Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55903

⸱

16 czerwca 2017

 ,  , 
1Cell Biology and Neuroscience, University of California, Riverside

W tym artykule

Podsumowanie

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Streszczenie

System inżynierii genomu CRISPR/Cas9 zrewolucjonizował biologię, umożliwiając precyzyjną edycję genomu przy niewielkim wysiłku. Kierując się pojedynczym przewodnikiem RNA (sgRNA), który nadaje specyficzność, białko Cas9 rozszczepia obie nici DNA w docelowym locus. Pęknięcie DNA może wywołać niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR). NHEJ może wprowadzać małe delecje lub insercje, które prowadzą do mutacji z przesunięciem ramki, podczas gdy HDR pozwala na większe i bardziej precyzyjne perturbacje. W tym miejscu przedstawiamy protokoły generowania linii komórkowych z nokautem poprzez sprzężenie ustalonych metod CRISPR/Cas9 z dwiema opcjami dalszej selekcji/badań przesiewowych. Podejście NHEJ wykorzystuje pojedyncze miejsce cięcia sgRNA i niezależne od selekcji badania przesiewowe, w których produkcja białka jest oceniana za pomocą immunoblot kropkowego w sposób wysokoprzepustowy. Podejście HDR wykorzystuje dwa miejsca cięcia sgRNA, które obejmują gen będący przedmiotem zainteresowania. Wraz z dostarczonym szablonem HDR, metoda ta może osiągnąć usunięcie dziesiątek kb, wspomagane przez wstawiony znacznik oporu do wyboru. Omówiono odpowiednie zastosowania i zalety każdej z metod.

Wprowadzenie

Stabilne zmiany genetyczne dają przewagę nad przejściowymi metodami perturbacji komórkowych, które mogą być zmienne pod względem skuteczności i czasu trwania. Edycja genomu staje się coraz bardziej powszechna w ostatnich latach ze względu na rozwój docelowych nukleaz, takich jak nukleazy palców cynkowych1,2,3,4,5, aktywatory transkrypcji podobne do efektorów nukleazy (TALENs)6,7,8,9 i nukleazy sterowane RNA pochodzące z systemu CRISPR (clustered, regularly interspaced short palindromic repeats)10.

Maszyneria edycji CRISPR/Cas9 jest zaadaptowana z układu odpornościowego, którego bakterie i archeony używają do obrony przed infekcjami wirusowymi11,12,13. W tym procesie krótkie, 20-30 nt fragmenty inwazyjnej sekwencji wirusa są włączane do locus genomu jako "przekładki" otoczone powtarzającymi się jednostkami14,15. Późniejsza transkrypcja i przetwarzanie RNA generuje małe RNA związane z CRISPR16 (crRNAs), które wraz z transaktywującym crRNA17 (tracrRNA) łączą się z endonukleazą efektorową Cas9. W ten sposób crRNA zapewniają specyficzność dla celowania w Cas9, kierując kompleks do rozszczepienia komplementarnych sekwencji wirusowego DNA i zapobiegając dalszym infekcjom18,19. Każda sekwencja "protospacer" w docelowym DNA może służyć jako źródło crRNA, o ile znajduje się bezpośrednio 5' do krótkiego motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM), NGG w przypadku S. pyogenes Cas920. Brak sekwencji PAM w pobliżu przekładki w locus CRISPR gospodarza rozróżnia siebie i nie-siebie, zapobiegając namierzaniu gospodarza. Ze względu na swoją uniwersalność i elastyczność, ten system biologiczny został silnie przystosowany do edycji genomu, tak że prawie każde miejsce DNA sąsiadujące z PAM może być celowane. W tej wersji dalsza modyfikacja połączyła crRNA i tracrRNA w pojedynczy składnik przewodnika RNA (sgRNA), który jest ładowany do białka Cas921.

