Przedstawiamy protokół do szybkiej charakterystyki biomolekularnych oddziaływań fałdowania i wiązania z termolabilnymi ligandami za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar biomolekularnych profili DSC za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to potężna technika ilościowego określania parametrów termodynamicznych rządzących biomolekularnym fałdowaniem i oddziaływaniami wiązania. Informacje te mają kluczowe znaczenie przy projektowaniu nowych związków farmaceutycznych. Jednak wiele ligandów istotnych z farmaceutycznego punktu widzenia jest chemicznie niestabilnych w wysokich temperaturach stosowanych w analizach DSC. W związku z tym pomiar oddziaływań wiążących jest trudny, ponieważ stężenia ligandów i produktów przekształcanych termicznie w komórce kalorymetrycznej stale się zmieniają. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystujący ligandy termolabilne i DSC do szybkiego uzyskiwania informacji termodynamicznych i kinetycznych na temat procesów fałdowania, wiązania i konwersji ligandów. Zastosowaliśmy naszą metodę do aptameru DNA MN4, który wiąże się z termolabilnym ligandem kokainy. Korzystając z nowej globalnej analizy dopasowania, która uwzględnia konwersję termolabilnego liganda, uzyskuje się pełny zestaw parametrów fałdowania i wiązania z pary eksperymentów DSC. Ponadto pokazujemy, że stałą szybkości konwersji ligandów termolabilnych można uzyskać za pomocą tylko jednego dodatkowego zestawu danych DSC. Przedstawiono wytyczne dotyczące identyfikacji i analizy danych z kilku bardziej skomplikowanych scenariuszy, w tym nieodwracalnej agregacji biomolekuły, powolnego fałdowania, powolnego wiązania i szybkiego wyczerpywania się ligandu termolabilnego.
Wprowadzenie
Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to potężna metoda ilościowego określania interakcji wiązania i fałdowania biomolekularnego1,2,3. Do mocnych stron DSC należy jego zdolność do wyjaśniania mechanizmów wiązania i fałdowania oraz do uzyskiwania odpowiednich parametrów termodynamicznych2,3. Co więcej, DSC może być wykonywany w roztworze w warunkach zbliżonych do fizjologicznych i nie wymaga znakowania biomolekuły lub ligandu, np. fluoroforami, znacznikami spinowymi lub izotopami jądrowymi4. Przyrząd skanuje temperaturę, mierząc ilość ciepła potrzebną do denaturacji biomolekuły w obecności i bez ligandu. Otrzymane termogramy są wykorzystywane do wyodrębnienia parametrów termodynamicznych rządzących procesami wiązania i fałdowania ligandów. Informacje dostarczane przez DSC lub inne techniki termodynamiczne mają kluczowe znaczenie dla projektowania leków ukierunkowanych na biomolekuły1,5,6,7,8. Jednak wielokrotne skanowanie do wysokich temperatur (~ 60 - 100 °C) może być problematyczne. Na przykład wiele ważnych farmaceutycznie związków ulega przegrupowaniu lub rozkładowi pod wpływem długotrwałej ekspozycji na wysokie temperatury9,10,11, tj. są termolabilne. Badanie oddziaływań wiązania przez DSC zazwyczaj wymaga wielu skanów do przodu i do tyłu w celu zweryfikowania odtwarzalności termogramu do analiz termodynamicznych12. Termiczna konwersja początkowego liganda do formy drugorzędowej o zmienionej charakterystyce wiązania prowadzi do wyraźnych różnic w kształcie i położeniu kolejnych termogramów, ponieważ stężenie początkowego liganda zmniejsza się z każdym skanem, podczas gdy produkty konwersji termicznej gromadzą się. Te zbiory danych nie podlegają tradycyjnym analizom.
