Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Summary

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Abstract

Określenie procesu fałdowania białek od ich sekwencji aminokwasów do ich natywnej struktury 3D jest ważnym problemem w biologii. Mikroskopia sił atomowych (AFM) może rozwiązać ten problem, umożliwiając rozciąganie i relaksację pojedynczych cząsteczek białka, co daje bezpośrednie dowody na specyficzne cechy rozwijania i ponownego fałdowania. Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek oparta na AFM (AFM-SFS) zapewnia środki do konsekwentnego pomiaru wysokoenergetycznych konformacji białek, które nie są możliwe w tradycyjnych pomiarach masowych (biochemicznych). Chociaż opublikowano wiele artykułów przedstawiających zasady działania AFM-SMFS, nie jest łatwo przeprowadzić eksperymenty SMFS ze względu na brak wyczerpująco kompletnego protokołu. W tym badaniu pokrótce ilustrujemy zasady AFM i obszernie szczegółowo opisujemy protokoły, procedury i analizę danych jako wskazówkę do osiągnięcia dobrych wyników z eksperymentów SMFS. Pokazujemy reprezentatywne wyniki SMFS pomiarów mechanicznego rozwijania pojedynczego białka i przedstawiamy strategie rozwiązywania niektórych często spotykanych problemów.

Introduction

Postępy w spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek (SMFS) przez AFM umożliwiły mechaniczną manipulację i precyzyjną charakterystykę pojedynczych cząsteczek białka. Ta charakterystyka dostarczyła nowych informacji na temat mechaniki białek^1,2, Składanie białek³, interakcje białko-ligand⁴, interakcje białko-białko⁵, oraz materiały inżynieryjne oparte na białkach^6,7,8. SMFS jest szczególnie przydatny do badania rozwijania białek, ponieważ rozciąganie za pomocą AFM pozwala wiązaniom chemicznym i fizycznym w cząsteczce białka stopniowo rozciągać się zgodnie z ich sztywnością, co powoduje stale rosnącą długość konturu. To nadmierne rozciągnięcie cząsteczki białka może spowodować nagłe przejście w krzywej rozciągnięcia siły, co skutkuje zerwaniem (lub szczytem siły). Szczyt siły daje bezpośrednią informację o sile rozwijania i zmianie strukturalnej białka podczas mechanicznego procesu rozwijania. W jednym z pierwszych badań z użyciem AFM zmierzono titin¹ i odkryto nowe aspekty rozwijania i ponownego fałdowania białek w warunkach fizjologicznych bez użycia nienaturalnych środków denaturujących, takich jak skoncentrowane chemikalia lub ekstremalne temperatury.

Eksperymenty SMFS są przeprowadzane na różnych instrumentach, choć tutaj bierzemy pod uwagę tylko AFM. AFM składa się z czterech głównych elementów: sondy, detektora, uchwytu próbki i skanera piezoelektrycznego. Sonda jest ostrą końcówką na swobodnie kołyszącym się końcu wspornika. Po kalibracji wygięcie wspornika podczas rozciągania przyłączonej cząsteczki jest mierzone za pomocą wiązki laserowej, która odbija się od tylnej części wspornika, aby precyzyjnie określić siły za pomocą prawa Hooke'a. Odbita wiązka laserowa rzutuje na kwadrantowy detektor fotodiody, który wytwarza napięcie proporcjonalne do przemieszczenia wiązki laserowej od środka diody. Substrat z próbką białka w płynie jest zamontowany na stoliku piezoelektrycznym 3D, który może być kontrolowany z precyzją subnanometrową. Komputer odczytuje napięcie z detektorów fotodiod i steruje stolikiem 3D poprzez sterowane komputerowo zasilanie napięciem. Te stopnie siłowników piezoelektrycznych są zwykle wyposażone w pojemnościowe lub tensometryczne czujniki położenia do precyzyjnego pomiaru przemieszczenia piezoelektrycznego i korygowania histerezy za pomocą systemu sterowania sprzężeniem zwrotnym. Sygnał wyjściowy czujnika z regulatora piezoelektrycznego jest przekształcany na odległość za pomocą stałej napięcia piezoelektrycznego, który jest fabrycznie skalibrowany. Przykładowa krzywa siła-wydłużenie z eksperymentu ciągnięcia jest pokazana na rysunku 2.