Po ekspresji Cas9 i sgRNA w komórkach eukariotycznych, białko Cas9 rozszczepia obie nici DNA w docelowym locus. W przypadku braku odpowiedniego regionu sekwencji homologicznej, komórka naprawia to przerwanie poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ)22,23,24, co zwykle wprowadza małe delecje lub, rzadko, insercje. W przypadku celowania w otwartą ramkę odczytu, naprawa prawdopodobnie prowadzi do translacyjnego przesunięcia ramki, które wytwarza niefunkcjonalny produkt białkowy. W przeciwieństwie do tego, gdy komórka jest wyposażona w egzogeniczny szablon z dużymi obszarami homologii, może naprawić pęknięcie podwójnej nici przez naprawę skierowaną do homologii25,26. Ta trasa pozwala na bardziej precyzyjne delecje, wymiany lub insercje w genomie, w połączeniu z wprowadzeniem markerów selekcyjnych podlegających akcyzie27.

Tutaj prezentujemy protokoły generowania linii komórkowych knockout za pomocą jednej z tych dwóch metod CRISPR/Cas9 (Rysunek 1A). Podejście NHEJ wykorzystuje pojedyncze miejsce cięcia sgRNA i niezależne od selekcji badania przesiewowe, a zatem wymaga niewielkiego wcześniejszego przygotowania. Stosując tę metodę, należy zaprojektować prowadzące RNA komplementarne do eksonów w pobliżu końca 5' transkryptu, które z największym prawdopodobieństwem wytworzą nokaut. Ponieważ modyfikacje genomu w tym przypadku są niewielkie, badania przesiewowe w kierunku klonów nokautujących opierają się na plamach punktowych, w których produkt białkowy jest oceniany w sposób wysokoprzepustowy. Jako przykładu używamy generowania linii nokautujących białka ELAV-podobnego do 1 (ELAVL1). Drugie podejście opiera się na naprawie kierowanej homologią (HDR) i wykorzystuje dwa miejsca cięcia sgRNA, które obejmują gen lub region zainteresowania, co pozwala na delecje dziesiątek kb. Plazmid z dwoma regionami homologii, które flankują miejsca rozszczepienia, zapewnia zastępczy szablon (Rysunek 1B), wprowadzając wybieralny marker oporu, który zwiększa efektywność generowania nokautu. Metoda ta może być również zaadaptowana do wprowadzania modyfikacji genów za pomocą odpowiednio zaprojektowanych ramion homologicznych. W tym przypadku integracja nowego fragmentu DNA pozwala na badanie przesiewowe oparte na PCR (Figura 1C). Tutaj jako przykładu używamy generacji linii nokautujących członka rodziny wiązania RNA Pumilio 2 (PUM2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Identyfikacja regionów homologii wokół pożądanego miejsca delecji

UWAGA: Wymagane tylko w przypadku korzystania z edycji opartej na zaznaczaniu.

  1. Wybierz dwa regiony o początkowej długości 1,5-2 kb, położone po obu stronach pożądanego miejsca delecji, które będą służyć jako ramiona homologii w matrycy HDR (Rysunek 1A). Zidentyfikuj regiony pozbawione miejsc rozpoznawania BsaI na obu niciach (GGTCTC), aby ułatwić klonowanie. Jeśli miejsc BsaI nie da się uniknąć, użyj innego enzymu restrykcyjnego typu IIs (BsmBI, SapI, BbsI) i zmodyfikuj odpowiednie miejsca w plazmidzie biorcy (pUC19-BsaI), plazmidzie donora markera oporności (pGolden-Neo lub pGolden-Hygro) oraz w nadwiszących końcach produktów PCR ramion homologii.

