Artykuł metodologiczny

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

DOI:

10.3791/55903

⸱

16 czerwca 2017

 ,  , 
1Cell Biology and Neuroscience, University of California, Riverside

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System inżynierii genomu CRISPR/Cas9 zrewolucjonizował biologię, umożliwiając precyzyjną edycję genomu przy niewielkim wysiłku. Kierując się pojedynczym przewodnikiem RNA (sgRNA), który nadaje specyficzność, białko Cas9 rozszczepia obie nici DNA w docelowym locus. Pęknięcie DNA może wywołać niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR). NHEJ może wprowadzać małe delecje lub insercje, które prowadzą do mutacji z przesunięciem ramki, podczas gdy HDR pozwala na większe i bardziej precyzyjne perturbacje. W tym miejscu przedstawiamy protokoły generowania linii komórkowych z nokautem poprzez sprzężenie ustalonych metod CRISPR/Cas9 z dwiema opcjami dalszej selekcji/badań przesiewowych. Podejście NHEJ wykorzystuje pojedyncze miejsce cięcia sgRNA i niezależne od selekcji badania przesiewowe, w których produkcja białka jest oceniana za pomocą immunoblot kropkowego w sposób wysokoprzepustowy. Podejście HDR wykorzystuje dwa miejsca cięcia sgRNA, które obejmują gen będący przedmiotem zainteresowania. Wraz z dostarczonym szablonem HDR, metoda ta może osiągnąć usunięcie dziesiątek kb, wspomagane przez wstawiony znacznik oporu do wyboru. Omówiono odpowiednie zastosowania i zalety każdej z metod.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stabilne zmiany genetyczne dają przewagę nad przejściowymi metodami perturbacji komórkowych, które mogą być zmienne pod względem skuteczności i czasu trwania. Edycja genomu staje się coraz bardziej powszechna w ostatnich latach ze względu na rozwój docelowych nukleaz, takich jak nukleazy palców cynkowych1,2,3,4,5, aktywatory transkrypcji podobne do efektorów nukleazy (TALENs)6,7,8,9 i nukleazy sterowane RNA pochodzące z systemu CRISPR (clustered, regularly interspaced short palindromic repeats)10.

Maszyneria edycji CRISPR/Cas9 jest zaadaptowana z układu odpornościowego, którego bakterie i archeony używają do obrony przed infekcjami wirusowymi11,12,13. W tym procesie krótkie, 20-30 nt fragmenty inwazyjnej sekwencji wirusa są włączane do locus genomu jako "przekładki" otoczone powtarzającymi się jednostkami14,15. Późniejsza transkrypcja i przetwarzanie RNA generuje małe RNA związane z CRISPR16 (crRNAs), które wraz z transaktywującym crRNA17 (tracrRNA) łączą się z endonukleazą efektorową Cas9. W ten sposób crRNA zapewniają specyficzność dla celowania w Cas9, kierując kompleks do rozszczepienia komplementarnych sekwencji wirusowego DNA i zapobiegając dalszym infekcjom18,19. Każda sekwencja "protospacer" w docelowym DNA może służyć jako źródło crRNA, o ile znajduje się bezpośrednio 5' do krótkiego motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM), NGG w przypadku S. pyogenes Cas920. Brak sekwencji PAM w pobliżu przekładki w locus CRISPR gospodarza rozróżnia siebie i nie-siebie, zapobiegając namierzaniu gospodarza. Ze względu na swoją uniwersalność i elastyczność, ten system biologiczny został silnie przystosowany do edycji genomu, tak że prawie każde miejsce DNA sąsiadujące z PAM może być celowane. W tej wersji dalsza modyfikacja połączyła crRNA i tracrRNA w pojedynczy składnik przewodnika RNA (sgRNA), który jest ładowany do białka Cas921.

