Artykuł metodologiczny

Badanie patofizjologii czynnika von Willebranda przy użyciu modelu komory przepływowej tworzenia się czynnika von Willebranda i sznurka płytkowego

DOI:

10.3791/55917

⸱

14 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Department of Medicine, Queen's University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisujemy metodę oceny śródbłonkowego uwalniania czynnika von Willebranda i późniejszego wychwytywania płytek krwi pod wpływem stresu ścinającego płyn w odpowiedzi na bodźce zapalne za pomocą systemu komór przepływowych in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynnik von Willebranda (VWF) jest multimerycznym czynnikiem krzepnięcia glikoproteiny, który pośredniczy w adhezji i agregacji płytek krwi w miejscach uszkodzenia śródbłonka i który przenosi czynnik VIII w krążeniu. VWF jest syntetyzowany przez komórki śródbłonka i jest albo uwalniany konstytutywnie do osocza, albo jest przechowywany w wyspecjalizowanych organellach, zwanych ciałami Weibela-Palade'a (WPB), do uwalniania na żądanie w odpowiedzi na prowokację hemostatyczną. Bodźce prokoagulacyjne i prozapalne mogą szybko indukować egzocytozę WPB i uwalnianie VWF. Większość VWF uwalniana przez komórki śródbłonka krąży w osoczu; jednak część VWF jest zakotwiczona na powierzchni komórek śródbłonka. W warunkach fizjologicznego ścinania, VWF zakotwiczony w śródbłonku może wiązać się z płytkami krwi, tworząc ciąg płytek VWF, który może reprezentować nidus tworzenia się skrzepliny. System komór przepływowych może być używany do wizualnej obserwacji uwalniania VWF z komórek śródbłonka i późniejszego wychwytywania płytek krwi w sposób, który jest powtarzalny i istotny dla patofizjologii tworzenia się skrzepliny za pośrednictwem VWF. Korzystając z tej metodologii, komórki śródbłonka są hodowane w komorze przepływowej, a następnie stymulowane za pomocą wydzielników w celu wywołania egzocytozy WPB. Umyte płytki krwi są następnie perfundowane przez aktywowany śródbłonek. Płytki krwi są aktywowane, a następnie wiążą się z wydłużonymi strunami VWF w kierunku przepływu płynu. Używając histonów zewnątrzkomórkowych jako prokoagulantu i bodźca prozapalnego, zaobserwowaliśmy zwiększone tworzenie się pasma płytek krwi VWF na komórkach śródbłonka traktowanych histonami w porównaniu z nieleczonymi komórkami śródbłonka. Protokół ten opisuje ilościową, wizualną i w czasie rzeczywistym ocenę aktywacji interakcji VWF-płytki krwi w modelach zakrzepicy i hemostazy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakrzepica jest główną przyczyną śmiertelności na całym świecie1 i może rozwinąć się w odpowiedzi na rozregulowaną aktywację płytek krwi i wytwarzanie trombiny zarówno w żyłach, jak i tętnicach. Poziomy VWF w osoczu są kluczowym regulatorem krzepnięcia krwi, przy czym niski poziom (<50%) powoduje zaburzenie krzepnięcia znane jako choroba von Willebranda (VWD)2, a wysoki poziom (>150%) wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy żylnej3 i arterial4 zakrzepicy.

VWF to multimeryczna glikoproteina syntetyzowana przez megakariocyty i komórki śródbłonka i przechowywana odpowiednio w α-granulkach płytek krwi i WPB. Po prowokacji hemostatycznej, VWF może zostać uwolniony ze śródbłonkowych WPB w celu przywiązania krążących płytek krwi do aktywowanych komórek śródbłonka5 lub odsłonięty kolagen na ścianie naczynia6. Wykazano, że w zakotwiczeniu VWF w komórkach śródbłonka pośredniczy P-selectin7 i integryna αvβ38. Późniejsze uwolnienie zapasów płytek krwi α granulek może dodatkowo zwiększyć miejscowe stężenia VWF w celu ustabilizowania interakcji płytki-płytki krwi w celu tworzenia czopów płytkowych, rusztowania potrzebnego do propagacji kaskady krzepnięcia i odkładania fibryny. Aktywność wiązania płytek krwi VWF jest regulowana przez jego strukturę multimeryczną, przy czym multimery o dużej masie cząsteczkowej mają większą aktywność hemostatyczną9,10. W obiegu VWF działa również jako nośnik czynnika krzepnięcia VIII.

