Artykuł metodologiczny

Badanie patofizjologii czynnika von Willebranda przy użyciu modelu komory przepływowej tworzenia się czynnika von Willebranda i sznurka płytkowego

DOI:

10.3791/55917

⸱

14 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Department of Medicine, Queen's University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisujemy metodę oceny śródbłonkowego uwalniania czynnika von Willebranda i późniejszego wychwytywania płytek krwi pod wpływem stresu ścinającego płyn w odpowiedzi na bodźce zapalne za pomocą systemu komór przepływowych in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynnik von Willebranda (VWF) jest multimerycznym czynnikiem krzepnięcia glikoproteiny, który pośredniczy w adhezji i agregacji płytek krwi w miejscach uszkodzenia śródbłonka i który przenosi czynnik VIII w krążeniu. VWF jest syntetyzowany przez komórki śródbłonka i jest albo uwalniany konstytutywnie do osocza, albo jest przechowywany w wyspecjalizowanych organellach, zwanych ciałami Weibela-Palade'a (WPB), do uwalniania na żądanie w odpowiedzi na prowokację hemostatyczną. Bodźce prokoagulacyjne i prozapalne mogą szybko indukować egzocytozę WPB i uwalnianie VWF. Większość VWF uwalniana przez komórki śródbłonka krąży w osoczu; jednak część VWF jest zakotwiczona na powierzchni komórek śródbłonka. W warunkach fizjologicznego ścinania, VWF zakotwiczony w śródbłonku może wiązać się z płytkami krwi, tworząc ciąg płytek VWF, który może reprezentować nidus tworzenia się skrzepliny. System komór przepływowych może być używany do wizualnej obserwacji uwalniania VWF z komórek śródbłonka i późniejszego wychwytywania płytek krwi w sposób, który jest powtarzalny i istotny dla patofizjologii tworzenia się skrzepliny za pośrednictwem VWF. Korzystając z tej metodologii, komórki śródbłonka są hodowane w komorze przepływowej, a następnie stymulowane za pomocą wydzielników w celu wywołania egzocytozy WPB. Umyte płytki krwi są następnie perfundowane przez aktywowany śródbłonek. Płytki krwi są aktywowane, a następnie wiążą się z wydłużonymi strunami VWF w kierunku przepływu płynu. Używając histonów zewnątrzkomórkowych jako prokoagulantu i bodźca prozapalnego, zaobserwowaliśmy zwiększone tworzenie się pasma płytek krwi VWF na komórkach śródbłonka traktowanych histonami w porównaniu z nieleczonymi komórkami śródbłonka. Protokół ten opisuje ilościową, wizualną i w czasie rzeczywistym ocenę aktywacji interakcji VWF-płytki krwi w modelach zakrzepicy i hemostazy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakrzepica jest główną przyczyną śmiertelności na całym świecie1 i może rozwinąć się w odpowiedzi na rozregulowaną aktywację płytek krwi i wytwarzanie trombiny zarówno w żyłach, jak i tętnicach. Poziomy VWF w osoczu są kluczowym regulatorem krzepnięcia krwi, przy czym niski poziom (<50%) powoduje zaburzenie krzepnięcia znane jako choroba von Willebranda (VWD)2, a wysoki poziom (>150%) wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy żylnej3 i arterial4 zakrzepicy.

VWF to multimeryczna glikoproteina syntetyzowana przez megakariocyty i komórki śródbłon....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania zostały zatwierdzone przez Radę Etyki Badań Queen's University w Kanadzie.

