Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56041

⸱

27 lipca 2017

 ,  , 
1Department of Cell and Tissue Biology, Program in Craniofacial Biology and Institute for Human Genetics, University of California San Francisco, 2Laboratory of Transgenic Models Diseases, Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z różnymi fluorescencyjnymi liniami myszy reporterowych oraz z inhibitorami szlaków w celu uzyskania wglądu mechanistycznego. Protokół ten może być zaadaptowany do obrazowania na żywo w innych systemach rozwojowych.

Streszczenie

Fuzja drugorzędowych półek podniebiennych w celu utworzenia nienaruszonego podniebienia wtórnego jest kluczowym procesem w rozwoju ssaków, a jego zakłócenie może prowadzić do rozszczepu podniebienia wtórnego, co jest powszechną wrodzoną anomalią u ludzi. Wtórna fuzja podniebienia została szeroko przebadana, co doprowadziło do kilku proponowanych mechanizmów komórkowych, które mogą pośredniczyć w tym procesie. Jednak badania te przeprowadzono głównie na utrwalonych tkankach embrionalnych w postępujących punktach czasowych podczas rozwoju lub w ustalonych kulturach eksplantatów analizowanych w statycznych punktach czasowych. Analiza statyczna jest ograniczona do analizy dynamicznych procesów morfogenetycznych, takich jak fuzja podniebienia, oraz tego, jakie typy dynamicznych zachowań komórkowych pośredniczą w fuzji podniebienia, nie jest w pełni poznane. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania na żywo wtórnej fuzji podniebienia ex vivo w zarodkach myszy. Aby zbadać zachowania komórkowe związane z fuzją podniebienia, specyficzną dla nabłonka keratynę 14-cre użyto do znakowania komórek nabłonka podniebienia w zarodkach reporterowych flox ROSA26-mTmG. Do wizualizacji aktyny nitkowatej wykorzystano myszy reporterowe Lifeact-mRFPruby. Obrazowanie na żywo wtórnego zespolenia podniebienia przeprowadzono poprzez wypreparowanie niedawno przylegających wtórnych półek podniebiennych zarodków w stadium embrionalnym dnia (E) 14,5 i hodowlę w pożywkach zawierających agarozę na szklanym dnie, aby umożliwić obrazowanie za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego. Korzystając z tej metody, wykryliśmy szereg nowych zachowań komórkowych podczas wtórnej fuzji podniebienia. Zrozumienie, w jaki sposób różne zachowania komórek są skoordynowane w przestrzeni i czasie, znacznie przyczynia się do zrozumienia tego dynamicznego procesu morfogenetycznego. Protokół ten można zastosować do zmutowanych linii myszy lub kultur leczonych inhibitorami farmakologicznymi, aby pogłębić wiedzę na temat kontrolowanej wtórnej fuzji podniebienia.

Wprowadzenie

Fuzja tkanek jest ważnym krokiem w rozwoju wielu narządów. Główne wady wrodzone u ludzi, takie jak rozszczep wargi i podniebienia, rozszczep kręgosłupa i wady rozwojowe serca, mogą wynikać z wad fuzji tkanek1. Fuzja podniebienia wtórnego myszy została szeroko przebadana w celu zidentyfikowania mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących fuzję tkanek w procesie rozwoju2,3,4. U myszy rozwój podniebienia wtórnego rozpoczyna się około E11,5 wraz z wyrastaniem wtórnej półki podniebiennej z każdego z obustronnych wyrostków szczękowych. Początkowy wzrost półek podniebiennych następuje pionowo wzdłuż języka, aż do około E14.0, kiedy to półki podniebienne unoszą się poziomo nad językiem. Wzrost ukierunkowany przyśrodkowo powoduje kontakt fizyczny między przylegającym nabłonkiem dwóch półek podniebiennych, tworząc szew nabłonkowy linii środkowej (MES) w E14,5. Pośredni MES musi zostać usunięty spomiędzy wtórnych półek podniebiennych, aby umożliwić mezenchymalne zbieganie się i rozwój nienaruszonego, całkowicie zrośniętego podniebienia wtórnego przez E15.53.