Naprężenie ścinające płynu jest podstawowym regulatorem fizjologii VWF. W przypadku braku naprężeń ścinających, VWF występuje w postaci kulistej, ukrywając domeny wiążące dla adhezji glikoproteiny Ib z glikoproteiną płytkową11. Gdy występuje naprężenie ścinające, odsłania się miejsce rozszczepienia metaloproteazy, dezintegryny A i metaloproteazy z motywem trombospondyny (ADAMTS13). ADAMTS13 rozszczepia nagie i ozdobione płytkami VWF struny VWF, aby regulować rozmiar multimera, zmniejszając w ten sposób jego aktywność hemostatyczną12.

VWF jest białkiem ostrej fazy, a liczne bodźce, w tym niedotlenienie13, infection14 i cytokiny prozapalne, okazały się pośredniczyć w uwalnianiu VWF z komórek śródbłonka. Podobnie jak inne czynniki zapalne, wykazano również, że histony zewnątrzkomórkowe indukują ogólnoustrojowe uwalnianie VWF u myszy15,16 i aktywację płytek krwi in vitro17,18,19. Wykazano, że jest to zależne od podtypu histonu, ponieważ różnice w zawartości lizyny i argininy mogą wpływać na function15. Nasze badanie ma na celu ustanowienie modelu komory przepływowej w celu zbadania wpływu podtypów histonów bogatych w lizynę (HK) i argininę (HR) oraz sekretagogów na śródbłonkowe uwalnianie VWF i wychwytywanie płytek krwi w czasie rzeczywistym, potencjalne wczesne zdarzenia w zakrzepicy wywołanej stanem zapalnym.

Ta metodologia komory przepływowej podsumowuje interakcje in vivo między kolagenem podśródbłonkowym, komórkami śródbłonka, VWF i płytkami krwi w systemie in vitro, który jest wizualny, powtarzalny i policzalny. Pozwala na ocenę w czasie rzeczywistym wszystkich aspektów szlaku, który reguluje interakcje VWF-płytki krwi, w tym wydzielanie WPB, aktywację płytek krwi i proteolizę VWF. Badania VWF w warunkach kontrolowanego naprężenia ścinającego zostały wykorzystane do oceny mutacji VWD, które upośledzają uwalnianie VWF i funkcję wiązania płytek krwi20, WPB physiology21, oraz rozszczepienie VWF według ADAMTS135. Używamy tej metodologii do ilościowego określenia powstawania sznurka płytek krwi VWF w wyniku bodźca zapalnego: histonów zewnątrzkomórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania zostały zatwierdzone przez Radę Etyki Badań Queen's University w Kanadzie.

