Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model hodowli komórkowych tętnic oporowych

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55992

⸱

8 września 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano model hodowli komórkowej tętnic oporowych, pozwalający na rozbiór szlaków sygnałowych w śródbłonku, mięśniach gładkich lub między śródbłonkiem a mięśniami gładkimi (połączenie mięśniowo-śródbłonkowe). Selektywne zastosowanie agonistów lub izolacji białek, mikroskopia elektronowa lub immunofluorescencja mogą być wykorzystane przy użyciu tego modelu hodowli komórkowej.

Streszczenie

Połączenie mięśniowo-śródbłonkowe (MEJ), unikalna mikrodomena sygnalizacyjna w tętnicach oporowych o małej średnicy, wykazuje lokalizację specyficznych białek i procesów sygnalizacyjnych, które mogą kontrolować napięcie naczyniowe i ciśnienie krwi. Ponieważ jest to projekcja ze śródbłonka lub komórki mięśni gładkich, a także ze względu na jej niewielki rozmiar (średnio powierzchnia ~1μm2), MEJ jest trudny do zbadania w izolacji. Opracowaliśmy jednak model hodowli komórkowej zwany kokulturą komórek naczyniowych (VCCC), który pozwala na tworzenie MEJ in vitro, polaryzację komórek śródbłonka oraz preparację białek i procesów sygnałowych w ścianie naczyniowej tętnic oporowych. VCCC ma wiele zastosowań i może być dostosowany do różnych typów ogniw. Model składa się z dwóch typów komórek hodowanych po przeciwnych stronach filtra z porami 0,4 μm, w których mogą tworzyć się MEJ in vitro. Tutaj opisujemy, jak stworzyć VCCC poprzez posiew komórek i izolację frakcji śródbłonka, MEJ i mięśni gładkich, które można następnie wykorzystać do izolacji białek lub testów aktywności. Filtr z nienaruszonymi warstwami komórek można zamocować, osadzić i podzielić na sekcje w celu analizy immunofluorescencyjnej. Co ważne, wiele odkryć z tego modelu zostało potwierdzonych przy użyciu nienaruszonych tętnic oporowych, co podkreśla jego fizjologiczne znaczenie.

Wprowadzenie

W tętnicach oporowych o małej średnicy, cienka wewnętrzna elastyczna blaszka (IEL) oddziela komórki śródbłonka (EC) i mięśni gładkich (SMC). Komórki mogą wystawać przez otwory w tej elastycznej matrycy i tworzyć bezpośrednie połączenia cytoplazmatyczne przez kanały połączeń szczelinowych1,2. Ta unikalna struktura nazywana jest połączeniem mięśniowo-śródbłonkowym (MEJ). MEJ jest małą (około 0,5 μm x 0,5 μm, w zależności od łożyska naczyniowego), projekcją komórkową składającą się głównie z komórek śródbłonka, ale może również pochodzić z mięśni gładkich3,4. Wielu badaczy wykazało ogromną złożoność sieci sygnalizacyjnych, które występują selektywnie w MEJ, co czyni go szczególnie ważnym miejscem ułatwiającym dwukierunkową sygnalizację między śródbłonkiem a mięśniami gładkimi5,6,7,8,9,10.

Jednak mechanistyczne rozwarstwienie szlaków sygnałowych w MEJ jest trudne w nienaruszonej tętnicy. Ponieważ MEJ jest projekcją komórkową, obecnie nie jest możliwe wyizolowanie MEJ in vivo ze ściany naczynia krwionośnego. Z tego powodu opracowano VCCC model1. Co ważne, VCCC replikuje fizjologiczną morfologię śródbłonka11 i polaryzację sygnalizacji między wierzchołkową i MEJ częścią komórki12. To właśnie ten unikalny model ułatwił odkrycie, że hemoglobina alfa znajduje się w komórce śródbłonka, spolaryzowanej do MEJ. Jest to przeciwieństwo konwencjonalnie hodowanych komórek śródbłonka, które nie wyrażają alfa hemoglobiny13. Dla badaczy zainteresowanych śródbłonkiem mikronaczyniowym bardziej odpowiednie może być użycie komórek śródbłonka, które zostały wyhodowane w VCCC, szczególnie jeśli celem jest przeanalizowanie szlaków sygnałowych, które występują w tętnicach oporowych o małej średnicy.

