Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55989

⸱

28 lutego 2019

 ,  ,  ,  , 
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Streszczenie

Określenie procesu fałdowania białek od ich sekwencji aminokwasów do ich natywnej struktury 3D jest ważnym problemem w biologii. Mikroskopia sił atomowych (AFM) może rozwiązać ten problem, umożliwiając rozciąganie i relaksację pojedynczych cząsteczek białka, co daje bezpośrednie dowody na specyficzne cechy rozwijania i ponownego fałdowania. Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek oparta na AFM (AFM-SFS) zapewnia środki do konsekwentnego pomiaru wysokoenergetycznych konformacji białek, które nie są możliwe w tradycyjnych pomiarach masowych (biochemicznych). Chociaż opublikowano wiele artykułów przedstawiających zasady działania AFM-SMFS, nie jest łatwo przeprowadzić eksperymenty SMFS ze względu na brak wyczerpująco kompletnego protokołu. W tym badaniu pokrótce ilustrujemy zasady AFM i obszernie szczegółowo opisujemy protokoły, procedury i analizę danych jako wskazówkę do osiągnięcia dobrych wyników z eksperymentów SMFS. Pokazujemy reprezentatywne wyniki SMFS pomiarów mechanicznego rozwijania pojedynczego białka i przedstawiamy strategie rozwiązywania niektórych często spotykanych problemów.

Wprowadzenie

Postępy w spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek (SMFS) przez AFM umożliwiły mechaniczną manipulację i precyzyjną charakterystykę pojedynczych cząsteczek białka. Ta charakterystyka dostarczyła nowych informacji na temat mechaniki białek1,2, Składanie białek3, interakcje białko-ligand4, interakcje białko-białko5, oraz materiały inżynieryjne oparte na białkach6,7,8. SMFS jest szczególnie przydatny do badania rozwijania białek, ponieważ rozciąganie za pomocą AFM pozwala wiązaniom chemicznym i fizycznym w cząsteczce białka stopniowo rozciągać się zgodnie z ich sztywnością, co powoduje stale rosnącą długość konturu. To nadmierne rozciągnięcie cząsteczki białka może spowodować nagłe przejście w krzywej rozciągnięcia siły, co skutkuje zerwaniem (lub szczytem siły). Szczyt siły daje bezpośrednią informację o sile rozwijania i zmianie strukturalnej białka podczas mechanicznego procesu rozwijania. W jednym z pierwszych badań z użyciem AFM zmierzono titin1 i odkryto nowe aspekty rozwijania i ponownego fałdowania białek w warunkach fizjologicznych bez użycia nienaturalnych środków denaturujących, takich jak skoncentrowane chemikalia lub ekstremalne temperatury.

Eksperymenty SMFS są przeprowadzane na różnych instrumentach, choć tutaj bierzemy pod uwagę tylko AFM. AFM składa się z czterech głównych elementów: sondy, detektora, uchwytu próbki i skanera piezoelektrycznego. Sonda jest ostrą końcówką na swobodnie kołyszącym się końcu wspornika. Po kalibracji wygięcie wspornika podczas rozciągania przyłączonej cząsteczki jest mierzone za pomocą wiązki laserowej, która odbija się od tylnej części wspornika, aby precyzyjnie określić siły za pomocą prawa Hooke'a. Odbita wiązka laserowa rzutuje na kwadrantowy detektor fotodiody, który wytwarza napięcie proporcjonalne do przemieszczenia wiązki laserowej od środka diody. Substrat z próbką białka w płynie jest zamontowany na stoliku piezoelektrycznym 3D, który może być kontrolowany z precyzją subnanometrową. Komputer odczytuje napięcie z detektorów fotodiod i steruje stolikiem 3D poprzez sterowane komputerowo zasilanie napięciem. Te stopnie siłowników piezoelektrycznych są zwykle wyposażone w pojemnościowe lub tensometryczne czujniki położenia do precyzyjnego pomiaru przemieszczenia piezoelektrycznego i korygowania histerezy za pomocą systemu sterowania sprzężeniem zwrotnym. Sygnał wyjściowy czujnika z regulatora piezoelektrycznego jest przekształcany na odległość za pomocą stałej napięcia piezoelektrycznego, który jest fabrycznie skalibrowany. Przykładowa krzywa siła-wydłużenie z eksperymentu ciągnięcia jest pokazana na rysunku 2.

