Artykuł metodologiczny

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

DOI:

10.3791/55855

⸱

5 lutego 2018

 ,  ,  , 
1Genomics Research Center, Academia Sinica

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy wysoce efektywny sposób na szybkie przygotowanie szerokiej gamy oligosacharydów związanych z N (szacowanych na ponad 20 000 struktur), które są powszechnie spotykane na ludzkich glikoproteinach. Aby osiągnąć pożądaną różnorodność strukturalną, strategię rozpoczęto od chemoenzymatycznej syntezy trzech rodzajów modułów fluorku oligosacharylu, a następnie ich stopniowej α-selektywnej glikozylacji w pozycjach 3-O i 6-O reszty mannozy wspólnego rdzenia trisacharydu o kluczowym β wiązaniem mannozydowym. Następnie przymocowaliśmy N-glikany do powierzchni szkiełka ze szkła pokrytego tlenkiem glinu (ACG), aby stworzyć kowalencyjną mieszaną matrycę do analizy interakcji hetero-liganda z przeciwciałem HIV. W szczególności wiązanie nowo wyizolowanego przeciwciała neutralizującego HIV-1 (bNAb), PG9, z mieszaniną blisko rozmieszczonego Man5GlcNAc2 (Man5) i 2,6-di-sjalylowanego kompleksu dwuantenowego typu N-glikan (SCT) na matrycy ACG, otwiera nową drogę do kierowania skutecznym projektem immunogenu do opracowania szczepionki przeciwko HIV. Ponadto nasza matryca ACG stanowi potężne narzędzie do badania innych przeciwciał HIV pod kątem wiązania hetero-ligandów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N-glikany na glikoproteinach są kowalencyjnie połączone z resztą asparaginy (Asn) konsensusu Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, które wpływają na kilka procesów biologicznych, takich jak konformacja białka, antygenowość, rozpuszczalność i rozpoznawanie lektyn1,2. Synteza chemiczna oligosacharydów sprzężonych z N stanowi poważne wyzwanie syntetyczne ze względu na ich ogromną mikroniejednorodność strukturalną i wysoce rozgałęzioną architekturę. Staranny dobór grup ochronnych w celu dostrojenia reaktywności bloków budulcowych, osiągnięcie selektywności w centrach anomerycznych oraz właściwe użycie promotora/aktywatora (aktywatorów) są kluczowymi elementami syntezy złożonych oligosacharydów. Aby rozwiązać ten problem złożoności, niedawno zgłoszono ogromną ilość pracy nad postępem w syntezie N-glikanów3,4. Pomimo tych solidnych podejść, znalezienie skutecznej metody przygotowania szerokiej gamy N-glikanów (~20 000) pozostaje poważnym wyzwaniem.

Szybkie tempo mutacji HIV-1 w celu osiągnięcia rozległej różnorodności genetycznej i jego zdolności do ucieczki przed neutralizującą odpowiedzią przeciwciał, jest jednym z największych wyzwań dla opracowania bezpiecznej i profilaktycznej szczepionki przeciwko HIV-15,6,7. Jedną ze skutecznych taktyk stosowanych przez wirusa HIV w celu uniknięcia odpowiedzi immunologicznej gospodarza jest potranslacyjna glikozylacja glikoproteiny otoczki gp120 z różnorodnymi glikanami sprzężonymi z N pochodzącymi z maszynerii glikozylacji gospodarza8,9. Niedawny raport dotyczący dokładnej analizy rekombinowanej monomerycznej glikozylacji gp120 HIV-1 z ludzkich embrionalnych komórek nerki (HEK) 293T sugeruje występowanie mikroheterogeniczności strukturalnej z charakterystycznym wzorcem specyficznym dla komórki10,11,12. Dlatego zrozumienie specyficzności glikanowej bNAbs HIV-1 wymaga dobrze scharakteryzowanych struktur N-glikanów związanych z gp120 w ilości wystarczającej do analizy.

Odkrycie technologii mikromacierzy glikanowych umożliwiło wysokoprzepustową eksplorację specyficzności różnorodnych białek wiążących węglowodany, wirusów/adhezyn bakteryjnych, toksyn, przeciwciał i lektyn13,14. Systematyczne ułożenie glikanów w formacie opartym na układach scalonych może określić problematyczne interakcje białko-glikany o niskim powinowactwie poprzez wielowartościową prezentację15,16,17,18. Ten układ glikanów oparty na chipie wydaje się skutecznie naśladować interfejsy komórka-komórka. Aby wzbogacić technologię i przezwyciężyć nierówny problem związany z konwencjonalnymi formatami matryc, nasza grupa opracowała niedawno matrycę glikanów na szkiełku pokrytym tlenkiem glinu (ACG) przy użyciu glikanów zakończonych kwasem fosfonowym w celu zwiększenia intensywności sygnału, jednorodności i czułości19,20.