Jak wspólna warstwa komórek MES nabłonka jest formowana między dwoma oddzielnymi półkami podniebiennymi, a następnie usuwana w celu osiągnięcia mezenchymalnej konfluencji, było głównym pytaniem w rozwoju podniebienia. Na podstawie badań histologicznych myszy i mikroskopii elektronowej (EM), badań hodowli eksplantatów i eksperymentów z genetyką funkcjonalną myszy, w proces ten zamieszano kilka podstawowych zachowań komórek. Podobne do filopodiów projekcje z nabłonka MEE na krawędzi przyśrodkowej każdej półki podniebiennej ułatwiają początkowy kontakt5,6, po którym następuje interkalacja tych komórek nabłonkowych do wspólnego pojedynczego MES6,7. Zaproponowano, aby zniesienie powstałego w ten sposób wspólnego systemu gospodarki rynkowej odbywało się za pomocą trzech mechanizmów niewyłącznych. Wczesne badania wykorzystujące obserwację histologiczną i śledzenie linii ex vivo za pomocą barwników witalnych wykazały, że MES może zostać usunięty przez przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) komórek MES8,9, chociaż ostatnio genetyczne śledzenie linii komórek nabłonka wzbudziło niepewność co do długoterminowego wkładu komórek nabłonkowych w mezenchymę półki podniebiennej10, 11,12. Znaczna liczba komórek apoptotycznych i zmniejszenie ich liczby u niektórych mutantów, które nie przechodzą prawidłowej fuzji podniebienia, doprowadziło do wniosku, że apoptoza może być głównym czynnikiem powodującym rozpad MES2,3. Wreszcie, początkowo na podstawie badań obejmujących znakowanie nabłonkowe i obserwację statyczną w postępujących punktach czasowych, zaproponowano migrację komórek MES w wymiarach ustno-nosowym i przednio-tylnym11,13, ale takie dynamiczne zachowania komórek były początkowo niepotwierdzone z powodu niemożności zaobserwowania ich w żywej tkance podniebienia. Niedawno udało nam się bezpośrednio zaobserwować te zachowania, opracowując nową metodologię obrazowania na żywo, która łączy mysie genetyczne metody znakowania fluorescencyjnego z konfokalnym obrazowaniem na żywo eksplantowanych półek podniebiennych.

Po pierwsze, aby zobrazować dynamiczne zachowania komórkowe w komórkach nabłonka podniebienia podczas fuzji podniebienia, wygenerowaliśmy specyficzną dla nabłonka mysz reporterową, krzyżując myszy flox ROSA26-mTmG z myszami Keratin14-cre14,15. Konfokalne obrazowanie na żywo hodowli eksplantatów podniebienia powstałych zarodków potwierdziło niektóre wcześniej zaproponowane zachowania komórkowe i zidentyfikowało nowe zdarzenia w procesie fuzji6. Wypukłości błony komórkowej nabłonka poprzedzały początkowy kontakt komórka-komórka, po którym nastąpiła konwergencja nabłonka przez interkalację komórek i przemieszczenie komórek ustno-nosowych. Warto zauważyć, że odkryliśmy również, że ekstruzja komórek, proces, o którym mówi się, że odgrywa ważną rolę w homeostazie nabłonka, był głównym mechanizmem napędzającym fuzję wtórnego podniebienia myszy 6,16. Ta metoda obrazowania może być stosowana z innymi liniami reporterowymi; wykorzystaliśmy transgeniczne myszy transgeniczne Lifeact-mRFPruby17,18 do zbadania dynamiki cytoszkieletu aktyny podczas procesu fuzji. Inne reportery mogą być również wykorzystywane do obserwacji innych specyficznych aspektów fuzji podniebienia, a metoda ta może być dostosowana do skaningowej mikroskopii konfokalnej ze skaningiem laserowym lub mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem, w zależności od potrzeb obrazowania i dostępności mikroskopu. Obrazowanie na żywo staje się coraz bardziej kluczowym podejściem w biologii rozwoju. W szczególności morfogeneza twarzoczaszki jest złożona, a wady wrodzone u ludzi, które wpływają na twarz, są powszechne. Ta metoda konfokalnego obrazowania na żywo pomoże lepiej zrozumieć podstawowe mechanizmy rozwojowe, a także pochodzenie nieprawidłowości twarzoczaszki u ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco.

1. Przygotowanie nośników do obrazowania na żywo

  1. Przygotowanie płynnych pożywek hodowlanych
    1. Dodaj 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 200 μg/ml kwasu L-askorbinowego, 15 mM HEPES do pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12.
      UWAGA: Nośniki do obrazowania na żywo zostały świeżo wykonane tuż przed obrazowaniem. Pożywka ta zawiera czerwień fenolową, która może prowadzić do fototoksyczności w długich cyklach obrazowania na żywo. Zastąpienie pożywki bez czerwieni fenolowej może poprawić długoterminowe obrazowanie.
  2. Przygotowanie niskotopliwego roztworu agarozy
    1. Rozpuścić 350 mg niskotopliwej agarozy w 10 ml autoklawowanej wody destylowanej, aby uzyskać 3,5% roztwór podstawowy.
    2. Dobrze wymieszać roztwór agarozy i inkubować w temperaturze 70 °C w łaźni wodnej do całkowitego rozpuszczenia agarozy.
    3. Schłodzić roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przed dodaniem go do nośnika do obrazowania na żywo.
    4. Dodać 1 ml roztworu podstawowego agarozy do 5 ml płynnego żywego podłoża obrazowego, aby uzyskać końcowe stężenie (0,6%).
    5. Pożywkę z agarozą należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu.