2. Generowanie plazmidów ekspresyjnych Cas9-sgRNA

  1. Określ miejsce lub miejsca docelowe dla mutogenezy. W przypadku metody z pojedynczym cięciem, bez selekcji, celuj w egzony kodujące proksymalne względem końca 5', aby zwiększyć prawdopodobieństwo powstania mutacji niefunkcjonalnej. W przypadku metody z dwoma cięciami wybierz dwa miejsca obejmujące taką część genu, jaka jest niezbędna.
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że efektywnie tworzone są delecje o wielkości do 53 kb.
  2. Wprowadź od 200 do 300 bp sekwencji regionu docelowego do narzędzia projektowego crispr.mit.edu. W przypadku klonowania opartego na selekcji wykorzystaj 200-300 bp zidentyfikowanych regionów homologii, które są proksymalne względem miejsca delecji (Rycyna 1A). Wybierz 2-3 najwyżej ocenione sgRNA na każdy region docelowy, aby uwzględnić różnice w ich aktywności oraz wyizolować niezależne klony, które nie wykazują tych samych potencjalnych efektów off-target.
  3. Aby zaprojektować dupleksowe oligonukleotydy z odpowiednimi nawisami do insercji do plazmidu ekspresyjnego, pomiń końcową sekwencję PAM (NGG) i dodaj nawis 5'-CACC, a następnie G do oligonu nici górnej. Dla oligonu nici dolnej dodaj nawis 5'-AAAC do odwrotnej komplementarnej sekwencji docelowej, a następnie 3'-C, jak zilustrowano poniżej:
    Dopasowanie sekwencji edycji genów; nici sgRNA, TS, BS; schemat procesu CRISPR.
  4. Wprowadź syntetyczne oligonukleotydy odpowiadające sgRNA do plazmidu pSpCas9(BB), stosując klonowanie Golden Gate28 zgodnie z protokołem laboratorium Zhanga29.

3. Generowanie plazmidów matrycowych do naprawy kierowanej homologią

UWAGA: Wymagane tylko w przypadku stosowania edycji opartej na selekcji. Plazmid matrycy do naprawy sterowanej homologią składa się z kasety oporności na lek, flankowanej przez dwa regiony komplementarne do genomu, znajdujące się bezpośrednio poza dwoma miejscami docelowymi sgRNA (Rycina 1B).