1. Stymulacja komórek śródbłonka

  1. Pokryj kolagenem 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej.
    1. 24 godziny wcześniej pokryć 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C 1 ml buforu kolagenowego (50 μg/ml kolagenu typu 1 z ogona szczura z 0,02 M lodowatym kwasem octowym).
    2. Umyj studzienki dwukrotnie 2 ml Zbilansowanego Roztworu Soli Hanka (HBSS).
      UWAGA: Talerze można zawijać w folię aluminiową i przechowywać w hermetycznej plastikowej torbie w temperaturze 4 °C.
  2. Wysiewać komórki śródbłonka o gęstości 1 x 106 komórek na studzienkę w 2 ml pożywki wzrostowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C (5% CO2 ).
    UWAGA: W tym przypadku wykorzystano komórki śródbłonka wyrostka krwi (BOEC) między pasażami 5 i 15. BOEC wyizolowano od zdrowych ochotników z sekwencją VWF typu dzikiego przy użyciu metody, do której odwołują się Starke i wsp.22 w sposób podobny do wcześniej opisanego przez JoVE23.
  3. Po 24 godzinach usunąć pożywkę i umyć komórki HBSS.
  4. Dodać 1 ml pożywki bez surowicy (minimalna niezbędna pożywka wzrostowa bez FBS) zawierającej 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA; 100 nM), niefrakcjonowany histon (UH) i HK lub HR (wszystkie w stężeniu 25 μg/ml) do komórek przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (5% CO2).
    UWAGA: To stężenie histonu zostało oparte na wcześniejszych raportach cytotoksyczności in vitro autorstwa Xu i wsp.24 oraz Abrams et al. 25, który używał 50 μg/ml.
  5. Po 2 godzinach zebrać pożywkę i przechowywać ją w temperaturze -20 °C do czasu analizy.

2. Kwantyfikacja VWF za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)

  1. Pokryć mikropłytkę 100 μl buforu powlekającego (10 mM dwuzasadowego fosforanu sodu i 145 mM chlorku sodu, pH 7,2) zawierającego 10 μg/ml poliklonalnego przeciwciała anty-VWF przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Umyć płytkę trzykrotnie 250 μl buforu do przemywania (10 mM dwuzasadowego fosforanu sodu, 500 mM chlorku sodu i 0,1% Tween 20, pH 7,2).
  3. Rozcieńczyć próbki podłoża w stosunku 1:2 i 1:4 buforem do przemywania i użyć normalnej plazmy referencyjnej dla krzywej wzorcowej, zaczynając od rozcieńczenia 1:10.
  4. Płytkę 100 μl rozcieńczonych próbek i wzorców przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Umyj płytkę trzykrotnie 250 μl buforu do mycia.
  6. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała anty-VWF, sprzężonego z HRP (1,1 μg/μL w buforze do płukania) do płytki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Umyć płytkę i inkubować przez 10 minut z odczynnikiem Dichlorowodorek O-fenylenodiaminy (OPD), zgodnie z instrukcjami producenta.
  8. Zatrzymać reakcję za pomocą 100 μL 1 M H2SO4 i odczytać płytkę przy 492 nm.

3. Test wiązania histonów VWF w fazie stałej

  1. Pokryć mikropłytkę histonami rozcieńczonymi w 0,5% deoksycholanie sodu 50 mM buforu węglanowym (pH 9,6) do 10 μg/ml przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Umyj płytkę trzykrotnie 250 μl PBS uzupełnionego 0,1% Tween 20, inkubując przez 10 minut między praniami.
  3. Zablokować płytkę 200 μl PBS uzupełnionego 0,1% Tween 20 i 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Powtórz krok 3.2.
  5. Seryjnie rozcieńczać ludzki kompleks VWF/czynnik VIII pochodzący z osocza od 200 mU/ml do 25 mU/ml w buforze soli fizjologicznej (10 mM dwuzasadowego fosforanu sodu, 500 mM chlorku sodu i 0,1% Tween 20, pH 7,2). Dodaj 100 μL do płytki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Powtórz krok 3.2.
  7. Wykryć wiązanie VWF z unieruchomionym histonem za pomocą 100 μl roztworu zawierającego PBS-0,1% Tween 20 i 1:1,000 królicze poliklonalne przeciwciało anty-VWF sprzężone z HRP przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Powtórz krok 3.2.
  9. Inkubować płytkę przez 30 minut ze 100 μl odczynnika OPD i zatrzymać reakcję ze 100 μl 1 M H2SO4. Zmierz gęstość optyczną przy długości fali 492 nm.

