Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55862

⸱

4 września 2017

 ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2College of Pharmacy, Chung-ang University

W tym artykule

Podsumowanie

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Streszczenie

Podczas endocytozy, na zakończeniach nerwowych pobierane są połączone pęcherzyki synaptyczne, co pozwala na recykling pęcherzyków, a tym samym utrzymanie transmisji synaptycznej podczas powtarzającego się uruchamiania nerwów. Upośledzona endocytoza w stanach patologicznych prowadzi do zmniejszenia siły synaps i funkcji mózgu. W tym miejscu opisujemy metody stosowane do pomiaru endocytozy pęcherzyków synaptycznych w synapsie hipokampa ssaków w hodowli neuronalnej. Monitorowaliśmy endocytozę białka pęcherzyków synaptycznych poprzez fuzję białka błony pęcherzykowej synapty, w tym synaptofizyny i VAMP2 / synaptobrewiny, po stronie światła pęcherzyka, z pHluoryną, wrażliwym na pH zielonym białkiem fluorescencyjnym, które zwiększa intensywność fluorescencji wraz ze wzrostem pH. Podczas egzocytozy pH światła pęcherzyków wzrasta, natomiast podczas endocytozy pH światła pęcherzyków ulega ponownemu zakwaszeniu. Zatem wzrost intensywności fluorescencji pHluoryny wskazuje na fuzję, podczas gdy spadek wskazuje na endocytozę znakowanego białka pęcherzyków synaptycznych. Oprócz zastosowania metody obrazowania pHluorin do rejestracji endocytozy, monitorowaliśmy endocytozę błony pęcherzykowej za pomocą pomiarów mikroskopii elektronowej (EM) wychwytu peroksydazy chrzanowej (HRP) przez pęcherzyki. Na koniec monitorowaliśmy powstawanie jam błony zakończeń nerwowych w różnych momentach po wysokiej depolaryzacji wywołanej potasem. Przebieg w czasie wychwytu HRP i tworzenia się jam błonowych wskazuje na przebieg endocytozy w czasie.

Wprowadzenie

Neuroprzekaźniki są przechowywane w pęcherzykach synaptycznych i uwalniane przez egzocytozę. Błona pęcherzyków synaptycznych i białko są następnie internalizowane przez endocytozę i ponownie wykorzystywane w następnej rundzie egzocytozy. Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest ważna dla utrzymania puli pęcherzyków synaptycznych i usuwa wystające pęcherzyki z błony komórkowej. Wrażliwe na pH zielone białko fluorescencyjne pHluorin, które jest wygaszane w kwaśnych warunkach i gaszone w neutralnym pH, zostało użyte do pomiaru przebiegu endocytozy w żywych komórkach1,2,3. Białko pHluorin jest zwykle przyłączone do strony świetlnej białek pęcherzyków synaptycznych, takich jak synaptofizyna lub VAMP2 / synaptobrewina. W stanie spoczynku pHluorin jest wygaszana w świetle pęcherzyków synaptycznych o pH 5,5. Fuzja pęcherzyków z błoną plazmatyczną wystawia światło pęcherzyka na działanie roztworu zewnątrzkomórkowego, w którym pH wynosi ~ 7,3, co powoduje wzrost fluorescencji pHluoryny. Po egzocytozie zwiększona fluorescencja zanika w wyniku endocytozy białek pęcherzyków synaptycznych, po której następuje ponowne zakwaszenie pęcherzyków w obrębie odzyskanych pęcherzyków. Chociaż rozpad odzwierciedla zarówno endocytozę, jak i ponowne zakwaszenie pęcherzykowe, głównie odzwierciedla endocytozę, ponieważ ponowne zakwaszenie jest szybsze niż endocytoza w większości stanów1,4. Stała czasowa ponownego zakwaszenia wynosi 3-4 s lub mniej5,6, co jest na ogół szybsze niż 10 s lub więcej wymagane dla endocytozy pęcherzyków4,5. Jeśli potrzebne są eksperymenty w celu odróżnienia endocytozy od ponownego zakwaszenia, można zastosować eksperymenty z wygaszaniem kwasem przy użyciu roztworu kwasu 4-morpholineethanosulfonowego (MES) (25 mM) o pH 5,5 w celu określenia, czy białka pęcherzyków synaptycznych są pobierane z błony komórkowej za pomocą endocytozy1,3,4. Tak więc wzrost intensywności fluorescencji pHluorin odzwierciedla równowagę egzo- i endocytozy, a spadek po stymulacji nerwów specyficznie odzwierciedla endocytozę.

