Model odwróconego serca do zbierania śródmiąższowego przesięku z izolowanego serca szczura

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę pobierania płynu śródmiąższowego serca z izolowanego, perfundowanego serca szczura. Aby fizycznie oddzielić przesięk śródmiąższowy od perfuzatu z żył wieńcowych, perfundowane serce Langendorffa jest odwracane, a przesięk (płyn śródmiąższowy) utworzony na powierzchni serca jest zbierany za pomocą miękkiej nasadki lateksowej.

Streszczenie

Obecny protokół opisuje unikalne podejście, które umożliwia pobranie przesięku serca (CT) z izolowanego, perfuzowanego solą fizjologiczną serca szczura. Po izolacji i wstecznej perfuzji serca zgodnie z techniką Langendorffa, serce jest odwracane do pozycji odwróconej i jest mechanicznie stabilizowane przez cewnik balonowy wprowadzany do lewej komory. Następnie na powierzchnię nasierdzia nakłada się cienką lateksową nasadkę – wcześniej odlewaną tak, aby pasowała do średniej wielkości serca szczura. Wylot nasadki lateksowej jest połączony z silikonową rurką, z dystalnym otworem 10 cm poniżej podstawowego poziomu serca, powodując lekkie ssanie. Tomografia komputerowa wytwarzana w sposób ciągły na powierzchni nasierdzia jest gromadzona w fiolkach chłodzonych lodem w celu dalszej analizy. Szybkość tworzenia TK wahała się od 17 do 147 μl/min (n = 14) w sercach kontrolnych i zawałowych, co stanowi 0,1-1% perfuzatu ścieku z żył wieńcowych. Analiza proteomiczna i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) wykazały, że pobrana tomografia komputerowa zawiera szerokie spektrum białek i metabolitów purynergicznych.

Wprowadzenie

Niewydolność serca (HF) jest główną przyczyną zgonów ludzi na całym świecie¹. Niewydolność serca często występuje z powodu zapalenia mięśnia sercowego, niedokrwiennych uszkodzeń mięśnia sercowego i przebudowy lewej komory, co prowadzi do postępującego pogorszenia funkcji skurczowej serca i jakości życia pacjentów. Chociaż postępy w kardiologii i kardiochirurgii znacznie obniżyły śmiertelność z powodu niewydolności serca, służą one jedynie jako przejściowe "opóźniacze" nieuchronnie postępującego procesu chorobowego, który niesie ze sobą znaczną zachorowalność. W związku z tym obecny brak skutecznego leczenia podkreśla potrzebę zidentyfikowania nowych celów molekularnych, które mogą zapobiec lub nawet odwrócić niewydolność serca. Obejmuje to zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej, niekontrolowaną odpowiedź immunologiczną serca oraz interakcje między komórkami sercowymi i niesercowymi².

Ważne jest, aby uznać, że mikrośrodowisko, na które narażone są komórki serca, bezpośrednio kształtuje odpowiedź immunologiczną i regeneracyjną uszkodzonego serca. W izolowanym, perfundowanym solą fizjologiczną sercu, CT jest generowany na powierzchni serca w postaci małych kropelek, które pochodzą z przestrzeni płynu śródmiąższowego (tj. mikrośrodowiska), zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patofizjologicznych^3,4,5. Dlatego analiza CT (tj. płynu śródmiąższowego) może pomóc w identyfikacji czynników, które regulują metabolizm serca i funkcję skurczu⁶ lub wpływają na funkcje komórek odpornościowych po migracji do uszkodzonego serca. Potencjalnie może to doprowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych w leczeniu niewydolności serca.