Niedawno opracowaliśmy globalną metodę dopasowania dla zestawów danych termolabilnych ligandów DSC, która dostarcza kompletny zestaw parametrów termodynamicznych rządzących biomolekularnymi oddziaływaniami fałdowania i wiązania z pojedynczego eksperymentu związanego z ligandem, odnoszącego się do wymaganego termogramu dla wolnej biomolekuły4. Analiza skraca czas eksperymentu i wymaganą próbkę ~ 10-krotnie w porównaniu ze standardowymi podejściami DSC. Uwzględniliśmy konwersję termiczną liganda, zakładając, że dzieje się to podczas części każdego skanowania o wysokiej temperaturze, w której termogram nie zależy od stężenia liganda. Dlatego stężenie liganda jest stałą w części termogramu, która jest używana do wyodrębniania parametrów termodynamicznych. Dodatkowo wykazaliśmy, w jaki sposób można uzyskać stałą szybkości konwersji termicznej ligandów, wykonując jeden dodatkowy eksperyment z dłuższym okresem równowagi w wysokiej temperaturze. W przypadku układów, w których konwersja termiczna ligandów jest w mniejszym stopniu zależna od temperatury (tj. zachodzi w znacznym stopniu we wszystkich temperaturach), analiza może być modyfikowana tak, aby obejmowała zmienne stężenia ligandów. Tutaj demonstrujemy tę procedurę dla aptameru DNA MN4 w obecności termolabilnego liganda kokainy, który szybko przekształca się w benzoiloekgoninę w wysokich temperaturach (>60 °C). Chinina jest stosowana jako kontrola ujemna termolabywalności ligandów, ponieważ nie ulega konwersji w tych temperaturach eksperymentalnych, a także wiąże się z MN4. Opisano pozyskiwanie zestawów danych DSC ligandów termolabilnych i ich analizę, uzyskując parametry termodynamiczne i kinetyczne procesów fałdowania, wiązania i konwersji ligandów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbki
- Oczyść pożądaną biomolekułę13.
UWAGA: W protokole tym wykorzystuje się zakupiony aptamer DNA wiążący kokainę MN4 po trzykrotnej wymianie na 2 M NaCl, a następnie trzech rundach dejonizowanej wody przy użyciu filtra odśrodkowego z membraną odcinającą masę cząsteczkową 3 kDa. - Zsyntetyzuj i oczyść lub kup żądany ligand termolabilny 13.
UWAGA: MN4 wiąże termolabilny ligand kokainę. MN4 wiąże również chininę, która jest stosowana jako ujemna kontrola termolabilności ligandów w tych temperaturach eksperymentalnych. - Przygotować do dializy oczyszczonej biomolekuły i rozpuszczenia ligandów (20 mM fosforanu sodu i 140 mM buforu NaCl, pH 7,4, dla MN4 i stosowanych tu ligandów).
- Poddać biomolekułę dializie w stosunku do co najmniej 2 l buforu za pomocą rurki dializacyjnej z odcięciem 0,5 - 1,0 kDa.
- Przefiltruj końcowy bufor (określany jako bufor roboczy) przez filtr 0,2 μm, który został dokładnie zrównoważony z buforem.
- Odważyć żądane masy ligandów i rozpuścić je w przefiltrowanym buforze roboczym. Jeśli pożądane stężenia ligandów wymagają mas, które są zbyt małe, aby można je było dokładnie zważyć, należy przygotować stężony roztwór podstawowy liganda (10x na przykład).
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wszystkie eksperymenty DSC wykorzystywały ten sam bufor roboczy dla próbki i liganda, tj. nigdy nie wykonuj eksperymentu, w którym ligand jest rozpuszczony w innej partii buforu roboczego niż biomolekuła, ponieważ spowoduje to artefakty niedopasowania bufora w danych. - Przefiltrować roztwór podstawowy biomolekuły przez filtr 0,2 μm, który został dokładnie zrównoważony z buforem roboczym.
- Określ stężenie biomolekuły za pomocą pomiarów absorbancji (260 nm dla kwasów nukleinowych, takich jak MN4 i 280 nm dla białek).