Istnieją dwa rodzaje eksperymentów AFM-SMFS: pomiary stałej prędkości i stałej siły ciągnącej. Pomiary SMFS o stałej sile opisano w Oberhauser i wsp.9, podczas gdy tutaj skupiamy się na pomiarach stałej prędkości. Typowy eksperyment ciągnięcia AFM ze stałą prędkością jest wykonywany przez dostarczenie napięcia do piezoelektrycznego w celu delikatnego przesunięcia podłoża względem końcówki wspornika. W typowym eksperymencie końcówka początkowo naciska na powierzchnię. Pomiar ciągnięcia rozpoczyna się od odsunięcia podłoża od końcówki w celu pozbawienia kontaktu. Jeśli białko początkowo wejdzie w kontakt z końcówką, zostanie ono pociągnięte i zostanie zmierzony ślad siły w stosunku do przemieszczenia. Substrat jest następnie ponownie doprowadzany do kontaktu z końcówką i mierzony jest relaksujący ślad, w którym można określić fałdowanie białka na podstawie przemieszczenia siły.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie białka

  1. Klonowanie DNA.
    1. Zsyntetyzować interesującą sekwencję DNA, na przykład sekwencję DNA NI10C10, lub wyizolować ją via PCR z organizmu gospodarza, stosując standardowe techniki biologii molekularnej11. Podczas syntezy lub poprzez wprowadzenie miejsc w końcu 5’ starterów PCR, otoczyć gen docelowy miejscami restrykcyjnymi odpowiadającymi modułowi w plazmidzie pEMI91 (Addgene #74888)12.
    2. Przeprowadzić oddzielnie trawienie plazmidu pEMI9112 oraz interesującej sekwencji DNA za pomocą pary miejsc restrykcyjnych w taki sposób, aby sekwencja docelowa została otoczona tandemowymi powtórzeniami I91 (patrz Rysunek 1). Postępować zgodnie ze standardowym protokołem dla danych miejsc restrykcyjnych.
    3. Oczyścić produkt trawienia za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie połączyć produkty za pomocą ligazy T4 DNA zgodnie ze standardowym protokołem. Po ligacji przeprowadzić transformację plazmidu do komórek E. coli w celu jego namnożenia i oczyścić plazmid zgodnie ze standardowymi protokołami. Przeprowadzić sekwencjonowanie z użyciem starterów T7 lub wewnętrznych starterów pEMI91, aby zweryfikować poprawność transformacji sekwencji.
  2. Transformacja.
    1. Wyjąć komórki do ekspresji białek, np. komórki C41 (DE3) pLysS, z zamrażarki -80 °C i całkowicie rozmrozić na lodzie.
    2. Dodać 1 µL plazmidowego DNA do komórek i krótko wymieszać; nie zaleca się pipetowania w górę i w dół, ponieważ wprowadza to pęcherzyki powietrza i ogrzewa komórki.
    3. Inkubować probówkę z kulturą zawierającą komórki i plazmid na lodzie przez 30 min.
    4. Przeprowadzić szok termiczny komórek w łaźni wodnej w temperaturze 42 °C przez 45 s.
    5. Przenieść probówkę z powrotem na lód na 2 min.
    6. Dodać do komórek 950 µL bulionu LB i inkubować w wytrząsarce przy 250 rpm przez 1 h w temperaturze 37 °C.
    7. Wyłożyć około 200 µL transformatu na płytki LB zawierające 100 µg/mL ampicyliny. W przypadku użycia innego plazmidu niż pEMI91, należy zastosować odpowiedni antybiotyk dla tego plazmidu. Inkubować płytkę przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Następnego dnia wyjąć płytkę z inkubatora, owinąć parafilmem i przechowywać w lodówce do 1 miesiąca.
  3. Ekspresja białka.
    1. Zaszczepić 15 mL bulionu LB z 100 µg/mL ampicyliny w probówce 50 mL i inkubować w 37 °C przez noc, dotykając sterylnym końcem pipety pojedynczej kolonii bakteryjnej na płytce i mieszając go w bulionie LB.
    2. Przenieść 15 mL kultury do 1 L bulionu LB z 100 µg/mL ampicyliny i inkubować w wytrząsarce przez 4-12 h w temperaturze 37 °C (do uzyskania OD600 > 0.8).
    3. Pobrać 10 mL kultury do przygotowania plazmidu.
    4. Dodać 0.2-1 mM izopropyl-β-D-tiogalakopiranozydu (IPTG) i obniżyć temperaturę do temperatury pokojowej w celu ekspresji nocnej.
    5. Zebrać komórki następnego dnia, rozdzielając je do czterech probówek i wirując przy 4,000 × g przez 40 min, a następnie zamrozić osad w -80 °C na kilka godzin.
    6. Wyekstrahowane z komórek plazmidy przekazać do sekwencjonowania z użyciem starterów odpowiadających wstawionej kasecie białka12 i zweryfikować wierność wstawionego DNA.
  4. Oczyszczanie białka.
    1. Rozmrozić jedną probówkę zamrożonych komórek przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    2. Zawiesić rozmrożone komórki w buforze do lizy (38 mL wody, 2 mL glicerolu, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 10 µg/mL DNazy, 1 mM PMSF, 1 mM TCEP, 500 µg/mL lizozymu) i inkubować w wytrząsarce na lodzie przez 1 h.
    3. Zamrozić zlizowane komórki w -80 °C na kilka godzin, a następnie ponownie rozmrozić w temperaturze pokojowej.
    4. Odwirować lizat przy 13,100 × g przez 30 min w 4 °C.
    5. Przepuścić nadsącz przez kolumnę grawitacyjną odpowiednią dla konkretnego znacznika (np. Strep-tag lub His-tag).
    6. Przeprowadzić wymianę buforu za pomocą filtra wirowego, stosując odpowiedni bufor dla Strep-tag lub His-tag, i przechowywać w 4 °C do czasu użycia.