Użycie solidnego plastikowego wkładu zawierającego filtr o małych średnicach porów (0,4 μm średnicy) do wspólnej hodowli dwóch różnych typów komórek zapobiega migracji komórek między warstwami. Powoduje to odległość między komórkami wynoszącą 10 μm, która jest znacznie dłuższa niż w in vivo, ale nadal odtwarza wiele cech MEJ in vivo, w tym lokalizację białek i sygnalizację drugiego przekaźnika1,14. Ponadto VCCC pozwala na ukierunkowanie sygnalizacji specyficznej dla typu komórki poprzez dodanie agonisty lub antagonisty do określonego przedziału komórkowego. Na przykład, ładowanie EC BAPTA-AM w celu chelatowania wapnia i stymulowanie SMC za pomocą fenylefryny14. W przeciwieństwie do innych opisów modeli współkulturowych15,16,17,18,19,20,21, zawiera instrukcje dotyczące izolowania odrębnych frakcji mRNA i białka, w tym odrębnej frakcji MEJ w porach filtra. Dodanie tej techniki do VCCC pozwala na szczegółowe badanie zmian w lokalizacji lub transkrypcji mRNA22, fosforylacja białek12,23, oraz aktywność białka12. W tym artykule opiszemy posiewanie EC na górze filtra i SMC na dole, chociaż możliwe jest hodowanie tych dwóch typów komórek w różnych konformacjach11,18,24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Komórki poszycia dla VCCC