- Przygotować biomolekułę i ligand należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C (odpowiedniej dla MN4 i stosowanych tu ligandów) lub w temperaturze -20 lub -80 °C, jeśli biomolekuła i ligandy tolerują zamrażanie i wymagane jest długotrwałe przechowywanie. Odgazowanie roztworów buforu, biomolekuły i liganda w odgazowywaczu stołowym (patrz tabela materiałów) przed załadowaniem do DSC.
UWAGA: Odgazowanie pomaga zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków w DSC w wyższych temperaturach. Bąbelki powodują artefakty sygnału, które zasłaniają kształty pików DSC i linie bazowe.
2. Przygotowanie DSC
- Odkręć uchwyt dociskowy od DSC (patrz Tabela materiałów).
- Poprowadź rurkę silikonową z bufora roboczego i przymocuj ją do przedniego kołnierza (metalowego otworu) kapilary odniesienia.
- Utwórz most między kapilarą odniesienia a kapilarą próbki, łącząc tylny kołnierz odniesienia z przednim kołnierzem próbki.
- Podłącz kawałek silikonowej rurki do tylnego kołnierza próbki, który biegnie do kolby na odpady z podłączonym przewodem próżniowym.
- Włącz linię podciśnieniową, aby przepłukać DSC 200 ml działającego buforu.
- Załadować kapilarnę referencyjną DSC buforem roboczym. Przymocuj około 3-5 cm odcinki rurki silikonowej do referencyjnych kołnierzy kapilary.
- Włóż końcówkę pipety o pojemności 1 ml do silikonowej rurki tylnego kołnierza. Pobrać 0,8 ml buforu roboczego za pomocą pipety i włożyć końcówkę pipety z buforem do silikonowej rurki przedniego kołnierza odniesienia.
- Delikatnie dociśnij tłok pipety w dół, aby przepuścić bufor roboczy przez przednią silikonową rurkę do kapilary referencyjnej i w górę do końcówki pipety dołączonej do tylnego kołnierza. Docisnąć tłok pipety, aż poziom bufora roboczego znajdzie się tuż nad przednią rurką silikonową, a następnie zwolnić tłok pipety, aż poziom buforu roboczego znajdzie się tuż nad tylną rurką silikonową.
- Powtórz przepuszczanie buforu roboczego tam iz powrotem, aby oczyścić objętość z pęcherzyków w kapilarze odniesienia.
UWAGA: Zwykle 10 przejść roztworu tam iz powrotem wystarcza, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.
- Powtórz przepuszczanie buforu roboczego tam iz powrotem, aby oczyścić objętość z pęcherzyków w kapilarze odniesienia.
- Zakryj tylną końcówkę pipety kciukiem i delikatnie pociągnij do góry tylną końcówkę pipety i przednią pipetę, aby wyjąć je z kołnierzy odniesienia z dołączoną silikonową rurką.
- Załadować kapilar próbki buforem roboczym, jak w krokach 2.6 - 2.9. Umieść czarną plastikową nasadkę na tylnym odnośniku i sample kołnierze, pozostawiając przednie kołnierze odkryte.
- Zamocuj uchwyt dociskowy.
- Otwórz oprogramowanie DSC (patrz Tabela materiałów) i zwiększ ciśnienie w urządzeniu, klikając czerwoną strzałkę w górę u góry interfejsu, gdy odczyt mocy się ustabilizuje; moc DSC jest wskazywana w polu w prawym górnym rogu interfejsu wraz z odczytem temperatury i ciśnienia przyrządu.
UWAGA: Monitoruj odczyt mocy, gdy ciśnienie w DSC rośnie. Zmiany mocy o więcej niż ~ 10 μW wskazują na tworzenie się pęcherzyków w naczyniach włosowatych, co może powodować artefakty w danych. Przed kontynuowaniem roztwory należy usunąć i dalej odgazować. - Zrównoważ DSC z buforem roboczym, wykonując skanowanie do przodu i do tyłu. W zakładce "Metoda eksperymentalna" po lewej stronie ekranu upewnij się, że wybrana jest opcja "Skanowanie", aby uruchomić DSC w trybie skanowania temperatury.
