Przedstawiamy protokół do szybkiej charakterystyki biomolekularnych oddziaływań fałdowania i wiązania z termolabilnymi ligandami za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar biomolekularnych profili DSC za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to potężna technika ilościowego określania parametrów termodynamicznych rządzących biomolekularnym fałdowaniem i oddziaływaniami wiązania. Informacje te mają kluczowe znaczenie przy projektowaniu nowych związków farmaceutycznych. Jednak wiele ligandów istotnych z farmaceutycznego punktu widzenia jest chemicznie niestabilnych w wysokich temperaturach stosowanych w analizach DSC. W związku z tym pomiar oddziaływań wiążących jest trudny, ponieważ stężenia ligandów i produktów przekształcanych termicznie w komórce kalorymetrycznej stale się zmieniają. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystujący ligandy termolabilne i DSC do szybkiego uzyskiwania informacji termodynamicznych i kinetycznych na temat procesów fałdowania, wiązania i konwersji ligandów. Zastosowaliśmy naszą metodę do aptameru DNA MN4, który wiąże się z termolabilnym ligandem kokainy. Korzystając z nowej globalnej analizy dopasowania, która uwzględnia konwersję termolabilnego liganda, uzyskuje się pełny zestaw parametrów fałdowania i wiązania z pary eksperymentów DSC. Ponadto pokazujemy, że stałą szybkości konwersji ligandów termolabilnych można uzyskać za pomocą tylko jednego dodatkowego zestawu danych DSC. Przedstawiono wytyczne dotyczące identyfikacji i analizy danych z kilku bardziej skomplikowanych scenariuszy, w tym nieodwracalnej agregacji biomolekuły, powolnego fałdowania, powolnego wiązania i szybkiego wyczerpywania się ligandu termolabilnego.
Wprowadzenie
Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to potężna metoda ilościowego określania interakcji wiązania i fałdowania biomolekularnego1,2,3. Do mocnych stron DSC należy jego zdolność do wyjaśniania mechanizmów wiązania i fałdowania oraz do uzyskiwania odpowiednich parametrów termodynamicznych2,3. Co więcej, DSC może być wykonywany w roztworze w warunkach zbliżonych do fizjologicznych i nie wymaga znakowania biomolekuły lub ligandu, np. fluoroforami, znacznikami spinowymi lub izotopami jądrowymi4....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbki
- Oczyść pożądaną biomolekułę13.
UWAGA: W protokole tym wykorzystuje się zakupiony aptamer DNA wiążący kokainę MN4 po trzykrotnej wymianie na 2 M NaCl, a następnie trzech rundach dejonizowanej wody przy użyciu filtra odśrodkowego z membraną odcinającą masę cząsteczkową 3 kDa. - Zsyntetyzuj i oczyść lub kup żądany ligand termolabilny 13.
UWAGA: MN4 wiąże termolabilny ligand kokainę. MN4 wiąże również chininę, która jest stosowana jako ujemna kontrola termolabilności ligandów w tych temperaturach eksperymentalnych. - Przygotować do dializy oczyszczonej biomole....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiono reprezentatywne dane DSC dla liganda termolabilnego w Rycina 1Położenie i wysokość piku dla kompleksu z ligandem termolabilnym stopniowo przesuwają się w stronę piku dla wolnej biomolekuły w miarę wyczerpywania się ligandu termolabilnego z każdym skanem (Rysunek 1a). Profil wolnej denaturacji służy jako punkt odniesienia dla punktu końcowego konwersji ligandu termolabilnego (Rycina 1b)........
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Szczegóły analizy dopasowania globalnego użytej na Rysunku 1 i Rysunku 2 opisano wcześniej4. Tutaj przedstawiamy praktyczne aspekty wykonywania i analizowania eksperymentów wiązania DSC z termolabilnymi ligandami. Należy zauważyć, że linia bazowa DSC uzyskana dla termolabilnego liganda samodzielnie jest odejmowana od zestawu danych ligand + biomolekuła, co sku.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
R. W. H. V był wspierany przez program szkoleniowy McGill Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) w zakresie bionanomaszyn. A. K. M. i P. E. J. byli wspierani przez granty NSERC 327028-09 (A. K. M) i 238562 (P. E. J.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chlorek sodu | Chem Impex | #00829 | |
| Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Woda dejoinizowana do biologii molekularnej | Sterylne | Millipore H20MB1001 | |
| 0,2 mikrona | VWR | CA28145-477 | |
| Filtry odśrodkowe 3 kDa | Milipore | UFC900324 | |
| rurki do dializy 0,5-1,0 kDa odcięcie | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Rurki silikonowe | VWR | 89068-474 | |
| Plastikowe zaślepki kołnierzowe DSC | TA Instruments | 6111 | |
| Aptamer DNA MN4 | Zintegrowane technologie DNA | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Kokaina | Sigma Aldrich | C008 | |
| Chinina | Sigma Aldrich | 22620 | |
| Mikrokalorymetr NanoDSC-III | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun oprogramowanie | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Oprogramowanie NanoAnalyze | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
Bibliografia
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