  1. Hodowla dużych 225 cm2 kolby EC i SMC w sterylnych warunkach w temperaturze 37 °C, aż do 70-90% zlewu. Upewnij się, że użyto więcej EC niż SMC; w przypadku stosowania pierwotnego ludzkiego EC i SMC, zazwyczaj 3 duże kolby EC na 1 dużą kolbę SMC.
    1. Używaj komórek pierwotnych w dolnych przejściach i nie używaj przeszłego przejścia 10. Wybierz pożywkę hodowlaną na podstawie komórek, które mają być współhodowane. W przypadku pierwotnej EC ludzkiej tętnicy wieńcowej należy użyć podłoża podstawowego EBM-2 EC z czynnikami wzrostu EGM2 MV. W przypadku pierwotnego ludzkiego SMC wieńcowego należy użyć podłoża podstawowego SmBM SMC z czynnikami wzrostu SmGM-2. Przed użyciem z hodowanymi komórkami dodaj czynniki wzrostu do pożywki.
  2. Budowa VCCC Dzień 1: Spryskaj duże (150 mm) szalki Petriego i pokrywki środkiem dezynfekującym (np. Cavicide) i wytrzyj ręcznikiem papierowym lub niestrzępiącymi się chusteczkami. Następnie spryskaj szalki Petriego 70% etanolem (EtOH) i umieść je w okapie do wyschnięcia na powietrzu.
  3. Otwórz płytkę wkładów filtracyjnych (patrz Tabela materiałów) w sterylnych warunkach i pokryj stronę SMC (dolna strona filtra) wkładu roztworem fibronektyny. Trzymając wkładkę w dołączonej płytce 6-dołkowej, odpipetuj roztwór fibronektyny przez boczne szczeliny do dna płytki, upewniając się, że dolna połowa filtra jest zakryta (nie więcej niż 1 ml).
  4. Po 30 minutach leczenia roztworem fibronektyny w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli komórkowych, wyjmij wkładki z płytki, odkurz nadmiar roztworu i odwróć, umieszczając w dolnej połowie czystej szalki Petriego. Uchylenie. Należy pamiętać, aby nie naruszyć membrany wkładu filtra podczas odsysania nadmiaru roztworu; Można tego uniknąć, delikatnie przechylając płytkę i odkurzając roztwór z krawędzi wkładu.
  5. Trypsynizować kolbę SMC o długości225 cm za pomocą 3 ml wstępnie podgrzanego roztworu 2X trypsyna-EDTA, a gdy komórki oderwą się od płytki, dodać 9 ml pożywki SMC, aby zneutralizować trypsynę (3:1, pożywka: trypsyna). Przenieść do stożkowej probówki, dobrze wymieszać i odpipetować 10 μl na hemocytometr, aby określić liczbę komórek.
    1. Policz liczbę komórek w pudełkach 5 x 5 (tj. 18), pomnóż to przez 10 000, aby uzyskać liczbę komórek w 1 ml (180 000). Następnie pomnóż przez 12 ml (całkowita objętość zawiesiny komórek, 2,16 miliona SMC). Upewnij się, że jest wystarczająca ilość SMC, aby pokryć żądaną liczbę dołków.
      UWAGA: Na przykład 1 odwiert powinien mieć 75 000 SMC, a zatem 18 odwiertów miałoby 1,35 miliona całkowitego SMC. Podziel 1,35 miliona potrzebnych komórek przez 180 000 komórek na 1 ml, a otrzymasz 7,5 ml zawiesiny komórek, która będzie potrzebna do posiewu. Następnie oblicz ostateczną potrzebną objętość (18 dołków x 750 μL = 13,5 ml). Tak więc weź 7,5 ml zawiesiny komórek, zwiększ objętość do 13,5 ml za pomocą wstępnie podgrzanego podłoża SMC i dobrze wymieszaj.
  6. Na spodzie każdego filtra umieścić 750 μl zawiesiny komórek zawierającej około 75 000 SMC, uważając, aby nie rozlać żadnego z pożywki i roztworu komórkowego. Umieścić pokrywkę na wierzchu i ostrożnie przenieść szalkę Petriego z wkładkami do inkubatora w temperaturze 37 °C na noc.
    UWAGA: Optymalna gęstość komórek dla innych typów komórek będzie musiała zostać określona empirycznie.
  7. W dniu 2 napełnij czyste naczynia 6-dołkowe 2 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki SMC. Wyjąć płytki z inkubatora. Wyjmuj wkładki pojedynczo i usuwaj pożywkę przez odsysanie, a następnie umieść w 6-dołkowym naczyniu z pożywką SMC.
  8. Pokryć przeciwną stronę filtra (stronę EC) 1 ml 0,5% roztworu żelatyny bydlęcej przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C.
  9. Trypsynizować 225 cm2 kolby EC za pomocą 3 ml wstępnie podgrzanego roztworu 2X Trypsin-EDTA (10x rozcieńczonego w sterylnym PBS firmy Dulbecco), delikatnie stukając kolbą w celu podniesienia komórek z płytki.
    UWAGA: Może być konieczne ponowne umieszczenie kolby w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1-3 minuty.
    1. Gdy komórki oderwą się od płytki, dodaj 9 ml pożywki EC, aby zneutralizować trypsynę (3:1). Przenieść do stożkowej probówki, połączyć razem, dobrze wymieszać i odpipetować 10 μl na hemocytometr w celu określenia liczby komórek.
      1. Policz liczbę komórek w pudełkach 5 x 5 (tj. 60), pomnóż to przez 10 000, aby uzyskać liczbę komórek w 1 ml (600 000). Następnie pomnóż przez 12 ml (całkowita objętość zawiesiny komórek, 7,2 miliona EC). Upewnij się, że jest wystarczająco dużo EC, aby pokryć żądaną liczbę dołków.
        UWAGA: Wymagane jest około 360 000 EC na odwiert. Na przykład 18 studzienek wymaga 6,48 miliona EC. Podziel 6,48 miliona potrzebnych komórek przez 600 000 EC na 1 ml, a otrzymasz 10,8 ml zawiesiny komórek, która będzie potrzebna do posiewu. Następnie oblicz potrzebną ostateczną objętość (18 dołków x 1 ml = 18 ml). W ten sposób weź 10,8 ml zawiesiny komórek, zwiększ objętość do 18 ml za pomocą wstępnie podgrzanego podłoża EC i delikatnie ponownie zawiesij.
  10. Umieść 1 ml 360 000 EC na górnej stronie każdego filtra wkładowego. Pozostawić komórki do inkubacji w spokoju w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Wymień podłoże w dniu 4. Żniwa w 5 dniu.

