Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55871

⸱

6 listopada 2017

 ,  ,  , 
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Streszczenie

Neurony ziarniste móżdżku (CGN) są powszechnie używanym modelem neuronalnym, tworzącym obfitą, jednorodną populację w móżdżku. W świetle ich rozwoju pourodzeniowego, obfitości i dostępności, CGN są idealnym modelem do badania procesów neuronalnych, w tym rozwoju neuronów, migracji neuronów i stymulacji fizjologicznej aktywności neuronalnej. Ponadto hodowle CGN stanowią doskonały model do badania różnych sposobów śmierci komórki, w tym ekscytotoksyczności i apoptozy. W ciągu tygodnia w hodowli CGN wyrażają receptory N-metylo-D-asparaginianu (NMDA), specyficzny jonotropowy receptor glutaminianu o wielu krytycznych funkcjach w zdrowiu i chorobie neuronów. Dodanie niskich stężeń NMDA w połączeniu z depolaryzacją błony do pierwotnych kultur CGN gryzoni zostało wykorzystane do modelowania fizjologicznej stymulacji aktywności neuronalnej, podczas gdy dodanie wysokich stężeń NMDA można zastosować do modelowania ekscytotoksycznego uszkodzenia neuronów. Opisano tu metodę izolacji i hodowli CGN od 6-dniowych szczeniąt, a także manipulację genetyczną CGN przez adenowirusy i lentiwirusy. Przedstawiamy również zoptymalizowane protokoły dotyczące stymulowania ekscytotoksyczności wywołanej przez NMDA, apoptozy wywołanej niskim poziomem potasu, stresu oksydacyjnego i uszkodzenia DNA po transdukcji tych neuronów.

Wprowadzenie

Neurony ziarniste móżdżku (CGN) są dobrze scharakteryzowane w kulturze i posłużyły jako skuteczny model do badania śmierci i rozwoju neuronów 1,2,3,4,5,6. Wczesna ekspresja receptorów N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) w hodowlach CGN in vitro czyni je atrakcyjnym modelem do badania sygnalizacji indukowanej przez NMDA. Aktywacja tych receptorów za pomocą NMDA w połączeniu z depolaryzacją błony jest wykorzystywana do modelowania fizjologicznej stymulacji aktywności neuronalnej i pozwoliła na badania nad mechanizmami plastyczności synaptycznej 7,8. Wręcz przeciwnie, nadmierna stymulacja tych receptorów przez ligand NMDA może być wykorzystana do modelowania ekscytotoksyczności, głównego mechanizmu utraty neuronów w ostrym uszkodzeniu mózgu i chorobach neurodegeneracyjnych 9. Jednym z mechanizmów indukcji ekscytotoksyczności jest głód ATP ze zmniejszoną ilością tlenu, co obserwuje się w przypadku ostrego uszkodzenia neuronów. Powoduje to depolaryzację błony i podwyższony poziom uwalniania glutaminianu w synapsie. Późniejsza nadmierna stymulacja receptora NMDA przez podwyższony poziom glutaminianu powoduje nadmierny napływ Ca2 + przez te receptory, co z kolei aktywuje kilka szlaków, w tym proteazy aktywowane przez Ca2 +, fosfolipazy i endonukleazy, co skutkuje niekontrolowaną degradacją krytycznych składników komórkowych i śmiercią komórki. Dodatkowo, wysoki wewnątrzkomórkowy Ca2+ prowadzi do generowania wolnych rodników tlenowych i uszkodzeń mitochondriów 10,11.

Chociaż większość utraty neuronów w wyniku ekscytotoksyczności neuronalnej wywołanej przez NMDA jest spowodowana napływem wapnia i jest niezależna od Bax/Bak, inne mechanizmy śmierci komórki nie mogą być wyłączone z tego modelu. Pojawienie się zarówno nekrotycznej, jak i apoptotycznej śmierci komórek z powodu ekscytotoksyczności jest częściowo spowodowane wytwarzaniem reaktywnych form tlenu (ROS) i uszkodzeniem DNA spowodowanym wysokimi wewnątrzkomórkowymi poziomami Ca2+ 12. Uszkodzenie DNA powoduje śmierć neuronów poprzez mechanizmy apoptotyczne, co jest skorelowane z cechami charakterystycznymi apoptotycznej śmierci komórki, takimi jak pojawienie się mas chromatyny i ciał apoptotycznych. Indukcja apoptozy odbywa się za pośrednictwem uwalniania cytochromu c z mitochondriów i wykazano, że jest zależna od oligomeryzacji Bax/Bak 13. Oligomeryzacja Bax/Bak sprzyja tworzeniu się porów w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, powodując uwalnianie cytochromu c i aktywację regulatorów proapoptotycznych, co widać w przypadku łagodnego uszkodzenia niedokrwiennego 14.