obrazowanie pHluorin może być używane nie tylko do pomiaru przebiegu endocytozy w czasie, ale także do pomiaru wielkości pul pęcherzyków synaptycznych 7,8, oraz prawdopodobieństwa wywołanego uwolnienia i spontanicznego uwolnienia9. Wiele czynników i białek biorących udział w regulacji endocytozy, takich jak wapń, rozpuszczalne białka receptora białka przyłączającego NSF (SNARE), neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) i kalcyneuryna zostały zidentyfikowane za pomocą obrazowania pHluorin1,2,10,11,12,13,14,15,16. Co więcej, uwalnianie neuroprzekaźnika można wykryć nie tylko w neuronach pierwotnych, ale także w komórkach nerwiaka zarodkowego z TIRFM17. Ostatnio opracowano warianty pHluorin, dsRed, mOrange i pHTomato do monitorowania jednoczesnych zapisów wielu czynników w jednej synapse18,19. Na przykład, pHTomato został połączony z synaptofizyną i użyty z genetycznie kodowanym wskaźnikiem wapnia (GCaMP5K) do monitorowania fuzji pęcherzyków presynaptycznych i napływu Ca2+ w przedziale postsynaptycznym 20. Dlatego pHluoryna przyłączona do białek synaptycznych stanowi użyteczną metodę analizy związku między endocytozą a egzocytozą.

EM to kolejna metoda powszechnie używana do badania endocytozy, ze względu na wysoką rozdzielczość przestrzenną, która pokazuje ultrastrukturalne zmiany podczas endocytozy. Dwa ogólne obszary to zdolność do wizualizacji zmian patologicznych w komórkach neuronalnych21 oraz śledzenie białek pęcherzyków22. W szczególności obserwacja wychwytu pęcherzyków synaptycznych, krzywizny błony pokrytej klatryną w strefie periaktywnej oraz struktur endosomalnych jest możliwa dzięki EM3,23,24,25,26,27,28. Podczas gdy EM wiąże się z potencjalnymi artefaktami, takimi jak wady rozwojowe wywołane fiksatywem, które mogą wpływać na endocytozę, a analiza danych jest pracochłonna, rozdzielczość zapewnia atrakcyjną okazję do wizualizacji struktury komórkowej. Potencjalne problemy z utrwalaniem i ograniczenie rozdzielczości czasowej EM można przezwyciężyć poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, zapewniając szybką i niechemiczną metodę stabilizacji delikatnych struktur obecnych podczas endocytozy27.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Poniższy protokół opisuje metody obrazowania z wykorzystaniem pHluoryny oraz metody EM zastosowane w hodowlach neuronów hipokampa. pHluoryna pozwala monitorować pobieranie białek pęcherzyków synaptycznych w żywych komórkach, natomiast EM umożliwia wykrycie pobierania pęcherzyków synaptycznych oraz zmian ultrastrukturalnych.

Opieka nad zwierzętami oraz procedury były zgodne z wytycznymi NIH i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Wykorzystania NIH.