2. Zbieranie frakcji z VCCC

  1. Przeprowadzić izolację w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C i trzymać wszystkie instrumenty na lodzie.
  2. Należy pamiętać o liczbie izolowanych pojedynczych wkładek i dodać bufor do lizy do probówki o pojemności 50 ml oznaczonej MEJ (dla izolowanych filtrów). Następnie oznacz dwie szalki o średnicy 10 mm; jeden dla EC i jeden dla SMC.
  3. Dostosuj objętość buforu do lizy w zależności od tego, jak skoncentrowany ma być lizat; dla 15 wkładek zaleca się 500 μl buforu do lizy dla probówki MEJ i 250 μl na szalkę Petriego.
  4. Pracuj z jedną 6-dołkową płytką wkładek na raz. Odessać pożywkę z okapu do hodowli komórkowych, a następnie przetransportować do chłodni na lodzie.
    UWAGA: Poniższe instrukcje dotyczą izolacji 1 wkładki.
  5. Odpipetować 10 μl 1x PBS na stronę SMC wkładki.
  6. Użyj podnośnika komórek, aby zeskrobać komórki na jeden koniec wkładki i przenieś komórki z podnośnika na szalkę Petriego SMC, w której znajduje się bufor do lizy.
  7. Gdy podnośnik komórek dotknie buforu do lizy w naczyniu, nie pozwól, aby dotknął wkładu filtra, dopóki nie zostanie całkowicie wytarty i wysuszony na ręcznikach papierowych. Powtórz skrobanie filtra SMC co najmniej jeden do dwóch razy, aby całkowicie usunąć pozostałe resztki ogniw SMC.
  8. Odwróć wkład na drugą stronę i odpipetuj 10 μl 1x PBS do górnej/EC strony filtra wkładowego. Powtórzyć kroki 2.6 i 2.7 ze skrobakiem do komórek i szalką Petriego EC.
  9. Zebrać pozostałą komórkę i zawiesinę PBS ze strony EC filtra za pomocą pipety i przenieść na płytkę Petriego EC z buforem do lizy. Bądź bardzo dokładny w zeskrobywaniu komórek z obu stron filtra, aby pozostawić minimalne zanieczyszczenie EC/SMC we frakcji MEJ.
  10. Ostrożnie użyj skalpela, aby wyciąć filtr z plastikowej wkładki. Zrób to, odcinając 70-80% od plastiku i używając kleszczy, aby całkowicie ściągnąć filtr z plastikowej struktury wkładu. Umieść filtr w stożkowej probówce o pojemności 50 ml oznaczonej MEJ z buforem do lizy i upewnij się, że znajduje się w buforze do lizy i pozostaje mokry.
  11. Powtarzaj kroki izolacji, w grupach po 6, aż wszystkie wstawki zostaną przetworzone.
  12. Upewnij się, że różne grupy pacjentów są przechowywane w oddzielnych probówkach i naczyniach.
  13. Wirować stożkową probówkę MEJ o pojemności 50 ml na pełnej mocy przez 15 sekund lub do momentu, gdy dobrze się wymieszają. Wyjmij filtry ze stożka MEJ za pomocą kleszczy, przeciągając je wzdłuż bocznych ścianek probówki, aby pozostawić maksymalną ilość białek i płynu w probówce. Po tym momencie wyrzuć filtry.
  14. Po wyjęciu wszystkich filtrów ze stożkowej rurki MEJ wykonaj szybkie wirowanie (10-15 s przy maksymalnej prędkości ~16 000 x g) w wirówce, aby wyciągnąć całą ciecz i białka na dno probówki. Przenieść zawartość probówki MEJ oraz szalek Petriego EC i SMC do oddzielnych, mniejszych probówek wirówkowych.
  15. Opcjonalnie: Sonikować zawartość probówek MEJ/SMC/EC przy ustawieniu 4 przez trzy impulsy 10 s na lodzie lub delikatnie homogenizować ręcznie.
  16. Wirować z maksymalną prędkością (~16 000 x g) 15 min w temperaturze 4 °C. Odpipetować supernatant i oznaczyć lizat na zawartość białka metodą testu bicynkowego.