Zbieranie CT z mysich serc jest technicznie trudne. W przypadku zwykłych serc z perfuzją Langendorffa wyłączne pobranie tomografii komputerowej jest trudne, ponieważ mieszanina tomografii komputerowej z perfuzatem ścieku z żył wieńcowych w nieprzewidywalny sposób rozrzedza wszelkie stężenie metabolitów/enzymów uwalnianych z przestrzeni śródmiąższowej. Jedną z możliwych strategii przezwyciężenia tego ograniczenia jest wykluczenie ścieków żylnych poprzez kaniulację płuc i jednoczesne podwiązanie żyły płucnej⁷. Jednak metoda ta napotyka trudności związane z kaniulacją i podwiązaniem tętnicy płucnej i żyły, powodując potencjalny wyciek ścieków żylnych do przesięku serca. Koncepcja użycia modelu odwróconego serca została po raz pierwszy wprowadzona przez grupę Kammermeiera, który odwrócił izolowane, perfundowane serce do pozycji odwróconej do góry nogami i umieścił cienką lateksową nasadkę na powierzchni nasierdzia, aby w sposób ciągły pobierać próbki CT bez zanieczyszczenia ścieków żylnych8^,9. Za pomocą tej procedury wykazano, że CT zapewnia bardzo czuły pomiar metabolitów uwalnianych z serca⁹, kapilarnego transferu kwasów tłuszczowych ⁸ i cząstek wirusa¹⁰.

Ostatnio czynniki parakrynne, które mogą regulować miejscową odpowiedź immunologiczną i nasilać angiogenezę serca¹¹ zostały powiązane z korzystnymi efektami terapii opartej na komórkach macierzystych w chorobach serca. Analiza tomografii komputerowej w odwróconym sercu może pomóc w chemicznej identyfikacji tych indywidualnych czynników parakrynnych. Ponadto tomografia komputerowa może pomóc w identyfikacji czynników zaangażowanych w aktywację in vivo komórek odpornościowych w sercu.

Szczegółowy opis pobierania tomografii komputerowej z powierzchni serca, zamieszczony tutaj, jest eksperymentalnie przydatny dla badaczy badających wzajemne oddziaływanie komórek odpornościowych, fibroblastów, komórek śródbłonka i kardiomiocytów w odniesieniu do ogólnej funkcji serca. Jak wspomniano powyżej, płyn śródmiąższowy przenosi informacje do komunikacji międzykomórkowej w sercu, które można wygodnie ocenić za pomocą zbioru tomografii komputerowej. Szczegółowy opis techniczny, w tym protokół wideo przedstawiający sposób pobierania tomografii komputerowej z odwróconego serca, powinien ułatwić zastosowanie tej unikalnej techniki w przyszłości.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez lokalną agencję regulacyjną (LANUV z Nadrenii Północnej-Westfalii, Niemcy) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi stosowania na zwierzętach. Zwierzęta były karmione standardową dietą karmową i otrzymywały wodę z kranu ad libitum. Cały sprzęt i substancje chemiczne niezbędne na każdym etapie eksperymentu są dostępne w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie lateksowej czapki i balonu dokomorowego

1. Wykonaj aluminiową formę za pomocą frezarki, która pasuje do średniej wielkości serca szczura (masa ciała 300-350 g). Wypoleruj formę bardzo drobnym (10/0) papierem ściernym.
   UWAGA: Szczegółowe metryki formy są pokazane w Rysunek 1A.
2. Przymocuj pionowo szyjkę aluminiowej formy do frezarki, aby przygotować nasadkę lateksową.
   UWAGA: Frezarka powoduje powolne obracanie się formy. Alternatywnie można zastosować silnik elektryczny.
3. Wlej 20 ml płynnego lateksu (zakupionego w handlu, patrz Tabela materiałów) do szklanej zlewki o pojemności 50 ml.
4. Opuść formę, aż cały korpus formy zostanie zanurzony w roztworze lateksu.
5. Powoli podnoś formę (5 cm/min) podczas obracania.
6. Obracaj formę przez dodatkowe 15 minut, aż lateks na powierzchni formy zestali się.
7. Dodaj około 1 g talku na powierzchnię formy (już pokrytą cienką folią lateksową), aby zapobiec uszkodzeniom podczas odłączania.
8. Delikatnie oderwij palcami już wysuszoną lateksową nasadkę od powierzchni formy; lateksowa nasadka jest teraz gotowa do użycia (Rysunek 1B).
9. Podłącz wylot nasadki lateksowej do 15-centymetrowej rurki silikonowej (ID = 0,2 mm), używanej później do zbierania CT.
10. Napełnij komorowy balon lateksowy wodą i mocno przymocuj go do metalowej kaniuli w kształcie litery L połączonej ze strzykawką wypełnioną wodą o pojemności 1 ml (Rysunek 1C).
    UWAGA: Zostanie to wykorzystane do zapewnienia pionowego ułożenia serca (patrz poniżej).
11. Upewnij się, że balon jest szczelny, wykonując kilka testów opróżniania/pompowania za pomocą dołączonej strzykawki o pojemności 1 ml.
12. Podłącz kaniulę, za pomocą trójdrożnego ogranicznika, do przetwornika ciśnienia, aby w przyszłości zmierzyć ciśnienie wytworzone w dokomorowej (Rysunek 1C).