1. Obrazowanie pHluoriny

  1. Kultura neuronów hipokampa
    1. Przygotować bufor do hipokampusa (HB), łącząc 4 mM NaHCO33 oraz 5 mM HEPES i dostosować pH do 7,3 za pomocą 5 M NaOH. Pożywkę hodowlaną przygotować poprzez zmieszanie medium Neurobasal, 2% B27, 0,5 mM L-glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny. Dodatkowo przygotować mieszaninę buforu HB z 20% płodową surowicą bydlęcą (HB/20% FBS).
      UWAGA: Niniejszy protokół hodowli opiera się na pracy Sankaranarayanan, i wsp.29 oraz Wui wsp.24
    2. Zdekapituj szczenięta myszy w okresie od 0. do 2. dnia po urodzeniu do podłoża hodowlanego, a następnie wyizoluj mózg do 4 °C HB/20% FBS. Usunąć pień mózgu i wzgórze, aby odsłonić hipokampy. Wypreparować hipokampy po ich odsłonięciu poprzez usunięcie pnia mózgu i wzgórza, a następnie przenieść do świeżego 4 °C HB/20% FBS.
      UWAGA: Zazwyczaj wydajność wynosi około 4 x 105 komórek/ml dla jednego szczenięcia (dwóch hipokampów). Usunąć przylegające błony za pomocą pęsety lub nożyczek, a następnie przenieść do świeżego 4 °C HB/20% FBS. Rozwinąć zakręt zębaty i wyizolować subiculum, wycinając go nożyczkami, a następnie przenieść do świeżego 4 °C HB/20% FBS.
    3. Każdy hipokamp należy podzielić, przecinając go od jednego końca do drugiego, na około 10 plastrów, a następnie przenieść je do stożkowej probówki z polipropylenu o pojemności 15 ml.
    4. Po odczekaniu do osadzenia się tkanki, przemyć ją 10 ml HB/20% FBS, a następnie trzykrotnie przemyć 10 ml HB.
    5. Przygotować roztwór trawienny o stężeniu 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 7 mM Na2HPO44, oraz 25 mM HEPES, a następnie dostosować pH do wartości 7,2 za pomocą 5 M NaOH. Usunąć naddestylat z hipokampów. Do 2 ml roztworu do trawienia dodać 10 mg trypsyny i 1 mg DNazy, a następnie przefiltrować przez sterylny 0.22 µm membranę bezpośrednio na osad próbki.
    6. Inkubować hipokampy przez 5 min w temperaturze 37 °Cnastępnie dwukrotnie przemyć 10 ml buforu HB z 20% FBS, a następnie jednokrotnie przemyć 10 ml buforu HB.
    7. Rozdzielić komórki przy użyciu 6 mg MgSO44∙7H2i 1 mg DNazy do 2 ml HB, a następnie przefiltrować przez sterylny filtr na osad z hipokampów 0.22 µm przefiltrować. Delikatnie rozdzielić komórki poprzez ostrożne triturację, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Pozostawić cząstki tkanki do osadzenia się przez 2 min, a następnie powoli przenieść nadsącz do innej probówki.
    8. Do zawiesiny komórkowej dodać 3 ml HB/20% FBS, a następnie wirować przez 10 min przy 4 °C przy 10 obr./min. Odrzucić nadsącz i resuspender w pożywce hodowlanej.
    9. Wysiać 60 0 komórek w zawiesinie w 150 µL pożywka hodowlana na szkiełku nakrywce o średnicy 25 mm pokrytym poli-D-lizyną, bez przelania poza obręb szkiełka. Po 2 godzinach od wysiewu dodać 2 ml uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej. Szkiełka nakrywki przechowuje się w 6-dołkowych płytkach hodowlanych lub sterylnych szalkach Petriego.
    10. Hodować komórki w 37 °C w 5% CO22 w nawilżonym inkubatorze w pożywce hodowlanej przez 14–21 dni przed rejestracją. W czasie wzrostu kultury należy dwukrotnie w tygodniu wymieniać górną połowę pożywki.
  2. Transfekcja
    1. 6-7 dni po wysianiu, przeprowadzić transfekcję synaptofizyny-pHluorin 2X (SpH) lub VAMP2-pHluorin do neuronów hipokampa. W przypadku SpH należy zastosować promotor cytomegalowirusowy (CMV), wstawiony do wektora pcDNA3.30W przypadku VAMP2-pHluorin należy zastosować promotor CMV wstawiony do wektora pCI31.
    2. Transfekuj wybrany wektor do komórek docelowych za pomocą nośnika lipidowego, stosując 1 µg plazmidu. Do transfekcji należy użyć pożywki hodowlanej z kroku 1.1.1 protokołu, która nie zawiera surowicy. Po 2 h od transfekcji należy wymienić pożywkę w celu zmniejszenia toksyczności.
      UWAGA: W przypadku niskiej ekspresji SpH w butonach, należy zwiększyć stężenie DNA do 2 µg lub czas inkubacji z nośnikiem lipidowym, chyba że komórki są w złym stanie. Zazwyczaj transfekcji poddano od 4 do 10 neuronów (0,06–0,08%).