Aby poprawić obecną wiedzę na temat epitopów glikanowych nowo wyizolowanych przeciwciał neutralizujących HIV-1 (bNAbs), opracowaliśmy wysoce efektywną strategię modułową do przygotowania szerokiej gamy glikanów sprzężonych z N21,22 do wydrukowania na slajdzie ACG (zobacz Rysunek 1). Badania profilowania swoistości bNAb HIV-1 na matrycy ACG wykazały niezwykłe wykrycie hetero-glikanowego zachowania wiązania bardzo silnego bNAb PG9, który został wyizolowany od osób zakażonych wirusem HIV23,24,25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie modułów ramienia D1/D222

  1. Przygotowanie produktu pośredniego 2
    1. Zważyć materiał wyjściowy 1 (pokazany w Rysunek 2, p-metoksyfenylo-O-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo-(1→2)-α-D-mannopiranozyd (100 mg, 0,204 mmol)) do probówki o pojemności 15 ml i rozpuścić w buforze Tris (25 mM, pH 7,5) zawierającym dichlorek manganu (MnCl2, 10 mM) do uzyskania końcowego stężenia glikanu 5 mM.
    2. Dodaj 2 odpowiedniki galaktozy difosforanu urydyny (UDP-Gal).
    3. Dodać 150 jednostek enzymu β-1, 4 transferazy galaktozylowe z mleka krowiego i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 15 godzin.
    4. Po 15 godzinach przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową (TLC) w celu wskazania całkowitego zużycia materiału wyjściowego poprzez namierzenie mieszaniny reakcyjnej na płytce TLC, wywołanie n-butanolem/kwasem octowym/wodą (H2O) w stosunku 1:1:1 i barwienie roztworem 0,25 M molibdenianu cerowo-amonowego, a następnie ogrzewanie. Następnie wygasić reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 90 oC przez 5 minut.
    5. Odwirować mieszaninę reakcyjną z prędkością 2,737 x g przez 3 minuty i załadować supernatant na szczyt kolumny z żelem poliakrylamidowym (patrz tabela materiałów). Eluować kolumnę za pomocą destylowanej wody dejonizowanej i zebrać produkt z frakcjami 1 - 2 ml.
    6. Monitoruj zebrane frakcje za pomocą TLC26, rozwijając n-butanolem: H2O: kwas octowy w stosunku 1:1:1 i barwiąc roztworem molibdenianu ceru amonowego, a następnie ogrzewając. Liofiliza27 produkt zawierający frakcje do otrzymania produktu pośredniego 2 (115 mg, 86%) w postaci białego proszku. Scharakteryzuj produkt za pomocą NMR28 i spektroskopii mas29 (patrz Plik danych uzupełniających).
  2. Przygotowanie produktu pośredniego 3
    1. Zważyć materiał wyjściowy 2 (pokazany w Rysunek 2, p-metoksyfenylo-O-β-D-galaktopiranozylo-(1→4)-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo-(1→2)-α-D-mannopiranozyd (80 mg, 0,122 mmol)) w probówce o pojemności 15 ml i rozpuścić go w buforze Tris (25 mM, pH 7,5) zawierającym MnCl2 (10 mM) w celu przygotowania końcowego stężenia glikanu 5 mM.
    2. Dodaj 2 odpowiedniki soli disodowej 5'-difosfo-β-L-fukozy guanozyny (GDP-Fuc).
    3. Dodać 150 jednostek enzymu α-1, 3 transferazy fukozylowe z Helicobacter pylori (Hp1-3FTΔ26695) i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 oC przez 15 godzin.
    4. Wykonaj krok 1.1.4.
    5. Wykonaj krok 1.1.5.
    6. Wykonaj krok 1.1.6, aby otrzymać produkt pośredni 3 (82 mg, 84%) w postaci białego proszku. Scharakteryzować produkt za pomocą NMR i spektroskopii mas (patrz plik danych uzupełniających).
  3. Przygotowanie modułów 4 i 5
    1. Zważyć związek 2, p-metoksyfenylo-O-β-D-galaktopiranozylo-(1→4)-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo-(1→2)-α-D-mannopiranozyd (0,230 g, 0,360 mmol) lub związek 3,p-metoksyfenylo-O-β-D-galaktopiranozylo-(1→4)-[α-L-fukopirazylo-(1→3)-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo]-(1→2)-α-D-mannopiranozyd (0,100 g, 0,125 mmol) do 25 ml pojedynczej szyjki kolby okrągłodennej i suszyć w próżni przez 30 min.
    2. Wyjmij kolbę z próżni, napełnij ją azotem gazowym, dodaj mieszadło magnetyczne, przykryj gumową przegrodą i przymocuj balon z azotem.
    3. Wstrzyknąć 7 ml suchej pirydyny i 3 ml bezwodnika octowego (Ac2O) do kolby umieszczonej na łaźni lodowej w temperaturze 0 o°C. Mieszać wynikową reakcję przez 12 godzin w temperaturze pokojowej za pomocą mieszadła magnetycznego przy 600-700 obr./min. Odparować rozpuszczalniki za pomocą wyparki obrotowej pod ciśnieniem 0 - 10 mbar w temperaturze 50 °C.
    4. Rozcieńczyć surową mieszaninę przy użyciu 30 ml dichlorometanu (DCM) i ekstrahować nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (NaHCO3) (2 x 20 ml) do lejka separacyjnego o pojemności 50 ml.