2. Przygotowanie buforu Krebsa-Henseleita (KHB) i systemu perfuzji Langendorffa

1. Skonfiguruj system perfuzyjny Langendorffa w trybie stałego przepływu (napędzanego przez pompę rolkową) lub stałego ciśnienia (generowanego przez ciśnienie statyczne w szklanej kolumnie).
   UWAGA: Szczegóły dotyczące preparatu serca Langendorffa zostały opisane wcześniej¹².
2. Przygotować 2 l zmodyfikowanego KHB (w mM: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO,₄·_7H2O, 1,21_K2HPO₄, 2,52 CaCl₂·2H₂O, 24,88 NaHCO₃, 8,30 D-glukozy i 2,0 pirogronianu sodu).
   1. Zważyć wszystkie substancje chemiczne z wyjątkiem CaCl₂ i rozpuścić je w 1,8 l podwójnie destylowanej wody w kolbie o pojemności 2 l.
   2. Pęcherzykować podłoże karbogenem (95% O₂/5% CO₂) przez co najmniej 5 minut w celu zrównoważenia (pH: 7.4) przy mieszaniu magnetycznym.
   3. Dodać 0,74 g CaCl 2,2H2O i zwiększyćcałkowitą objętość do 2 l wodą podwójnie destylowaną.
   4. Kontynuuj mieszanie i bulgotanie pożywki z karbogenem przez dodatkowe 5 minut.
   5. Przefiltruj KHB przez filtr 0,2 μm, aby wyeliminować małe cząsteczki, które mogą utrudniać mikrokrążenie serca.
3. Przygotowanie systemu perfuzyjnego Langendorffa.
   1. Umieścić przefiltrowany KHB we wstępnie podgrzanej łaźni wodnej (38 °C); nadal bulgotać karbogenem, aby wytworzyć ciśnienie 100 cmH₂O wewnątrz zbiornika KHB.
   2. Podłączyć zbiornik do szklanej kolumny, aby ustalić ciśnienie hydrostatyczne 100 cmH₂O dla perfuzji Langendorffa z KHB; kontynuować bulgotanie KHB wewnątrz kolumny za pomocą karbogenu.
   3. Dostosuj temperaturę systemu grzewczego tak, aby temperatura na wylocie kaniuli aortalnej wynosiła 37 °C.
   4. Upewnij się, że system przewodów jest wolny od pęcherzyków powietrza.
   5. Natleniaj KHB karbogenem przez dodatkowe 5 minut, aż PO₂ w KHB osiągnie 500-600 mmHg (mierzone przez analizator gazometrii krwi).
4. Ustaw system perfuzyjny tak, aby działał przy stałym ciśnieniu 100 cmH₂O lub przy stałym przepływie około 10-20 ml/min za pomocą ręcznego przełączania. Alternatywnie użyj wymiennego sterownika pompy CPK, aby natychmiast przełączyć się w tryb perfuzji.

3. Izolacja i kaniulacja serca

UWAGA: Samce szczurów rasy Wistar o masie ciała 300-350 g zostały użyte tak, aby rozmiary serc odpowiadały prefabrykowanej lateksowej czapce. Szczury przeszły podwiązanie lewej tętnicy zstępującej (LAD) przez 50 minut, a następnie reperfuzję lub były operowane pozorowano. Szczegóły dotyczące metodologii indukcji zawału mięśnia sercowego (MI) zostały podane w innym miejscu¹³. Eksperymenty z odwróconym sercem u zwierząt z zawałem przeprowadzono 5 dni po operacji.