Generowanie ROS jest poważnym problemem w mózgu ze względu na niski endogenny poziom przeciwutleniaczy, w połączeniu z dużym zapotrzebowaniem na tlen dla funkcjonowania neuronów 15. Pod wpływem zdarzenia niedokrwiennego syntaza tlenku azotu jest regulowana w górę, wytwarzając tlenek azotu i zwiększając reaktywne formy tlenu 14. Zwiększone stężenie rodników tlenowych może skutkować uszkodzeniem DNA i pośrednio powodować głód energii. Wysoki poziom dwuniciowych pęknięć DNA jest korygowany przez aktywację polimerazy poli ADP-rybozy-1 (PARP-1), białka związanego z chromatyną eukariotyczną odpowiedzialnego za katalizowanie transferu jednostek ADP-rybozy z NAD+, proces integralny z naprawą DNA 16. Jednak przy nadmiernych uszkodzeniach spowodowanych stresem oksydacyjnym, aktywacja PARP-1 może powodować głód energii z powodu zwiększonego drenażu NAD +, niezbędnego substratu do produkcji ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. Ostatecznie stres oksydacyjny wywoła apoptozę w sposób zależny od Bax/Bak, prowadząc do uwolnienia mitochondrialnego cytochromu c i wykazano, że indukuje przebudowę mitochondriów w CGN 17.

Na koniec, zmiany stężenia chlorku potasu (KCl) w kulturach CGN mogą być wykorzystane do modelowania apoptozy za pośrednictwem niskiego poziomu potasu/depolaryzacji 18,19,20. Pod wpływem niskich poziomów K+, CGN ulegają wyraźnym zmianom fizjologicznym, co skutkuje zmniejszeniem zarówno oddychania mitochondrialnego, jak i glikolizy, przypisywanym zmniejszonemu zapotrzebowaniu komórkowemu 21, a także zmniejszeniu poziomu czynnika jądrowego-κB (NFκB), który reguluje działania, w tym stan zapalny i transmisję synaptyczną 22. Model ten jest szczególnie interesujący dla badań nad śmiercią komórki podczas rozwoju neuronów. Środowisko o niskim współczynniku K+ bardziej przypomina warunki fizjologiczne i powoduje oznaki śmierci komórki widoczne podczas rozwoju neuronów 23.

Podsumowując, CGN-y dostarczają długotrwałego modelu do badania leżących u podstaw molekularnych mechanizmów śmierci i degeneracji neuronów. Poniższy protokół pozwoli na izolację i hodowlę CGN, ekspresję lub represję określonego szlaku genetycznego za pomocą wirusów oraz indukcję śmierci neuronów poprzez różne mechanizmy reprezentujące uszkodzenie i zwyrodnienie neuronów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół opiera się na modyfikacjach procedur, które zostały opisane wcześniej 18,24,25,26,27. Protokół ten został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie McGill.

1. Przygotowanie do eksperymentu

UWAGA: Następujące roztwory podstawowe mogą być przygotowane i utrzymywane aż do użycia.