Istnieją dwa rodzaje eksperymentów AFM-SMFS: pomiary stałej prędkości i stałej siły ciągnącej. Pomiary SMFS o stałej sile opisano w Oberhauser i wsp.⁹, podczas gdy tutaj skupiamy się na pomiarach stałej prędkości. Typowy eksperyment ciągnięcia AFM ze stałą prędkością jest wykonywany przez dostarczenie napięcia do piezoelektrycznego w celu delikatnego przesunięcia podłoża względem końcówki wspornika. W typowym eksperymencie końcówka początkowo naciska na powierzchnię. Pomiar ciągnięcia rozpoczyna się od odsunięcia podłoża od końcówki w celu pozbawienia kontaktu. Jeśli białko początkowo wejdzie w kontakt z końcówką, zostanie ono pociągnięte i zostanie zmierzony ślad siły w stosunku do przemieszczenia. Substrat jest następnie ponownie doprowadzany do kontaktu z końcówką i mierzony jest relaksujący ślad, w którym można określić fałdowanie białka na podstawie przemieszczenia siły.

Protocol

1. Przygotowanie białka

1. Klonowanie DNA.
   1. Zsyntetyzuj interesującą sekwencję DNA, na przykład sekwencję DNA NI₁₀C¹⁰, lub wyizoluj za pomocą PCR od organizmu gospodarza przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej¹¹. Flankuj gen będący przedmiotem zainteresowania miejscami restrykcyjnymi podczas syntezy lub umieszczając miejsca na końcu 5' starterów PCR, aby odpowiadały modułowi w plazmidzie pEMI91 (Addgene #74888)¹².
   2. Oddzielnie trawić zarówno plazmid pEMI91¹², jak i interesującą sekwencję DNA z parą miejsc restrykcyjnych, tak aby sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania była otoczona powtórzeniami tandemu I91 (patrz Rysunek 1). Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem dla witryn z ograniczeniami.
   3. Oczyść strawiony produkt za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie podwiązaj produkty za pomocą ligazy DNA T4, postępując zgodnie ze standardowym protokołem. Po ligacji przekształć plazmid w komórki E. coli w celu oczyszczenia plazmidu i oczyść plazmid przy użyciu standardowych protokołów. Sekwencja przy użyciu starterów T7 lub wewnętrznych starterów pEMI91 w celu sprawdzenia, czy sekwencja została pomyślnie przekształcona.
2. przekształcenie.
   1. Usunąć komórki ekspresji białek, takie jak komórki pLysS C41 (DE3), z zamrażarki w temperaturze -80 °C i całkowicie rozmrozić na lodzie.
   2. Dodać 1 μl plazmidowego DNA do komórek i krótko zamieszać; pipetowanie w górę i w dół nie jest wskazane, ponieważ wprowadzi pęcherzyki powietrza i ogrzeje komórki.
   3. Inkubować probówkę hodowlaną zawierającą komórki i plazmid na lodzie przez 30 minut.
   4. Szok termiczny komórek w łaźni wodnej w temperaturze 42 °C przez 45 s.
   5. Umieść probówkę z powrotem w lodzie na 2 minuty.
   6. Umieścić 950 μl bulionu LB w komórkach i wstrząsać z prędkością 250 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   7. Umieścić około 200 μl przemiany na płytkach LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Jeśli używasz plazmidu innego niż pEMI91, użyj odpowiedniego antybiotyku dla tego plazmidu. Umieścić płytkę na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Następnego dnia wyjmij płytkę z inkubatora, owiń parafolią i przechowuj w lodówce do 1 miesiąca.
3. Ekspresja białek.
   1. Zaszczepić 15 ml pożywki bulionowej LB 100 μg/ml ampicyliny w probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C w celu wzrostu przez noc, dotykając sterylną końcówką pipety pojedynczej kolonii bakteryjnej na płytce i pipetując w górę iw dół w LB.
   2. Przenieść 15 ml kultury do 1 l pożywki bulionowej LB ze 100 μg/ml ampicyliny i wstrząsać przez 4-12 godzin w temperaturze 37 °C (do OD₆₀₀ > 0,8).
   3. Zebrać 10 ml kultury do przygotowania plazmidu.
   4. Dodać 0,2-1 mM izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i obniżyć temperaturę do temperatury pokojowej do odciągania przez noc.
   5. Następnego dnia należy zebrać komórki, dzieląc je na cztery probówki i odwirowując w temperaturze 4 000 × g przez 40 minut, a następnie zamrażając granulki w temperaturze -80 °C przez kilka godzin.
   6. Wyślij plazmidy wyekstrahowane z komórek do sekwencjonowania ze starterami odpowiadającymi wstawionej kasecie białka¹² i sprawdź wierność wstawionego DNA.
4. Oczyszczanie białek.
   1. Rozmrażać jedną probówkę zamrożonych komórek przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Zawiesić rozmrożone komórki w buforze do lizy (38 ml wody, 2 ml glicerolu, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 10 μg/ml DNazy, 1 mM PMSF, 1 mM TCEP, 500 μg/ml lizozymu) i wstrząsać na lodzie przez 1 godzinę.
   3. Zamrozić zlizowane komórki w temperaturze -80 °C przez kilka godzin, a następnie ponownie rozmrozić w temperaturze pokojowej.
   4. Wirować lizat w temperaturze 13 100 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Przepuścić supernatant przez kolumnę przepływu grawitacyjnego dla określonego znacznika (np. znacznika Strep-tag lub znacznika His).
   6. Przeprowadzić wymianę buforu za pomocą filtra odśrodkowego, używając odpowiedniego buforu dla Strep-tag lub His-tag i przechowywać w temperaturze 4 °C przed użyciem.