3. Pobieranie VCCC do immunofluorescencji en face

  1. W 5. dniu inkubacji VCCC należy wyjąć wkładki z inkubatora. Pracując w kapturze do hodowli komórkowych, odessać pożywkę SMC z każdego z dolnych dołków filtra wkładowego i przepłukać dwa razy 1x PBS. Powtórz po stronie EC.
  2. Utrzymując wkładki w stanie nienaruszonym i na płytce, dodaj 4% paraformaldehydu (PFA) przez 10-20 minut w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C na delikatnym shakerze. Umyj obie strony filtra wkładowego 1x PBS przez 5 minut i powtórz dwa razy.
    UWAGA: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  3. Przeprowadzić inkubację przeciwciał blokujących, pierwszorzędowych i drugorzędowych na płytce, upewniając się, że obie strony filtra są utrzymywane w roztworze przeciwciało + blok (9 ml PBS, 25 μl Triton X100, 50 mg albuminy surowicy bydlęcej, 500 μl normalnej surowicy)
  4. Aby zamontować filtr na szkiełku podstawowym należy wyciąć filtr z plastikowego wkładu za pomocą skalpela zamontowanego na uchwycie i umieścić na szkiełku mikroskopowym z medium montażowym.

4. Pobieranie VCCC do immunofluorescencji poprzecznej

  1. W 5. dniu inkubacji VCCC należy wyjąć wkładki z inkubatora. Odessać pożywkę z obu stron filtra wkładowego w okapie do hodowli komórkowych i przepłukać każdą stronę filtra dwa razy 1x PBS.
  2. Utrzymując wkładki w stanie nienaruszonym i na płytce 6-dołkowej, dodać 4% PFA i inkubować przez noc w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C na delikatnym wytrząsarce.
    UWAGA: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.

5. Osadzanie VCCC dla immunofluorescencji poprzecznej

  1. Po utrwaleniu wkładów filtracyjnych na około 24 godziny w 4% PFA, przenieść do 70% EtOH na co najmniej 24 godziny, ale do kilku tygodni.
  2. Przetwarzaj filtry przez długi czas (przez noc) na automatycznym procesorze tkanek. Użyj programu w następujący sposób: 70% EtOH przez 30 min, 85% EtOH 30 min, 95% EtOH 30 min, 100% EtOH 30 min, 100% EtOH 45 min, 100% EtOH 45 min, Ksylen 30 min, Ksylen 30 min, Ksylen 45 min, 60 °C parafina 30 min, 60 °C parafina 30 min, 60 °C parafina 45 min.
  3. Po przetworzeniu zebrane filtry przenieść do stacji zatapiania w ciekłej parafinie, utrzymując filtr w kasecie.
  4. Wyjmij filtr z kasety, ostrożnie używając kleszczyków, aby przytrzymać go tuż przy krawędzi. Nożyczkami przetnij filtr na pół, tworząc dwie półokrągłe połówki. Połóż każdą z 2 połówek na zimnej płycie stacji zatapiania na tyle długo, aby wypełnić formę do zatapiania płynną parafiną.
  5. Po napełnieniu ciekłą parafiną bardzo krótko przyłóż formę do zatapiania do zimnej płyty, a następnie zanurz każdą połówkę filtra w formie do zatapiania (ściętą stroną do dołu); gwarantuje to, że podczas cięcia będzie się ciąć od środka filtra w kierunku krawędzi.
  6. Podczas zatapiania użyj kleszczyków, aby przytrzymać filtr na miejscu, aby zapobiec wpadaniu połówek na siebie, dopóki parafina nie ostygnie na tyle, aby mogły stać samodzielnie. Przenieś formę do zatapiania na zimną płytę, aż do całkowitego zestalenia.
    UWAGA: Bloki chłodzące na tackach na lód pomagają zapobiegać powstawaniu pomarszczonych sekcji.