  1. Z szerszych regionów homologii zidentyfikowanych w kroku 1.1, wybierz fragment o długości 800-1 000 bp26, znajdujący się nie dalej niż 5-10 bp od zaprojektowanych miejsc cięcia Cas9, który będzie służył jako ramiona homologii (Rysunek 1A). Należy upewnić się, że ramiona homologii nie zawierają miejsca docelowego sgRNA ani sekwencji PAM, ponieważ spowodowałoby to cięcie samego plazmidu matrycy przez CRISPR/Cas9. Jeśli ramiona homologii zawierają wewnętrzne miejsca BsaI, należy zastosować alternatywne miejsca sgRNA.
  2. Amplifikuj ramiona homologii z DNA genomowego metodą PCR, wykorzystując polimerazę DNA o wysokiej wierności, zgodnie z instrukcjami producenta, stosując primery forward i reverse z dodatkową sekwencją na końcu 5', która wprowadza miejsca BsaI (GGTCTC) oraz unikalne nawisy na obu końcach regionu homologii. Nawisy muszą zawierać odpowiednie sekwencje, aby zapewnić prawidłową kolejność i orientację montażu, jak opisano poniżej (Rysunek 1B):
    Nawis FP lewego ramienia homologii: 5' GGGTCTCAGGCC
    Nawis RP lewego ramienia homologii: 5' GGGTCTCTCACG
    Nawis FP prawego ramienia homologii: 5' GGGTCTCAGTCC
    Nawis RP prawego ramienia homologii: 5' GGGTCTCTCCAC
  3. Przed kontynuacją sprawdź poprawność amplifikacji ramion homologii za pomocą elektroforezy w żelu.
  4. Zmontuj regiony prawego i lewego ramienia homologii wraz z kasetą oporności w plazmidzie matrycy HDR za pomocą klonowania Golden Gate28. Jako źródło kaset oporności flankowanych przez loxP (loxP-PGK-Neo-pA-loxP lub loxP-PGK-Hyg-pA-loxP) wykorzystaj plazmidy pGolden-Neo lub pGolden-Hygro30. Jako wektor biorcy wykorzystaj pUC19-BsaI, zmodyfikowany plazmid pUC19 z miejscami BsaI w regionie wielokrotnego klonowania i usuniętymi miejscami BsaI w pozostałych częściach (dostępny na zapytanie). Zastosuj stosunek 1:1:1:1 dla trzech wstawek i wektora.
    1. Przygotuj następującą mieszaninę reakcyjną30:
      Produkt PCR prawego ramienia homologii0,06 pmol (30-40 ng)
      Produkt PCR lewego ramienia homologii0,06 pmol (30-40 ng)
      Plazmid pGolden-Neo (100 ng/µL)1 µL
      Plazmid pUC19-BsaI (100 ng/µL)1 µL
      Bufor 2x T7 DNA ligase5 µL
      BsaI (10 U/µL)0,75 µL
      T7 DNA ligase (3000 U/µL)0,25 µL
      Wodado 10 µL
    2. Zastosuj następujące parametry termocyklera: 37 °C przez 5 min, 20 °C przez 5 min. Powtórz przez 30 cykli.
    3. Potraktuj produkt klonowania egzonukleazą zgodnie z instrukcjami producenta, aby strawić pozostałe liniowe DNA.
    4. Przeprowadź transformację mieszaniny reakcyjnej do kompetentnego szczepu E. coli zgodnie z protokołem dostarczonym wraz z komórkami i wysiej na szalki zawierające ampicylinę.
  5. Aby zidentyfikować klony z prawidłowo zmontowaną matrycą, przeprowadź kolonialną reakcję PCR w celu amplifikacji podregionów ramion homologii zmontowanej wstawki (ponieważ cała wstawka może być zbyt duża, aby można było ją niezawodnie amplifikować). Użyj jednego primera przyłączającego się do flankującej sekwencji plazmidu i drugiego primera komplementarnego do krawędzi kasety oporności (Rysunek 1B, sekwencja jest wspólna dla wstawek Neo i Hygro), co pozwoli uzyskać produkt zależny od montażu, który jest o około 200 bp dłuższy od zawartego ramienia homologii:
    pUC19-Bsal-Left: 5' GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
    Resistance-Left: 5' AAAAGCGCCTCCCCTACCC
    pUC19-BsaI-Right: 5' GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
    Resistance-Right: 5' AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG
    1. Pobierz kolonie bakteryjne za pomocą sterylnych wykałaczek i zawieś bakterie w 20 µL wody. Podgrzewaj w temperaturze 95 °C przez 15 min, a następnie wiruj w wirówce stołowej z maksymalną prędkością przez 5 min. Natychmiast umieść na lodzie.
    2. Przygotuj następującą mieszaninę PCR31:
      Rozcieńczona matryca kolonialna1,25 µL
      Bufor reakcyjny 10x Taq1,25 µL
      20 mM dNTPs0,25 µL
      Primer Forward 10 µM0,25 µL
      Primer Reverse 10 µM0,25 µL
      Polimeraza Taq0,25 µL
      Woda9 µL
    3. Zastosuj następujące parametry termocyklera: 95 °C przez 30 s, (95 °C przez 30 s, 61 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min/kb), powtórz przez 25 cykli, 72 °C przez 2 min.
    4. Sprawdź wielkość produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    5. Opcjonalnie przeprowadź miniprep DNA plazmidowego z poszczególnych kolonii o prawidłowej wielkości wstawki i zsekwencjonuj regiony ramion homologii metodą sekwencjonowania Sangera, używając wspomnianych wyżej primerów amplifikacyjnych.

4. Transfekcja komponentów CRISPR do hodowli komórkowych

  1. Przed transfekcją: hodować komórki T-REx293 w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  2. Wysiać komórki na płytki 6-dołkowe i hodować do uzyskania około 70% konfluencji. Wyznaczyć dołek dla kontroli nietransfekowanej.
  3. Przetransfekować komórki łącznie 2,5 µg plazmidu zgodnie z komercyjnym protokołem transfekcji. Równolegle prowadzić kontrolę nietransfekowaną.
    UWAGA: Metoda i wydajność transfekcji różnią się w zależności od typu komórek. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy dobrać odpowiednią metodę transfekcji dla danego układu.
    1. W przypadku transfekcji komórek z selekcją, użyć 0,75 µg Cas9-sgRNA 1 (cięcie lewe), 0,75 µg Cas9-sgRNA 2 (cięcie prawe) oraz 1,0 µg matrycy do rekombinacji homologicznej.
    2. W przypadku transfekcji komórek bez selekcji, użyć 2,5 µg plazmidu Cas9-sgRNA.