UWAGA: Parametry eksperymentalne to zakres skanowania temperatury, szybkość skanowania, czas równoważenia niskiej i wysokiej temperatury oraz liczba skanów.- W polu "Parametry temperatury" w zakładce "Metoda eksperymentalna" kliknij przycisk "Ogrzewanie". Wprowadź 1 i 100 °C dla dolnej i górnej temperatury doświadczalnej, 1 °C/min dla szybkości skanowania i 60 s dla okresu równowagi.
- Kliknij przycisk "Dodaj serię" pod polem wprowadzania dla okresu równowagi. Wpisz 2 w polu "Kroki do dodania" w wyskakującym okienku (dla jednego skanowania ogrzewania i jednego chłodzenia) i zaznacz pole "Alternatywne ogrzewanie/chłodzenie". Kliknij "OK"; Dodane skany pojawiają się w dolnej części interfejsu. Sprawdź, czy parametry każdego skanowania są zgodne z oczekiwaniami.
- Rozpocznij eksperyment, klikając zielony przycisk "odtwórz" u góry interfejsu. Przejdź do żądanego folderu i wprowadź nazwę pliku, aby zapisać eksperyment w wyskakującym okienku. Aby sprawdzić postęp eksperymentu, kliknij kartę "Dane" po prawej stronie karty "Metoda eksperymentu".
3. Zbieranie zestawów danych DSC dla ligandów termolabilnych
UWAGA: Minimalna procedura składa się z pięciu eksperymentów: eksperymentów z odniesieniem do bufora z ligandem i bez niego (używane do odejmowania linii bazowej, zobacz Dyskusję), próbnych eksperymentów z wolną biomolekułą, biomolekułą związaną z ligandem oraz biomolekułą związaną z ligandem z dłuższym okresem równowagi w wysokiej temperaturze.
- Uruchom eksperymenty referencyjne w celu odjęcia linii bazowej przykładowych danych. Załaduj DSC z buforem roboczym w obu kapilarnach i zbierz wiele skanów do przodu i do tyłu w odpowiednim zakresie temperatur w temperaturze 1 °C min-1 z górnym (wysokotemperaturowym) czasem równowagi wynoszącym 120 s.
- Usuń poprzednie skany równoważenia bufora z dolnej części interfejsu, podświetlając każdy z nich osobno i klikając czerwony X w prawym środkowym rogu interfejsu. Dodaj nowe skany, klikając przycisk "Dodaj serię", wpisując 20 w polu "Kroki do dodania" i zaznaczając pole "Alternatywne ogrzewanie/chłodzenie". Kliknij przycisk OK i uruchom eksperyment, klikając zielony przycisk odtwarzania, jak powyżej.
- Powtórzyć kroki 3.1 - 3.1.1 z buforem roboczym zawierającym pożądane stężenie liganda w obu naczyniach włosowatych, aby uzyskać doświadczenia referencyjne dla liganda (zebrać dwa oddzielne doświadczenia, używając odpowiednio czasów równowagi wysokiej temperatury 120 s i 600 s, które zostaną wykorzystane do uzyskania stałej szybkości dla termolabilnej konwersji liganda).