2. Przygotowanie preparatów do przygotowania próbki

1. Przygotuj szkiełka za pomocą roztworu Piranha.
   1. Umieść 10-30 sztuk okrągłych szkiełek nakrywkowych (promień 7,5 mm) w szklanej zlewce o pojemności 40 ml.
      nuta: Wykonaj ten krok i kolejne kroki w okapie. Na tym etapie postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami postępowania z niebezpiecznymi chemikaliami.
   2. Dodać 30 ml stężonego (18,4 M) kwasu siarkowego.
   3. Dodaj 10 ml 30% nadtlenku wodoru.
   4. Podgrzewać mieszaninę przez 10-30 minut do 95 °C.
   5. Ostrożnie przelać roztwór piranii do oddzielnego pojemnika na odpady (do ponownego użycia lub wyrzucenia).
   6. Opłucz szkiełka wodą dejonizowaną, aby usunąć roztwór piranii.
   7. Zawiesić szkiełka w 40 ml acetonu.
   8. Przelać aceton do pojemnika na odpady i ponownie zawiesić szkiełka w 40 ml etanolu.
   9. Użyj czystych kleszczy, aby ostrożnie wyjąć jedno szkiełko na raz i osuszyć argonem lub oczyszczonym powietrzem.
   10. Umieść czyste i wysuszone szkiełka pod próżnią do momentu odparowania złota lub pod argonem w celu długotrwałego przechowywania.
2. Przygotuj pozłacane szkiełka (opcjonalnie).
   nuta: Ten etap wymaga użycia parownika próżniowego (wiązki elektronicznej), który jest dostępny w wielu pomieszczeniach czystych na głównych uniwersytetach.
   1. Przetnij pięć szkiełek mikroskopowych (prostokątny kształt 25 mm x 75 mm) na pół za pomocą noża do szkła.
   2. Nałóż dwustronną taśmę klejącą na środek każdego z 10 szkiełek podstawowych mikroskopu.
   3. Odetnij lepką stronę karteczki samoprzylepnej i nałóż na taśmę dwustronną tak, aby lepka strona notatki była zadrukowana do góry. Karteczka samoprzylepna jest na ogół mniej przyczepna, ale nadal mocno przylega do szkiełek, aby zapobiec przyszłemu pękaniu. Wtedy te półpreparaty mikroskopowe mogą teraz działać jako uchwyt na szkiełka podstawowe.
   4. Ostrożnie docisnąć cztery czyste szkiełka podstawowe (z ppkt 2.1.10) do każdego rogu lepkiej strony uchwytu.
   5. Przenieś szkiełka do parownika z wiązką elektroniową. Postępuj zgodnie ze specyfikacją parownika, aby nałożyć 70 nm chromu i 300 nm złota na powierzchnię.
   6. Przechowuj pozłacane szkiełka pod argonem.