    5. Ponownie ekstrahować warstwę wodną za pomocą DCM (3 x 15 ml) i wysuszyć połączone warstwy organiczne na siarczanie sodu. Usunąć siarczan sodu przez filtrację i przemyć DCM (5 ml). Odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej przy ciśnieniu podciśnienia 400 mbar w temperaturze 40 °C.
    6. Załaduj roztwór surowej mieszaniny do 2 ml DCM na wierzchu złoża krzemionki.
    7. Eluować kolumnę mieszaniną zawierającą toluen i aceton z 0 - 20% acetonu w toluenie i zebrać frakcje 5 - 10 ml.
    8. Monitorować zebrane frakcje za pomocą TLC (kroki 1.1.4 i 1.1.6), rozwijając toluenem/acetonem (7/3) i barwiąc roztworem molibdenianu ceru amonowego, a następnie ogrzewając na płycie grzejnej.
    9. Odparuj produkt zawierający frakcje za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać pożądane produkty w postaci białej piany odpowiednio z wydajnością 72% i 85%.
    10. Rozpuścić produkty w 7 ml acetonitrylu: toluen: H2O w stosunku 4:2:1 w kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml.
    11. Dodać azotan ceru amonu (2 równoważniki) schładzając do 0 oC w łaźni lodowej. Mieszać reakcję w temperaturze pokojowej przez 3 godziny przy ~500 - 800 obr./min.
    12. Po wskazaniu całkowitego zużycia materiału wyjściowego przez TLC (TLC rozwijające się toluenem/acetonem (7/3) i uwidocznione przez absorbancję UV przy 254 nm lub przez barwienie roztworem molibdenianu cerowo-amonowego, a następnie przez ogrzewanie), rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną octanem etylu (30 ml) i ekstrahowaćH2O(15 x 2 ml).
    13. Ekstrahować połączone warstwy organiczne za pomocą 5 ml nasyconego roztworu chlorku sodu (NaCl).
    14. Odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej przy ciśnieniu podciśnienia 240 mbar w temperaturze 40 °C.
    15. Załaduj roztwór produktu surowego do 2 ml DCM na wierzchu złoża krzemionki. Eluować kolumnę mieszaniną zawierającą toluen i aceton (0 - 20% acetonu w toluenie) i zebrać frakcje 5 - 10 ml. Monitorować zebrane frakcje za pomocą TLC, rozwijając się z toluenem/acetonem (7/3).
    16. Odparować frakcje zawierające produkt za pomocą wyparki obrotowej w temperaturze próżni 77 mbar i temperaturze 40 oC, aby uzyskać pożądane produkty w postaci białych pian.
    17. Rozpuścić odpowiednie alkohole w 10 ml DCM w kolbie okrągłodennej z pojedynczą szyjką o pojemności 25 ml i schłodzić do temperatury -30 °C.
    18. Dodać trifluorek dietyloaminosiarki (DAST, 2 odpowiedniki). Mieszaninę reakcyjną mieszać w temperaturze -30 oC przez 2 godziny.
    19. Po wskazaniu TLC zużycia materiału wyjściowego (TLC rozwijający się toluenem/acetonem (4/1) i uwidoczniony przez absorbancję UV przy 254 nm lub przez barwienie roztworem molibdenianu ceru amonowego, a następnie ogrzewanie), rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną DCM (30 ml) i przemyć nasyconym NaHCO3 (15 x 2 ml).
    20. Ekstrahować połączoną warstwę organiczną za pomocą 5 ml nasyconego roztworu NaCl, wysuszyć ją dodając bezwodny siarczan magnezu, przefiltrować mieszaninę po przemyciu DCM (5 ml) i zebrać ją do 100-mililitrowej kolby okrągłodennej z pojedynczą szyjką.
    21. Odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej przy ciśnieniu podciśnienia 400 mbar w temperaturze 40 °C.
    22. Załadować roztwór produktu surowego w 2 ml DCM na wierzch złoża krzemionki. Eluować kolumnę mieszaniną toluenu i acetonu (0-20% acetonu w toluenie) i zebrać frakcje 5-10 ml.
    23. Monitorować zebrane frakcje za pomocą TLC, rozwijając się z toluenem/acetonem (7/3).
    24. Odparować produkt zawierający frakcje za pomocą wyparki obrotowej w celu uzyskania pożądanych produktów 4,[2,3,4,6-O-tetraacetylo-β-D-galaktopiranozylo]-(1→4)-[3,6-O-diacetylo-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo]-(1→2)-3,4,6-O-triacetylo-α-D-mannopiranozylofluorku (54% w 2 etapach) i 5,[2,3,4,6-O-tetraacetylo-β-D-galaktopiranozylo]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetylo-α-L-fukopirazylo-(1→3)-3, Fluorek 6-O-diacetylo-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo]-(1→2)-3,4,6-O-triacetylo-α-D-mannopiranozylu (67% w 2 etapach) w postaci białych ciał stałych.
    25. Scharakteryzować produkt za pomocą NMR i spektroskopii mas (patrz plik danych uzupełniających).

