem kontaktu krew-mózg i odgrywa kluczową rolę w homeostazie ośrodkowego układu nerwowego (OUN)1,2. Dynamiczne procesy zachodzące w BBB zapobiegają wchłanianiu niepożądanych cząsteczek z krwi, usuwają produkty przemiany materii z OUN, dostarczają niezbędne składniki odżywcze i cząsteczki sygnałowe do OUN oraz modulują zapalenie nerwów1,2,3,4,5. Uszkodzenie BBB jest powszechne podczas starzenia się i kilku zaburzeń neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD), stwardnienia rozsianego i udaru mózgu1,2,3,4,5,6. W związku z tym dysfunkcja bariery krew-mózg może odgrywać kluczową rolę w zaburzeniach neurodegeneracyjnych, w tym jako cel terapeutyczny.

Utrzymanie zasięgu naczynia jest ważne dla funkcji homeostatycznych BBB. Jednak dane in vivo i in vitro są sprzeczne co do tego, czy procesy związane z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi powodują wyższe czy niższe pokrycie BBB6,7,8,9,10,11,12,13, szczególnie w chorobie Alzheimera. W związku z tym istnieje silne uzasadnienie dla opracowania modeli in vitro wykorzystujących odpowiednie typy komórek do oceny i bardziej kompleksowego zrozumienia dynamiki pokrycia bariery krew-mózg. Naczynia włosowate mózgu składają się z astrocytów, perycytów i komórek śródbłonka mózgu (BEC)3. Wszystkie typy komórek przyczyniają się do funkcjonowania bariery krew-mózg poprzez wsparcie strukturalne i wydzielanie cząsteczek efektorowych, takich jak angiogenne czynniki wzrostu, cytokiny i chemokiny, które działają w sposób podobny do parakrynnego i autokrynnego. Jednak głównymi komórkami efektorowymi BBB są BECs3. Ogólnie rzecz biorąc, techniki hodowli komórkowych do oceny funkcji BBB to testy przepuszczalności przeprowadzane na komórkach hodowanych na wkładkach filtracyjnych lub ocena poziomów kluczowych białek BEC, zarówno po dodaniu stresorów14,15,16. Chociaż są ważne, testy te nie koncentrują się na pokryciu naczyń mózgowych.

Tutaj nasze poprzednie metody17 są szczegółowo opisane do oceny pokrycia BEC i struktur przypominających siatkę przy użyciu pojedynczych kultur unieśmiertelnionych ludzkich BEC, pojedynczych kultur pierwotnych mysich BEC oraz humanizowanego modelu potrójnej hodowli (BECs, astrocyty i perycyty) BBB. Celem było wykazanie szkodliwego wpływu oAβ, który jest uważany za ważny czynnik przyczyniający się do progresji choroby Alzheimera, na pokrycie BEC. Ochronne działanie naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) podkreśla potencjał tej techniki jako terapeutycznego narzędzia przesiewowego. Technika ta ma kilka szerokich zastosowań w badaniach podstawowych i stosowanych, w tym: 1) określenie roli określonych szlaków w angiogenezie i pokryciu naczyń, 2) ocena wpływu czynników istotnych dla choroby i starzenia się na angiogenezę i pokrycie naczyń oraz 3) identyfikacja celów farmakologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty są zgodne z protokołami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Illinois, Chicago.

1. Ogólne przygotowanie

UWAGA: Linia komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (hCMEC/D3) jest szeroko scharakteryzowaną unieśmiertelnioną ludzką linią BEC14,15,16,18,19. Hodowla komórek hCMEC/D3 na kolbach do hodowli tkankowych pokrytych kolagenem typu I (skóra cielęcej, rozcieńczenie 1:20 0,1% roztworu w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) zawierającym Ca2+ i Mg2+) w podstawowym podłożu podstawowym wzrostu śródbłonka (EBM-2) zawierającym 2-5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10% kwasu askorbinowego, 10% siarczanu gentamycyny, 25% hydrokortyzonu i 1/4 całkowitej objętości dostarczonych suplementów czynnika wzrostu na 500 ml pożywki [śródbłonek naczyniowy czynnik wzrostu (VEGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1) i ludzki podstawowy fibroblastyczny czynnik wzrostu (bFGF), patrz tabela materiałów].
UWAGA: Pożywka EBM-2 z FBS i czynnikami wzrostu jest określana jako "EBM-2 kompletna". EBM-2 bez FBS i suplementów jest określany jako "EBM-2 podstawowy". Przy pełnej konfluencji komórki hCMEC/D3 mają wymiary ~1 x 105 komórek/cm2.