  3. Mikroskopia świetlna
    1. Przygotować roztwór soli fizjologicznej składający się z 19 mM NaCl i 2 mM CaCl22, 2,5 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM glukozy, 2 mM MgCl22, 0,01 mM 6-cyano-7-nitrochinoksalin-2,3-dionu (CNQX) oraz 0,05 mM kwasu DL-2-amino-5-fosfonowalerowego (AP5). Wyjąć szkiełko nakrywką z płytki z podłożem hodowlanym i umieścić na komorze obrazowania umożliwiającej stymulację polową, stosując smar i uszczelniacz, aby zapobiec wyciekom. Aby zapobiec wyschnięciu szkła podczas przenoszenia szkiełka nakrywki z płytki do komory, należy niezwłocznie dodać 750 µL roztwór soli fizjologicznej
      UWAGA: Do zablokowania aktywności postsynaptycznej, która może prowadzić do aktywności nawrotnej, zastosowano CNQX oraz AP5. Przed umieszczeniem komory na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym należy upewnić się za pomocą chusteczek do czyszczenia, że komora nie przecieka. Powolny wyciek powoduje zmiany ogniskowania podczas rejestracji na skutek mieszania się soli fizjologicznej z olejkiem imersyjnym, co prowadzi do zmian współczynnika załamania światła.
    2. Stymulacja i rejestracja
      1. Obrazowanie za pomocą odwróconego mikroskopu szerokopolowego z obiektywem imersyjnym olejowym 60X (apertura numeryczna 1,4) z lampą halogenkową. Wizualizacja pHluoryny przy użyciu zestawu filtrów z pikiem pobudzenia 480 nm, lustra długoprzechodniego 490 nm, filtra emisyjnego 50-50 nm oraz ręcznej przysłony obrotowej. Przechwytywanie obrazów co 10 ms, z binningiem 2 x 2, przy użyciu kamery EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device).
        UWAGA: Aby uzyskać odpowiednie warunki pozwalające uniknąć fotoblaknięcia, należy wziąć pod uwagę kilka parametrów, w tym odstępy między poszczególnymi klatkami obrazu, filtry oraz binning, które są zależne od zastosowanego sprzętu. W przypadku obrazowania konfokalnego należy uwzględnić moc lasera oraz czas ekspozycji, aby zapobiec fotoblaknięciu. Konfigurację ustalono po rejestracji trwającej co najmniej 3 min bez stymulacji, a następnie przeprowadzono pomiar przez co najmniej 10 s bez stymulacji w celu sprawdzenia występowania fotoblaknięcia.
      2. W każdym eksperymencie należy wybrać obszar o wysokiej gęstości boutonów, aby ułatwić analizę. Komórki transfektowane należy identyfikować po sygnale zielonej fluorescencji, zwracając szczególną uwagę na okrągłe lub owalne wzorce ekspresji w boutonach oraz ciągłość ekspresji pomiędzy nimi.
      3. Wywołaj endocytozę poprzez stymulację polową, stosując impuls o czasie trwania 1 ms i natężeniu potencjału czynnościowego (AP) 20 mA, generowany przez stymulator impulsowy i dostarczany poprzez elektrodę platynową w jednostce izolacji stymulacji. Obrazuj aktywność fluorescencyjną w trakcie stymulacji oraz podczas regeneracji komórki.
        UWAGA: W przypadku martwych komórek ekspresja była silniejsza niż w żywych zakończeniach presynaptycznych (boutons) i wykazywała mozaikowy wzorzec rozmieszczenia pomiędzy nimi.
  4. Analiza obrazu
    1. Aby przeanalizować intensywność fluorescencji w pojedynczym boutonie, ustaw obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 1,5 x 1.5 µm kwadrat; rozmiar Boutona mieści się w granicach około 1.5 µmNależy wykorzystać zapisy sprzed stymulacji do sprawdzenia stopnia fotowybielania i odjąć je jako tło.
    2. Znormalizuj zmianę fluorescencji (ΔF) za pomocą równania: Wzór na obliczenie ΔF dla analizy zmian fluorescencji; schemat równania naukowego.
      gdzie Fmaksymalny oraz F0 odnoszą się odpowiednio do maksymalnego wzrostu po stymulacji oraz fluorescencji bazowej. Prędkości endocytozy należy mierzyć jako szybkość spadku w ciągu pierwszych 4–10 s po osiągnięciu punktu maksymalnego fluorescencji pHluoryny. Stałą czasową (τ) endocytozy wyznacza się poprzez dopasowanie funkcji monoeksponencjalnej do spadku fluorescencji pHluoryny od punktu szczytowego do poziomu bazowego.