2. Przygotowanie glikanu 10

  1. Przygotowanie intermidiatu 7
    1. Odważyć triflaty srebra (AgOTf) (0,039 g, 0,155 mmol), dichlorek bis(cyklopentadienylo)hafnu(IV) (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0,108 mmol) do kolby okrągłodennej o pojemności 25 ml z pojedynczą szyjką, wysuszyć pod próżnią Schlenk przez 30 minut, usunąć z próżni i napełnić azotem gazowym.
    2. Przenieść świeżo wysuszone 4 A sita molekularne (0,2 g) do kolby zawierającej AgOTf i Cp2HfCl2, dodać mieszadło magnetyczne, natychmiast przykryć przegrodą i dodać balon z azotem.
    3. Przenieść 3 ml suchego toluenu do kolby za pomocą strzykawki z suchego szkła. Mieszaninę reakcyjną mieszać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie schłodzić do 0 oC.
    4. Wstrzyknąć roztwór donora 4 (Rysunek 2, 0,043 g, 0,046 mmol) i akceptora 6, 5,5-azydofoto-O-2-O-acetylo-4,6-O-benzylidyno-β-D-mannopiranozylo-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoksy-2-(2,2,2-trichloroetoksy)karbonyloamino-β-D-glukopiranozylo)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoksy-2-(2,2,2-trichloroetoksy)karbonyloamino-β-D-glukopiranozyd (Rysunek 3, 0,045 g, 0,031 mmol) w 3 ml toluenu do kolby przez przegrodę za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml w temperaturze 0 oC. Mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
    5. Po wskazaniu TLC zużycia materiałów wyjściowych (TLC, wywoływanie za pomocą DCM/acetonu (8,5/1,5) i wizualizacja za pomocą absorbancji UV przy 254 nm lub barwienie roztworem molibdenianu cerowo-amonowego, a następnie ogrzewanie), należy wygasić reakcję, wstrzykując 10 równoważników trietyloaminy.
    6. Przefiltrować sita molekularne przez złoże celitu do kolby okrągłodennej o pojemności 50 ml, a następnie przemyć 10 ml octanu etylu. Ekstrahować połączone warstwy organiczne nasyconym roztworem wodnego roztworu NaHCO3 (2 x 20 ml) w lejku separacyjnym o pojemności 50 ml. Ekstrahować warstwę wodną octanem etylu (3 x 15 ml).
    7. Wyekstrahować połączone warstwy organiczne nasyconym roztworem NaCl (5 ml), wysuszyć go przy użyciu bezwodnego siarczanu magnezu, przefiltrować mieszaninę w celu usunięcia siarczanu magnezu, przemyć octanem etylu (3 x 15 ml) i zebrać filtrat do kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml.
    8. Odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej przy ciśnieniu podciśnienia 240 mbar w temperaturze 40 °C.
    9. Załaduj roztwór produktu surowego w DCM na kolumnę złoża krzemionki. Eluować kolumnę mieszaniną zawierającą DCM i aceton (0-10% acetonu w DCM) i zebrać frakcje 5-10 ml.
    10. Monitorować zebrane frakcje za pomocą TLC, rozwijając się za pomocą DCM/acetonu (8,5/1,5). Odparować frakcje zawierające produkt za pomocą wyparki obrotowej w celu otrzymania intermidiatu 7,5-azydofoto-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetylo-β-D-galaktopiranozylo]-(1→4)-[3,6-O-diacetylo-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetylo-α-D-mannopiranozylo]}-(1→3)-[2-O-acetylo-4,6-O-benzylidyno-β-D-mannopiranozylo-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoksy-2-(2,2,2-trichloroetoksy)karbonyloamino-β- D-glukopiranozylo)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoksy-2-(2,2,2-trichloroetoksy)karbonyloamino-β-D-glukopiranozyd (0,052 g, 70%), w postaci białej piany.
    11. Scharakteryzować produkt za pomocą NMR i spektroskopii mas (patrz plik danych uzupełniających).
  2. Przygotowanie intermidiatu 8
    1. Zważyć heksasacharyd 7 (Rysunek 3, 0,040 g, 0,016 mmol) do kolby okrągłodennej o pojemności 25 ml z pojedynczą szyjką, wysuszyć pod próżnią przez 1 godzinę, usunąć z próżni, napełnić azotem, dodać mieszadło magnetyczne i przykryć gumową przegrodą.
    2. Przenieść 3 ml acetonitrylu:metanolu (MeOH) (w stosunku 2:1) do kolby.
    3. Dodać jednowodny kwas p-toluenosulfonowy (0,001 g, 0,008 mmol) do kolby reakcyjnej i mieszać reakcję z prędkością 800 obr./min przez 5 godzin.
    4. Po wskazaniu przez TLC zużycia materiału wyjściowego (TLC, rozwijanie za pomocą DCM/acetonu (8,5/1,5) i wizualizacja przez absorbancję UV przy 254 nm lub przez barwienie roztworem molibdenianu ceru amonowego, a następnie ogrzewanie), wygasić reakcję przez wstrzyknięcie 10 równoważników trietyloaminy.
    5. Odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej przy ciśnieniu podciśnienia 337 mbar w temperaturze 40 oC.
    6. Rozpuść surową mieszaninę w około 2 ml DCM i załaduj ją na wierzch złoża krzemionki.
    7. Eluować kolumnę mieszaniną DCM i acetonu (0-10 % acetonu w DCM) i zebrać frakcje 5-10 ml. Monitorować zebrane frakcje za pomocą TLC, rozwijając się za pomocą DCM/acetonu (8,5/1,5). Odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej w próżni 400 mbar i temperaturze 40 oC.