  1. Rozwiązanie do rozwarstwiania
    1. Rozpuścić 3,62 g chlorku sodu (NaCl), 0,2 g chlorku potasu (KCl), 0,069 g fosforanu sodu (NaH2PO4 ∙ H2O) i 1,306 g D-(+)-glukozy w 500 ml destylowanegoH2O. Następnie do roztworu dodać 12,5 ml buforu HEPES, 450 μl roztworu czerwieni fenolowej i 20 ml frakcji B V. Dostosować do pH 7,4 za pomocą 1 N wodorotlenku sodu (NaOH).
    2. Sterylizować filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. To rozwiązanie pozostanie stabilne przez okres od tygodnia do 10 dni.
  2. trypsyna
    1. Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 25 g/l trypsyny w 0,9% chlorku sodu. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
  3. Inhibitor trypsyny
    1. Przygotować bulion o stężeniu 10 mg/ml, rozpuszczając 1 g inhibitora trypsyny białka jaja kurzego w 100 ml 1 mM HCl. Przechowywać ten roztwór w temperaturze -20 °C.
  4. Strefa DNaza
    1. Rozpuść 100 mg DNazy 1 w 10 ml sterylnej wody, aby uzyskać zapas 10 mg/ml. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
  5. MgSO4
    1. Dodać 6,02 g siarczanu magnezu (MgSO4) do 50 ml wody destylowanej (H2O), aby uzyskać 1 M zapas. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  6. CaCl 2
    1. Rozpuścić 0,735 g chlorku wapnia (CaCl2∙ 2H2O) w 50 ml destylowanegoH2Odo stężenia podstawowego 100 mM. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  7. Kcl
    1. Rozpuścić 3,7275 g KCl w 50 ml destylowanegoH2Odo stężenia podstawowego 1 M. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  8. D-(+)-glukoza
    1. Rozpuścić 1,802 g D-(+)-glukozy w 50 ml destylowanegoH2Odo stężenia podstawowego 100 mM. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  9. Pożywki do hodowli komórkowych
    1. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych w następujący sposób: 5 ml inaktywowanej termicznie dializowanej płodowej surowicy bydlęcej, 500 μl 200 mM L-glutaminy, 100 μl 50 mg/ml Gentamycyny i 1 ml 1,0 M KCL należy dodać do 45 ml minimalnej niezbędnej pożywki Eagle'a sterylizowanej filtrem (E-MEM), którą uzupełnia się 1,125 g / l D-glukozy w celu wytworzenia 50 ml pożywki do hodowli neuronów ziarnistych móżdżku. Przechowuj nośniki w temperaturze 4 °C.
  10. Cytozyna Beta-D-Arabino Furanoside
    1. Rozpuścić 48 mg beta-D-arabino furanozydu cytozyny w 10 ml pożywki wzrostowej do stężenia podstawowego 20 mM. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
  11. Poli-D-lizyna
    1. Aby wytworzyć zapas poli-D-lizyny o stężeniu 2 mg/ml, dodaj 10 ml sterylnegoH2Odo 20 mg poli-D-lizyny. Zapas poli-D-lizyny należy przechowywać w temperaturze -80 °C w 100 μl podwielokrotności.
  12. UWAGA: Następujące roztwory należy przygotować przed rozbioru i utrzymywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  13. MgSO4 Uzupełniony roztwór preparacyjny
    1. Dodać 300 μl wywaruMgSO4 do 250 ml roztworu rozwarstwiającego.
  14. Roztwór do rozwarstwiania trypsyny
    1. Dodać 100 μl trypsyny i 12 μl MgSO 4 do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.
  15. Roztwór inhibitora trypsyny 1
    1. Dodać 164 μl podstawowego inhibitora trypsyny, 250 μl podstawowej DNazy 1 i 12 μl podstawowego MgSO4 do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.
  16. Roztwór inhibitora trypsyny 2
    1. Dodać 1040 μl podstawowego inhibitora trypsyny, 750 μl podstawowej DNazy 1 i 12 μl podstawowego MgSO4 do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.
  17. CaCl 2 uzupełniony roztwór preparacyjny
    1. Dodać 10 μl podstawowego CaCl2 i 25 μl podstawowego MgSO4 do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.
  18. Naczynia hodowlane pokryte poli-lizyną
    1. Aby pokryć szalki hodowlane, rozcieńczyć 100 μl bulionu poliD-lizyny w 40 ml sterylnegoH2O. W przypadku szalek do hodowli Nunc o średnicy 35 mm dodaj 2 ml rozcieńczonego roztworu poli-D-lizyny. W przypadku płytek 4dołkowych dodać 300 μl rozcieńczonej poli-D-lizyny do każdej studzienki.
    2. Pozostaw poli-D-lizynę na 1 godzinę przed zasysaniem i umyciem każdej studzienki 4 ml lub 600 μl (odpowiednio dla szalek hodowlanych 35 mm lub 4 dołków) sterylnego H2O. Następnie zassaćH2Oi pozostawić naczynia do wyschnięcia na powietrzu przez 1 godzinę.