Po ekspresji Cas9 i sgRNA w komórkach eukariotycznych, białko Cas9 rozszczepia obie nici DNA w docelowym locus. W przypadku braku odpowiedniego regionu sekwencji homologicznej, komórka naprawia to przerwanie poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ)22,23,24, co zwykle wprowadza małe delecje lub, rzadko, insercje. W przypadku celowania w otwartą ramkę odczytu, naprawa prawdopodobnie prowadzi do translacyjnego przesunięcia ramki, które wytwarza niefunkcjonalny produkt białkowy. W przeciwieństwie do tego, gdy komórka jest wyposażona w egzogeniczny szablon z dużymi obszarami homologii, może naprawić pęknięcie podwójnej nici przez naprawę skierowaną do homologii25,26. Ta trasa pozwala na bardziej precyzyjne delecje, wymiany lub insercje w genomie, w połączeniu z wprowadzeniem markerów selekcyjnych podlegających akcyzie27.

Tutaj prezentujemy protokoły generowania linii komórkowych knockout za pomocą jednej z tych dwóch metod CRISPR/Cas9 (Rysunek 1A). Podejście NHEJ wykorzystuje pojedyncze miejsce cięcia sgRNA i niezależne od selekcji badania przesiewowe, a zatem wymaga niewielkiego wcześniejszego przygotowania. Stosując tę metodę, należy zaprojektować prowadzące RNA komplementarne do eksonów w pobliżu końca 5' transkryptu, które z największym prawdopodobieństwem wytworzą nokaut. Ponieważ modyfikacje genomu w tym przypadku są niewielkie, badania przesiewowe w kierunku klonów nokautujących opierają się na plamach punktowych, w których produkt białkowy jest oceniany w sposób wysokoprzepustowy. Jako przykładu używamy generowania linii nokautujących białka ELAV-podobnego do 1 (ELAVL1). Drugie podejście opiera się na naprawie kierowanej homologią (HDR) i wykorzystuje dwa miejsca cięcia sgRNA, które obejmują gen lub region zainteresowania, co pozwala na delecje dziesiątek kb. Plazmid z dwoma regionami homologii, które flankują miejsca rozszczepienia, zapewnia zastępczy szablon (Rysunek 1B), wprowadzając wybieralny marker oporu, który zwiększa efektywność generowania nokautu. Metoda ta może być również zaadaptowana do wprowadzania modyfikacji genów za pomocą odpowiednio zaprojektowanych ramion homologicznych. W tym przypadku integracja nowego fragmentu DNA pozwala na badanie przesiewowe oparte na PCR (Figura 1C). Tutaj jako przykładu używamy generacji linii nokautujących członka rodziny wiązania RNA Pumilio 2 (PUM2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Identyfikacja regionów homologicznych wokół pożądanego usunięcia

UWAGA: Konieczne tylko w przypadku korzystania z edycji opartej na zaznaczeniach.

  1. Wybierz dwa regiony, początkowo 1,5-2 kb, po obu stronach żądanego locus delecji, które będą służyć jako ramiona homologii w szablonie HDR (Rysunek 1A). Zidentyfikuj regiony, w których brakuje miejsc rozpoznawania BsaI na którymkolwiek z pasm (GGTCTC), aby ułatwić klonowanie. Jeśli miejsca BsaI są nieuniknione, użyj alternatywnego enzymu restrykcyjnego typu II (BsmBI, SapI, BbsI) i zmodyfikuj odpowiednie miejsca w plazmidzie biorcy (pUC19-BsaI), plazmidzie dawcy markera oporności (pGolden-Neo lub pGolden-Hygro) i zwisy produktu PCR ramienia homologicznego.