    8. Wysuszyć pozostałość pod zmniejszonym ciśnieniem w celu uzyskania pośredniego ciśnienia 8,5-5-azydo-O-(2-O-acetylo-3,4,6-tri-O-benzylowego) w celu uzyskania →3)-2-O-acetylo-4,6-O-benzylidyno-β-D-mannopiranozylo-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoksy-2-ftalimido-β-D-glukopiranozylo)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoksy-2-ftalimido-nzylo-2-deoksy-2-deoksy-2-ft. (Rysunek 3, 0,022 g, 57%) jako białe ciało stałe. Scharakteryzować produkt za pomocą NMR i spektroskopii mas (patrz plik danych uzupełniających).
  3. Przygotowanie intermidiatu 9
    1. Przygotowanie intermidiatu 9 (Rysunek 3) zostało zrealizowane przy użyciu donora 5 (0,015 g, 13,2 μmol) i akceptora 8 (Rysunek 3, 0,020 g, 8,80 μmol).
    2. Jako promotory zastosowano AgOTf (0,011 g, 44,1 μmol) i Cp2HfCl2 (0,012 g, 30,8 μmol).
    3. Wykonaj czynności 2.Wykonaj czynności 2.1,1 do 2.1.10, aby uzyskać pośrednie 9,5-azydopentylo-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetylo-β-D-galaktopiranozylo]-(1→4)-[3,6-O-diacetylo-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetylo-α-D-mannopiranozylo]}-(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetylo-β-D-galaktopiranozylo]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetylo-α-LS160fukopirazylo-(1→3)-3,6-O-diacetylo-2-acetamido-2-deoksy-β- D-glukopiranozylo]-(1→2)-3,4,6-O-triacetylo-α-D-mannopiranozylo}-(1→6)-[2-O-acetylo-β-D-mannopiranozylo-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoksy-2-(2,2,2-trichloroetoksy)karbonyloamino-β-D-glukopiranozylo)-(1O-benzyl-2-deoksy-2-(2,2,2-trichloroetoksy)karbonyloamino-β-D-glukopiwoźnylo)-D-glukopikry (0,010 g, 34%), jako biała piana.
  4. Globalna deprotekcja intermidiat
    1. Zważyć związek 9 (0,010 g, 2,9 μmol) do kolby okrągłodennej o pojemności 25 ml z pojedynczą szyjką, dodać mieszadło magnetyczne, nakryć gumową przegrodą i przymocować balon z azotem.
    2. Przenieść 2 ml 1,4 dioksanu:H2O(4:1) do kolby. Dodać wodorotlenek litu (LiOH) (0,005 g, 50% wag.) do kolby. Mieszaninę reakcyjną mieszać w temperaturze 90-100 oC przez 12 godzin i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej.
    3. Odparować rozpuszczalniki za pomocą wyparki obrotowej i wysuszyć kolbę w próżni przez 1 godzinę, napełnić ją azotem, wyjąć z kolektora próżniowego i przykryć gumową przegrodą.
    4. Wstrzyknąć 4 ml suchej pirydyny i 2 ml bezwodnika octowego do kolby przez przegrodę za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml w temperaturze 0 oC. Mieszać mieszaninę reakcyjną przez 12 godzin w temperaturze pokojowej.
    5. Odparować rozpuszczalniki za pomocą wyparki obrotowej przy ciśnieniu 0-10 mbar w temperaturze 50 °C.
    6. Rozpuścić surową mieszaninę przy użyciu 30 ml DCM i wyekstrahować roztwór nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 (2 x 20 ml) w lejku separacyjnym o pojemności 50 ml.
    7. Ponownie usunąć warstwę wodną za pomocą DCM (3 x 15 ml). Odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej.
    8. Załadować roztwór produktu w około 2 ml DCM na wierzch złoża krzemionki C18. Eluować kolumnę mieszaniną wody i metanolu (0 - 100% metanolu w wodzie) i zebrać frakcje 5 - 10 ml.
    9. Zebrać frakcje produktu i odparować pod zmniejszonym ciśnieniem, aby uzyskać pożądany produkt w postaci białej piany.
    10. Rozpuścić produkt w 5 ml suchego metanolu w kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml i przykryć ją gumową przegrodą.
    11. Przenieść 0,1 ml m«tlenku sodu (NaOMe) do metanolu i schłodzić do temperatury 0 °C w łaźni lodowej i mieszać mieszaninę przez 12 godzin.
    12. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej i wysuszyć produkt w wysokiej próżni.
    13. Rozpuścić produkty surowe w 5 ml metanolu:H2O: kwasu octowego (6:3:1).
    14. Dodać wodorotlenek palladu (Pd(OH)2) (50% wag.) i mieszać reakcję w atmosferze wodoru za pomocą balonu wodorowego przez 15 godzin.
    15. Przefiltrować reakcję przez złoże celitowe i przemyć 2 ml metanolu, a następnie 2 ml dd wody.
    16. Odparować rozpuszczalniki za pomocą wyparki obrotowej.
    17. Rozpuść surową mieszaninę w około 1 ml wody i załaduj ją na wierzch złoża żelu poliakryloamidowego (patrz Tabela materiałów). Produkt przepłukać wodą i zebrać frakcje 1 - 2 ml.
    18. Monitorować zebrane frakcje za pomocą TLC, rozwijać za pomocą n-butanolu:H2O: kwasu octowego (1:1:1).
    19. Zebrać frakcje produktu i liofilizować, aby uzyskać pożądany produkt 10,5-aminoopentylo-β-D-galaktopiranozylo-(1→4)-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo-(1→2)-α-D-mannopiranozylo]-(1→3),-[β-D-galaktopiranozylo-(1→4)-(α-L-fukopirazylo-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo)-(1→2)-α-D-mannopiranozylo]-(1→6)-β-D-mannopiranozylo-(1→4)-2- acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo-(1→4)-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozyd (0,002 g, 36%), w postaci białego proszku.
    20. Scharakteryzować produkt za pomocą NMR i spektroskopii mas (patrz plik danych uzupełniających).