3. Przygotowanie próbki

1. Przygotuj szkiełko.
   1. Wybierz czysty żelazny krążek (o średnicy 15 mm) i przymocuj do niego samoprzylepną zakładkę.
   2. Odczep pokrywę zakładki samoprzylepnej.
   3. Wybierz kawałek czystego szkła (z sekcji 2.1.10) lub złota (z sekcji 2.2.7) i mocno umieść go na lepkiej stronie żelaznego dysku, będzie to szkiełko do próbek.
2. Umieść białko na szkiełku.
   1. Dializować poliproteinę do buforu do eksperymentu (25 mM Tris-HCl, pH 7,6 z 150 mM NaCl) za pomocą kolumny do wymiany buforowej, takiej jak filtr odśrodkowy o pojemności 0,5 ml. Wirować białko w kolumnie przez 10 minut z prędkością 13 000 obr./min, a następnie odwrócić kolumnę i wymyć białko do nowego buforu, wirując z prędkością 1 000 obr./min przez 2 min.
   2. Oznaczyć przybliżone stężenie białka, mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru.
   3. Rozcieńczyć białko do 10-100 μg/ml w końcowej objętości 100 μl.
   4. Nałóż 60 μl roztworu białkowego na środek szkiełka. Na tym etapie należy uważać, aby żadna ciecz nie dostała się pod spód do szczeliny między szkiełkiem a żelaznym szkiełkiem, ponieważ może to spowodować pęcznienie kleju podczas eksperymentu i niekontrolowane ruchy próbki.
      nuta: Szkiełka złote są hydrofobowe i tworzy się kulista kropla, podczas gdy szkiełka są bardziej hydrofilowe, a roztwór białkowy może się rozprzestrzeniać.
   5. Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej na 10-60 minut. W tym czasie przejdź do następnego kroku, aby rozpocząć konfigurację mikroskopu sił atomowych.

4. Konfiguracja mikroskopu sił atomowych (AFM)

Uwaga: Poniżej znajduje się ogólny opis konfiguracji AFM, a niektóre szczegóły mogą się różnić w zależności od konkretnego używanego oprzyrządowania. Użyte oprzyrządowanie jest częściowo zbudowane w domu i szczegółowo opisane w Scholl¹³.

1. Zamontuj wspornik na komorze AFM.
   1. Wybierz wspornik o odpowiednich właściwościach do zastosowania. Dla małych sił rozwijania należy stosować wsporniki o stałych sprężystości 4-10 pN/nm, natomiast dla dużych sił rozwijania należy stosować wsporniki o stałych sprężystości 15-100 pN/nm.
   2. Ostrożnie podnieś wspornik z końca i umieść go w celi przytrzymującej sondę.
   3. Przed kontynuowaniem upewnij się, że komórka mocująca mocno trzyma wspornik na miejscu.
   4. Umieść komórkę przytrzymującą w głowicy AFM w celu wyrównania lasera.
2. Ustaw laser w głowicy AFM.
   1. Umieść głowicę na odwróconym mikroskopie i podłącz akumulator do głowicy AFM w celu zasilania lasera w głowicy.
   2. Podłącz kamerę do detektora mikroskopu, aby światło lasera można było wizualizować na telewizorze lub monitorze.
   3. Ustaw laser tak, aby znajdował się na końcówce wspornika
3. Zamontuj głowicę z próbką.
   1. Przepłukać 10 μl buforu do każdego z portów celi przytrzymującej sondę.
   2. Pobrać szkiełko z próbką, które było w inkubacji, i zdekantować 40 μl płynu z inkubowanego roztworu. Dodać 40 μl buforu na szkiełku. Umieść szkiełko do próbki na magnesie nad piezo.
   3. Upewnij się, że stolik AFM znajduje się w pozycji podniesionej. Następnie umieść głowicę AFM na stoliku tak, aby wspornik AFM znajdował się powyżej kropli próbki.
4. Wyśrodkuj odbitą wiązkę laserową na fotodiodę.
   1. Wytnij mały kawałek papieru i umieść go przed fotodiodą AFM.
   2. Zmień położenie lasera AFM za pomocą pokręteł, aby plamka lasera na papierze stała się skupiona i jasna.
   3. Wyreguluj lusterko czołowe AFM tak, aby laser uderzał w fotodiodę, aby zmaksymalizować całkowity sygnał we wszystkich kwadrantach (A+B+C+D) i powodował, że sygnał różnicowy między dwoma górnymi i dolnymi dwoma kwadrantami wynosił zero (A+B-C-D).