2. Ekstrakcja mózgu i izolacja móżdżku

  1. Odetnij głowę 6-7-dniowemu szczeniakowi myszy za pomocą nożyczek do dekapitacji. Wykonaj sekcję mózgu w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.
  2. Aby usunąć mózg, chwyć głowę za pomocą kleszczy i przetnij skórę w kierunku przedniej części głowy za pomocą nożyczek do mikrodysekcji, jak pokazano na Rysunek 1. Następnie przetnij kość czaszki za pomocą nowej pary nożyczek, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Usuń czaszkę zakrywającą mózg za pomocą kleszczy i wydłub mózg za pomocą kleszczy lub szpatułki.
    1. W razie potrzeby przeciąć nerw wzrokowy, aby ułatwić wydostanie mózgu jako całości.
  3. Umieść mózg w roztworze preparacyjnym, który jest uzupełnionyMgSO4. Utrzymuj roztwór i mózg na lodzie.
  4. Po usunięciu mózgu, pod mikroskopem preparacyjnym, wypreparuj móżdżek z mózgu, będąc jeszcze w roztworze preparacyjnym uzupełnionym MgSO4, i usuń opony mózgowe za pomocą cienkich kleszczy. Obróć móżdżek na jego brzuszną stronę i zapewnij usunięcie splotu naczyniówkowego.
  5. Umieść móżdżek w 35-milimetrowym naczyniu zawierającym ~ 1 ml roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego MgSO4
    6. .
  6. Pokrój tkankę na małe kawałki i przenieś do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml buforowanego roztworu preparacyjnegoMgSO4
    7. .

3. Izolacja i hodowla neuronów ziarnistości móżdżku myszy

  1. Odwirować probówkę o pojemności 50 ml zawierającą rozdrobnioną tkankę mózgową przez 5 minut w temperaturze 644 x g i temperaturze 4 °C.
  2. Usunąć sklarowany osad i dodać 10 ml roztworu do rozwarstwiania trypsyny. Następnie wstrząsać probówką z dużą prędkością przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Dodaj 10 ml roztworu inhibitora trypsyny 1 do probówki i delikatnie kołysz przez 2 minuty.
  4. Wirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 644 x g i temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć supernatant i dodać 2 ml roztworu inhibitora trypsyny 2, a następnie przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
  6. Rozcierać tkankę w probówce o pojemności 15 ml, aż roztwór stanie się mętny. Następnie odstaw na 5 minut.
  7. Usunąć klarowny supernatant i przenieść go do nowej probówki zawierającej 1 ml roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego CaCl2.
  8. Dodać kolejny ml roztworu inhibitora trypsyny 2 na dno probówki zawierającej osad z kroku 3.6. Ponownie rozetrzeć i odstawić na 5 minut. Usunąć supernatant i dodać go do probówki zawierającej supernatant z kroku 3.7 (jest to powtórzenie kroków 3.6-3.7). Powtarzaj ten proces, aż większość tkanki zostanie mechanicznie zdysocjowana.
  9. Dodać 0,3 ml roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego CaCl2 do zbioru supernatantu na każdy ml supernatantu.
  10. Wymieszać zawartość probówki, a następnie wirować przez 5 minut przy 644 x g.
  11. Usunąć sklarowany osad i dodać 10 ml świeżej pożywki do osadu i wymieszać.
  12. Komórki można następnie policzyć i rozcieńczyć do stężenia 1,5 x 106 komórek/ml. Należy pamiętać, że ogólnie oczekuje się, że z każdego wypreparowanego mózgu oczekuje się 10 milionów komórek, w zależności od czasu trypsynizacji i skuteczności sekcji. Ogniwa płytkowe na wcześniej wykonanych płytkach poli D-lizynowych. W przypadku płytek 4-dołkowych płytka 0,5 ml, co daje 7,5 x 105 komórek na dołek. W przypadku szalek 35 mm talerz 4 ml, co daje 6 x 106 komórek na płytkę.
  13. Po 24 godzinach dodać do płytek cytozyno-β-arabino furanozyd (AraC) w celu zmniejszenia zanieczyszczenia glejowego. Na każdy ml pożywki wymagane jest 0,5 μl z 20 mM AraC. Dodanie AraC nie wymaga zmiany nośnika. Jeśli komórki mają być utrzymywane przez 7-8 dni, powtórz ten zabieg w 3 dniu.
  14. Utrzymywać kultury w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C i karmić 100 μl 100 mM glukozy dodawanej do kultury na każde 2 ml pożywki co 2 dni po 5 dniach. Całkowita zmiana nośnika nie jest wymagana.