UWAGA: Zastosowana tutaj szybkość skanowania zapewnia, że biomolekuła w kolejnych eksperymentach jest w równowadze termicznej w skanowaniu do przodu i do tyłu (patrz Dyskusja). Szybkość skanowania < 0,1 - 0,2 °C min-1 prowadzi do hałaśliwych termogramów i nie ma zastosowania w eksperymentach DSC. Temperatury powinny wahać się od znacznie poniżej temperatury topnienia wolnej biomolekuły do znacznie powyżej temperatury topnienia biomolekuły nasyconej ligandem (~ 20 - 80 °C dla MN4). Sprawdź odtwarzalność skanów (na przykład wystarczy 10 skanów do przodu i 10 skanów wstecznych, co daje łącznie 20). - W przypadku stosowania wielu ligandów (takich jak kokaina i chinina), należy przepłukać DSC 200 ml buforu roboczego (powtórzyć od kroku 2.5) między seriami, aby usunąć ligand z naczyń włosowatych i zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
UWAGA: Pomocne jest przeprowadzenie powtórzonego eksperymentu na wolnej biomolekułach po przebiegu związanym z ligandem w celu sprawdzenia, czy poprzedni ligand silnie adsorbuje się na ściankach naczyń włosowatych i nie jest odpowiednio usuwany przez przepłukiwanie buforu. Jeśli termogramy dla wolnej biomolekuły wydają się być przesunięte do większej wielkości i wyższej temperatury denaturacji po eksperymencie związanym z ligandem, jest prawdopodobne, że poprzedni ligand jest nadal obecny w kalorymetrze po przepłukaniu. Usunąć zaadsorbowany ligand przez inkubację naczyń włosowatych z 20% Contrad-70 przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C z plastikowymi nasadkami i zdjętym uchwytem dociskowym. W oprogramowaniu DSC zmień tryb eksperymentalny na "Izotermalny" w zakładce Metoda eksperymentalna. Wybierz 3 600 s jako czas trwania i 60 °C jako temperaturę izotermiczną, z zerem wprowadzonym jako czas równowagi. Kliknij "Dodaj do metody eksperymentalnej". Eksperyment izotermiczny pojawia się w dolnej części ekranu. Po zakończeniu przepłucz przyrząd 2 litrami wody dejonizowanej i powtórz od kroku 2.5.
- Uruchom eksperymenty z próbkami przy użyciu tej samej procedury ładowania DSC i parametrów eksperymentalnych, co skany referencyjne. W przypadku wolnego zestawu danych biomolekuł należy upewnić się, że kapilara referencyjna zawiera bufor roboczy, podczas gdy kapilara próbki zawiera wolną biomolekułę w pożądanym stężeniu w buforze roboczym.
- W przypadku doświadczeń związanych z ligandem należy upewnić się, że ligand znajduje się w buforze roboczym w kapilarze odniesienia, a biomolekuła i ligand znajdują się w buforze roboczym w kapilarze próbki. Przepłukać system między dodatkami różnych ligandów, jak w kroku 2.5.
- Przeprowadzić jeden dodatkowy eksperyment z biomolekułą związaną z ligandem termolabilnym, w którym okres równowagi w wysokiej temperaturze zwiększa się do 600 s, a wszystkie inne parametry eksperymentalne są takie same jak w kroku 3.2.1.
UWAGA: Czas trwania okresu równowagi w wysokiej temperaturze dla drugiego eksperymentu związanego z ligandem jest po prostu wybierany tak, aby zapewnić, że ligand zostanie szybciej wyczerpany niż w eksperymencie z krótkim czasem równowagi. Jeśli piki związane z ligandem z pierwszego doświadczenia rozpadają się powoli w funkcji liczby skanowania (np. różnice w kolejnych maksimach pików wynoszą ≤ 0,5 °C), należy oszacować 10- do 20-krotny wzrost okresu równowagi wysokiej temperatury, aby odpowiednio zubożyć ligand podczas drugiego eksperymentu. Dokładne obliczenie stałej szybkości konwersji liganda wymaga, aby drugi eksperyment miał szybsze zubożenie liganda w stosunku do pierwszego. Stężenia ligandów uzyskane z globalnej analizy dwóch eksperymentów będą podobne, a zatem bezużyteczne, jeśli zubożenie ligandów nie zostanie wystarczająco przyspieszone w drugim doświadczeniu.