5. Wybór leku

  1. 48 h po transfekcji potraktuj komórki odpowiednim lekiem (neomycyną/higromycyną). Prowadź selekcję do momentu, aż wszystkie komórki w niepoddanej transfekcji kontroli obumrą (zazwyczaj 3-5 dni dla Neo, 7-14 dni dla Hygro).
    UWAGA: Dla komórek T-REx293 stosuj stężenia odpowiednio 500 µg/mL dla neomycyny oraz 10 µg/mL dla higromycyny. W przypadku innych typów komórek pomocne może być wcześniejsze przeprowadzenie miareczkowania leku na komórkach niepoddanych transfekcji w celu określenia stężenia efektywnego.

6. Izolacja populacji klonalnych

  1. Po selekcji hodować komórki do 100% konfluencji w oryginalnej studzience. Wysiać komórki na płytki 96-dołkowe z gęstością 0,33 komórki na studzienkę.
    UWAGA: Wysianie trzech płytek 96-dołkowych jest dobrym punktem wyjścia, aby zapewnić izolację więcej niż jednego poprawnego klonu, jednak może być potrzebna większa lub mniejsza liczba płytek w zależności od wydajności sgRNA i HDR.
  2. Obserwować kolonie przez okres od 2 do 4 tygodni, aż staną się widoczne gołym okiem. Pobrać widoczne kolonie za pomocą sterylnego końcówki pipety i przesiać do nowych studzienek, aby wspomóc wzrost monowarstwy. W przypadku komórek w zawiesinie można zastosować jeszcze niższą gęstość siewu, aby zapewnić większy odsetek studzienek z pojedynczą kolonią.