2. Mikroskopia elektronowa

  1. Przygotuj płytkę 6-dołkową powleczoną poli-D-lizyną, nakładając do każdego dołka 1,5 mL 0,01% sterylnie filtrowanego roztworu poli-D-lizyny na 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie płcząc trzy razy sterylizowaną wodą. Wypreparuj, hoduj i utrzymuj neurony hipokampa zgodnie z krokami 1.1.1, 1.1.2 i 1.1.3 odpowiednio.
  2. Przygotuj roztwór stymulujący z wysoką zawartością K+ z HRP o składzie: 31,5 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 90 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM glukozy, 2 mM MgCl2, 0,01 mM CNQX, 0,05 mM AP5 oraz 5 mg/mL HRP, a następnie dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5 M NaOH.
    1. Stymuluj hodowlę neuronów hipokampa 1,5 mL roztworem stymulującym z wysoką zawartością K+ w temperaturze pokojowej (oznaczonym jako K+), dodając 1,5 mL do każdego dołka przez 90 s. W warunkach spoczynkowych (oznaczonych jako R) zastosuj to samo stężenie 5 mg/mL HRP przez 90 s, ale w roztworze soli fizjologicznej. Dla próbki regeneracyjnej zastosuj roztwór stymulujący z wysoką zawartością K+ tak jak w próbce K+, następnie szybko wypłucz i zastąp solą fizjologiczną oraz inkubuj przez 10 min.
  3. Fiksacja i barwienie
    1. Przygotuj 0,1 M bufor kakodylanowy sodu, używając 21,4 g/L kakodylanu sodu przy pH 7,4. Utrwal komórki 4% glutaraldehydem w 0,1 M buforze kakodylanowym sodu przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej. Płucz trzy razy 0,1 M buforem kakodylanowym sodu po 7 min za każdym razem.
    2. Przygotuj roztwór diaminobenzydyny (DAB), składający się z 0,5 mg/mL DAB z 0,3% H2O2 w ddH2O, i przefiltruj go przez filtr 0,2 µm. Nałóż 1,5 mL roztworu DAB na 30 min w temperaturze 37 °C. Płucz trzy razy 0,1 M buforem kakodylanowym sodu po 7 min za każdym razem.
      OSTRZEŻENIE: DAB jest toksyczny i podejrzewany o działanie rakotwórcze. Należy używać rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.
      UWAGA: Znakowanie DAB wynika z jego utleniania przez H2O2, katalizowanego przez HRP. Niewielkie zwiększenie ilości składników prowadzi do wzmocnienia sygnału w próbce. Zwiększenie stężenia HRP przyspiesza działanie katalizatora. Wystarczająco duże stężenia H2O2 umożliwiają zachodzenie szkodliwych reakcji pobocznych z HRP, hamując efekt znakowania32. W niniejszej pracy stężenia tego systemu znakowania zostały dobrane na podstawie aktualnie dostępnych badań3,34.
    3. Inkubuj neurony z 1,5 mL 1% OsO4 w 0,1 M buforze kakodylanowym sodu przez 1 h w temperaturze 4 °C jako post-fiksację. Płucz trzy razy 1,5 mL 0,1 M buforem kakodylanowym sodu po 7 min za każdym razem.
      OSTRZEŻENIE: Ze względu na toksyczność i reaktywność OsO4, w wielu przypadkach preferowane jest trzymanie próbki w lodzie w dygestorium zamiast inkubacji w lodówce.
    4. Przygotuj 0,1 M bufor octanu sodu z 13,61 g/L octanu sodu i 1,43 mL/L octu lodowego przy pH 5,0. Płucz trzy razy 1,5 mL 0,1 M buforem octanowym o pH 5,0 po 7 min za każdym razem i inkubuj z 1,5 mL 1% octanu uranylowego w 0,1 M buforze octanowym o pH 5,0 przez 1 h w temperaturze 4 °C. Płucz trzy razy 1,5 mL 0,1 M buforem octanowym po 7 min za każdym razem.
  4. Zatapianie w żywicy epoksydowej
    1. Odwodnij hodowlę neuronów pojedynczymi płukaniami 1,5 mL 50%, 70% i 90% etanolu przez 7 min w każdym z nich, a następnie wykonaj 3 płukania 1,5 mL 10% etanolem przez 7 min każde w dygestorium.