  1. Pasaż komórek hCMEC/D3 w stosunku 1:5, najpierw inkubując z HBSS przez 3 minuty bez Ca2+ i Mg2+, a następnie odrywając 5 ml trypsyny/EDTA (0,25%) przez 5 minut. Zneutralizować trypsynę za pomocą EBM-2 (neutralizacja 1:1) i odwirować przy 290 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C; odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulat w EBM-2 całkowicie i ponownie płytkować w stosunku 1:5.
  2. Hodowla pierwotnych ludzkich perycytów i astrocytów zgodnie z protokołem dostawcy [Tabela materiałów]. Hodowla perycytów w pożywce podstawowej perycytów za pomocą FBS i suplementu wzrostu perycytów.
  3. Hodowla ludzkich astrocytów w pożywce astrocytów zawierającej czynniki wzrostu astrocytów. Hoduj zarówno perycyty, jak i astrocyty w kolbach do hodowli tkankowych pokrytych 3 ml poli-L-lizyny (PLL) w celu przylegania komórek i wykorzystaj komórki między pasażami 2 i 5.
  4. Poddaj eutanazji 7 myszy i usuń pnie mózgu i móżdżek za pomocą kleszczy; odłącz opony mózgowe, ostrożnie zwijając mózgi na gazie. Zmiel pozostałą tkankę mózgową na szalce Petriego w minimalnym niezbędnym podłożu (MEM) z HEPES (5 ml na mózg) za pomocą sterylnej żyletki. Wyizoluj pierwotne mysie BEC od 2-miesięcznych myszy C57BL/6J zgodnie z przywołanym protokołem20.
  5. Przenieś zmieloną tkankę mózgową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 290 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i inkubować tkankę w roztworze papainy (833,33 μl na mózg) i DNazy (41,7 μl na mózg), w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, w celu trawienia tkanki.
  6. Rozcierać homogenat sekwencyjnie przez 19 i 21 igieł, mieszać w stosunku 1:1 z 22% roztworem albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i wirować przy 1360 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Zawiesić powstały osad w 1 ml EBM-2 complete i odwirować przy 290 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić w 1 ml EBM-2 complete i umieścić komórki (1 ml / dołek) na 6-dołkowych płytkach pokrytych kolagenem (~1 mózg na studzienkę).
  8. 24 godziny później należy wymienić pożywkę na EBM-2 complete zawierającą 4 μg/ml chlorowodorku puromycyny; po 2 dniach zastąpić na EBM-2 complete. Pierwotne BEC są hodowane tak jak w przypadku komórek hCMEC / D3 i są w pełnej konfluencji przy 1 x 105 komórkach / cm2.
  9. Przygotować 100 μM oAβ na 24 godziny przed badaniem.
    UWAGA: oAβ jest uważany za postać A istotną dla choroby. W przypadku oAβ należy stosować dobrze scharakteryzowane preparaty opisane przez Dahlgrena i wsp.21.
  10. Rozmrozić roztwór podstawowy membrany podstawnej przez noc w temperaturze 4 °C i podzielić na sterylne paski probówki do PCR (8 probówek) w 140 μl membrany podstawowej na probówkę. Ponownie zamrozić każdy pasek i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić jeden pasek na 96-dołkową płytkę w temperaturze 4 °C, 24 godziny przed badaniem. Wstępnie schłodzić końcówki pipet, aby uniknąć zestalenia.
    UWAGA: Cała obsługa matrycy membrany podstawnej musi odbywać się na lodzie, aby uniknąć szybkiego krzepnięcia. Ponieważ w dniu testu stosuje się 10 μl na studzienkę membrany podstawnej, każdy pasek wystarcza na jedną płytkę 96-dołkową.
  11. Inkubować w pełni zlewające się BEC w bazie EBM-2, 24 godziny przed testem.
    UWAGA: Uzasadnienie jest następujące: EBM-2 complete zawiera suplementy czynników i FBS w celu promowania optymalnego wzrostu komórek; Jednak te same szlaki molekularne, które promują wzrost komórek, są również ważne dla pokrycia i dynamiki komórek śródbłonka mózgu, zarówno w obecności, jak i braku stresora. W związku z tym surowicy i suplementy głodzą BEC, aby zmniejszyć zakłócający efekt resztkowej aktywacji komórkowych szlaków sygnałowych. Warto zauważyć, że komórki są krótko (5 minut) wystawione na działanie FBS podczas neutralizacji komórek trypsynizowanych przed testem. W przeciwieństwie do BEC, perycyty i astrocyty nie są pozbawione surowicy, ze względu na zapotrzebowanie na różne czynniki wzrostu i względną niestabilność tych typów komórek w odpowiedzi na głód surowicy (laboratorium Tai, obserwacje niepublikowane).
    UWAGA: EBM-2 basal jest wykorzystywany podczas testu do testów tworzenia i przerywania pojedynczych i potrójnych siatek kulturowych. Ma to kluczowe znaczenie, aby zapobiec mylącemu stresorowi lub sygnalizacji zależnej od leczenia.