6. Cięcie i barwienie VCCC pod kątem immunofluorescencji poprzecznej

  1. W przypadku cięcia bloków parafinowych i montażu szkiełek: należy przyciąć odcinki o wielkości 5 μm, umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C i zebrać sekcje za pomocą dodatnio naładowanych szkiełek. Następnie przechowuj szkiełka przez noc w piekarniku o temperaturze 42 °C do wyschnięcia.
  2. Przed rozpoczęciem etapów nawadniania upiecz szkiełka w temperaturze 60 °C, aby stopić parafinę i pomóc przykleić sekcje VCCC do szkiełka. Krótko ostudzić, a następnie ponownie nawodnić szkiełka przez dwie zmiany ksylenu, 100% EtOH, 95% EtOH, jedną zmianę 70% EtOH i dwie zmiany wody destylowanej.
  3. Unikaj metod pobierania antygenu, które obejmują podgrzewanie w kuchence mikrofalowej lub podgrzewanie, ponieważ sekcje mogą spaść ze szkiełka.
  4. Przeprowadzić wzorcową blokadę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, następnie inkubację przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C, a następnie etapy przemywania i przeciwciała drugorzędowego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Zamontuj za pomocą nośnika montażowego i szkiełka nakrywkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wkładki filtracyjne stosowane w VCCC mają niewielkie, 0.4 µm otwory. Rycina 1A, an en face widok wstawki z filtrem VCCC przedstawia pory, w których mogą tworzyć się MEJ in vitroSchemat przedstawia komórki mięśni gładkich wysiane na dolnej stronie filtra na jeden dzień przed wysianiem komórek śródbłonka na stronie przeciwnej (Rycina 1B). Po wysianiu komórek frakcje EC, MEJ i SMC można wyizolować po trzech dniach....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

VCCC ma wiele zalet w zakresie rekapitulacji MEJ in vitro, ale istnieją punkty dyskusyjne przy określaniu, czy VCCC może być wykorzystany do konkretnego zastosowania. Na przykład, jeśli z tym modelem mają być używane różne typy komórek, należy go zoptymalizować. Użyliśmy pierwotnych komórek ludzkich, ale możliwe jest wyizolowanie komórek z aorty bydlęcej24 lub myszy typu dzikiego lub myszy z nokautem i użycie ich w VCCC 1,5,14