2. Generowanie plazmidów ekspresyjnych Cas9-sgRNA

  1. Zdefiniuj miejsca docelowe do mutagenezy. W przypadku metody pojedynczego cięcia, bez selekcji, należy skupić się na proksymalnych eksonach kodujących 5', aby zwiększyć prawdopodobieństwo niefunkcjonalnej mutacji. W przypadku metody dwóch cięć wybierz dwa miejsca, które obejmują tyle genu, ile to konieczne.
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że usunięcia do 53 kb są tworzone wydajnie.
  2. Wprowadź od 200 do 300 pz docelowej sekwencji regionu do narzędzia do projektowania crispr.mit.edu. W przypadku klonowania opartego na selekcji należy użyć 200-300 pz zidentyfikowanych regionów homologii, które są proksymalne do locus delecji (Rysunek 1A). Wybierz 2-3 najwyżej oceniane sgRNA na region docelowy, aby uwzględnić różnice w ich aktywności i wyizolować niezależne klony, które nie mają takich samych potencjalnych efektów poza celem.
  3. Aby zaprojektować dupleksowane oligonukleotydy z odpowiednimi zwisami do insercji do plazmidu ekspresyjnego, należy pominąć końcową sekwencję PAM (NGG) i dołączyć zwis 5'-CACC, a następnie G do górnego oligonukleotydu. W przypadku dolnego pasma oligo dołącz zwis 5'-AAAC do sekwencji docelowej z odwrotnym uzupełnieniem, a następnie 3'-C, jak pokazano poniżej:
    figure-protocol-1
  4. Wstaw syntetyczne oligonukleotydy odpowiadające sgRNA do plazmidu pSpCas9(BB) za pomocą klonowania Golden Gate28, zgodnie z opisem w protokole laboratorium Zhang29.

3. Generowanie plazmidów szablonu naprawy ukierunkowanego na homologię

UWAGA: Konieczne tylko w przypadku korzystania z edycji opartej na zaznaczeniach. Plazmid matrycy naprawy ukierunkowanej na homologię składa się z kasety oporności na leki otoczonej dwoma regionami, które są komplementarne do genomu tuż poza dwoma miejscami docelowymi sgRNA (Figura 1B).