2. Testy tworzenia i zakłócania podobnych do siatki

  1. Testy pojedynczej hodowli BEC:
    UWAGA: Trzy różne paradygmaty dla pojedynczych kultur BEC są pokazane w Rysunek 1A. Każdy paradygmat ma na celu ocenę reakcji BEC w różnych modelach pokrycia statków. Paradygmat 1 to tworzenie siatki. Paradygmat ten ma na celu zbadanie wpływu stresorów i/lub leczenia na angiogenezę i tworzenie siatek. BECs, oAβ i zabiegi są dodawane do płytki w punkcie czasowym 0 godzin. Paradygmat 2 to zapobieganie zakłóceniom pracy siatki. Komórki są siane w obecności czynnika wzrostu lub leku i inkubowane przez 4 godziny w celu utworzenia struktur przypominających siatkę. Stresor, w tym przypadku oAβ, dodaje się po 4 godzinach. Ten paradygmat ocenia zdolność leczenia do zapobiegania uszkodzeniom wywołanym przez stresor wstępnie uformowanych struktur przypominających siatki. Paradygmat 3 to równoczesne traktowanie zakłóceń w pracy siatki. Komórki są platerowane i pozostawiane do tworzenia struktur przypominających siatkę przez 4 godziny. Zabiegi i oAβ są następnie dodawane jednocześnie w 4-godzinnym punkcie czasowym, oceniając zdolność wstępnie uformowanej sieci komórkowej do reagowania na różne zabiegi. Wszystkie paradygmaty przebiegają podobnie jak wspólne kroki, z wyjątkiem różnic w czasie dodawania leczenia.
    1. W dniu badania należy odpipetować matrycę błony podstawnej w ilości 10 μl/basenik na dno 96-dołkowych płytek i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    2. Zawiesić liofilizowany barwnik śledzący zielone krwinki (patrz tabela materiałów) w 10 μl DMSO, aby wytworzyć 10-mM roztwór podstawowy, i rozcieńczyć do 10 μM (1:1000) w EBM-2 basetal. Usunąć pożywkę z w pełni zlewającej się kolby i zastąpić ją podstawową EBM-2 zawierającą barwnik śledzący zielone krwinki (5 ml dla kolby o średnicy 75cm2). Wstępnie załaduj BEC barwnikiem śledzącym zielone krwinki, 20 minut przed rozpoczęciem testu.
    3. Inkubować komórki przez 20-30 minut w temperaturze 37 °C, usunąć pożywkę z barwnikiem śledzącym komórki i odłączyć komórki zgodnie z opisem w kroku 1.1. Zneutralizować pożywkę za pomocą EBM-2 zawierającego 10% FBS i odwirować przy 240 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 1 ml EBM-2 basetal.
    4. Umieść BEC w 96-dołkowej płytce w 10 000 komórek/dołek w podstawowej EBM-2 (punkt czasowy 0 h we wszystkich paradygmatach).
      UWAGA: W zależności od stosowanego paradygmatu, zabiegi, stresory lub kontrole pojazdu są dodawane w określonych punktach czasowych. We wszystkich paradygmatach pożywkę pobiera się do późniejszej analizy (np. analizy ELISA), a komórki utrwala się po 24 godzinach za pomocą świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu w surowicy buforowanej fosforanami (PBS). Jako alternatywne podejście do określenia wpływu czasowego oAβ na tworzenie siatki, protokół można zmodyfikować w celu wstępnej inkubacji kolb do hodowli komórek konfluentnych z oAβ, a następnie przeprowadzenia paradygmatów tworzenia siatki (+/-oAβ).