2. Przygotowanie szkiełek do przygotowania próbek

  1. Przygotowanie szkiełek przedmiotowych przy użyciu roztworu Piranha.
    1. Umieść 10-30 okrągłych szkiełek nakrywkowych (promień 7,5 mm) w szklance o pojemności 40 mL.
      Uwaga: Ten oraz kolejne kroki należy przeprowadzać w dygestorium. Podczas tego etapu należy przestrzegać standardowych procedur postępowania z niebezpiecznymi chemikaliami.
    2. Dodaj 30 mL stężonego (18,4 M) kwasu siarkowego.
    3. Dodaj 10 mL 30% nadtlenku wodoru.
    4. Podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 10-30 min.
    5. Ostrożnie zlej roztwór Piranha do oddzielnego pojemnika na odpady (do ponownego użycia lub utylizacji).
    6. Przepłucz szkiełka wodą dejonizowaną, aby usunąć roztwór Piranha.
    7. Zanurz szkiełka w 40 mL acetonu.
    8. Zlej aceton do pojemnika na odpady i ponownie zanurz szkiełka w 40 mL etanolu.
    9. Za pomocą czystej pęsety ostrożnie wyjmij po jednym szkiełku i osusz argonem lub oczyszczonym powietrzem.
    10. Umieść czyste i wysuszone szkiełka w próżni do czasu naparowania złota lub w argonie do długoterminowego przechowywania.
  2. Przygotowanie szkiełek powlekanych złotem (opcjonalnie).
    Uwaga: Ten krok wymaga użycia naparowarki próżniowej (wiązka elektronów), która jest dostępna w wielu laboratoriach typu clean room na dużych uniwersytetach.
    1. Przecnij pięć szkiełek mikroskopowych (prostokątnych, 25 mm x 75 mm) na pół za pomocą przecinaka do szkła.
    2. Naklej dwustronną taśmę klejącą na środku każdego z 10 połowic szkiełek mikroskopowych.
    3. Odetnij fragment karteczki samoprzylepnej i naklej go na taśmę dwustronną tak, aby lepka strona karteczki była skierowana do góry. Karteczka samoprzylepna ma zazwyczaj słabszą przyczepność, ale wciąż mocno trzyma się szkiełka, co zapobiega ich późniejszemu pękaniu. W ten sposób połowice szkiełek mikroskopowych mogą służyć jako uchwyty na szkiełka przedmiotowe.
    4. Ostrożnie dociśnij cztery czyste szkiełka przedmiotowe (z sekcji 2.1.10) do każdego z narożników lepkiej strony uchwytu.
    5. Przenieś szkiełka do naparowarki z wiązką elektronów. Zgodnie ze specyfikacją urządzenia napać na powierzchnię 70 nm chromu i 300 nm złota.
    6. Przechowuj szkiełka powlekane złotem w argonie.