4. Pakowanie, oczyszczanie i miareczkowanie lentiwirusa

UWAGA: Protokół pakowania, zagęszczania, oczyszczania i miareczkowania lentiwirusa został wcześniej szczegółowo opisany bez użycia zestawu 28, w tym alternatywne metody miareczkowania, takie jak cytometria przepływowa 29. W tym miejscu pokrótce przedstawiamy protokół stosowany w naszym laboratorium do produkcji lentiwirusa do badania uszkodzeń neuronów przy użyciu szybkiego roztworu do oczyszczania wirusa i zestawu do miareczkowania lentiwirusa qPCR.

  1. Płytki komórek Hek293T w 10-centymetrowych szalkach hodowlanych ze zmodyfikowanym minimalnym niezbędnym podłożem (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 10% FBS. Aby uzyskać wysokie miano wirusa, należy wyhodować co najmniej 5 płytek komórek Hek293T dla każdej transfekcji. Upewnij się, że w dniu transfekcji komórki są w 70% zlewne. Zmień podłoże na trzy godziny przed transfekcją.
  2. Do każdej transfekcji przygotuj dwie probówki. Do probówki 1 dodać 1,5 ml pożywki surowicy o obniżonej zawartości MEM i 41 μl odczynnika do transfekcji, dobrze wymieszać. Do probówki 2 dodać 1,5 ml pożywki surowicy o obniżonej zawartości MEM i 6 μg plazmidu transferowego, 6 μg wektora pCMV-dR8.2 (plazmid pakujący), 3 μg wektora pCMV-VSV-G (plazmid otoczkowy) i 35 μl odczynnika wzmacniającego p3000 (dostarczanego z lipofektaminą). Dobrze wymieszaj i połącz probówki 1 i 2, wiruj i inkubuj przez 15 minut.
  3. Usuń 50% pożywki z płytek Hek293T i dodaj kompleksy DNA-lipidowe do komórek. Inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Usuń pożywkę i zastąp 5 ml świeżego DMEM, inkubuj przez noc.
  4. Po 24 godzinach od transfekcji należy pobrać pierwszą partię supernatantu wirusa z każdej płytki. Utrzymuj pożywkę wirusową w temperaturze 4 °C i dodaj 5 ml świeżej pożywki do każdej płytki komórek Hek293T. Inkubować przez noc.
  5. 48 godzin po transfekcji zebrać drugą partię supernatantu wirusowego, połączyć go z pierwszą partią i odwirować połączony supernatant wirusowy przez 10 minut przy 600 x g.
  6. Przefiltrować supernatant przez filtr o wielkości porów 45 μm.
  7. Oczyść wirusa za pomocą szybkiego roztworu do oczyszczania wirusów. Na każde 45 ml supernatantu wirusa dodać 5 ml roztworu wiążącego lentiwirusa, wymieszać i odwirować przez 10 minut w temperaturze >5 000 x g w temperaturze 4 °C.
  8. Ostrożnie usunąć supernatant, aby nie naruszyć osadu.