      UWAGA: Ostateczna objętość w każdym studzience dla wszystkich paradygmatów wynosi 70 μL. Wszystkie zabiegi (oAβ, EGF itp.) dodaje się do odpowiednich studzienek w rozcieńczeniu 1:20, tj. 3,5 μl na zabieg. W przypadku paradygmatu 1 komórki dodaje się do roztworu zawiesiny komórek w stężeniu 63 μl/basenik. Natychmiast dodaje się oAβ, pożądane zabiegi i kontrole w ilości 3,5 μl / studzienkę każdy, co daje w sumie 70 μl. W przypadku paradygmatu 2 dodaje się 63 μl zawiesiny komórek i 3,5 μl poddania działaniu substancji (np. 100 ng/ml EGF) w punkcie czasowym 0 godzin. Po 4 godzinach inkubacji dodaje się 3,5 μl oAβ materiału wyjściowego (np. dla końcowego stężenia 100 nM oAβ 3,5 μl z 2 μM oAβ zapasu). W przypadku paradygmatu 3 dodaje się 63 μl zawiesiny komórek w punkcie czasowym 0 godzin, a po 4 godzinach, oAβ i pożądane zabiegi dodaje się po 3,5 μl/studzienkę, co daje w sumie 70 μl. Objętości te można regulować w zależności od zabiegów. Na przykład, jeśli wymagany jest tylko jeden zabieg, objętość zawiesiny komórek można dostosować do 66,5 μl (utrzymując 10 000 komórek/studzienkę), a objętość leczenia może pozostać na poziomie 3,5 μl.
  2. Test potrójnej hodowli:
    UWAGA: Oprócz testów pojedynczych hodowli BEC, opracowaliśmy paradygmat testu potrójnej hodowli (Rysunek 1B) w celu określenia odpowiedzi BEC, perycytów i astrocytów w ramach wstępnie uformowanych sieci na odpowiednie czynniki stresogenne (np. oAβ). BEC są posiewane w obecności pożądanych zabiegów po 0 godzinach. Po 4 godzinach perycyty delikatnie dodaje się do płytki. Po 7 godzinach do płytki dodaje się astrocyty, a po 11 godzinach dodaje się stresor. Komórki są następnie inkubowane do 24-godzinnego punktu czasowego.
    UWAGA: W przypadku testów potrójnej hodowli ważne jest, aby wziąć pod uwagę czas, aby upewnić się, że wszystkie komórki zlewają się w tym samym czasie. Ludzkie astrocyty i perycyty należy hodować 1 tydzień przed testem, podczas gdy komórki hCMEC/D3 należy posiać lub pasażować 4-5 dni przed datą testu. Ponadto ważne jest, aby używać komórek pierwotnych o niskim pasażowaniu (2-5), aby uniknąć dryfu fenotypowego.
    1. Dodaj roztwór roboczy barwnika śledzącego zielone krwinki do komórek hCMEC/D3 20 minut przed rozpoczęciem testu. Płytkę komórek hCMEC / D3 w 10 000 komórek / dołku w podstawowej EBM-2 (punkt czasowy 0 h). Stosowane objętości to 45 μl zawiesiny komórek i 3,5 μl poddania działaniu substancji (tj. końcowe stężenia EGF wynoszą 50 ng/ml, 100 ng/ml lub 1 000 ng/ml z zapasów, które są 20 razy bardziej skoncentrowane).
    2. Po 3,5 godzinnej inkubacji w temperaturze 37 °C dodać roztwór roboczy barwnika śledzącego niebieskie krwinki (10 μM niebieski znacznik komórek w bazie EBM-2) do ludzkich pierwszorzędowych perycytów. W 4-godzinnym punkcie czasowym (~ 30 min inkubacji z barwnikiem śledzącym komórki), delikatnie dodaj 2,000 perycytów / studzienkę do płytki zawierającej hCMEC / D3 w objętości 6 μl / basenik.
    3. Po dodatkowych 2,5 h inkubacji (łącznie 6,5 h od punktu czasowego 0 h) dodaj pomarańczowy roztwór roboczy barwnika śledzącego komórki (10 μM cell tracker orange w EBM-2 basel) do ludzkich astrocytów pierwotnych. W 7-godzinnym punkcie czasowym delikatnie dodaj 10 000 astrocytów/studzienkę do płytki w objętości 12 μl. Dlatego ogólny stosunek komórkowy dla komórek śródbłonka:perycyty:astrocyty wynosi 5:1:5. Ponadto osiągnięta do tego momentu objętość wynosi 66,5 μl.
    4. Dodaj oAβ (3,5 μl ze 100 μM bulionu) 4 godziny później (łącznie 11 godzin od 0 godziny).
    5. Utrwal komórki 13 godzin później w świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydzie w PBS.
      Uwaga: Podczas pracy z paraformaldehydem należy nosić odzież ochronną, rękawice i okulary.