3. Przygotowanie glikanów z kwasem fosfonowym Tail19,22

  1. Zważyć odpowiedni glikan (2–5 μmol) w kolbie okrągłodennej o pojemności 5 ml, dodać mieszadło magnetyczne i przykryć go gumową przegrodą.
  2. Przenieść 400 μl świeżo suszonego dimetyloformamidu.
  3. Dodać [2 (2 (bis (benzyloksy) fosforyl) etoksyetoksy) etylowy (2,5-dioksopirolidyn1-ylo)węglan] (10 - 25 μmol, przygotowany w domu) do roztworu glikanu. Mieszaj mieszaninę przy 800 obr./min przez 5 godzin.
  4. Odparować rozpuszczalniki za pomocą wyparki obrotowej przy ciśnieniu podciśnienia 5 - 10 mbar w temperaturze 40 oC.
  5. Rozpuścić mieszaninę reakcyjną w 0,5 ml wody i załadować na wierzch złoża żelu poliakryloamidowego (patrz tabela materiałów). Produkt należy wypłukać wodą i zebrać frakcje 1-2 ml.
  6. Monitoruj zebrane frakcje według TLC26. Umieścić mieszaninę reakcyjną na płytce TLC i dodać roztwór barwienia 0,25 M molibdenianu cerowo-amonowego; Następnie podgrzej za pomocą płyty grzejnej. Zebrać produkt zawierający frakcje i poddać go liofilizacji, aby uzyskać pożądany produkt w postaci białego proszku.
  7. Rozpuścić produkt w 2 ml wody i dodać Pd (OH)2 (50% wagowo). Mieszaj reakcję przy 800 obr./min w atmosferze wodoru za pomocą balonu wodorowego przez 15 godzin.
  8. Przefiltrować reakcję przez złoże kalcynowane topnikiem i przemyć 2 ml metanolu, a następnie 2 ml destylowanej wody dejonizowanej. Odparować rozpuszczalniki za pomocą wyparki obrotowej przy ciśnieniu podciśnienia 300 mbar w temperaturze 40 oC.
  9. Rozpuść surową mieszaninę w około 1 ml wody i załaduj ją na wierzch złoża żelu poliakryloamidowego (patrz Tabela materiałów).
  10. Produkt przepłukać wodą i zebrać frakcje 1 - 2 ml. Monitoruj zebrane frakcje za pomocą TLC26. Liofilizuj frakcje (zamroź produkt za pomocą ciekłego azotu, a następnie umieść na liofilizatorze pod próżnią), aby uzyskać pożądany produkt w postaci białego proszku. Scharakteryzować produkty za pomocą NMR i spektroskopii mas (patrz plik danych uzupełniających) przy użyciuD2Ojako rozpuszczalnika.