3. Przygotowanie próbek

  1. Przygotowanie preparatu.
    1. Wybierz czysty żelazny dysk (średnica 15 mm) i przytwierdź do niego pasek klejący.
    2. Odklej warstwę ochronną paska klejącego.
    3. Wybierz kawałek czystego szkła (z sekcji 2.1.10) lub złota (z sekcji 2.2.7) i mocno dociśnij go do lepkiej strony żelaznego dysku; będzie to szkiełko z próbką.
  2. Osadzanie białka na preparacie.
    1. Przeprowadź dializę polibiałka do buforu eksperymentalnego (25 mM Tris-HCl, pH 7.6 z 150 mM NaCl), używając kolumny do wymiany buforu, np. wirówki filtracyjnej o pojemności 0.5-mL. Wirowanie białka w kolumnie powinno trwać 10 min przy 13,000 rpm, a następnie należy odwrócić kolumnę i eluować białko do nowego buforu, wirując przez 2 min przy 1,000 rpm.
    2. Wyznacz przybliżone stężenie białka, mierząc absorbancję przy 280 nm za pomocą spektrofotometru.
    3. Rozcieńcz białko do stężenia 10-100 µg/mL w końcowej objętości 100 µL.
    4. Nanieś 60 µL roztworu białka na środek preparatu. Na tym etapie należy uważać, aby żadna ciecz nie przedostała się w szczelinę między szkłem a żelaznym dyskiem, ponieważ może to spowodować pęcznienie kleju podczas eksperymentu i niekontrolowane ruchy próbki.
      Uwaga: Podłoża złote są hydrofobowe, przez co utworzy się kropla w kształcie sfery, natomiast podłoża szklane są bardziej hydrofilowe i roztwór białka może się rozprzestrzenić.
    5. Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej na 10-60 min. W tym czasie przejdź do następnego kroku, aby rozpocząć konfigurację mikroskopu sił atomowych.

4. Konfiguracja mikroskopu sił atomowych (AFM)

Uwaga: Poniższy opis stanowi ogólne wyjaśnienie konfiguracji AFM, a niektóre szczegóły mogą się różnić w zależności od zastosowanego instrumentarium. Wykorzystane instrumentarium jest częściowo zbudowane własnym sumptem i szczegółowo opisane w publikacji Scholl13.

