Artykuł metodologiczny

Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR

DOI:

10.3791/55854

⸱

30 grudnia 2017

 ,  , 
1Departamento de Histología y Embriología, Facultad de Medicina, Laboratorio de Biología del Desarrollo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tkankach Drosophila jest kluczowa dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju. Oto opis prostej procedury preparowania skrzydeł poczwarki. Skrzydełka te mogą być używane jako próbki w kilku technikach (immunohistochemia, test PCR itp.).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój skrzydeł u Drosophila melanogaster jest idealnym modelem do badania morfogenezy na poziomie tkanki. Wyrostki te rozwijają się z grupy komórek zwanych dyskami imaginalnymi skrzydeł, które powstały podczas rozwoju embrionalnego. W stadiach larwalnych wyobrażone krążki rosną, zwiększając liczbę komórek i tworząc jednowarstwowe struktury nabłonkowe. Wewnątrz koperty poczwarki wyimaginowane dyski wyrastają i składają się w dwie warstwy wzdłuż linii, która staje się przyszłym brzegiem skrzydła. Podczas tego procesu podłużne żyły primodia tworzą komórki żyłowe na prospektywnej grzbietowej i brzusznej powierzchni skrzydła. W stadium poczwarki paski komórek żyłowych każdej powierzchni komunikują się w celu wytworzenia ciasnych rurek; W tym samym czasie zaczynają się tworzyć żyły krzyżowe.

Za pomocą odpowiednich markerów molekularnych możliwe jest zidentyfikowanie głównych elementów składających się na skrzydło podczas jego rozwoju. Z tego powodu zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tej strukturze ma kluczowe znaczenie dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju skrzydła.

Procedura opisana tutaj skupia się na manipulowaniu skrzydłami poczwarki, dostarczając szczegółowych instrukcji, jak przeprowadzić sekcję skrzydła podczas fazy poczwarki. Sekcja tkanki poczwarki jest trudniejsza do wykonania niż ich odpowiedniki u larw w trzecim stadium rozwojowym. Właśnie dlatego opracowano to podejście, aby uzyskać szybkie i wydajne próbki wysokiej jakości. Szczegółowe informacje na temat sposobu barwienia immunologicznego i montowania tych próbek skrzydeł, aby umożliwić wizualizację białek lub składników komórkowych, znajdują się w protokole. Przy niewielkiej wiedzy specjalistycznej możliwe jest zebranie 8-10 wysokiej jakości skrzydeł poczwarek w krótkim czasie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skrzydła Drosophila są zbudowane z wyimaginowanych dysków skrzydeł. Pierwotne z tych dysków skrzydeł są odkładane na bok podczas rozwoju embrionalnego jako małe grupy 20-30 wyimaginowanych komórek, które wyrastają z nabłonka embrionalnego. Podczas gdy larwa rośnie do trzeciego stadium rozwojowego, mitoza zachodzi w komórkach wyobrażeniowych w określonych charakterystycznych momentach, zwiększając jej liczbę (około 50000 komórek) i tworząc dysk skrzydła1,2,3,4. W miarę namnażania się komórek tworzy się nabłonek rurkowaty, w wyniku czego powstaje samozwijająca się zwarta spirala. Podczas przepoczwarzania nabłonek dysku wysuwa się, tworząc dwuwarstwowe skrzydło, a żyły podłużne zaczynają się jako luki między nimi, co występuje dwukrotnie podczas rozwoju skrzydła5,6.

Układ żył zawsze ma identyczny wzór; Możliwość łatwej identyfikacji każdej zmiany w obrębie tworzenia się żył sprawia, że mutacje są niezwykle widoczne (np. brakujące lub dodatkowe żyły, zmiany w położeniu żył itp.). Co ciekawe, zmiany fenotypu są zwykle dowodem na mutacje w znanych lub nowych składnikach szlaków sygnałowych, które są istotne dla rozwoju skrzydeł. Jedną ze ścieżek, która odgrywa rolę w określaniu pozycji i utrzymywaniu terytoriów żył i międzyżyłowych, jest ścieżka Hedgehog (Hh)6,7,8.

Biorąc pod uwagę znaczenie skrzydła poczwarki jako systemu modelowego, ważne będzie uzyskanie dobrej jakości próbek do pracy. W przeszłości naukowcy, którzy opublikowali protokoły preparowania skrzydeł Drosophila, nie dali odpowiednich wskazówek, jak uzyskać nadające się do pracy próbki. Bez wskazówek badacza nie da się jasno zobrazować tego procesu. W tych naprzemiennych podejściach preparacyjnych poczwarka jest dzielona na dwie części, oddzielając skrzydło od otaczającej tkanki i wielokrotnie myta w celu usunięcia szczątków. Tego rodzaju podejście zakłada, że skrzydło pozostaje wolne od zanieczyszczeń, ale ze względu na wcześniejsze doświadczenia proces ten jest wolniejszy i istnieje większe prawdopodobieństwo naruszenia struktury delikatnych skrzydeł9.