7. Przesiewanie kandydatów

  1. Przesiewanie kandydatów bez użycia selekcji: dot blot
    1. Hodować poszczególne klony do 50-100% konfluencji. Oddzielić monowarstwę komórek poprzez pipetowanie wewnątrz dołka.
    2. Przenieść 90 µL z całkowitej objętości 100 µL do czystej probówki do mikrocentryfugi. Wirować przy 6000 rpm przez 5 min, usunąć medium i lizować osad komórkowy w 10 µL 1x buforu do lizy lub 1x buforu do ładowania SDS (5x: 250 mM Tris-Cl pH 6.8, 8% SDS, 0.1% błękitu bromofenolowego, 40% glicerolu, 100 mM DTT). Do pozostałych komórek w dołku dodać 90 µL świeżego medium, aby kontynuować namnażanie.
    3. Nanieść 1 µL lizatu komórkowego na suchą membranę nitrocelulozową, tworząc kropkę. Wykonać dot blot dla każdej próbki dwukrotnie na dwóch oddzielnych membranach, tworząc dwa identyczne układy próbek.
    4. Blokować membrany w 5% roztworze mleka w TBST (Tris Buffered Saline + 0.01% Tween 20: 8 g NaCl, 0.2g KCl, 3 g zasady Tris, uzupełnić wodą destylowaną do 1 L, pH 7.4)31 przez 1 h w temperaturze pokojowej (z wytrząsaniem, tutaj i w dalszej części procedury).
    5. Inkubować membrany z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko białku docelowemu na jednej membranie oraz przeciwciałem pierwszorzędowym dla białka kontrolnego (tubuliny, GAPDH lub innego białka, którego nie oczekuje się, że ulegnie zmianie) na drugiej. Stosować zalecane rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego (0.2 µg/mL dla ELAVL1 i 0.1 µg/mL dla Pum2 w tym przypadku) w TBST + 5% mleka. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.
    6. Przemywać 3 razy w TBST przez 5 min.
    7. Inkubować każdą membranę z odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP w TBST + 5% mleka przez 1 h w temperaturze pokojowej.
    8. Przemywać 3 razy w TBST przez 5 min.
    9. Nanieść roztwór substratu do chemiluminescencji (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i obrazować membranę na cyfrowym imagerze do chemiluminescencji.
    10. Ilościowo określić intensywność kropki dla białek docelowych i kontrolnych za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
    11. Odrzucić kandydatów z niskim sygnałem białka kontrolnego i obliczyć stosunki intensywności białka docelowego do kontrolnego po odjęciu tła dla pozostałych kandydatów. Wybrać kandydatów z najniższymi stosunkami do pasażowania i dalszej walidacji za pomocą western blot.
  2. Przesiewanie kandydatów z użyciem selekcji: colony PCR
    1. Zebrać lizat komórkowy przy użyciu zestawu do preparatyki DNA (patrz Tabela materiałów).
      1. Przenieść poszczególne kolonie do nowej płytki 96-dołkowej i hodować do 100% konfluencji.
      2. Usunąć medium z jednego zestawu klonów i resuspendować komórki w 30 µL buforu do ekstrakcji z zestawu. Przenieść do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL.
      3. Podgrzać roztwór do 96 °C przez 15 min i pozwolić mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
      4. Dodać 30 µL buforu stabilizującego z zestawu. Dokładnie wymieszać.
    2. Zidentyfikować linie typu dzikiego oraz mutanty monoalleliczne/bialleliczne za pomocą colony PCR.
      1. Zaprojektować dwa oddzielne zestawy starterów PCR (dla lewej i prawej strony docelowego locus), aby amplifikować regiony wokół ramion homologii w zależności od pomyślnej lub niepomyślnej integracji kasety oporności (Rysunek 2C). Po każdej stronie zastosować wspólny starter (czerwony), który hybrydyzuje poza ramieniem homologii. Użyć go w parze z odpowiadającym mu starterem komplementarnym do sekwencji endogennej, obejmującym region homologii (niebieski), aby przetestować obecność allelu typu dzikiego. Użyć innego startera parzystego, komplementarnego do wstawionej kasety oporności (patrz startery w sekcji 2.3), aby przetestować pożądaną mutację.
      2. (Zalecane) Zwalidować zestawy starterów, używając lizatu komórkowego z oryginalnej wyselekcjonowanej populacji komórek zbiorczych, ponieważ będzie ona zawierać mieszankę alleli WT i mutantów (Rysunek 2D).
      3. Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną:
        Lizat komórkowy0.5 µL
        10x bufor KOD1.25 µL
        25mM MgSO40.75 µL
        2 mM dNTPs1.25 µL
        10 µM starter Forward0.375 µL
        10 µM starter Reverse0.375 µL
        Polimeraza KOD0.25 µL
        Woda7.75 µL
      4. Zastosować następujące warunki termocyklera: 95 °C przez 2 min, (95 °C przez 20 s, Tm startera przez 10 s, 70 °C przez 20 s/kb) powtórzyć przez 25 cykli.
      5. Wizualizować produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    3. Powtórzyć testy colony PCR dla każdej strony przewidywanej integracji. Wybrać i namnożyć kandydatów, u których stwierdzono obecność integracji i brak produktu sekwencji endogennej dla regionu usuniętego.
    4. Zwalidować pozytywne kandydaty za pomocą western blot i/lub RT-qPCR.

8. Weryfikacja mutacji genomicznej poprzez sekwencjonowanie

  1. Wyizolować DNA genomiczne z mutantowych linii komórkowych metodą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej31.
  2. Przeprowadzić amplifikację PCR regionu docelowego sgRNA, stosując primery z nadmiarowymi końcami 5', które dodają miejsca restrykcyjne BsaI na obu końcach.
    UWAGA: W przypadku klonów edytowanych metodą HDR, gdzie oba allele mogą być identyczne, produkt PCR można sekwencjonować bezpośrednio.
  3. Sklonować amplifikowany region do wektora pUC19-BsaI za pomocą klonowania Golden Gate.
  4. Przenieść mieszaninę reakcyjną do kompetentnego szczepu E. coli poprzez transformację.
  5. Wykonać miniprep DNA plazmidowego z 6-10 pojedynczych kolonii i zsekwencjonować sklonowany region metodą sekwencjonowania Sangera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do wygenerowania linii z nokautem ELAVL1 dostępnym było skuteczne przeciwciało, dlatego edycję przeprowadzono z użyciem pojedynczych sgRNA (Rycina 1A, po lewej) przeprowadzono, a następnie wykonano dot immunoblot. W celu porównania wydajności oraz wykluczenia efektów poza celowych w otrzymanych klonach, niezależnie przetransfekowano trzy sgRNA. Po zebraniu lizatów komórkowych z populacji klonalnych i naniesieniu ich na dwie membrany nitrocelulozowe, bloty pod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