3. Kwantyfikacja

  1. Uchwyć obrazy fluorescencyjne całego dołka płytki 96-dołkowej przy 1,6-krotnym powiększeniu z czasem naświetlania 2 s przy maksymalnej mocy 50% za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
    UWAGA: Można użyć równoważnych mikroskopów; Jednak bardzo ważne jest, aby uchwycić cały odwiert w celu kompleksowej analizy.
  2. W przypadku analizy ilościowej przetwarzaj obrazy za pomocą wtyczki analizatora angiogenezy ImageJ22, aby określić ilościowo liczbę rozgałęzień, liczbę oczek i całkowitą długość komórki (odczyty te są automatycznie tabelaryzowane przez oprogramowanie), jak opisano poniżej. Szczegółowy wizualny protokół tego kroku znajduje się w Rysunek 2.
    1. Otwórz Fiji ImageJ, klikając ikonę oprogramowania.
    2. Kliknij podwójne czerwone strzałki do przodu znajdujące się na końcu paska narzędzi, a następnie kliknij "Analizator angiogenezy".
    3. Wybierz folder z plikami graficznymi, kliknij "Otwórz".
    4. Gdy pojawi się pole "ustawienia do analizy", kliknij "OK".
    5. Gdy pojawi się pole "przetwarzanie obrazów", które wskazuje liczbę obrazów do przetworzenia, kliknij "OK".
    6. Gdy pojawi się okno "postęp wsadu", które wskazuje szacowany czas przetwarzania. W tym czasie program określa ilościowo dane wyjściowe, w tym liczbę rozgałęzień, liczbę siatek i całkowitą długość komórki.
      UWAGA: Po określeniu ilościowym wszystkich obrazów plik wyników pojawi się w oryginalnym folderze obrazów jako dokument arkusza kalkulacyjnego.
    7. Wybierz plik arkusza kalkulacyjnego zawierający wyniki i porównaj liczbę rozgałęzień, siatek oraz całkowitą długość komórek między grupami.
      UWAGA: W teście potrójnej hodowli ImageJ jest dalej wykorzystywany do analizy pokrycia i liczby perycytów/astrocytów. Obrazy są progowane przez zaślepionego eksperymentatora, a funkcja "analizuj cząstki" jest wykorzystywana do generowania odczytów. Stałe komórki i struktury przypominające rurki mogą być również barwione immunologicznie pod kątem Aβ17 lub innych markerów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W hodowlach pojedynczych zarówno komórki hCMEC/D3 (Rysunek 3A), jak i pierwotne komórki BEC myszy (Rysunek 3B) tworzą w obrębie studni struktury przypominające siatkę. Struktury te charakteryzują się obecnością sieci powiązanych węzłów (Rysunek 3). We wszystkich opisanych schematach (Rysunek 1), po 24 h w grupach kontrolnych struktury przypominające siatkę są podobne, tw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane metody można wykorzystać do odpowiedzi na kilka podstawowych pytań biologicznych dotyczących pokrycia naczyń mózgowych24. W szczególności mogą zidentyfikować, które receptory i szlaki sygnałowe odgrywają rolę w angiogenezie, pokryciu naczyń w tkance nowotworowej i komórkach śródbłonka obwodowego istotnych dla mózgu. Przykłady obejmują receptory angiogennego czynnika wzrostu, tlenek azotu, sygnalizację kinazy białkowej aktywowanej mitogenem i sygnalizację wapnia 25,26,27.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Leon Tai jest finansowany przez fundusze start-upowe Uniwersytetu Illinois w Chicago.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki hCMEC/D3MiliporeSCC066
EBM-2 podłoże podstawoweLonzaCC-3156
Kolagen typu 1ThermoFisherA1064401
HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowejThermoFisher14025092