    2. Zmieszaj 485 mL/L żywicy epoksydowej bisfenolu-A-(epichlorohydryny), 160 mL/L bezwodnika dodecenylosuccynowego (DDSA), 340 mL/L bezwodnika metylo-5-norborneno-2,3-dikarboksylowego (NMA) i 15 mL/L 2,4,6-tris(dimetylaminometylu)fenolu (DMP-30), aby stworzyć żywicę epoksydową. Wymieszaj dokładnie, a następnie przechowuj w próżni, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
      UWAGA: Kluczowe jest usunięcie pęcherzyków powietrza z żywicy, szczególnie tych mniejszych niż widoczne gołym okiem, ponieważ mogą one powodować powstanie kawern w żywicy podczas skrawania.
    3. Przeprowadź infiltrację próbki, zastępując etanol 50% żywicą epoksydową w etanolu przez 30 min w temperaturze pokojowej na wytrząsarce, a następnie 70% żywicą epoksydową w etanolu przez 30 min w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
    4. Zastąp roztwór żywicy epoksydowej 10% żywicą epoksydową i inkubuj przez 10 min w temperaturze 50 °C. Przeprowadź dwie wymiany na świeżą 10% żywicę epoksydową z inkubacjami przez 1 h w temperaturze 50 °C. Dodaj świeżą 10% żywicę epoksydową i pozostaw do utwardzenia w temperaturze 50 °C przez noc, a następnie w 60 °C przez ponad 36 h do pełnego utwardzenia.
  5. Usuń każdą próbkę z płytki wielodołkowej za pomocą jubilerskiej piłki ręcznej. Wybierz obszary zainteresowania, o dużym zagęszczeniu komórek, używając odwróconego mikroskopu świetlnego, a następnie wytnij bloki o wymiarach 70 do 80 nm do skrawania mikrotomem. Zamocuj wycięty obszar w uchwycie mikrotomu i załaduj mikrotom. Ustaw uchwyt w mikrotomie i zamontuj nóż diamentowy krawędzią równolegle do powierzchni bloku. Zbieraj przekroje o grubości 70 do 80 nm bezpośrednio na poszczególne siatki.
  6. Rozpuść octan uranylowy w wodzie, aby uzyskać 1% roztwór wagowy, a oddzielnie rozpuść cytrynian ołowiu w wodzie, aby uzyskać 3% roztwór wagowy. Wykonaj przeciwbarwienie przekrojów poprzez zanurzenie w 1% wodnym roztworze octanu uranylowego przez 15 min, a następnie w 3% wodnym cytrynianie ołowiu przez 5 min, aby poprawić kontrast próbek.
  7. Obrazowanie EM
    1. Zbadaj przekroje za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego i zarejestruj obrazy za pomocą cyfrowej kamery CCD przy powiększeniu pierwotnym 10 0-20 0X3.
  8. Statystyka
    1. Przeprowadź test t, aby zidentyfikować istotne różnice poprzez porównanie średniej i standardowego błędu pomiaru (s.e.m.) między próbkami kontrolnymi a eksperymentalnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Za pomocą metody nośnika lipidowego SpH został wyeksprymowany w neuronach hipokampa, co umożliwiło identyfikację pęcherzyków (Rycina 1a). Elektryczne podrażnienie komórek wywołało egzocytozę oraz odpowiadające jej zwiększenie intensywności fluorescencji. Wzrost fluorescencji (ΔF) został zatrzymany po zakończeniu bodźca (Rycina 1b). Po zwiększonej fluorescencji nastąpił powolny spadek, spowodowany endocytozą. W przypadku VAMP2-pHl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj pokazujemy dwie metody monitorowania endocytozy pęcherzyków synaptycznych. W pierwszej metodzie monitorowaliśmy pHluorynę połączoną z białkiem pęcherzyków synaptycznych w transfekowanych neuronach, a następnie stymulowaną elektrycznie. Po drugie, zastosowaliśmy obrazowanie EM wychwytu HRP indukowanego przez KCl. Używaliśmy różnych bodźców z dwóch powodów. Po pierwsze, wysoka dawka potasu indukuje depolaryzację wszystkich neuronów w kulturze. Ułatwia to badanie EM, biorąc pod uwagę, że nasza metodologia EM nie była ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Yong-Ling Zhu za dostarczenie konstruktu synaptophysin-pHluorin2x oraz dr Jamesowi E. Rothmanowi za dostarczenie VAMP2-phluorin. Dziękujemy dr Susan Cheng i Virginii Crocker z NINDS Electron Microscopy Facility za ich wsparcie techniczne i pomoc. Praca ta była wspierana przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke Intramural Research Program w USA oraz grant z Programu Inicjatywy Badawczej KRIBB (Korean Biomedical Scientist Fellowship Program), Koreański Instytut Badawczy Bionauk i Biotechnologii, Republika Korei.