Opisana tutaj procedura została opracowana w odpowiedzi na zapotrzebowanie na szybką i efektywną metodę uzyskania próbek skrzydeł poczwarki odpowiednich do wykrywania określonych białek lub transkryptów za pomocą protokołów immunodetekcji lub testów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Aby to zilustrować, ekspresja i lokalizacja Patched (Ptc lub receptor kanoniczny szlaku Hh) jest wykrywana w próbkach skrzydeł poczwarki, zapewniając protokół, który zawiera istotne szczegóły, aby pomyślnie przeprowadzić całą procedurę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzień 1

1. Zbieranie i hodowla poczwarek.

  1. Usunąć 0 godzin po utworzeniu się poczwarki (APF) lub przedwarek za pomocą mokrego pędzla z fiolek z kulturami i umieścić je w nowych fiolkach, aby prawie zakończyć okres rozwoju (patrz 2.1 i 2.2).
    nuta: Zdrowa populacja much powinna być utrzymywana przy użyciu standardowych protokołów hodowli. Po trzech lub czterech dniach składania jaj dorosłe osobniki można wyjąć z fiolek, aby umożliwić optymalny rozwój osobników. Są one utrzymywane w stałej temperaturze do momentu, gdy larwy trzeciego stadium rozwojowego zainicjują przepoczwarzenie. Przejście larwala/poczwarka jest zaznaczone przez utworzenie się poczwarki uważanej za 0 h APF. Poczwarka to nieruchoma biała larwa, która ma podłużny, okrągły kształt z wystającymi przednimi przetchlinkami.

Dzień 2

2. Transfer, rozbiór i fiksacja.

  1. Poczwarki (2 godziny przed zakończeniem czasu rozwoju) przenieść pędzlem na szkiełko mikroskopowe z przyklejoną do niego taśmą dwustronną. Ustaw poczwarki tak, aby utworzyły rząd z grzbietowymi stronami do góry i końcami głowowymi skierowanymi w tym samym kierunku.
  2. Przywróć szkiełko mikroskopowe do stałej temperatury i pozwól poczwarkom na osiągnięcie odpowiedniego czasu rozwoju (tj. 24-30 godzin APF).
    nuta: Szkiełko mikroskopowe z taśmą dwustronną będzie przejściową platformą preparacyjną do usunięcia obudowy poczwarki (patrz poniżej). Upływ czasu na szkiełku mikroskopowym (na zewnątrz fiolki) pomaga wysuszyć etui poczwarki, dzięki czemu łatwo je złamać kleszczami.
  3. Usuń wieczko z etui poczwarki za pomocą kleszczy.
  4. Przełam obudowę kleszczami (jak pokazano na filmie), tworząc linię wzdłuż boku poczwarki do jej ogonowego końca. Przy odpowiednim oświetleniu możliwe jest wykrycie wewnętrznego kształtu poczwarki, dzięki czemu uwidacznia się przestrzeń tuż nad zawiasem skrzydła poczwarki. Ta przestrzeń służy jako przewodnik do wykonania otwarcia bez uszkadzania poczwarki.
  5. Usuń części etui, podnosząc je za otwartą krawędź i przenosząc na przeciwną stronę, gdzie pomieści je taśma dwustronna. Pod koniec sekcji poczwarki będą prawie "nagie", tylko mały kawałek obudowy będzie zakrywał tylny koniec.
    Uwaga: Celem pozostawienia niewielkiej ilości etui na górnym końcu ogonowym jest zapewnienie płynnego zwolnienia z etui na zamek za pomocą taśmy dwustronnej. Powodem tego działania jest to, że jeśli usuniesz zbyt dużo obudowy, znacznie ryzykujesz uszkodzenie poczwarki. Z drugiej strony, jeśli usuniesz zbyt mało, poczwarka nie wydobędzie się łatwo z etui.
  6. Dociśnij (kleszczami) pozostałą część etui. Ten ruch podniesie przedni koniec poczwarki, pozwalając zarówno głowie, jak i tułowiu pozostać w preferencyjnej pozycji, aby przylegać i zostać przeniesione w kolejnym kroku.
  7. Weź nowy slajd z taśmą dwustronną i odwróć go w rzędzie poczwarek lub poczwarek. Zalecamy wykonanie tego podejścia poprzez obserwację ruchów za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby zapobiec pękaniu poczwarek.
  8. Lekko dociśnij, aby poczwarki przykleiły się do taśmy i delikatnie przesuń suwak, aby usunąć poczwarki z reszty etui. Odwróć szkiełko mikroskopowe: poczwarki utkną po stronie grzbietowej na poziomie głowy / klatki piersiowej.
  9. Przykryj wszystkie nagie poczwarki 4% paraformaldehydem i odczekaj 10 minut. Z naszego doświadczenia wynika, że ten upływ czasu z utrwalaczem pomaga zmienić konsystencję naskórka, czyniąc go jędrnym, mniej lepkim i łatwym w obsłudze.
    nuta: Aby przeprowadzić ekstrakcję kwasu rybonukleinowego (RNA), zastąp paraformaldehyd solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) wykonaną z wody wolnej od RNaz i usuń skrzydła poczwarki, wykonując nacięcie (za pomocą nożyczek) w pobliżu punktu zawiasu każdego wyrostka. Za pomocą kleszczy przenieś skrzydło poczwarki do probówki mikrowirówkowej z 1 ml tiocyjanianu guanidyny i odczynnikiem fenolowym. Po zebraniu łącznie 50-80 skrzydeł, przechowuj probówkę mikrowirówki w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia ekstrakcji RNA10,11.
  10. Wykonaj małe nacięcie w obszarze zawiasów skrzydła lub w jego pobliżu. Pozwól, aby utrwalacz dotarł do nabłonka skrzydeł. Za pomocą pipety (p200) przepłukać utrwalacz na skrzydełku. Podczas spłukiwania zanieczyszczony fiksat należy wymienić na nowy. Po wypłukaniu trzymaj skrzydło w utrwalaczu przez 5 min.
    nuta: Chociaż ten manewr pomaga usunąć większość zanieczyszczającej tkanki, niektóre hemocyty i kropelki tłuszczu mogą pozostać uwięzione między grzbietowymi i brzusznymi warstwami nabłonka skrzydła (patrz Ryc. 1A).
  11. Rozerwij kleszczami od brzegów naskórka (jak pokazano na filmie), rozszerzając otwór i umożliwiając uwolnienie nabłonka skrzydeł z worka naskórka. Po uwolnieniu tkanki skrzydła pozostaw ją w roztworze paraformaldehydu, aby zakończyć 30 minut utrwalania.
  12. Przenieś stałe skrzydełka do jednego 4-dołkowego plastikowego naczynia wypełnionego PBST (Triton X-100 0,05%). Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.