4. Wysiewanie komórek śródbłonka do komór przepływowych

  1. Załadować 0,5 ml buforu powlekającego kolagen (opisanego w kroku 2.1) do strzykawki Luer-lock o pojemności 1 ml.
  2. Przekręcić końcówkę strzykawki typu Luer-lock na zbiornik szkiełka z komorą przepływową.
  3. Naciskać tłok powoli, aż cała ścieżka zostanie pokryta, a każdy zbiornik będzie pełny. Powtórzyć dla każdego toru i inkubować komorę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  4. Odessać bufor powlekający kolagen za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Załadować do kolejnej strzykawki 1 ml HBSS i powoli naciskać tłok, aby umyć każdą linię komory przepływowej. Odessać popłuczynę pipetą o pojemności 200 μl umieszczoną na przeciwległym końcu komory przepływowej. Powtórz dwa razy.
  5. Odpipetować około 100 μl roztworu komórek śródbłonka 3 x 106 komórek/ml (BOEC) w pożywce wzrostowej z 10% FBS do toru komory przepływowej.
    UWAGA: Gęstość wysiewu komórek śródbłonka przekracza pojemność komory. Ma to na celu zapewnienie maksymalnego pokrycia kanału; Nieprzylegające komórki są usuwane w kolejnym etapie mycia.
  6. Inkubować w komorze w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Zmieniać podłoże co 8-12 godzin za pomocą strzykawek typu Luer-lock (jak w kroku 4.4). Upewnij się, że na pasach ruchu nie ma widocznych bąbelków.

5. Izolowanie płytek krwi od ludzkiej krwi pełnej

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego z igłą 30 G dodać 300 μl buforu dekstrozy kwasowo-cytrynianowego (85 mM cytrynianu trisodowego, 111 mM D-glukozy i 71 mM kwasu cytrynowego, pH 4,5) do wolnego od dodatków wakutainera do pobierania krwi o pojemności 3 ml.
  2. Pobieraj pełną krew od zdrowych ochotników (wolną od leków przeciwpłytkowych i niesteroidowych leków przeciwzapalnych przez siedem dni) przez nakłucie żyły (trzy probówki po 3 ml każda), zgodnie z protokołem podobnym do tego opublikowanego przez Bernardo i wsp26.
  3. Wyrzuć pierwszą rurkę, ponieważ początkowe uszkodzenie tkanki związane z nakłuciem dożylnym może spowodować spontaniczną aktywację płytek krwi.
  4. Delikatnie odwróć wakutainery trzy razy, aby wymieszać krew z antykoagulantem.
  5. Odwirować urządzenia próżniowe przy 150 x g przez 15 minut w temperaturze 24 °C (temperatura pokojowa).
  6. Powoli usunąć osocze bogatopłytkowe (supernatant) za pomocą pipety w komorze bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przenieś bogatą w płytki krwi objętość każdego urządzenia do utrzyżenia do pojedynczej stożkowej probówki, aby uniknąć potencjalnej aktywacji krzyżowej.
    UWAGA: Izolacja płytek krwi powinna być wykonywana w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu i potencjalnej aktywacji sztucznych płytek krwi i/lub śródbłonka.
  7. Odwirować stożkowe probówki o sile 900 x g przez 10 minut w temperaturze 24 °C (temperatura pokojowa) w celu osadzenia płytek krwi.
  8. Odpipetować i wyrzucić supernatant ubogi w płytki krwi.
  9. Ostrożnie przepłukać osad 1 ml buforu cytrynianowo-glukozowo-sodowego (CGS) (13 mM cytrynian sodu, 30 mM D-glukozy i 120 mM chlorek sodu, pH 7,0).
    UWAGA: Płytki krwi pojawią się w formacjach przypominających ogniki po dodaniu buforu CGS i delikatnym ponownym zawieszeniu osadu. W próbkach zanieczyszczonych aktywacją płytek krwi płytki krwi nie ulegają łatwemu zawieszeniu i wydają się grudkowate.
  10. Po całkowitym ponownym zawieszeniu próbki należy odwirowywać przy masie 900 x g przez 10 minut w temperaturze 24 °C (temperatura pokojowa).
  11. Usunąć bufor płuczący CGS i ponownie zawiesić osad w 3 ml buforu Tyrode'a (138 mM chlorku sodu, 5,5 mM D-glukozy, 12 mM wodorowęglanu sodu, 2,9 mM chlorku potasu i 0,36 mM dwuzasadowego fosforanu sodu, pH 7,4). Zapewnić całkowite ponowne zawieszenie płytek krwi i, jeśli zaobserwowane są skupiska, odrzucić próbkę.
  12. Dodać 1,5 μl z 20 mM roztworu podstawowego DiOC6 (rozpuścić 57,25 mg w 5 ml metanolu) do każdej stożkowej probówki o pojemności 3 ml z przemytymi płytkami krwi, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM,
    UWAGA: DIOC6 to zielony fluorescencyjny barwnik mitochondrialny używany w tym eksperymencie do znakowania płytek krwi.
  13. Podwielokrotność 1 ml przemytego roztworu płytek krwi do trzech probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Objętość płytek krwi wymagana w tym eksperymencie jest obliczana na podstawie wielkości komory przepływowej, pożądanego naprężenia ścinającego i długości eksperymentu (krok 6.5). Protokół ten można dostosować w miarę zmiany warunków, aby zapewnić wystarczającą objętość dla przepływu płynu.
  14. Umyte płytki krwi należy zużyć w ciągu 2 godzin od izolacji.