1. Stymulacja komórek śródbłonka

  1. Pokryj kolagenem 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej.
    1. 24 godziny wcześniej pokryć 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C 1 ml buforu kolagenowego (50 μg/ml kolagenu typu 1 z ogona szczura z 0,02 M lodowatym kwasem octowym).
    2. Umyj studzienki dwukrotnie 2 ml Zbilansowanego Roztworu Soli Hanka (HBSS).
      UWAGA: Talerze można zawijać w folię aluminiową i przechowywać w hermetycznej plastikowej torbie w temperaturze 4 °C.
  2. Wysiew....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby bezpośrednio ocenić wpływ histonów na uwalnianie VWF z komórek śródbłonka, wystawiliśmy zbiegające się BOEC na działanie pożywki bez surowicy zawierającej PMA (kontrola pozytywna), UH, HR i HK przez 2 godziny. Wykazaliśmy, że HK indukował 2-krotny wzrost białka VWF (VWF: Ag) w pożywce leczonych komórek śródbłonka (Ryc. 1). Co ciekawe, gdy BOEC były stymulowane za pomocą UH i HR, w pożywce wykryto mniej VWF:Ag niż w stanie nieleczonym. Postawiliśmy hipotezę, że poni.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż fizjologiczne znaczenie łańcuchów płytek krwi VWF pozostaje kontrowersyjne ze względu na ich szybkie rozpuszczanie w obecności proteazy rozszczepiającej VWF ADAMTS13, służą one jako ilościowy model in vitro rekrutacji płytek krwi przez VWF do miejsca, w którym może tworzyć się skrzeplina w obecności miejscowego wzrostu poziomu histonów5. Co więcej, w patologiach pozbawionych ADAMTS13 aktywności - takich jak zakrzepowa plamica małopłytkowa (TTP) - lub w mikrośrodowiskach zapalnych .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alison Michels jest laureatką stypendium Fredericka Bantinga i Charlesa Besta dla absolwentów Kanady od Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR). Laura L. Swystun jest laureatką stypendium CIHR. David Lillicrap jest laureatem Kanadyjskiej Katedry Badawczej w dziedzinie Hemostazy Molekularnej. Badanie to zostało częściowo sfinansowane z grantu operacyjnego CIHR (MOP-97849).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Niefrakcjonowane histony cielęco-grasicowate (UH)Worthington BiochemicalHLYRozpuszczony w pożywce o obniżonej surowicy (5 mg/ml)
Histony bogate w lizynę cielęcej i grasicy (HK)Sigma-AldrichH5505rozpuszczony w pożywce o obniżonej surowicy (5 mg/ml)
Histony bogate w argininę cielęcej grasicy (HR)Sigma-AldrichH4830Rozpuszczony w pożywce o obniżonej surowicy (5 mg/mL)
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)Sigma-AldrichP8139Rozpuszczony w DMSO (20 mM)
HistaminaSigma-AldrichH7125-1GRozpuszczony w wodzie (50 mg / ml)
3,3' Jodek diheksyloksakarbocyjaniny (DiOC6)InvitrogenD273Rozpuszczony w metanolu (20 mM)
Królicze przeciwciało powlekające anty-VWFDAKOA0082Dla VWF ELISA
Królicze przeciwciało detekcyjne anty-VWF, sprzężone z HRPDAKOP0026Do testu wiązania VWF ELISA i histon-VWF
Nunc MaxiSorp 96-dołkowe mikropłytki płaskodenneeBioscience44-2404-21Do testu wiązania histon-VWF
Immulon 4 HBX Płaskie dno Microtiter 96-dołkoweThermo Scientific3855Do VWF ELISA
Humate-PCSL BehringN/ALudzki kompleks czynnika von Willebranda/czynnika VIII pochodzenia osocza
Normalna referencyjna precyzja plazmyBioLogicCCNRP-05Do krzywej wzorcowej VWF ELISA
Odczynnik dichlorowodorku O-fenylenodiaminy (OPD)Sigma-AldrichP8287Równoważny produkt dostępny za pośrednictwem ThermoFisher Scientific (numer katalogowy: 34006)
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Do hodowli i początkowej wysiew BOEC
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)ThermoFisher Scientific14025092
Kolagen typu 1 ze szczurzego ogonaCorning354236
Gibco Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicyThermoFisher Scientific31985070Do stymulacji komórek śródbłonka
Mikroskopia METAMORPH Oprogramowanie do automatyzacji i analizy obrazuUrządzenia molekularneNie dotyczy
Probówki do pobierania krwi BD Vacutainer, bez dodatkuBD Biosciences366703
&mikro;-Slide III 0.1 (komory przepływowe)IbidiTen produkt został wycofany z produkcji. Sugerujemy użycie µ-Slide VI 0.1 (#80661) lub 0.4 (# 80601) i ponowne obliczenie natężenia przepływu i objętości płytek krwi potrzebnych do utrzymania naprężenia ścinającego 4.45 dyn/cm2
Rurka silikonowa 1.6 mm ID: 5 m, sterylizowanaIbidi10842
Luer Lock Connector Żeńska: naturalny polipropylen, sterylizowanyIbidi10825
Złącze kolankowe Luer Męskie: białe Polipropylen, sterylizowaneIbidi10802
igła 18GStrzykawki BD Biosciences305180
20 mlBD Biosciences302830
Pompa strzykawkowaNew Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTMN/A
Quorum TechnologiesN/A
Oprogramowanie do przetwarzania obrazuImageJN/A
Mikroskop z wirującym dyskiem WaveFX-4X1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie nici VWF p ytkihodowla kom rek r db onkaperfuzja p ytek krwistymulacja sekretagogiemuwalnianie VWFwi zanie p ytek krwiobrazowanie mikroskopowestymulacja histonamimodel zakrzepicy

Powiązane artykuły