Dzień 3

3. Inkubacja przeciwciał pierwotnych.

  1. Przepuszczalność tkanki inkubującej skrzydła poczwarki w PBST (Triton X-100 0,2%) przez 15 minut za pomocą platformy kołyszącej, aby ułatwić delikatny ruch płynnego podłoża.
    nuta: Do momentu zamontowania próbek czynności te należy wykonywać za pomocą platformy bujanej.
  2. Blokować próbki za pomocą PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) przez 1 godzinę.
  3. Użyć tego samego buforu do rozcieńczenia pierwszorzędowego przeciwciała (mysiego anty-Ptc, 1:100) i inkubować skrzydła poczwarki przez noc w temperaturze 4 °C.

Dzień 4

4. Drugorzędowa inkubacja przeciwciał.

  1. Próbki należy przemywać 4 x po 10 minut PBST (Triton X-100 0,05%)
  2. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (np. anty-mysim sprzężonym z fluorochromem) rozcieńczonym do odpowiedniego stężenia w PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) w temperaturze pokojowej w ciemności, przez 2 godziny
    nuta: Jeśli jest to właściwe, użyj 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) i/lub falloidyny, aby przeciwdziałać barwieniu tkanki. Dodaj te sondy z przeciwciałem drugorzędowym, biorąc pod uwagę długość fali emisji fluorochromów, aby zapobiec nakładaniu się sygnałów.
  3. Próbki należy przemywać 4 x po 10 minut PBST (Triton X-100 0,05%)