5. Kalibracja mikroskopu sił atomowych

1. Zmierz spektrum mocy.
   1. Na filtrze podłączonym do AFM ustaw ustawienie filtra sygnału głowicy AFM na pełną szerokość pasma.
   2. Na samym AFM upewnij się, że piezo jest wyłączone, ponieważ spowoduje to dodanie szumów do sygnału.
   3. Użyj oprogramowania AFM¹⁴, aby zmierzyć średnią z 512 obliczeń widma mocy z 1 024 punktów danych na obliczenie.
   4. Użyj oprogramowania AFM¹⁵, aby zintegrować gęstość widmową mocy na pierwszym piku, który odpowiada głównemu trybowi drgań wspornika.
2. Obliczać czułość fotodiody.
   1. Na samym AFM włącz kontroler piezoelektryczny i zmień ustawienie filtra na 500 Hz (filtr dolnoprzepustowy).
   2. Monitoruj sygnał różnicowy, który powinien oscylować wokół zera w oprogramowaniu AFM. Szybko przesuń głowicę AFM o kilkaset mikrometrów w dół za pomocą mikropozycjonerów. Powtórz przesuwanie głowy w dół i monitoruj sygnał różnicy, aby uzyskać spójne skoki. Powierzchnia znajduje się bardzo blisko, gdy skoki sygnału zaczynają zwiększać swoją wysokość.
   3. Gdy tylko sygnał ugięcia nasyci się w kontakcie z powierzchnią, lekko odsuń głowicę od powierzchni.
   4. W oprogramowaniu AFM użyj elementów sterujących wejściem, aby wyregulować napięcie piezoelektryczne, aby znaleźć powierzchnię, przesuwając się w górę lub w dół o 100-5,000 nm. Jeśli powierzchnia nadal nie jest dostępna, kontynuuj ręczne zmniejszanie odległości między głową a próbką.
   5. W oprogramowaniu AFM przeprowadź eksperyment ciągnięcia z rozmiarem skanu około 500 nm, tak aby końcówka zetknęła się z około 100 nm ruchu piezoelektrycznego.
   6. Zmierz nachylenie obszaru liniowego sygnału fotodiody w funkcji krzywej przemieszczenia piezoelektrycznego, w której końcówka AFM pozostaje w kontakcie z powierzchnią podłoża.
   7. Oblicz stałą sprężystości i czułość, korzystając z nachylenia i zintegrowanego widma mocy ().

6. Akwizycja danych

1. preparat.
   1. Na filtrach podłączonych do AFM ustaw filtr tak, aby częstotliwość próbkowania była co najmniej dwukrotnie większa od szerokości pasma (kryterium Nyquista), co da górną granicę odcięcia dolnoprzepustowego.
2. Pomiary.
   1. Ustaw rozmiar skanu na całkowity teoretyczny rozmiar rozwijającej się poliproteiny (liczba aminokwasów × 0,365) plus około 40%, aby umożliwić dociśnięcie do podłoża. Na przykład wyciągnięcie konstrukcji 9x I91 będzie miało teoretyczną długość po rozłożeniu około 300 nm, więc rozmiar skanu powinien wynosić około 420 nm.
   2. W oprogramowaniu AFM ustaw wspornik tak, aby znajdował się w odległości 80% rozmiaru skanowania od powierzchni (w tym przypadku około 340 nm od powierzchni).
   3. W oprogramowaniu AFM ustaw początkowo prędkość skanowania na 300 nm/s.
      nuta: Prędkość tę można zmodyfikować tak, aby była mniejsza lub szybsza, w zależności od zastosowania.
   4. Wykonaj eksperyment ciągnący i zmierz wynikowe położenie sygnału piezoelektrycznego i fotodiody. Użyj oprogramowania AFM, aby rozpocząć skanowanie.
   5. W oprogramowaniu AFM kontynuuj wykonywanie pomiarów, aż pojawi się około 10 000 nagrań.
      nuta: Ogólnie rzecz biorąc, szybkość wychwytywania cząsteczki kontrolowanej pozytywnie wynosi około 0,5%¹⁶, więc 10 000 jest niezbędnych, aby móc zebrać wystarczającą ilość danych do analizy.