System CRISPR/Cas9 pozwolił na efektywne generowanie stabilnych modyfikacji genomu, które stanowią bardziej spójną alternatywę dla innych metod manipulacji w stanach nieustalonych. W tym miejscu przedstawiliśmy dwie metody szybkiej identyfikacji nokautów genów CRISPR/Cas9 w liniach komórkowych ssaków. Obie metody wymagają niewielkiej ilości materiału komórkowego, więc testy można przeprowadzić we wczesnych stadiach hodowli klonalnej, oszczędzając czas i odczynniki. Aby zwiększyć skuteczność obu metod, zalecamy testowanie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Gissell Sanchez, Megan Lee i Jasonowi Estepowi za pomoc eksperymentalną oraz Weifeng Gu i Xuemei Chen za udostępnienie odczynników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kompetentny E. Zestaw
plazmid pSpCas9 (BB)Addgene42230Ran et al. 2013, klonowanie sgRNA
Enzym BbsIThermoFisherFD1014Ran et al. 2013, klonowanie sgRNA
Ran et al. 2013, klonowanie sgRNAs
Tango BufferThermoFisherBY5Ran et al. 2013, klonowanie sgRNAs
PlasmidSafe egzonukleazaEpicentrumE3105KRan et al. 2013, klonowanie sgRNAs
Q5 gorący start polimeraza wysokiej wiernościNEBM0494AHA amplifikacja
pUC19-BsaIZmodyfikowany plazmid pUC19, zmutowany istniejący obszar BsaI i wstawiony dwa skierowane na zewnątrz miejsca BsaI po trawieniu BamHI/EcoRI
Kaseta rezystancyjnapGolden-NeoAddgene51422
pGolden-HygroAddgene51423Kaseta rezystancyjna
BsaINEBR3535SBudowa ramienia homologicznego
Ligaza DNA T7NEBM0318L
PlasmidSafe egzonukleazaEpicentrumE3105K
Wykałaczkibakteryjne PCR
Taq polimerazakolonia bakteryjna
PCR HEK293 komórki
DMEMCorning10-013-CV
FBSCorningMT35010CV
Penicylina-Strep (opcjonalnie)Gibco15140-122
Płytki 6-dołkoweBioLite12556004
Odczynnik do transfekcji TransIT-LTIMirusMIR2300tylko do lipofekcji
Opti-MEMThermoFisher31985062tylko do lipofekcji
G418 (neomycyna)Sigma AldrichA1720-5G
HigromycynaSigma AldrichH3274-250MG
96-dołkowe płytkiThermoFisher12556008
Pasywny bufor do lizy, 5xPromega
1x receptura buforaopisana w protokole
Membrana nitrocelulozowaBio-Rad162-0115
Receptura TBSTopisana w protokole
Mleko suszone
Substrat SuperSignal West Dura o wydłużonym czasie trwaniaThermoFisher34075do przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP
Przygotowanie Extracta DNA do PCRQuantabio95091-025
Polimeraza KODNovagen71316
do przygotowania plazmidu komórek em< / em> Ligaza DNA T7 NEB M0318L enzym ludzkie ładującego SDS

Bibliografia

  1. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  2. Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
  3. Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
  4. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  5. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
  6. Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
  7. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  8. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  9. Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
  10. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
  11. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  12. Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
  13. Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  14. Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  15. Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
  16. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  17. Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
  18. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  19. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  20. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  21. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  22. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  23. Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
  24. Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
  25. Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
  26. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  27. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  28. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  29. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  30. Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
  31. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
  32. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766(2014).
  33. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nokaut genuniehomologiczne czenie ko c wnaprawa kierowana homologidot immunoblotPCR koloniiizolacja klonalnarozcie czenia seryjneselekcja lekowaWestern blot
Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.