  9. Dodać 20-40 μl podłoża i ponownie zawiesić osad. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  10. Aby uzyskać miano lentiwirusa, stosuje się zestaw do miareczkowania lentiwirusowego qPCR. Rozcieńczyć 2 μl oczyszczonego wirusa w 500 μl PBS. Dodać 2 μl rozcieńczonego wirusa do 18 μl buforu do lizy wirusa (dostarczonego w zestawie).
  11. Ustaw trzy różne reakcje RT-q-PCR w trzech egzemplarzach i oznacz je jako lizat wirusa, kontrola pozytywna 1 (STD1) i kontrola pozytywna 2 (STD2). Do każdej reakcji dodaj 12,5 μl 2x qPCR MasterMix, 2,5 μl lizatu wirusowego lub STD1 (dostarczone w zestawie) lub STD2 (dostarczone w zestawie) i 10 μl mieszaniny odczynników (dostarczonych w zestawie) w probówkach PCR o pojemności 0,2 ml.
  12. Ustaw program PCR w następujący sposób: 20 minut w temperaturze 42 °C dla odwrotnej transkrypcji, 10 minut w temperaturze 95 °C dla aktywacji enzymu, 40 cykli po 15 s w temperaturze 95 °C dla denaturacji i 1 minuta w temperaturze 60 °C dla wyżarzania/przedłużania.
  13. Oblicz miano wirusa za pomocą tego wzoru:
    Miano lizatu wirusa = 5 x 107/23(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    Ctx = średnia wartość Ct nieznanej próbki, Ct1 = średnia wartość STD1, Ct2 = średnia wartość STD2,
    UWAGA: CGN mogą być najlepiej transdukowane lentiwirusami lub zakażone adenowirusami, w zależności od badanego sposobu uszkodzenia. Dodanie lentiwirusów przy MOI 2-3 do roztworu do hodowli komórkowej w czasie posiewu stosuje się do badania sygnalizacji indukowanej NMDA w 7 dniu hodowli. Powoduje to ponad 80% transdukcji i jest odpowiednie do przeprowadzenia analiz biochemicznych tych neuronów (Rysunek 2). Dodanie adenowirusów w 5 dniu hodowli (w MOI 50) i badanie sygnalizacji indukowanej NMDA w 7-8 dniu jest stosowane w innych technikach, takich jak obrazowanie. Zabieg ten powoduje mniej niż 10% infekcję neuronów, co czyni go idealnym do obrazowania i kolokalizacji białek. Adenowirusy mogą być używane w czasie posiewu do badania śmierci komórek wywołanej uszkodzeniem DNA przez dodanie kamptotecyny w 2-3 dniu lub stresu oksydacyjnego przez dodanie nadtlenku wodoru. Obecność białek fluorescencyjnych (GFP, RFP, CFP lub YFP) znakowanych do genu będącego przedmiotem zainteresowania może być wykorzystana do oszacowania procentowej transdukcji i potencjalnej toksyczności. Przy zalecanym MOI widzimy minimalną toksyczność i maksymalną transdukcję (Rysunek 3).