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejThermoFisher14175095
Trypsyna-EDTA (0,25%)ThermoFisher25200056
Końcowe stężenia suplementów czynnika wzrostu SingleQuot dla pożywek EBM2LonzaCC-4147
5% FBSLonzaCC-4147
10% Kwas askorbinowyLonzaCC-4147
10% siarczan gentamycynyLonzaCC-4147
25% HydrokortyzonLonzaCC-4147
1/4 objętości dostarczonych czynników wzrostu: czynnik wzrostu fibroblastów, naskórkowy czynnik wzrostu, insulinopodobny czynnik wzrostu, czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowegoLonzaCC-4147
Chlorowodorek puromycynyVWR80503-312
MEM-HEPESThermo Scientific12360-038
System dysocjacji komórek papainy (papaina i DNaza1)Worthington BiochemicalLK003150
Ludzkie perycytySciencell1200
Pożywka bazowa perycytówSciencell1201
Suplement wzrostu perycytówSciencell1252
Astrocyty ludzkieSciencell1800
AstrocytySciencell1801
Astrocyty suplement wzrostuSciencell1852
Błona podstawna (Matrigel Growth Factor Reduced )Corning356231
Płytki m angiogenezy (96-dołkowe)ibidi89646
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostuShenendoah Biotechnology100-26
CellTracker zielonyThermoFisherC7025
CellTracker pomarańczowyThermoFisherC34551
CellTracker niebieskiThermoFisherC2110
Poly-l-lizynaSciencell0403
10% neutralna buforowana formalinaSigma-AldrichHT5012-60ML
C57BL myszyJackson Laboratoryna
paski probówek do PCRGeneMateT-3014-2
Mikroskop preparacyjny Zeiss stereo discover v.8Zeissna

Bibliografia

  1. Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
  2. Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
  5. Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
  6. Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
  7. Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789(2011).
  8. Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598(2012).
  9. Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
  10. Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
  11. Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
  12. Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280(2011).
  13. Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
  14. Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
  15. Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
  16. Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
  17. Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
  18. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).
  19. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  20. Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
  21. Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
  22. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
  23. Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111(2016).
  24. Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
  25. Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
  26. Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
  27. Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

komórki śródbłonkaastrocytyperycytyoligomeryczna beta-amyloidczynnik wzrostu naskórkabarwnik do śledzenia komórektrypsyna EDTApłytki pokryte kolagenemchlorowodorek puromycyny
In vitro Testy oceniające tworzenie i rozrywanie naczyń przypominających siatkę bariery krew-mózg
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.