4. Tablica glikanów

  1. Przygotowanie szkiełek ze szkła powlekanego aluminium (ślizg ACG)19,20,22
    UWAGA: Produkcja szkiełek ze szkła pokrytego aluminium została wykonana w Wydziale Technologii Cienkowarstwowych, Centrum Badań nad Technologią Przyrządów i Narodowych Laboratoriach Badań Stosowanych w Parku Naukowym Hsinchu na Tajwanie.
    1. Zapakuj powlekane szkiełka, uszczelnij je próżniowo, aby zapobiec tworzeniu się NAO, i trzymaj szczelnie zamknięte do czasu reakcji elektrochemicznej anodowania powierzchniowego.
  2. Anodowanie powierzchni szkiełek ze szkła powlekanego aluminium19,20,22
    1. Ustawić inkubator z kontrolowaną temperaturą na 4 °C. Przygotować 0,3 M wodny roztwór kwasu szczawiowego i przechowywać go w łaźni lodowej. Weź zlewkę o pojemności 500 ml, dodaj mieszadło magnetyczne.
    2. Przenieść 0,3 M kwas szczawiowy do zlewki o pojemności 500 ml, a następnie umieścić w roztworze platynowy pręt o długości 10 cm jako katodę. Mieszaj (przy 300 obr./min) kwas szczawiowy przez cały proces anodowania.
    3. Włącz oprogramowanie do śledzenia laboratoryjnego, kliknij przycisk "skonfiguruj", a następnie "wybór funkcji przemiataj napięcie". Ustaw napięcie startu i zatrzymania na 25,8 V, liczbę punktów na 100, zgodność na 1, a opóźnienie przemiatania na 1,200 ms i kliknij "ok".
    4. Clamp szklaną stronę pokrytą aluminium skierowaną w stronę katody. Kliknij przycisk "uruchom test". Przestrzegać pomiaru prądu (~8 - 10 mA).
    5. Po anodowaniu powierzchniowym dokładnie umyj szkiełko wodą podwójnie destylowaną, osusz gazowym azotem, a następnie przechowuj w komorze o wilgotności względnej 30% do dalszego użycia.
  3. Produkcja mikromacierzy glikanów ACG22
    1. Przygotować indywidualnie 100 μl wszystkich glikanów jednowartościowych (I-XI) w glikolu etylenowym o stężeniu 10 mM.
    2. Rozcieńczyć powyższy glikan buforem drukującym (80% glikolu etylenowego i 20% wody dejonizowanej) do uzyskania stężenia 100 μM.
    3. Do badania heteroligandów należy przygotować 5 μl pojedynczych glikanów I-XI, a do każdego dodać 5 μl Man5GlcNAc2 (stosunek 1:1).
    4. Drukuj mikromacierze za pomocą zrobotyzowanego pina (patrz Tabela materiałów) poprzez nałożenie 0,6 nL wcześniej przygotowanych glikanów na szkiełka ACG31.
    5. Przechowuj wydrukowane preparaty w suchym pudełku o kontrolowanej wilgotności przed testem wiązania.
  4. Mapowanie epitopów glikanów wirusa HIV-1 szeroko neutralizującego przeciwciało PG922
    1. Przygotować 1 ml buforu PBST zawierającego BSA, 3% w/v.
    2. Przygotować 70 μl PG9 (50 μg/ml) w buforze PBST (bufor PBST zawierający BSA, 3% w/v).
    3. Przygotować 120 μl przeciwciała przeciwko wtórnemu znacznikowi fluorescencyjnemu Donkey Anti-Human IgG (sprzężona z Alexa Fluor 647) 50 μg/ml w buforze PBST (bufor PBST zawierający BSA, 3% w/v) w ciemności.
    4. Wymieszać przeciwciało pierwszorzędowe (PG9) i przeciwciało z drugorzędowym znacznikiem fluorescencyjnym w stosunku 1:1 (po 60 μl każdy). Inkubować wstępnie zmieszane przeciwciała przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Załaduj szkiełko ACG do komory inkubacyjnej szkiełka, która jest podzielona na 16 dołków. Przenieść 100 μl wstępnie zmieszanych przeciwciał do układu glikanowego i inkubować w temperaturze 4 °C przez 16 godzin.
    6. Odpipetować wstępnie zmieszane przeciwciała. Wyjąć komorę inkubacyjną szkiełka.
    7. Najpierw umyj szkiełko w buforze PBST (PBS i 0,05% Tween-20), a następnie w wodzie dejonizowanej i odwiruj do sucha w temperaturze 2,000 x g.
    8. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu mikromacierzy (patrz tabela materiałów). Wstawianie slajdu z elementami ustawionymi w szyku skierowanym w dół.
    9. Kliknij menu "ustawienia", ustaw rozdzielczość obrazu na 5 μm na piksel, a długość fali na 635 nm z PMT450 i mocą na 100%.
    10. Kliknij przycisk "skanuj", aby rozpocząć obrazowanie slajdu.
    11. Kliknij ikonę "plik", aby zapisać zeskanowany obraz w formacie tif.
    12. Wykonaj analizę obrazu, postępując zgodnie z instrukcją obsługi oprogramowania32.