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lipofectamine LTX z PlusThermo Fisher15338-100Transfekcja plazmidowego DNA, w tym synaptofizyny lub pożywki neurobazalnej VAMP2-pHluorin
Thermo Fisher21103-049Pożywka wzrostowa dla neuronów, Rozgrzej do 37° C przed użyciem
B27Thermo Fisher17504-044Gradient do różnicowania neuronów
GlutamaxThermo Fisher35050-061Gradient do hodowli neuronów
Szkiełko nakrywkowe powlekane poli-D-lizynąNeuvitroGG-25-pdlPodłoże do wzrostu neuronów i obrazowania pHluorin
Trypsyna XI z trzustki bydłaSigmaT1005Neuronal kulturo-trawienie tkanek hipokampa
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcejSigmaD5025Hodowla neuronów hamuje stymulator impulsów zawiesiny komórek lepkich
Systemy AMmodel 2100Zastosuj stymulację elektryczną
Kąpiel szczelinowa ze stymulacją polaWarner InstrumentsRC-21BRFS
jednostkę izolacyjną bodźcaWarner InstrumentsSIU102Zastosuj smar do stymulacji elektrycznej
Dow corning111pHluorin obrazowanie-uszczelka z szkiełkiem nakrywkowym i komorą obrazowania, unikaj wycieku z komory
AP5Tocris3693Gradient dla normalnej soli fizjologicznej, selektywny antagonista receptora NMDA, hamuje aktywność postsynaptyczną, która ma potencjał do nawracającej aktywności
CNQXTocris190Gradient dla normalnej soli fizjologicznej, konkurencyjnego antagonisty receptora AMPA/kainian, hamuje aktywność postsynaptyczną, która ma potencjał do powtarzającej się aktywności
OświetlaczNikonC-HGFIŹródło światła metalohalogenkowego do kamery pHluorin
EMCCDAndoriXon3obrazowanie pHluorin, wykrywanie intensywności fluorescencji pHluorin
Mikroskopia odwróconaNikonTi-EObrazowanie dla komórek transfekowanych synaptofizyną lub VAMP2 pHluoryny
NIS-Elements ARNIS-Elements Zaawansowaneoprogramowanie badawcze do akwizycji i analizy obrazowania
Igor ProWaveMetricsIgor proOprogramowanie do analizy obrazowania i prezentacji danych
komora obrazowaWarner InstrumentsRC21Bobrazowanie pHluoryny, zastosuj stymulację pola na żywych komórkach
poli-l-lizynaSigmaP4832Mikroskopia elektronowa, podłoże do wzrostu neuronów, nakładać na płytkę wielodołkową przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie 3 razy przemyć wysterylizowaną wodą
Peroksydaza chrzanowa (HRP)SigmaP6782Mikroskopia elektronowa, znakowanie endocytozowanych pęcherzyków synaptycznych poprzez katalizowanie DAB w obecności nadtlenku wodoru, końcowe stężenie wynosi 5 mg / ml w normalnej soli fizjologicznej, przed użyciem przygotować świeże
Na kakodylanMikroskopia elektronowa Sciences12300Mikroskopia elektronowa, bufor do utrwalaczy i płukania, stężenie końcowe wynosi 0,1 N
3,3′-diaminobenzydyna(DAB)SigmaD8001Mikroskopia elektronowa, znakowanie endocytozowanych pęcherzyków synaptycznych, substrat dla HRP, stężenie końcowe wynosi 0,5 mg / ml w DDW i filtrowane, przed użyciem odświeżyć
Roztwór nadtlenku wodoruSigmaH1009Mikroskopia elektronowa, znakowanie endocytozowanych pęcherzyków synaptycznych poprzez indukcję reakcji HRP-DAB, końcowe stężenie wynosi 0,3% w DDW, odświeżyć przed użyciem