5. Montaż

  1. Przygotuj szkiełko podstawowe, umieszczając 4 kropki przezroczystego lakieru do paznokci na szkiełku mikroskopowym tak, jakby były wierzchołkami kwadratu. Będą to punkty, w których szkiełka nakrywkowe będą spoczywać, pomagając uniknąć zgniecenia tkanki.
  2. Umieść 30 μl podłoża montażowego (glicerol/Tris-HCl 80%) na środku kwadratu kropek wykonanych lakierem do paznokci, nie dotykając żadnego z rogów (kropek). Weź pipetę z żółtą, przyciętą końcówką, załaduj trochę podłoża montażowego, a następnie wciągnij kilka skrzydełek poczwarki.
  3. Przenieść skrzydła poczwarki do punktu podłoża montażowego na szkiełku mikroskopowym. Za pomocą końcówki rozprowadź podłoże montażowe i zanurz skrzydła poczwarki, aby zapobiec ich unoszeniu się. Morfologia tkanki zostanie zachowana, jeśli skrzydła pozostaną płaskie po nałożeniu szkła nakrywkowego. Przed umieszczeniem szkła nakrywkowego usuń pęcherzyki powietrza.
  4. Opuścić szkiełko nakrywkowe na próbki, starając się zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Ten ruch można wykonać za pomocą kleszczy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół oferuje prostą metodę pozyskiwania próbek skrzydeł poczwarki, które zachowują znajomą morfologię skrzydła. Z tych preparatów możliwe jest uzyskanie stosów obrazów, które mogą być wyświetlane jako 2D lub 3D, w celu zbadania dystrybucji i/lub wzbogacania białek podczas różnicowania skrzydła. Podobny protokół (patrz uwaga w ppkt 2.9) może być wykorzystany do pobrania dużej próbki skrzydeł poczwarki (obejmującej 50-80 skrzydeł poczwarki) niezbędnej do syntezy komplementarnego kwasu d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana w tym filmie metoda preparacji może być wykorzystana do przygotowania wysokiej jakości próbek skrzydeł poczwarki Drosophila z różnych etapów rozwoju dla wielu rodzajów technik (np. immunofluorescencja, synteza cDNA do testów PCR, rozwój skrzydeł in vitro ). Jeśli chodzi o tę metodę, zaangażowani naukowcy wykorzystali 24-30 h APF. Nie powinno być jednak żadnych przeszkód w podstawowych krokach w sekcji młodszych lub starszych poczwarek. Być może trzeba będzie wprowadzić zmiany, aby dosto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować CSIC za wsparcie finansowe udzielone temu projektowi, Marianie Di Doménico za jej pomoc techniczną przy mikroskopii konfokalnej; José Leonardo Báezowi za jego poprawki rękopisu; Luciano Correi za jego poświęcenie się tworzeniu filmu; Natalii Rosano za użyczenie swojego głosu do filmu i Bloomington Drosophila Stock Center w celu udostępnienia zapasów wykorzystanych w tym badaniu. Monoklonalny anty-Ptc Apa1 opracowany przez Isabel Guerrero został uzyskany z Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) pod auspicjami NICHD i utrzymywany przez The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop stereoskopowy z chłodnym oświetleniem świetlnymNikon 
Platforma bujanaBiometra (WT 16)042-500
Szkiełka mikroskopoweStarFrost8037/1
Okulary nakrywkowe (24 x 32 mm)Kleszcze D102432
FST11252-00
NożyczkiLawton63-1400
Plastikowe naczynie wielofunkcyjneThermo Pipeta Scientific144444
p100 lub p200Finnpipette (Labsystems)9400130
1X PBS (Dulbecco)Gibco21600-010
4% paraformaldehydu Sigma158127
Triton X-100SigmaT8787
BSABio Basic INC.9048-46-8
GlicerolMallinckrodt5092
TrisAmresco497
TRIzolOdczynnik Ambion15596026
DEPC woda uzdatnionaMO. BIO17011-200
Alexa Fluor 546 kozia anty-mysia IgG (H+L), 2 mg/mL
(rozcieńczenie robocze 1/800)		InvitrogenA11030
Monoklonalny anty-Ptc (Apa-1) 54 μ g/mL
(rozcieńczenie robocze 1/100)		Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)Autor: Isabel Gerrero z DSHB pod auspicjami NICHD i utrzymywane przez The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. 
DAPI, 1 mg/ml
(rozcieńczenie robocze 1/5000)		Invitrogen62248
Falloidyna sprzężona z Alexa 488, 300 U/1,5 mML metanolu
(rozcieńczenie robocze 1/600)		InvitrogenA12379
Canton S (stado muchowe)Centrum Magazynowe Bloomington Drosophila 
SMZ1000Deltalab

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
  2. Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
  3. Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
  4. Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
  5. De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
  6. Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
  7. Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
  8. De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
  9. Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
  10. Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
  11. Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Skrzyd a poczwarki Drosophilasekcja skrzydeprotok immunodetekcjiusuwanie pochewki poczwarkiuwalnianie nab onka skrzyd afiksacja paraformaldehydemobrazowanie konfokalnedetekcja bia ka Patchedbarwienie filament w aktynowych

Powiązane artykuły