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty National Heart, Lung and Blood Institute R01088554, T32HL007284 oraz stypendium przeddoktoranckie American Heart Association 14PRE20420024. Szczególnie dziękujemy St. Jude Cellular Imaging Shared Research Core, w tym Randallowi Wakefieldowi i Lindzie Horner za obrazy z mikroskopii elektronowej, Adamowi Straubowi za pomoc w tworzeniu reprezentatywnych obrazów immunofluorescencyjnych oraz Pooneh Bagher za jej cenne opinie na temat protokołu rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Średnica 24 mm, 0,4 i mikro; m Transwell Wkład filtracyjny z membraną poliestrowąCorning3450Jest to jedna 6-dołkowa płytka wkładów
Kolba 225 cmCorning431082
6-dołkowe płytki (bez wkładów filtracyjnych)Corning3506
Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka tętnicy wieńcowejLonzaCC-2585
Pierwotne ludzkie komórki mięśni gładkich tętnicy wieńcowejLonzaCC-2583
EBM-2 EC Pożywka podstawowaLonzaCC-3156
Czynniki wzrostu EC (EGM2 MV Pojedyncze kwotowania)LonzaCC-4147Dodaj do podłoża podstawowego przed użyciem
SmBM Pożywka podstawowa SMCLonzaCC-3181
Czynniki wzrostu SMC (SmGM-2 SingleQuot)LonzaCC-4149Dodaj do podłoża podstawowego przed użyciem
0,5% Trypsyna-EDTA 10XGibco15400-054Rozcieńczyć do 2X sterylnym
hemocytometremVWR15170-208
duże szalki Petriego do posiewu SMC (150mm)Corning353025
Żelatyna bydlęcaSigmaG-9382
Ludzka fibronektynaCorning3560085&mikro; g/ml fibronektyny i przechowywać w temperaturze -20
10x Buforowany roztwór soli Hanksa (HBSS)Gibco14065-056Rozcieńczyć do 1x sterylną wodą
10x Dulbecco's Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (dPBS)Gibco14200-075Rozcieńczyć do 1x sterylną wodą
Jednorazowy zakrzywiony skalpel (krawędź tnąca 30 mm) z uchwytemAmazonMDS15210
KleszczeFisher17-467-201
Podnośnik komórekCorning3008
Skrobak do komórekBD Falcon353085
Rurka stożkowa 50 mlCorning352070
Szalki Petriego 10 mmFalcon35-1008
Rneasy mini zestawQiagen74104
Odczynnik do lizy RNAQiagen79306
ParaformaldehydSigma158127Przygotuj 4% roztwór z dPBS
70% etanolemFisher04-355-305
Środek dezynfekujący kawcydFisher131000
Bufor do lizy białek RIPASigmaR0278
Dysmembranator sonicznyFisherModel 50
1x PBS do zbioru EC / SMC i immunocytochemiaGibco10010023nie musi być sterylny
NazwaFirma>Numer katalogowyUwagi
Embedding/Sectioning/Staining
ParaffinFisher P31-500
Zautomatyzowany procesor tkanekExcelsiorES
Stacja zatapiania + zimna płytaLeicaHistoCore Arcadia
Tissue Tek Accu-Edge Ostrze mikrotomuVWR25608-961 lub 25608-964
Szkiełka mikroskopoweThermo Fisher22-230-900
Szkiełka nakrywkoweThermo Fisher12-548-5E
Nośnik montażowy Prolong GoldThermo FisherP36931
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Other Solutions** Wykonaj wszystkie czynności w sterylnych warunkach, jeśli używasz roztworu na żywych komórkach
Sterylna woda w autoklawie dPBSdo sterylizacji. Używając sterylnej wody, przygotuj DPBS (450 ml sterylnej wody: 50 ml 10X DPBS), wymieszaj i przefiltruj sterylizację (0,2 i mikro; m filtr).
Końcowe stężenie: 1X
sterylna woda w autoklawie HBSSdo sterylizacji. Używając sterylnej wody, przygotuj HBSS (450 ml sterylnej wody: 50 ml 10X HBSS), wymieszaj i przefiltruj sterylizację (0,2 i mikro; m filtr).
Końcowe stężenie: 1X
podstawowy fibronektynyUżyj 50 ml sterylnej wody do fibronektyny, aby zrobić zapas 1 ml podwielokrotności, a następnie zamroź do momentu, aż będzie potrzebny
Końcowe stężenie: 100&mikro; g/ml
Fibronektyny do pokrycia strony SMC VCCCrozmrozić jedną porcję i dodać 1 ml fibronektyny (100&mikro; g / ml) do 19 ml 1X HBSS, aby osiągnąć końcowe stężenie 5&mikro; g / ml.
Stężenie końcowe: 5&mikro; g / ml
2x roztwórRozcieńczyć 10X 0,5% Trypsyna-EDTA do 2X za pomocą 1X dPBS (40 ml DPBS: 10 ml 10X Trypsyna) .
Końcowe stężenie: 2X
blokujący / przeciwciało(9 ml 1X PBS, 25 ml Triton X100, 50 mg albuminy surowicy bydlęcej, 500 ml normalnej surowicy)
Żelatyna bydlęca do pokrycia EC VCCCWymieszaj 0,5 g żelatyny wołowej ze 100 ml wody destylowanej. Autoklaw przed pierwszym użyciem i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przechowywać w sterylnych warunkach.
Końcowe stężenie: 0,50%
1x PBS do pobierania komóreknie musi być sterylny
dPBS Roztwór trypsyny EDTA Roztwór

Bibliografia

  1. Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
  2. Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
  3. Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
  4. Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
  5. Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
  6. Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
  7. Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
  8. Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
  9. Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
  10. Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
  11. Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
  12. Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
  13. Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
  14. Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
  15. Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
  16. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
  17. Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123(2014).
  18. Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
  19. Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
  20. van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
  21. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  22. Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
  23. Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
  24. Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
  25. Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
  26. Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
  27. Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Złącze mioendotelialneko-kultura komórek naczyniowychkomórki śródbłonkakomórki mięśni gładkichfrakcjonowanie komórekanaliza immunofluorescencyjnazatapianie w parafinieWestern blotizolacja białek
Model hodowli komórkowych tętnic oporowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.