  1. Zamocuj dźwignię (cantilever) w celi AFM.
    1. Wybierz dźwignię o właściwościach odpowiednich do zastosowania. Do niskich sił rozfałdowania (~10-50 pN) należy używać dźwigni o stałych sprężystości 4-10 pN/nm, natomiast do wysokich sił rozfałdowania należy używać dźwigni o stałych sprężystości 15-100 pN/nm.
    2. Ostrożnie chwyć dźwignię za koniec i umieść ją w celi trzymającej sondę.
    3. Przed kontynuacją upewnij się, że cela trzymająca mocno stabilizuje dźwignię w miejscu.
    4. Umieść celę trzymającą w głowicy AFM w celu wyrównania lasera.
  2. Wyrównaj laser w głowicy AFM.
    1. Umieść głowicę na mikroskopie odwróconym i podłącz pakiet baterii do głowicy AFM, aby zasilić wbudowany w nią laser.
    2. Zamocuj kamerę do detektora mikroskopu, aby światło lasera mogło być wizualizowane na telewizorze lub monitorze.
    3. Ustaw laser tak, aby padał on na końcówkę dźwigni.
  3. Zamocuj głowicę z próbką.
    1. Wprowadź 10 µL buforu do każdego z portów celi trzymającej sondę.
    2. Pobierz szkiełko z próbką, która była inkubowana, i odlej 40 µL płynu z inkubowanego roztworu. Dodaj na szkiełko 40 µL buforu. Umieść szkiełko z próbką na magnesie nad piezoelektrykiem.
    3. Upewnij się, że stolik AFM znajduje się w pozycji podniesionej. Następnie umieść głowicę AFM na stoliku tak, aby dźwignia AFM znajdowała się nad kroplą próbki.
  4. Wycentruj odbitą wiązkę lasera na fotodiodzie.
    1. Wytnij mały kawałek papieru i umieść go przed fotodiodą AFM.
    2. Przestaw laser AFM za pomocą pokręteł tak, aby plamka lasera na papierze stała się skupiona i jasna.
    3. Wyreguluj lustro głowicy AFM tak, aby laser uderzał w fotodiodę w sposób maksymalizujący całkowity sygnał we wszystkich kwadrantach (A+B+C+D) i powodował, aby sygnał różnicowy między dwoma górnymi a dwoma dolnymi kwadrantami wynosił zero (A+B-C-D).

5. Kalibracja mikroskopu sił atomowych

  1. Pomiar widma mocy.
    1. W filtrze podłączonym do AFM ustaw filtr sygnału głowicy AFM na pełne pasmo.
    2. W samym AFM upewnij się, że piezo jest wyłączone, ponieważ powodowałoby to wprowadzenie szumów do sygnału.
    3. Użyj oprogramowania AFM14, aby zmierzyć średnią z 512 obliczeń widma mocy z 1 024 punktów danych na każde obliczenie.
    4. Użyj oprogramowania AFM15, aby zintegrować gęstość widmową mocy w obszarze pierwszego piku, który odpowiada głównemu modowi drgań wspornika.
  2. Obliczenie czułości fotodiody.
    1. W samym AFM włącz kontroler piezo i zmień ustawienie filtra na 500 Hz (filtr dolnoprzepustowy).
    2. Monitoruj sygnał różnicowy w oprogramowaniu AFM, który powinien fluktuować wokół zera. Szybko przesuń głowicę AFM w dół o kilkaset mikrometrów za pomocą mikropozycjonerów. Powtarzaj przesuwanie głowicy w dół i monitoruj sygnał różnicowy w poszukiwaniu spójnych skoków. Powierzchnia znajduje się bardzo blisko, gdy wysokość skoków sygnału zaczyna rosnąć.
    3. Gdy tylko sygnał ugięcia nasyci się w momencie kontaktu z powierzchnią, lekko odsuń głowicę od powierzchni.
    4. W oprogramowaniu AFM użyj elementów sterujących wejściem, aby regulować napięcie piezo w celu zlokalizowania powierzchni, przesuwając ją w górę lub w dół o 100-5 000 nm. Jeśli powierzchnia nadal pozostaje nieosiągalna, kontynuuj ręczne zmniejszanie odległości między głowicą a próbką.
    5. W oprogramowaniu AFM przeprowadź eksperyment rozciągania (pulling experiment) z rozmiarem skanu około 500 nm, tak aby końcówka stykała się z powierzchnią przez około 100 nm przesunięcia piezo.
    6. Zmierz nachylenie liniowego obszaru krzywej sygnału fotodiody w funkcji przesunięcia piezo, w którym końcówka AFM pozostaje w kontakcie z powierzchnią podłoża.
    7. Oblicz stałą sprężystości i czułość, korzystając z nachylenia oraz zintegrowanego widma mocy (Równanie równowagi statycznej na schemacie do badań naukowych obliczeń kC.).