  1. Z szerszych obszarów homologii zidentyfikowanych w kroku 1.1 wybierz 800-1,000 bp26 nie dalej niż 5-10 bp od zaprojektowanych miejsc cięcia Cas9, które posłużą jako ramiona homologii (Rysunek 1A). Pamiętaj, aby nie włączać miejsca docelowego sgRNA i jego PAM do ramion homologii, ponieważ spowoduje to rozszczepienie CRISPR/Cas9 samego plazmidu matrycy. Jeśli ramiona homologii zawierają wewnętrzne miejsca BsaI, użyj alternatywnych miejsc sgRNA.
  2. PCR amplifikuje ramiona homologii z genomowego DNA przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności, zgodnie z instrukcjami producenta, przy użyciu starterów do przodu i do tyłu z dodatkową sekwencją 5', która wprowadza miejsca BsaI (GGTCTC) i unikalne zwisy na obu końcach regionu homologii. Wysięgi muszą zawierać odpowiednie sekwencje, aby wygenerować prawidłową kolejność montażu i orientację, jak opisano poniżej (Rysunek 1B):
    Zwis lewego ramienia homologicznego FP: 5' GGGTCTCAGGCC
    Zwis lewego ramienia homologicznego RP: 5' GGGTCTCTCACG
    Zwis prawego ramienia homologicznego FP: 5' GGGTCTCAGTCC
    Zwis prawego ramienia homologicznego RP: 5' GGGTCTCTCCAC
  3. Przed kontynuowaniem sprawdź ramiona homologiczne pod kątem odpowiedniego wzmocnienia za pomocą elektroforezy żelowej.
  4. Złóż prawe i lewe obszary ramienia homologii z kasetą rezystancyjną w plazmid szablonu HDR za pomocą klonowania Golden Gate28. Użyj plazmidów pGolden-Neo lub pGolden-Hygro class=30 jako źródła kaset oporowych flankowanych loxP (loxP-PGK-Neo-pA-loxP lub loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Użyj pUC19-BsaI, zmodyfikowanego pUC19 z miejscami BsaI w regionie wielokrotnego klonowania i wyeliminowanymi miejscami BsaI w innych miejscach, jako wektorem biorcy (dostępnym na żądanie). Użyj proporcji 1:1:1:1 dla trzech wstawek i wektora.
    1. Przygotuj następującą mieszaninę reakcyjną30:
      Produkt PCR z prawym ramieniem homologicznym0,06 pmol (30-40 ng)
      Produkt PCR z lewym ramieniem homologicznym0,06 pmol (30-40 ng)
      plazmid pGolden-Neo (100 ng/μL)1 μL
      plazmid pUC19-BsaI (100 ng/μL)1 μL
      2x bufor ligazy DNA T75 μL
      BsaI (10 U/μL)0,75 μL
      Ligaza DNA T7 (3000 U/μL)0,25 μL
      Wodado 10 μL
    2. Stosować następujące parametry termocyklera: 37 °C przez 5 min, 20 °C przez 5 min. Powtarzać przez 30 cykli.
    3. Produkt do klonowania należy poddać działaniu egzonukleazy zgodnie z instrukcjami producenta, aby usunąć wszelkie pozostałe zlinearyzowane DNA.
    4. Przekształć mieszaninę reakcyjną w kompetentny szczep E. coli zgodnie z protokołem dostarczonym z komórkami i ułożyć na płytkach zawierających ampicylinę.
  5. Aby zidentyfikować klony z prawidłowym zespołem szablonu, należy przeprowadzić PCR kolonii bakteryjnej w celu amplifikacji podregionów ramienia homologicznego zmontowanej wkładki (ponieważ cała wkładka może być zbyt duża, aby niezawodnie amplifikować). Użyj jednego startera wyżarzającego do bocznej sekwencji plazmidowej i drugiego startera komplementarnego do krawędzi kasety oporowej (Rysunek 1B, sekwencja jest wspólna zarówno dla wkładek Neo, jak i Hygro), generując produkt zależny od montażu, który jest o około 200 pz dłuższy niż zawarte ramię homologii:
    pUC19-Bsal-Lewo: 5' GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
    Rezystancja w lewo: 5' AAAAGCGCCTCCCCTACCC
    pUC19-BSAI-Prawy: 5' GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
    Opór-w prawo: 5' AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG
    1. Zbierz kolonie bakterii sterylnymi wykałaczkami i zawieś bakterie w 20 μl wody. Podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 15 minut i wirować w wirówce stołowej z maksymalną prędkością przez 5 minut. Umieść natychmiast na lodzie.
    2. Przygotuj następującą mieszaninę PCR31:
      Rozcieńczony szablon kolonii1,25 μL
      10x bufor reakcyjny Taq1,25 μL
      20 mM dNTP0,25 μL
      Podkład 10 μM do przodu 0,25 μL
      10 μM Podkład odwrotny 0,25 μL
      Polimeraza Taq0,25 μL
      Woda 9 μl
    3. Stosować następujące parametry termocyklera: 95 °C przez 30 s, (95 °C 30 s, 61 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min/kb), powtarzać przez 25 cykli, 72 °C przez 2 min.
    4. Sprawdź produkt PCR pod kątem prawidłowego rozmiaru amplikonu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    5. Opcjonalnie miniprzygotuj plazmidowe DNA z poszczególnych kolonii o odpowiednim rozmiarze wstawki i zsekwencjonuj regiony ramienia homologii za pomocą sekwencjonowania Sangera z wyżej wymienionymi starterami amplifikacyjnymi.

4. Transfekcja składników CRISPR do hodowanych komórek

  1. Przed transfekcją: hodowla komórek T-REx293 w pożywce DMEM uzupełniona 10% FBS w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Umieść komórki na płytkach 6-dołkowych i osiągnij około 70% konfluencji. Dołącz studzienkę do kontroli nietransfekowanej.
  3. Komórki transfekcyjne z 2,5 μg całkowitego plazmidu przy użyciu komercyjnego protokołu transfekcji. Równolegle utrzymuj nietransfekowaną kontrolę.
    UWAGA: Metoda transfekcji i wydajność różnią się w zależności od typu komórki. Określ odpowiednią metodę transfekcji dla systemu przed eksperymentem.
    1. Do transfekcji komórek z selekcją użyj 0,75 μg Cas9-sgRNA 1 (lewe cięcie), 0,75 μg Cas9-sgRNA 2 (prawe cięcie) i 1,0 μg homologicznej matrycy rekombinacji.
    2. Do transfekcji komórek bez selekcji użyj plazmidu 2,5 μg Cas9-sgRNA.