7. Analiza danych

1. Normalizacja danych.
   1. Dla każdego nagrania oblicz rozszerzenie, używając extension = przemieszczenie - F/kc (kc pochodzi z 5.2.7).
   2. Określić poziom siły podstawowej, biorąc średnią z początku lub końca ścieżki siła-wydłużenie, gdzie nie występują skoki siły i gdzie wspornik nie naciska na powierzchnię. Cała krzywa siła-wydłużenie może być następnie przesunięta o tę wartość średnią.
   3. Przetłumacz dane tak, aby rozszerzenie było wyrównane wzdłuż zerowej osi y. Dzieje się tak, ponieważ cząsteczka powinna być ustawiona na zero rozciągłości na początku śladu.
2. Identyfikacja białka będącego przedmiotem zainteresowania.
   1. Zidentyfikuj nagrania z co najmniej czterema zdarzeniami I91, które zapewniają odcisk palca pojedynczej cząsteczki. Nagrania te rejestrują prawdziwe "pomiary pojedynczych molekuł".
   2. Zapisz zdarzenia, które są oznaczone zdarzeniami pojedynczymi cząsteczkami do dalszej analizy.
3. Określ przyrost długości konturu.
   1. Dla każdego nagrania dopasuj model łańcucha przypominającego robaka do rozwijającego się zdarzenia, gdzie W temperaturze pokojowej p jest długością trwałości (zwykle 0,4 do 1 nm), x jest przedłużeniem w nanometrach, a L jest długością konturu w nanometrach.
      nuta: Forma łańcucha przypominającego robaka jest rozwiązaniem interpolowanym do dokładnego, dokładniejsze rozwiązanie numeryczne znajduje się w Bouchiat i wsp.¹⁷. Alternatywne modele dopasowania można znaleźć w Su et al.¹⁸.
   2. Oblicz różnicę między wartościami L wyznaczonymi dla dwóch kolejnych zdarzeń rozwijających się, a różnicę tę określa się mianem "przyrostu długości konturu".
4. Określ siłę zrywania.
   1. Oblicz siłę zrywającą dla danego zdarzenia rozwijającego się, biorąc najwyższy punkt przed największym spadkiem krzywej rozwijania.

Results

Reprezentatywne wyniki z tego protokołu są pokazane w Rysunek 2. Oba panele pokazują reprezentatywne krzywe rozciągnięcia siły od białek. Górna część pokazuje wyniki z poliproteiny I91, podczas gdy dolna pokazuje białko I91 otaczające interesujące białko, cząsteczkę NI₁₀C. Zapisy te pokazują charakterystyczną siłę I91 (200 pN) i przyrost długości konturu (28 nm), co wskazuje, że wyrównanie i kalibracja AFM zakończyły się sukcesem. Te krzywe rozciąg...

Discussion

Krytycznym krokiem w protokole jest użycie poliproteiny, opisanej w kroku 1.1.2, która służy jako pozytywna kontrola do "odcisków palców" zdarzeń pojedynczych cząsteczek. Ogólnie rzecz biorąc, muszą zachodzić zdarzenia rozwijania białek polibiałkowych (dla I91 oznacza to siłę rozwijania około 200 pN i przyrost długości konturu około 28 nm), aby jednoznacznie stwierdzić, że białko będące przedmiotem zainteresowania zostało rozwinięte. Na przykład, gdy białko będące przedmiotem zainteresowania jest otoczone przez trzy dome...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Krążki do próbek AFM, średnica 15 mm	Ted Pella, Inc.	16218	Służy jako podstawa dla podłoża szklanego
Okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe, średnica 15 mm nr 1 o grubości	Ted Pella, Inc.	26024	służy jako szklane podłoże i baza do powlekania złotem
Zakładki samoprzylepne	Ted Pella, Inc.	16079	Wklej na krążki z próbkami AFM, aby zapewnić lepką powierzchnię do mocowania szklanych szkiełek nakrywkowych
Zespół głowicy wielomodowej STD	Bruker Nano Inc.	Głowica 1B75C	AFM
Szklany uchwyt sondy	Bruker Nano Inc.	MTFML-V2	Szklany uchwyt sondy do skanowania w płynie za pomocą MultiMode AFM.
Sondy Microlever AFM firmy	Bruker Nano Inc.		Wsporniki z azotku krzemu MLCT z końcówkami z azotku krzemu, idealne do trybów obrazowania kontaktowego
Sondy AFM z końcówkami z powłoką Au	Bruker Nano Inc.	Wsporniki OBL-10	do ciągnięcia białek o niskiej sile rozwijania
Karta wielofunkcyjnej akwizycji danych (DAQ), 16-bitowa, 1 MS/s (wielokanałowa), 1,25 MS/s (1-kanałowa), 32 wejścia analogowe	National Instruments	PCI-6259	Akwizycja danych dla sygnałów z głowicy AFM i siłowników piezoelektrycznych
LISA Liniowe siłowniki piezoelektryczne	Physik Instrumente LP	P-753.11C	Siłownik piezoelektryczny do kontroli położenia podłoża i wykonywania pomiarów ciągnięcia
XY Piezo Stage	Physik Instrumente LP	P-541.2CD	Siłownik piezoelektryczny do kontroli położenia podłoża i skanowania na powierzchni podłoża