6. Zespół aparatury przepływowej

  1. Podłącz 70-centymetrowy kawałek sterylnej silikonowej rurki (średnica wewnętrzna 1.6 mm) do męskiego łącznika kolankowego Luer na jednym końcu i żeńskiego adaptera Luer lock na drugim.
  2. Podłącz żeński adapter Luer lock podłączony do rurki do strzykawki o pojemności 20 ml.
  3. Powtórz kroki 6.1 i 6.2 dwukrotnie, aby wygenerować trzy identyczne połączenia rurki strzykawki.
  4. Użyj pompy strzykawkowej, aby wytworzyć przepływ płynu. Wprowadź następujące ustawienia do pompy strzykawki: średnicę wewnętrzną strzykawki i natężenie przepływu.
    UWAGA: Strzykawka o pojemności 20 ml ma średnicę wewnętrzną 19,55 mm. Natężenie przepływu jest obliczane na podstawie żądanej szybkości ścinania/naprężenia ścinającego i wymiarów komory przepływowej. Dla komory przepływowej zastosowanej w niniejszym badaniu, aby osiągnąć 1 dyn/cm2 (obserwowane przy niskim ścinaniu żylnym), wymagane jest natężenie przepływu 9,37 μl/min. Ze względu na dowody łączące histony z zakrzepicą żylną, wybiera się umiarkowane ścinanie żylne 4,45 dyn/cm2. Opiera się to również na założeniu, że bufor ma podobną lepkość do wody. Natężenie przepływu wynosi wtedy 41,7 μl/min. Równania używane do obliczania natężenia przepływu dla różnych wymiarów komory przepływowej można znaleźć pod adresem:
    1. Ustaw pompę tak, aby pobierała płyn za pomocą przycisku na pompie strzykawkowej.
  5. Załadować trzy strzykawki podłączone do rurki na pompie strzykawkowej i mocno zamocować wsporniki wokół strzykawek i tłoków.
  6. Przymocuj męski łokieć Luer do obu końców drugiego 20-centymetrowego kawałka sterylnej silikonowej rurki.
  7. Podłącz jeden łokieć Luer do igły o rozmiarze 18.
  8. Powtórz dwukrotnie, tworząc trzy identyczne układy dolotowe dla trzech torów komory przepływowej.
    UWAGA: Rurki silikonowe i Luers można umyć 10% wybielaczem, a następnie wodą destylowaną przed ponownym użyciem. Nie zaleca się ponownego użycia komór przepływowych.