5. Wybór leków

  1. 48 godzin po transfekcji potraktuj komórki odpowiednim lekiem (neomycyna/higromycyna). Przeprowadzaj selekcję, aż wszystkie komórki w nietransfekowanej kontroli umrą (zwykle 3-5 dni dla Neo, 7-14 dni dla Hygro).
    UWAGA: Stosować stężenia 500 μg/ml i 10 μg/ml odpowiednio dla neomycyny i higromycyny, odpowiednio dla komórek T-REx293. W przypadku innych typów komórek przydatne może być wcześniejsze dostosowanie leku do nietransfekowanych komórek w celu określenia skutecznego stężenia.

6. Izolacja populacji klonalnych

  1. Wyhoduj komórki do 100% zbiegu w oryginalnym dołku po selekcji. Komórki nasienne do 96 dołków w gęstości 0,33 komórki na dołek.
    UWAGA: Wysiewanie trzech 96-dołkowych płytek jest dobrym punktem wyjścia, aby zapewnić izolację więcej niż jednego prawidłowego klonu, ale może być potrzebne mniej więcej w zależności od wydajności sgRNA i HDR.
  2. Obserwuj kolonie przez okres 2-4 tygodni, aż kolonie będą widoczne dla oka. Wybierz widoczne kolonie za pomocą sterylnej końcówki pipety i ponownie zasiej w nowych dołkach, aby pobudzić wzrost jednowarstwowy. W przypadku stosowania komórek zawiesinowych można zastosować jeszcze niższe gęstości wysiewu, aby zapewnić większy udział studzienek jednokolonijnych.