4. Przetwarzanie danych
- Otwórz pliki eksperymentu DSC w oprogramowaniu do analizy danych DSC (patrz Tabela materiałów) i wyeksportuj surowe dane dotyczące mocy jako arkusze kalkulacyjne.
- Zaimportuj arkusze kalkulacyjne zawierające surowe dane dotyczące mocy do oprogramowania w celu dopasowania danych.
- Linia bazowa Odejmij dane próbki, odejmując dane dotyczące mocy bufora z eksperymentów z biomolekułami swobodnymi i związanymi z ligandem.
UWAGA: W eksperymencie z ligandem termolabilnym stężenie początkowego ligandu zmniejsza się z każdym skanem. Dlatego idealnym rozwiązaniem jest odjęcie skanu bufora 1 od skanu próbki 1 i tak dalej. Odkryliśmy, że skany buforowe z kokainą nie zmieniają się znacząco w miarę postępu konwersji liganda, a zatem pojedynczy termolabilny skan bufora liganda może być użyty do odjęcia wszystkich danych związanych z termolabilnym ligandem. - Przelicz odjęte od linii bazowej dane dotyczące mocy próbki na pojemność cieplną.
UWAGA: Konwersja wymaga częściowej objętości właściwej biomolekuły, którą można oszacować14,15,16. Równanie zamiany mocy na pojemność cieplną zostało opisane wcześniej17.
5. Analiza danych
- Globalnie dopasuj zestaw danych o pojemności cieplnej związanej z ligandem o krótkim czasie równowagi z pojedynczym zestawem parametrów linii podstawowej, stężenia liganda, fałdowania i wiązania liganda, jak opisano wcześniej4.
- Powtórz globalne dopasowanie dla zestawu danych długiego czasu równowagi, aby obliczyć stałą szybkości konwersji ligandów termolabilnych, jak opisano wcześniej4.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiono reprezentatywne dane DSC dla liganda termolabilnego w Rycina 1Położenie i wysokość piku dla kompleksu z ligandem termolabilnym stopniowo przesuwają się w stronę piku dla wolnej biomolekuły w miarę wyczerpywania się ligandu termolabilnego z każdym skanem (Rysunek 1a). Profil wolnej denaturacji służy jako punkt odniesienia dla punktu końcowego konwersji ligandu termolabilnego (Rycina 1b)....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Szczegóły analizy dopasowania globalnego użytej na Rysunku 1 i Rysunku 2 opisano wcześniej4. Tutaj przedstawiamy praktyczne aspekty wykonywania i analizowania eksperymentów wiązania DSC z termolabilnymi ligandami. Należy zauważyć, że linia bazowa DSC uzyskana dla termolabilnego liganda samodzielnie jest odejmowana od zestawu danych ligand + biomolekuła, co sku...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
R. W. H. V był wspierany przez program szkoleniowy McGill Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) w zakresie bionanomaszyn. A. K. M. i P. E. J. byli wspierani przez granty NSERC 327028-09 (A. K. M) i 238562 (P. E. J.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chlorek sodu | Chem Impex | #00829 | |
| Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Woda dejoinizowana do biologii molekularnej | Sterylne | Millipore H20MB1001 | |
| 0,2 mikrona | VWR | CA28145-477 | |
| Filtry odśrodkowe 3 kDa | Milipore | UFC900324 | |
| rurki do dializy 0,5-1,0 kDa odcięcie | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Rurki silikonowe | VWR | 89068-474 | |
| Plastikowe zaślepki kołnierzowe DSC | TA Instruments | 6111 | |
| Aptamer DNA MN4 | Zintegrowane technologie DNA | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Kokaina | Sigma Aldrich | C008 | |
| Chinina | Sigma Aldrich | 22620 | |
| Mikrokalorymetr NanoDSC-III | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun oprogramowanie | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Oprogramowanie NanoAnalyze | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
Bibliografia
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Hinz, H. -J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