7. Ustawienia mikroskopu

  1. Użyj mikroskopu z wirującym dyskiem wyposażonego w w pełni zautomatyzowany stolik. Wykonuj oświetlenie za pomocą wystrzeliwania laserowego, które zapewnia linie laserowe o długości fali 405, 458, 491, 543 i 633 nm. Uchwyć wszystkie obrazy za pomocą obiektywu 20X. Dostosuj wszystkie parametry za pomocą oprogramowania analitycznego (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
  2. Wybierz ustawienia kanału (filtr emisyjny: 520/35), ze wzbudzeniem przy 491 nm, do akwizycji. Ustaw urządzenie sprzężone z ładunkiem zwielokrotniającym elektrony na wzmocnienie zwielokrotniające elektrony wynoszące 150, z czasem ekspozycji 200 ms, aby uzyskać pełny zakres danych dynamicznych.
    UWAGA: Płytki krwi są znakowane zielonym barwnikiem fluorescencyjnym, DiOC6, z maksimum długości fali (wzbudzenie, 482 nm; emisja, 504 nm).
  3. Dostosuj moc lasera 491 nm do 20%.
  4. Zaznacz środek wszystkich trzech pasów ruchu i wybierz 1 μm dla zakresu z i 0,5 μm dla rozmiaru kroku. Wybierz liczbę punktów czasowych (tj. czas trwania) i czas między obrazami (tj. interwał), aby przechwytywać obraz co 10 s; Wybierz "60 punktów czasowych" na slajd. Ustaw mikroskop tak, aby przechwytywał obrazy z trzech torów i zapisywał je w wyznaczonym folderze eksperymentu.
    UWAGA: Ponieważ komora przepływowa ma trzy pasy, mikroskop będzie musiał przełączać się między trzema pozycjami, aby uchwycić obrazy.

8. Formacja łańcucha płytek VWF

  1. Usunąć pożywkę hodowlaną z komory przepływowej (z kroku 4) stosując tę samą technikę, co w kroku 4.4.
  2. Dodać 100 μl histaminy (25 μM), PMA (100 nM), UH, HK lub HR (wszystko w stężeniu 25 μg/ml) rozcieńczonych w podłożu bez surowicy (jak w kroku 1.4), aby stymulować monowarstwę BOEC przez 15 minut w temperaturze pokojowej i temperaturze otoczenia O2/CO2,
    UWAGA: Chociaż nie jest to konieczne do uwolnienia VWF, wykonanie tej stymulacji w temperaturze 37 °C poprawi egzocytozę VWF27.
  3. Upewnić się, że jeden z trzech oddzielnych torów komory przepływowej pozostaje nietraktowany jako kontrola doświadczalna.
  4. Usunąć pożywkę za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i zastąpić ją 100 - 200 μl PBS, aby zmyć wydzieliny z monowarstwy śródbłonka.
  5. Zamontuj komorę przepływową na stojaku do slajdów za pomocą klipsów naczyniowych, aby zabezpieczyć komorę na miejscu.
  6. Podłącz dostępne męskie złącze Luer na końcu rurki o długości 70 cm (podłączonej do strzykawki) do zbiornika komory przepływowej. Powtórz tę czynność dla dwóch pozostałych torów komory przepływowej.
  7. Uruchomić pompę strzykawkową, aby usunąć płyn do płukania PBS. Odpipetuj dodatkowe PBS do zbiornika przeciwległej komory przepływu, aby upewnić się, że pasy nie wyschną.
  8. Obserwować układ przepływu pod kątem równoważnego przepływu na wszystkich trzech torach, a następnie wstrzymać pompę strzykawkową.
  9. Wybierz obszar, aby przechwycić obrazy mniej więcej w środku każdego pasa, mniej więcej w tym samym obszarze między eksperymentami.
    UWAGA: Osoba obsługująca mikroskop może być ślepa na warunki eksperymentalne. Ten krok zapewnia, że mikroskop jest ustawiony przed wypływem płytek krwi (patrz krok 7).
  10. Podłączyć żeński łącznik luer do strzykawki o pojemności 5 ml, a następnie do wolnego męskiego łącznika luer (krok 6.8) i zanurzyć stępioną igłę w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej przemyty roztwór płytek krwi (krok 5.13). Powoli przeciągnąć roztwór płytek krwi przez rurkę, aby upewnić się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza.
  11. Wyjąć strzykawkę o pojemności 5 ml i podłączyć męski Luer do otwartego zbiornika komory przepływowej. Powtórz dla trzech pasów.
  12. Uruchom ponownie pompę strzykawkową i rejestruj obrazy podczas przepływu płytek krwi za pomocą mikroskopu i ustawień protokołu z kroku 7 przez 10 minut w ciemności.
  13. Po 10 minutach odłącz Luer od rurki dolotowej w zbiorniku komory przepływowej i napełnij zbiornik PBS, aby utrzymać przepływ przez monowarstwę śródbłonka.