aldehyd glutarowyMikroskopia elektronowaSciences 16365Mikroskopia elektronowa, utrwalacze, stężenie końcowe wynosi 4% w buforze Na-kakodylanu, przed użyciem przygotować na świeżość, dobrze wstrząsnąć przed użyciem
TEMJEOL200CXMikroskopia elektronowa, obrazowanie endocytozowanych pęcherzyków i zmian ultrastrukturalnych
Kamera cyfrowa CCDAMTXR-100Mikroskopia elektronowa, rejestrowanie obrazów
Cytrynian ołowiuMikrosystemy Leica16707235Mikroskopia elektronowa, barwienie siatkowe
Zastosuj stymulacji elektrycznej

Bibliografia

  1. Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
  2. Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
  3. Wu, X. -S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
  4. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
  5. Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
  6. Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
  7. Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
  8. Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
  9. Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
  10. Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
  11. Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
  12. Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
  13. Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
  14. Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
  15. Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
  16. Wu, L. -G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
  17. Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267(2015).
  18. Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
  19. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  20. Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658(2014).
  21. Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -È Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060(2016).
  22. Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
  23. Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
  24. Wu, Y., O'Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621(2014).
  25. Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
  26. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
  27. Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
  28. Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
  29. Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
  30. Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
  31. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  32. Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
  33. Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
  34. Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
  35. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
  36. Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
  37. Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
  38. Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392(2015).
  39. Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
  40. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
  41. Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  42. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
  43. Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obrazowanie pHluorinąmikroskopia elektronowawychwyt peroksydazy chrzanowejpęcherzyki powlekane klatrynąstymulacja wysokim stężeniem potasuzatapianie w żywicy epoksydowejbarwienie octanem uranyluformowanie wlewków błonowych
Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.