7. Selekcja kandydatów

  1. Selekcja kandydatów bez użycia selekcji: plama punktowa
    1. Hoduj pojedyncze klony do 50-100% konfluencji. Usunąć monowarstwę komórek przez pipetowanie w studzience.
    2. Porcję 90 μl ze 100 μl całkowitej objętości do czystej probówki do mikrowirówki. Wirować z prędkością 6000 obr./min przez 5 minut, usunąć pożywkę i poddać lizie osady komórkowe w 10 μl 1x buforu do lizy lub 1x bufora ładującego SDS (5x: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 8% SDS, 0,1% błękitu bromofenolowego, 40% glicerolu, 100 mM DTT). Dodać 90 μl nowej pożywki do pozostałych komórek w studzience, aby kontynuować rozmnażanie.
    3. Odpipetować 1 μl lizatu komórkowego na suchą membranę nitrocelulozową, aby utworzyć kropkę. Osusz każdą próbkę dwukrotnie na dwóch oddzielnych błonach, tworząc dwa identyczne wzory próbek.
    4. Zablokuj błony w 5% mleku w TBST (Tris Buffered Saline + 0,01% Tween 20: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3 g Tris base, do 1 l wody destylowanej, pH 7,4)31 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (z kołysaniem, tutaj i przez cały zabieg).
    5. Osuszyć za pomocą pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białku docelowemu na jednej błonie i pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białku kontrolnemu (tubulinie, GAPDH lub jakiemukolwiek innemu białku, które nie powinno ulec zmianie) na drugiej. Stosować zalecane rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych (0,2 μg/ml dla ELAVL1 i 0,1 μg/ml dla Pum2 w tym przypadku) w TBST + 5% mleka. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Umyć 3 razy łyżką łyżkową przez 5 minut.
    7. Inkubować każdą błonę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w TBST + 5% mleka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    8. Umyć 3 razy łyżką łyżkową przez 5 minut.
    9. Nałożyć roztwór substratu chemiluminescencyjnego (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i zobrazować osuszoną membranę na cyfrowym obrazowniku chemiluminescencyjnym.
    10. Określ ilościowo intensywność kropek dla białek docelowych i kontrolnych za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
    11. Wyeliminuj kandydatów z niskim sygnałem białka kontrolnego i oblicz odjęte w tle proporcje intensywności białka docelowego do kontrolnego dla pozostałych kandydatów. Wybierz kandydatów o najniższych wskaźnikach przejścia i dalszej walidacji za pomocą western blot.
  2. Selekcja kandydatów z wykorzystaniem selekcji: colony PCR
    1. Zbierz lizat komórkowy za pomocą zestawu do przygotowania DNA (patrz tabela materiałów).
      1. Zduplikuj poszczególne kolonie w nowej studni 96 i rośnij aż do 100% zbieżności.
      2. Usunąć pożywkę z jednego zestawu klonów i ponownie zawiesić komórki w 30 μl buforu ekstrakcyjnego z zestawu. Przenieść do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      3. Podgrzewać roztwór do temperatury 96 °C przez 15 minut i ostudzić do temperatury pokojowej.
      4. Dodać 30 μl buforu stabilizacyjnego z zestawu. Dobrze wymieszaj.
    2. Zidentyfikuj zmutowane linie typu dzikiego i monoallelicznego/biallelicznego za pomocą PCR kolonii.
      1. Zaprojektuj dwa oddzielne zestawy starterów PCR (dla lewej i prawej strony docelowego locus) w celu amplifikacji regionów wokół ramion homologii w oparciu o udaną lub nieudaną integrację kasety rezystancyjnej (Rysunek 2C). Z każdej strony użyj wspólnego startera (czerwonego), który wyżarza się na zewnątrz ramienia homologii. Użyj go z odpowiednim sparowanym starterem, który jest komplementarny do sekwencji endogennej, obejmującej region homologii (niebieski), aby przetestować allel typu dzikiego. Użyć innego sparowanego startera, komplementarnego do włożonej kasety oporowej (patrz startery w sekcji 2.3), aby przetestować pożądaną mutację.
      2. (Zalecane) Zweryfikuj zestawy starterów przy użyciu lizatu komórkowego z oryginalnie wybranej populacji komórek masowych, ponieważ będzie on zawierał mieszaninę zarówno alleli WT, jak i zmutowanych (Rysunek 2D).
      3. Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną:
        Lizat komórkowy0,5 μL
        10x bufor KOD1,25 μL
        25mM MgSO40,75 μL
        2 mM dNTP 1,25 μL
        Podkład 10 μM do przodu 0,375 μL
        10 μM Podkład odwrotny0,375 μL
        Polimeraza KOD0,25 μL
        Woda7,75 μL
      4. Stosować następujące warunki termocyklera: 95 °C przez 2 minuty, (95 °C przez 20 s, Primer Tm przez 10 s, 70 °C przez 20 s/kb) powtarzać przez 25 cykli.
      5. Wizualizacja produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    3. Powtórzyć test PCR kolonii dla każdej strony przewidywanej integracji. Wybierz i rozwiń kandydatów, którzy wykazują obecność integracji i brak produktu sekwencji endogenicznej dla usuniętego regionu.
    4. Walidacja pozytywnych kandydatów za pomocą western blot i/lub RT-qPCR.