1. Znieczulenie szczurów za pomocą parownika izofluranu (2% V/V) podłączonego do komory przetrzymywania zwierząt (20 l).
2. Przenieś szczury na stół operacyjny (bez kontrolowanej temperatury) po osiągnięciu głębokiego znieczulenia.
3. Podnieś skórę i mięśnie tuż pod mostkiem za pomocą kleszczy i przetnij dolny brzeg żeber ciężkimi nożyczkami.
4. Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj małe nacięcie w przeponie, na brzegu żebra. Przetnij żebra doogonowo, aby utworzyć klapę całej brzusznej ściany klatki piersiowej.
5. Delikatnie chwyć serce kciukiem oraz palcem wskazującym i środkowym i powoli unieś je do góry, aby naczynia sercowe uległy lekkiemu rozciągnięciu.
6. Wytnij serce, aż aorta zostanie całkowicie odsłonięta.
7. Umieścić serce w zlewce o pojemności 100 ml zawierającej 50 ml lodowatego KHB (4 °C) i przenieść je do aparatu perfuzyjnego.
8. Natychmiast zamontuj serce przez aortę na kapiącej kaniuli i mocno zaciśnij je szwem (4-0). Unikaj przedostawania się pęcherzyków powietrza do serca.
9. Stosować stałe ciśnienie perfuzji (100 cmH₂O). Alternatywnie można zastosować pełne natężenie przepływu (zaczynając od 20 ml/min).
   Uwaga: Czas od otwarcia klatki piersiowej do podłączenia serca do kaniuli perfuzyjnej powinien zająć około 3 minut w rękach doświadczonego operatora.

4. Model odwróconego serca

1. Delikatnie obracaj kaniulę aortalną, aż tylna ściana serca znajdzie się w widoku en face.
2. Usuń tkankę łączną nożyczkami, aby odsłonić otwór lewego przedsionka, przygotowując go do kaniulacji śródkomorowej.
3. Wprowadzić opróżniony balon lateksowy przymocowany do sztywnego cewnika przez lewy przedsionek do lewej komory.
4. Napompuj balon, aż wypełni całą jamę komorową (objętość do napompowania jest wstępnie zaznaczona na strzykawce).
5. Odwróć serce, aż znajdzie się do góry nogami, podtrzymując je cewnikiem balonowym dokomorowym.
6. Jak pokazano w Rysunek 1C, mechanicznie ustabilizuj odwrócone serce w pozycji pionowej za pomocą balonu dokomorowego ze sztywnym metalowym cewnikiem.
7. Dostosuj pozycję serca, aby uniknąć nadmiernego skręcenia korzenia aorty.
8. Dostosuj ciśnienie rozkurczowe do 3-5 mmHg (mierzone przez balon wewnątrzkomorowy; patrz Rysunek 1C).
9. Obserwuj powierzchnię nasierdzia serca i upewnij się, że tworzą się małe kropelki.
10. Umieść lateksową nasadkę na powierzchni serca, delikatnie dociskając ją palcami, aby pokryła całe serce.
11. Upewnij się, że lateksowa nasadka zakrywa większość powierzchni komory.
12. Usuń pęcherzyki powietrza, jeśli występują, z wnętrza nasadki i rurki, delikatnie zasysając strzykawką o pojemności 1 ml.
13. Wyreguluj dystalny otwór rurki przepuszczającej tomografię komputerową na 10 cm poniżej poziomego poziomu serca.
    UWAGA: Ta procedura zapewnia lekkie zasysanie przez ujemne ciśnienie hydrostatyczne.
14. Zbierz krople CT w probówce o pojemności 1,5 ml umieszczonej w lodzie zmieszanym 1:1 z NaCl. Zbierz około 0,15-1,5 ml CT.
    UWAGA: Mieszanina lodu i NaCl stabilizuje temperaturę w probówce zbiorczej poniżej zera (około -4 °C).
    UWAGA: Czas pobierania próbek zależy od celu eksperymentu. Natężenie przepływu w tomografii komputerowej wynosi około 27 ± 20 μl/min u zwierząt operowanych pozorowo (n = 3) i 100 ± 47 μl/min u zwierząt podwiązanych wieńcowo (n = 11).
15. Zważ i zamroź próbki CT w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80 °C do późniejszych pomiarów.

5. Analiza CT

1. Do analizy metabolitów należy używać płynu CT, w zależności od zagadnienia naukowego.
   UWAGA: Dane pokazane w Rysunek 2 i Rysunek 3 zostały zebrane z perfuzji o stałym ciśnieniu (100 cmH₂O), a około 0,15-1,5 ml płynu CT pobrano w ciągu 10 minut. Ten czas i objętość były wystarczające do przeprowadzenia proteomiki (minimum: 50 μL; Rysunek 2)¹⁴ i HPLC (minimum: 20 μL; Rysunek 3)¹⁵ analiza różnych puryn.