    13. Oblicz całkowitą intensywność fluorescencji i zilustruj ją za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu33 (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: W tym miejscu średni błąd procentowy dla wszystkich punktów danych jest przedstawiony za pomocą słupków błędów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modułowa strategia chemoenzymatyczna do syntezy szerokiej gamy N-glikanów jest przedstawiona w Rysunek 1. Strategia opiera się na fakcie, że różnorodność może być tworzona na początku przez chemoenzymatyczną syntezę trzech ważnych modułów, a następnie przez swoistą dla α mannozylację w pozycji 3-O i/lub 6-O reszty mannozy wspólnego rdzeniowego trisacharydu N-glikanów. Biorąc pod uwagę różnorodność strukturalną struktur N-gl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klasa bNAb HIV-1, w tym PG9, PG16 i PGTs 128, 141-145, okazała się bardzo skuteczna w neutralizowaniu 70-80% krążących izolatów HIV-1. Epitopy tych bNAb są wysoce konserwatywne wśród wariantów całej grupy M HIV-1, dlatego mogą kierować skutecznym projektem immunogenowym szczepionki przeciwko HIV w celu wywołania przeciwciał neutralizujących 23,24,25. W ramach naszych ciągłych wysiłków zmierzających do zidentyfikowania epitopów g...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Wydziałowi Technologii Cienkowarstwowej, Centrum Badań nad Technologią Instrumentów (ITRC) oraz Narodowym Laboratoriom Badań Stosowanych, Park Naukowy Hsinchu, Tajwan. Prace te były wspierane przez Krajową Radę Nauki (grant nr 1). MOST 105-0210-01-13-01) oraz Academia Sinica.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowySigma Aldrich64197
AcetonitrylSigma Aldrich75058
Bezwodnik octowySigma Aldrich108247
Bezwodny siarczan magnezuSigma Aldrich7487889
Eterian etylowy trifluorku boruSigma Aldrich109637
Albumina surowicy bydlęcejSigma Aldrich9048468
Bio-Gel P2 poliakryloamidBio-Rad1504118
Dichlorek bis(cyklopentadienylo)hafnu(IV)Sigma Aldrich12116664
β-1,4 Galaktozylotransferazy z mleka krowiegoSigma Aldrich48279
BioDot Technologia kartezjanowa z robotycznym pinem SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)Arrayit
Molibdenian ceru amonuTCIC1794
Azotan ceru amonuSigma Aldrich16774213
Szkiełko czyste Schott 
Kwas cytydyno-5′-monofosfo-N-acetyloneuraminowySigma Aldrich3063716
Deuterowany chloroformSigma Aldrich865496
Osioł Anty-ludzka IgG (Alexa Fluor647 sprzężonaJackson Immuno Research, USA709605098
DichlorometanSigma Aldrich75092
Trifluorek dietyloaminosarkiSigma Aldrich38078090
DimetyloformamidSigma Aldrich68122
Octan etyluSigma Aldrich141786
Glikol etylenowyAcros Organic107211
FAST Szkiełka ramoweSigma Aldrich
Guanozyna 5'- sól disodowa difosfo-b-L-fukozy Oprogramowanie Sigma Aldrich15839700
Lab tracer 2.0 Sekcja 4 protokołu
Czytnik GenePix Pro 4300A (analiza obrazu mikromacierzy)urządzenia molekularnewww.moleculardevices.com
Oprogramowanie GraphPad Prism (przetwarzanie obrazu)GraphPad Software, Inchttp://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Wodorotlenek lituSigma Aldrich1310652
Chlorek manganuSigma Aldrich7773015
MetanolSigma Aldrich67561
N-butanolSigma Aldrich71363
Kwas szczawiowyAcros Organiczny144627
Wodorotlenek palladuSigma Aldrich12135227
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemThermo Fisher Scientific 
PirydynaSigma Aldrich110861
Kwas P-toluenosulfonowy jednowodnySigma Aldrich773476
Srebrna triflataSigma Aldrich2923286
Wodorowęglan soduSigma Aldrich144558
Chlorek soduSigma Aldrich7647145
Sód wodórSigma Aldrich144558
Mettlenek sodu Sigma Aldrich124414
Siarczan soduSigma Aldrich7757826
Toluen Bufor Sigma Aldrich108883
Tris AmrescoN/AUltra-czysty gatunek
Tween-20Amresco9005645
galaktoza difosforanu urydyny (UDP-galaktoza)Sigma Aldrich137868521
10010023

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317(2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094(2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581(2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes? J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
  33. GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

N glycan ArrayGlycan MicroarrayAluminum Oxide GlassHeteroligand BindingPG9 AntibodyMass SpectrometrySurface AnodizationGlycan Synthesis

Powiązane artykuły