8. Sprawdź mutację genomową za pomocą sekwencjonowania

  1. Wyizoluj genomowe DNA ze zmutowanych linii komórkowych za pomocą ekstrakcji chloroformem fenolowym31.
  2. PCR amplifikuje region docelowy sgRNA, używając starterów z 5' zwisami, które dodają miejsca restrykcyjne BsaI na każdym końcu.
    UWAGA: W przypadku klonów edytowanych za pomocą HDR, w których oba allele mogą być identyczne, produkt PCR można sekwencjonować bezpośrednio.
  3. Sklonuj amplifikowany region do pUC19-BsaI przez klonowanie Golden Gate.
  4. Przekształć mieszaninę reakcyjną w właściwy szczep E. coli.
  5. Miniprep plazmidowe DNA z 6-10 pojedynczych kolonii i sekwencjonowanie sklonowanego regionu za pomocą sekwencjonowania Sangera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do wytworzenia linii nokautujących ELAVL1 dostępne było silne przeciwciało, więc przeprowadzono edycję przy użyciu pojedynczych sgRNA (Rysunek 1A, po lewej), a następnie immunoblot kropkowy. Trzy sgRNA transfekowano niezależnie, aby porównać wydajność i wykluczyć docelowe efekty w otrzymanych klonach. Po zebraniu i osuszeniu lizatów komórkowych z populacji klonalnych na dwóch błonach nitrocelulozowych, bloty były badane zarówno pod kątem ELAVL1, jak i PUM2 (jako kontro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System CRISPR/Cas9 pozwolił na efektywne generowanie stabilnych modyfikacji genomu, które stanowią bardziej spójną alternatywę dla innych metod manipulacji w stanach nieustalonych. W tym miejscu przedstawiliśmy dwie metody szybkiej identyfikacji nokautów genów CRISPR/Cas9 w liniach komórkowych ssaków. Obie metody wymagają niewielkiej ilości materiału komórkowego, więc testy można przeprowadzić we wczesnych stadiach hodowli klonalnej, oszczędzając czas i odczynniki. Aby zwiększyć skuteczność obu metod, zalecamy testowanie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Gissell Sanchez, Megan Lee i Jasonowi Estepowi za pomoc eksperymentalną oraz Weifeng Gu i Xuemei Chen za udostępnienie odczynników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kompetentny E. Zestaw
plazmid pSpCas9 (BB)Addgene42230Ran et al. 2013, klonowanie sgRNA
Enzym BbsIThermoFisherFD1014Ran et al. 2013, klonowanie sgRNA
Ran et al. 2013, klonowanie sgRNAs
Tango BufferThermoFisherBY5Ran et al. 2013, klonowanie sgRNAs
PlasmidSafe egzonukleazaEpicentrumE3105KRan et al. 2013, klonowanie sgRNAs
Q5 gorący start polimeraza wysokiej wiernościNEBM0494AHA amplifikacja
pUC19-BsaIZmodyfikowany plazmid pUC19, zmutowany istniejący obszar BsaI i wstawiony dwa skierowane na zewnątrz miejsca BsaI po trawieniu BamHI/EcoRI
Kaseta rezystancyjnapGolden-NeoAddgene51422
pGolden-HygroAddgene51423Kaseta rezystancyjna
BsaINEBR3535SBudowa ramienia homologicznego
Ligaza DNA T7NEBM0318L
PlasmidSafe egzonukleazaEpicentrumE3105K
Wykałaczkibakteryjne PCR
Taq polimerazakolonia bakteryjna
PCR HEK293 komórki
DMEMCorning10-013-CV
FBSCorningMT35010CV
Penicylina-Strep (opcjonalnie)Gibco15140-122
Płytki 6-dołkoweBioLite12556004
Odczynnik do transfekcji TransIT-LTIMirusMIR2300tylko do lipofekcji
Opti-MEMThermoFisher31985062tylko do lipofekcji
G418 (neomycyna)Sigma AldrichA1720-5G
HigromycynaSigma AldrichH3274-250MG
96-dołkowe płytkiThermoFisher12556008
Pasywny bufor do lizy, 5xPromega
1x receptura buforaopisana w protokole
Membrana nitrocelulozowaBio-Rad162-0115
Receptura TBSTopisana w protokole
Mleko suszone
Substrat SuperSignal West Dura o wydłużonym czasie trwaniaThermoFisher34075do przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP
Przygotowanie Extracta DNA do PCRQuantabio95091-025
Polimeraza KODNovagen71316
do przygotowania plazmidu komórek em< / em> Ligaza DNA T7 NEB M0318L enzym ludzkie ładującego SDS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  2. Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
  3. Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
  4. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  5. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
  6. Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
  7. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  8. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  9. Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
  10. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
  11. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  12. Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
  13. Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  14. Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  15. Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
  16. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  17. Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
  18. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  19. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  20. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  21. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  22. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  23. Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
  24. Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
  25. Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
  26. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  27. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  28. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  29. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  30. Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
  31. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
  32. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766(2014).
  33. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nokaut genuniehomologiczne czenie ko c wnaprawa kierowana homologidot immunoblotPCR koloniiizolacja klonalnarozcie czenia seryjneselekcja lekowaWestern blot

Powiązane artykuły