Wyniki

Model odwróconego serca umożliwia pobranie przesięku śródmiąższowego serca serca w izolowanym, retroperfundowanym sercu szczura (Rysunek 1A-C). Po perfuzji pod stałym ciśnieniem 100_cmH2O szybkość tworzenia płynu śródmiąższowego wahała się od 17 do 147 μL/min, co stanowiło 0,1-1% ścieku z żył wieńcowych w izolowanym sercu.

Stwierdzono, że zawartość białka w tomografii komp...

Dyskusja

Model odwróconego serca opiera się na dobrze znanej technice perfuzji serca Langendorffa¹² i jest wykonywany po prostu poprzez odwrócenie serca do pozycji odwróconej i utrzymanie tej pozycji za pomocą sztywnego wewnątrzkomorowego cewnika balonowego. W ten sposób przesięk śródmiąższowy serca może być fizycznie oddzielony od perfuzatu z żył wieńcowych, kapiącego grawitacyjnie z podstawy serca⁹. Tomografia komputerowa może być pobierana w sposób ciągły za pomocą cienkiej i ela...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rozwiązanie lateksowe	ProChemie	Z-Latex LA-TZ	http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
Forma aluminiowa	Domowa robota-model		odwróconego serca
Piekarniki uniwersalne	Memmert	UNB 400	Model odwróconego serca
Balon lateksowy	Hugo Sachs	Rozmiar 4	Model odwróconego serca
Frezarka	Proxxon	MF70	Odwrócony model serca
Chlorek sodu	Sigma	SZBD0810V	Chemikalia
Wodorowęglan sodu	Roth	68852	Chemikalia
Chlorek potasu	Merck	49361	Chemikalia
Siarczan magnezu siedmiowodny	Merck	58861	Chemikalia
Diwodorofosforan potasu	Merck	48731	Chemikalia
D(+)-glukoza bezwodna	Merck	83371	Chemikalia
Chlorek wapnia dwuwodny	Fluka	21097	Waga chemiczna
	VWR	SE 1202	Chemikalia do ważenia
Podwójnie destylowana woda		Chemikalia rozpuszczające	młyny
Medyczny przetwornik ciśnienia	Gold-Langendorff		aparatura
Medyczna sonda przepływu	Transonic	3PXN	Aparat Langendorffa
Ogrzewanie Kąpiel cyrkulacyjna	Haake	B3 ; DC1	Aparat Langendorffa
Rurki laboratoryjne i próżniowe	Tygon	R-3603	Aparat Langendorffa
Przepływomierze do badań na zwierzętach	Aparatura Transonic	T206	Langendorffa
Urządzenie do akwizycji danych PowerLab Wykres	przyrządów AD	7.1	Aparat Langendorffa
Oprogramowanie do akwizycji danych LabChart	Wykres AD Instruments	7.1	Aparat Langendorffa
Pompa perystaltyczna	Glison	MINIPULS 3	Aparat Langendorffa
Szklana kolumna wodna	domowej roboty		- aparat Langendorffa
Środek ochronny do kąpieli wodnej	VWR	462-7000	Aparat Langendorffa
Sterylne filtry jednorazowe (0,2 i mikro; m)	Thermo Scientific	595-4520	Aparat Langendorffa
Analizatory parametrów krytycznych	Radiometer	ABL90 FLEX PLUS	Analizator gazów
70% etanolu	VWR	UN1170	Węże do czyszczenia
100% etanol	Merck	64-17-5	Rurki do czyszczenia
Wistar Rats	Janvier-Animals
Nożyczki ze stali nierdzewnej	AESCULAP	BC702R	Instrumenty chirurgiczne
Nożyczki ze stali nierdzewnej	AESCULAP	BC257R	Instrumenty chirurgiczne
Duże kleszcze	AESCULAP	-	Narzędzia chirurgiczne
8 m / m Kleszcze ze stali nierdzewnej	FST	11052-10	Instrumenty chirurgiczne
bardzo cienki (10/0) papier ścierny	3M	051111-11694	Odwrócony model serca