6. Pozyskiwanie danych

  1. Przygotowanie.
    1. W filtrach podłączonych do AFM ustaw parametry tak, aby częstotliwość próbkowania była co najmniej dwukrotnie większa od szerokości pasma (kryterium Nyquista), co wyznaczy górną granicę częstotliwości odcięcia filtra dolnoprzepustowego.
  2. Pomiary.
    1. Ustaw rozmiar skanowania na całkowitą teoretyczną długość rozwijanego poliproteiny (liczba aminokwasów × 0.365) powiększoną o około 40%, aby uwzględnić docisk do podłoża. Na przykład w przypadku rozciągania konstruktu 9x I91 teoretyczna długość rozwinięta wyniesie około 300 nm, zatem rozmiar skanowania powinien wynosić około 420 nm.
    2. W oprogramowaniu AFM ustaw pozycję wspornika tak, aby znajdował się w odległości 80% rozmiaru skanowania od powierzchni (w tym przypadku około 340 nm od powierzchni).
    3. W oprogramowaniu AFM ustaw początkową prędkość skanowania na 300 nm/s.
      Uwaga: Prędkość tę można zmodyfikować, zmniejszając ją lub zwiększając, w zależności od zastosowania.
    4. Przeprowadź eksperyment rozciągania i zmierz wynikową pozycję piezoelektryka oraz sygnał fotodiody. Do zainicjowania skanowania użyj oprogramowania AFM.
    5. W oprogramowaniu AFM kontynuuj pomiary do momentu uzyskania około 10 000 zapisów.
      Uwaga: Zazwyczaj wskaźnik wychwytu cząsteczki kontroli pozytywnej wynosi około 0.5%16, dlatego konieczne jest wykonanie 10 000 pomiarów, aby zebrać wystarczającą ilość danych do analizy.