5. Modelowanie uszkodzeń neuronów

  1. Aby wywołać ekscytotoksyczność neuronalną wywołaną NMDA, po 7 dniach in vitro należy traktować CGN 100 μM NMDA i 10 μM glicyny przez 1 godzinę. Zastąp całą pożywkę kondycjonowaną pożywką z równoległych kultur bez leczenia. Stężenie to powoduje 50% śmierć komórki w ciągu 24 godzin po leczeniu (Rysunek 3C). Fragmentacja mitochondriów jest widoczna po 6-8 godzinach od leczenia (patrz Jahani-Asl i wsp.26,27).
  2. Aby wywołać śmierć komórki indukowaną przez ROM (stres oksydacyjny), potraktuj neurony nadtlenkiem wodoru o stężeniu 75-100 μM (H2O2) i przełącz się na kondycjonowane pożywki z równoległych kultur po 5-minutowej ekspozycji naH2O2. Uwaga, ze względu na niestabilnośćH2O2, zoptymalizuj stężenie do poziomu, który indukuje 50-70% śmierć komórek w hodowli po 24 godzinach leczenia.
  3. Aby wywołać śmierć komórki wywołaną uszkodzeniem DNA, należy potraktować CGN 10 μM kamptotekiną. Stężenie to indukuje ponad 50% śmierć komórki w ciągu 24 godzin. Fragmentacja mitochondriów i wczesna sygnalizacja apoptozy zachodzi 2-3 godziny po dodaniu kamptotecyny w tym stężeniu (patrz Jahani-Asl i wsp.18)
  4. Aby wywołać apoptozę neuronalną indukowaną niskim K+ w CGN, zmień pożywkę zawierającą 25 mM K+ na pożywkę o niskiej zawartości potasu na 5 mM K+ po 7 dniach in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dzięki starannej sekcji nienaruszony mózg powinien zostać usunięty przy minimalnych uszkodzeniach, jak pokazano na Rysunku 1A-B. Należy dołożyć wszelkich starań, aby zminimalizować uszkodzenia mózgu podczas usuwania, w szczególności uszkodzenia móżdżku. Uszkodzenie móżdżku utrudnia identyfikację i całkowite usunięcie opon mózgowych oraz zwiększa prawdopodobieństwo kontaminacji hodowli neuronalnej. Po usunięciu opon mózgowych móżdżek można wyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych móżdżku (CGN), badań nad utratą i zyskiem funkcji oraz modelowania różnych mechanizmów śmierci komórki. Na odtwarzalność wyników przy użyciu tej procedury wpływa kilka czynników, które wymagają ścisłego monitorowania. Należą do nich czystość hodowli, w tym eliminacja komórek glejowych w hodowli, zbieg kultury i utrzymanie zdrowych komórek. Wprowadzenie zmienności tych czynników może zniekształcić wyniki i podważyć odtwarzalność. Pon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych oraz granty Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem dla A.J.-A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do miareczkowania qPCR lentivitral kit ABM#LV900
szybkie rozwiązanie do oczyszczania wirusów ABM#LV999
pCMV-dR8.2Addgene#8455
pCMV-VS.VGAddgene#8454
Woda destylowana Gibco#15230162
200 mM L-glutamina Gibco#25030081
35 mm Naczynia do kultur NuncGibco#174913
PowerUP SYBR green master mixlife technologies#A25742
BSA V SolutionSigma Aldrich#A-8412
CaCl2 • 2H2OSigma Aldrich#C-7902 
CamptothecinSigma Aldrich#C-9911
Inhibitor trypsyny białka jaja kurzego Sigma Aldrich#10109878001
Cytozyna beta-D-Arabino FuranozydSigma Aldrich#C-1768
D-(+)-Glukoza Sigma Aldrich#G-7528
DNase1 Sigma Aldrich#11284932001
Eagle-minimal essential mediumSigma Aldrich#M-2279
GlycineSigma Aldrich#G-5417
Inaktywowana termicznie dializowana płodowa surowica bydlęca Sigma Aldrich#F-0392
Bufor Hepes Sigma Aldrich#H-0887
Nadtlenek wodoruSigma Aldrich#216763
50 mg/ml Gentamycyna Sigma Aldrich#G-1397
MgSO4 Sigma Aldrich#M-2643
Kwas N-metylo-D-asparaginowySigma Aldrich#M-3262
Roztwór czerwieni fenolowej Sigma Aldrich#P-0290
Trypsyna Sigma Aldrich#T-4549
Lipofectamina 3000Thermo Fisher ScientificL3000-008
P3000 odczynnik wzmacniającyThermo Fisher ScientificL3000-008
Opti-MEM I Zredukowana surowicaThermo Fisher Scientific31985070
KCl VWR
NaCl VWR
NaH2PO4H2O VWR
Poly D-lizyna VWR#89134-858
DMEMŻubr#319-005-CL
FBSŻubr#080-450
#CABDH9258 #CABDH9286 #CABDH9298

Bibliografia

  1. Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
  2. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  3. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
  4. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  5. Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
  8. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
  9. Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
  10. Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
  11. Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
  12. Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
  13. Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
  14. Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
  15. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
  16. Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
  17. Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
  18. Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
  19. Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
  20. Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
  21. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  22. Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
  23. D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
  24. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
  25. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  26. Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
  27. Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
  28. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
  29. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  30. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
  31. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mier kom rek neuronalnychmodelowanie ekscytotoksyczno ciindukcja apoptozystres oksydacyjnyuszkodzenie DNApierwotna hodowla neuron wtransdukcja wirusowatraktowanie NMDAapoptoza indukowana niskim st eniem potasu
Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.