9. Kwantyfikacja ciągu płytek VWF

UWAGA: Ciągły przepływ PBS jest wymagany do utrzymania wydłużenia pasma płytek VWF do analizy obrazu. Zatrzymanie przepływu spowoduje, że VWF stanie się kulisty i upośledza oznaczanie ilościowe VWF – pasma płytkowego. Konieczne jest uzupełnienie każdego zbiornika PBS podczas robienia zdjęć. HBSS może zastąpić PBS, jeśli na tym etapie zaobserwuje się kurczenie lub odklejanie komórek.

  1. Zaczynając od pierwszego pasa, uchwyć 10 obrazów na slajd bez nakładania się, używając soczewki obiektywowej 20X mniej więcej na środku slajdu. Powtórz tę czynność dla każdego pasa ruchu.
    UWAGA: Należy unikać obszarów otaczających zbiorniki ze względu na turbulentne naprężenia ścinające.
  2. Korzystając z oprogramowania do przetwarzania obrazu, dostosuj jasność, klikając "Obraz", "Dostosuj" i "Jasność/Kontrast". Przeciągnij pasek przewijania, aż przylegające płytki krwi będą mogły być wystarczająco dobrze widoczne do określenia ilościowego.
  3. Nagraj ciąg płytek VWF, gdy na obrazie zaobserwowane są trzy lub więcej wyrównanych płytek krwi. Policz wszystkie ciągi płytek VWF na obrazie. Powtórz te czynności dla wszystkich 10 obrazów i uśrednij dla eksperymentu.
    UWAGA: Osoba dokonująca kwantyfikacji może być ślepa na warunki eksperymentalne. Nie jest konieczne współbarwienie dla VWF, ponieważ zostało to potwierdzone przez niezależne badania8,28,29.
  4. Powtórz eksperyment co najmniej trzy razy, aby ocenić każdą sekretagogę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby bezpośrednio ocenić wpływ histonów na uwalnianie VWF z komórek śródbłonka, wystawiliśmy zbiegające się BOEC na działanie pożywki bez surowicy zawierającej PMA (kontrola pozytywna), UH, HR i HK przez 2 godziny. Wykazaliśmy, że HK indukował 2-krotny wzrost białka VWF (VWF: Ag) w pożywce leczonych komórek śródbłonka (Ryc. 1). Co ciekawe, gdy BOEC były stymulowane za pomocą UH i HR, w pożywce wykryto mniej VWF:Ag niż w stanie nieleczonym. Postawiliśmy hipotezę, że poni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż fizjologiczne znaczenie łańcuchów płytek krwi VWF pozostaje kontrowersyjne ze względu na ich szybkie rozpuszczanie w obecności proteazy rozszczepiającej VWF ADAMTS13, służą one jako ilościowy model in vitro rekrutacji płytek krwi przez VWF do miejsca, w którym może tworzyć się skrzeplina w obecności miejscowego wzrostu poziomu histonów5. Co więcej, w patologiach pozbawionych ADAMTS13 aktywności - takich jak zakrzepowa plamica małopłytkowa (TTP) - lub w mikrośrodowiskach zapalnych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alison Michels jest laureatką stypendium Fredericka Bantinga i Charlesa Besta dla absolwentów Kanady od Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR). Laura L. Swystun jest laureatką stypendium CIHR. David Lillicrap jest laureatem Kanadyjskiej Katedry Badawczej w dziedzinie Hemostazy Molekularnej. Badanie to zostało częściowo sfinansowane z grantu operacyjnego CIHR (MOP-97849).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Niefrakcjonowane histony cielęco-grasicowate (UH)Worthington BiochemicalHLYRozpuszczony w pożywce o obniżonej surowicy (5 mg/ml)