7. Analiza danych

  1. Normalizacja danych.
    1. Dla każdego pomiaru oblicz wydłużenie, korzystając ze wzoru extension = displacement - F/kc (kc pochodzi z punktu 5.2.7).
    2. Wyznacz poziom siły bazowej, obliczając średnią z początku lub końca krzywej siła-wydłużenie, w miejscu, gdzie nie występują piki siły i gdzie wspornik nie naciska na powierzchnię. Następnie całą krzywą siła-wydłużenie można przesunąć o tę wartość średnią.
    3. Przesuń dane tak, aby wydłużenie było wyrównane wzdłuż osi y równej zero. Wynika to z faktu, że na początku pomiaru cząsteczka powinna mieć wydłużenie równe zero.
  2. Identyfikacja białka docelowego.
    1. Zidentyfikuj pomiary zawierające co najmniej cztery zdarzenia I91, które stanowią „odcisk palca” pojedynczej cząsteczki. Pomiary te reprezentują rzeczywiste „pomiary pojedynczych cząsteczek”.
    2. Zapisz zdarzenia oznaczone jako zdarzenia pojedynczych cząsteczek do dalszej analizy.
  3. Wyznaczenie przyrostu długości konturowej.
    1. Dla każdego pomiaru dopasuj model łańcucha typu WLC (worm-like chain) do zdarzenia rozfałdowania, Wzór mechaniki statystycznej, siła-wydłużenie, równanie fizyki polimerów, reprezentacja matematyczna gdzie Równanie energii termicznej \(k_bT=4,1\ pN\ nm\); wzór w badaniu z zakresu biofizyki molekularnej w temperaturze pokojowej, p to długość persistencji (zazwyczaj od 0,4 do 1 nm), x to wydłużenie w nanometrach, a L to długość konturowa w nanometrach.
      Uwaga: Postać modelu łańcucha WLC jest rozwiązaniem interpolowanym; dokładniejsze rozwiązanie numeryczne znajduje się w pracy Bouchiat et al.17. Alternatywne modele dopasowania można znaleźć w pracy Su et al.18.
    2. Oblicz różnicę między wartościami L wyznaczonymi dla dwóch kolejnych zdarzeń rozfałdowania; różnicę tę określa się mianem „przyrostu długości konturowej”.
  4. Wyznaczenie siły zerwania.
    1. Oblicz siłę zerwania dla danego zdarzenia rozfałdowania, przyjmując najwyższy punkt przed największym spadkiem na krzywej rozfałdowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki z tego protokołu przedstawiono na Rysunku 2. Oba panele pokazują reprezentatywne krzywe siła-wydłużenie dla białek. Górny panel przedstawia wyniki dla polibiałka I91, natomiast dolny pokazuje białko I91 flankujące białko docelowe, cząsteczkę NI10C. Rejestracje te wykazują charakterystyczną siłę I91 (200 pN) oraz przyrost długości konturowej (28 nm), co wskazuje na prawidłowe ustawienie i kalibrację AFM. Krzywe siła-wydłużenie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytycznym krokiem w protokole jest użycie poliproteiny, opisanej w kroku 1.1.2, która służy jako pozytywna kontrola do "odcisków palców" zdarzeń pojedynczych cząsteczek. Ogólnie rzecz biorąc, muszą zachodzić zdarzenia rozwijania białek polibiałkowych (dla I91 oznacza to siłę rozwijania około 200 pN i przyrost długości konturu około 28 nm), aby jednoznacznie stwierdzić, że białko będące przedmiotem zainteresowania zostało rozwinięte. Na przykład, gdy białko będące przedmiotem zainteresowania jest otoczone przez trzy dome...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation przyznające MCB-1244297 i MCB-1517245 PEM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Krążki do próbek AFM, średnica 15 mmTed Pella, Inc.16218Służy jako podstawa dla podłoża szklanego
Okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe, średnica 15 mm nr 1 o grubościTed Pella, Inc.26024służy jako szklane podłoże i baza do powlekania złotem
Zakładki samoprzylepneTed Pella, Inc.16079Wklej na krążki z próbkami AFM, aby zapewnić lepką powierzchnię do mocowania szklanych szkiełek nakrywkowych
Zespół głowicy wielomodowej STDBruker Nano Inc.Głowica 1B75CAFM
Szklany uchwyt sondyBruker Nano Inc.MTFML-V2Szklany uchwyt sondy do skanowania w płynie za pomocą MultiMode AFM.   
Sondy Microlever AFM firmyBruker Nano Inc.Wsporniki z azotku krzemu MLCT z końcówkami z azotku krzemu, idealne do trybów obrazowania kontaktowego
Sondy AFM z końcówkami z powłoką AuBruker Nano Inc.Wsporniki OBL-10do ciągnięcia białek o niskiej sile rozwijania
Karta wielofunkcyjnej akwizycji danych (DAQ), 16-bitowa, 1 MS/s (wielokanałowa), 1,25 MS/s (1-kanałowa), 32 wejścia analogoweNational InstrumentsPCI-6259Akwizycja danych dla sygnałów z głowicy AFM i siłowników piezoelektrycznych
LISA Liniowe siłowniki piezoelektrycznePhysik Instrumente LPP-753.11CSiłownik piezoelektryczny do kontroli położenia podłoża i wykonywania pomiarów ciągnięcia
XY Piezo StagePhysik Instrumente LPP-541.2CDSiłownik piezoelektryczny do kontroli położenia podłoża i skanowania na powierzchni podłoża

Bibliografia

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
  3. Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
  4. Rico, F., Chu, C., Moy, V. T. Methods in Molecular Biology. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. 331-353 (2011).
  5. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
  6. Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
  7. Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
  8. Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
  9. Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
  10. Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
  11. Davis, L. Basic methods in molecular biology. , Elsevier. (2012).
  12. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
  13. Scholl, Z. N. The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , Duke University. (2016).
  14. Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
  15. Nanopuller. , https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018).
  16. Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
  17. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
  18. Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
  19. Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
  20. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
  21. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  22. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
  23. Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a(2014).
  24. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  25. Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
  26. He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
  27. Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
  28. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  29. Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
  30. Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Skaningowa mikroskopia si atomowychspektroskopia si pojedynczych cz steczekrozwijanie bia ekstabilno bia ekmodel a cucha przypominaj cego robakaanaliza polibia ekkalibracja wspornikapomiar si yst enie bia kaoprogramowanie AFM
Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.