Histony bogate w lizynę cielęcej i grasicy (HK)Sigma-AldrichH5505rozpuszczony w pożywce o obniżonej surowicy (5 mg/ml)
Histony bogate w argininę cielęcej grasicy (HR)Sigma-AldrichH4830Rozpuszczony w pożywce o obniżonej surowicy (5 mg/mL)
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)Sigma-AldrichP8139Rozpuszczony w DMSO (20 mM)
HistaminaSigma-AldrichH7125-1GRozpuszczony w wodzie (50 mg / ml)
3,3' Jodek diheksyloksakarbocyjaniny (DiOC6)InvitrogenD273Rozpuszczony w metanolu (20 mM)
Królicze przeciwciało powlekające anty-VWFDAKOA0082Dla VWF ELISA
Królicze przeciwciało detekcyjne anty-VWF, sprzężone z HRPDAKOP0026Do testu wiązania VWF ELISA i histon-VWF
Nunc MaxiSorp 96-dołkowe mikropłytki płaskodenneeBioscience44-2404-21Do testu wiązania histon-VWF
Immulon 4 HBX Płaskie dno Microtiter 96-dołkoweThermo Scientific3855Do VWF ELISA
Humate-PCSL BehringN/ALudzki kompleks czynnika von Willebranda/czynnika VIII pochodzenia osocza
Normalna referencyjna precyzja plazmyBioLogicCCNRP-05Do krzywej wzorcowej VWF ELISA
Odczynnik dichlorowodorku O-fenylenodiaminy (OPD)Sigma-AldrichP8287Równoważny produkt dostępny za pośrednictwem ThermoFisher Scientific (numer katalogowy: 34006)
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Do hodowli i początkowej wysiew BOEC
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)ThermoFisher Scientific14025092
Kolagen typu 1 ze szczurzego ogonaCorning354236
Gibco Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicyThermoFisher Scientific31985070Do stymulacji komórek śródbłonka
Mikroskopia METAMORPH Oprogramowanie do automatyzacji i analizy obrazuUrządzenia molekularneNie dotyczy
Probówki do pobierania krwi BD Vacutainer, bez dodatkuBD Biosciences366703
&mikro;-Slide III 0.1 (komory przepływowe)IbidiTen produkt został wycofany z produkcji. Sugerujemy użycie µ-Slide VI 0.1 (#80661) lub 0.4 (# 80601) i ponowne obliczenie natężenia przepływu i objętości płytek krwi potrzebnych do utrzymania naprężenia ścinającego 4.45 dyn/cm2
Rurka silikonowa 1.6 mm ID: 5 m, sterylizowanaIbidi10842
Luer Lock Connector Żeńska: naturalny polipropylen, sterylizowanyIbidi10825
Złącze kolankowe Luer Męskie: białe Polipropylen, sterylizowaneIbidi10802
igła 18GStrzykawki BD Biosciences305180
20 mlBD Biosciences302830
Pompa strzykawkowaNew Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTMN/A
Quorum TechnologiesN/A
Oprogramowanie do przetwarzania obrazuImageJN/A
Mikroskop z wirującym dyskiem WaveFX-4X1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, aB., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473(2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384(2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie nici VWF p ytkihodowla kom rek r db onkaperfuzja p ytek krwistymulacja sekretagogiemuwalnianie VWFwi zanie p ytek krwiobrazowanie mikroskopowestymulacja histonamimodel zakrzepicy

Powiązane artykuły