2. Przygotowanie kultury eksplantatów podniebienia do obrazowania na żywo

  1. Rozwarstwienie niedawno przylegających półek wtórnych podniebiennych E14,5
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że obrazowanie fuzji wymaga rozpoczęcia od lekko przylegającej pary półek podniebiennych; To przyleganie zapobiega ruchom eksplantatów, które zapobiegają zlaniu się podczas obrazowania.
    1. Rozbioruj zarodki w stadium E14,5 w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i wybierz ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) (od K14-cre; ROSA26-mTmGflox) lub (czerwone białko fluorescencyjne) RFP z ekspresją RFP (z Lifeact-mRFPruby) zarodki dodatnie przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w lampy fluorescencyjne. Przenieś tkankę do wstępnie ogrzanych pożywek do obrazowania na żywo bez agarozy.
    2. Przeciąć głowę zarodka i usunąć górną część mózgu za pomocą dwóch cienkich kleszczy nr 5 (Rysunek 1A-C). Użyj jednego kleszczyka nr 5 do przytrzymania zarodka, podczas gdy drugi kleszczyk nr 5 do wycięcia dodatkowej tkanki poza półkami podniebiennymi.
      UWAGA: Do przecięcia główki zarodka można użyć cienkich nożyczek (pierwszy krok) zamiast jednego kleszcza nr 5. Jednak dwa cienkie kleszczyki nr 5 zapewnią lepszą kontrolę nad wykonywaniem precyzyjnych cięć.
    3. Ostrożnie wyjmij żuchwę, nie uszkadzając półek podniebiennych, jak pokazano na Rysunek 1D i 1E. Aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia podniebienia, utrzymuj język przez rozwarstwienie żuchwy, a następnie ostrożnie usuń język.
    4. Po usunięciu żuchwy i języka zbadaj ustną stronę podniebienia wtórnego za pomocą mikroskopu stereoskopowego z fluorescencją, aby potwierdzić silny sygnał reporterowy w MES (Ryc. 1M).
    5. Wypreparuj tylne części, w tym tyłomózgowie i pień mózgu, po usunięciu żuchwy i języka (Rysunek 1F).
    6. Usuń obie szczęki z przylegającymi półkami podniebiennymi (Ryc. 1G).
    7. Przetnij tkankę przedniej górnej szczęki, zachowując nienaruszone podniebienie pierwotne i wtórne (Rysunek 1H i I).
    8. Usuń przegrodę nosową po stronie nosa eksplantatu, odsłaniając MES.
      UWAGA: Te późniejsze etapy sekcji wymagają szczególnej uwagi, aby nie zakłócić kontaktów między dwiema wtórnymi półkami podniebiennymi. Usunięcie przegrody nosowej pomaga zredukować sygnał tła z innych obszarów, a także zmniejszyć pionowy ruch tkanki, umożliwiając stabilne obrazowanie (Rysunek 1J-L).
    9. Po wypreparowaniu półek podniebiennych ponownie zbadaj sygnał reporterowy linii środkowej, aby upewnić się, że nie ma uszkodzenia warstwy nabłonkowej między tkankami.
  2. Ustawianie eksplantatów podniebienia w naczyniu hodowlanym z żywymi pożywkami do obrazowania
    1. Umieść nośnik obrazu na żywo w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
    2. Umieść wypreparowane półki podniebienne stroną ustną skierowaną w dół jak najbliżej szklanego dna, aby obrazować za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego (Ryc. 1N).
    3. Umieść granulki suchego lodu na przewodzącej powierzchni w pobliżu naczynia hodowlanego, aby przyspieszyć krzepnięcie agarozy poprzez szybkie obniżenie temperatury, lub umieść naczynie do hodowli w temperaturze 4 °C. Na tym etapie można również użyć zimnej płyty, takiej jak ta używana do zatapiania parafiny.
      UWAGA: W przypadku stosowania suchego lodu należy uważnie monitorować zmianę podłoża agarozowego, aby zapobiec zamarzaniu mediów.

3. Konfokalne obrazowanie poklatkowe eksplantatu podniebienia

  1. Obrazowanie i akwizycja danych
    1. Po częściowym zestaleniu agarozy zamontować szalkę hodowlaną w odwróconym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w komorę inkubacyjną o temperaturze 37 °C. Użyj mikroskopu konfokalnego ze światłem białym i mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem do obserwacji komórek.
      UWAGA: Użyliśmy zmodyfikowanej pożywki zawierającej 15 mM HEPES bez gazu CO2 .
    2. Umieść wazelinę między naczyniem hodowlanym a pokrywą za pomocą strzykawki, aby zapobiec parowaniu pożywki (Rysunek 1N).
      UWAGA: Po nocnej hodowli (O/N) następuje pewna kondensacja na pokrywie szalki hodowlanej, ale objętość pożywki nie zmienia się, co sugeruje, że wazelina zapobiega parowaniu pożywki.
    3. Zlokalizuj obszar zainteresowania za pomocą obiektywów o małym powiększeniu (10x) i użyj obiektywów o większym powiększeniu (obiektyw 20x z 3-krotnym zoomem cyfrowym lub 40-krotny obiektyw z Immersol W) do poklatkowego obrazowania na żywo.
      UWAGA: Rozcięte wtórne półki podniebienne nie są płaskie. Podniebienie wtórne jest strukturą zakrzywioną, co utrudnia zobrazowanie całego MES w tej samej płaszczyźnie. Obrazowanie w małym powiększeniu (10x) może umożliwić obrazowanie całego podniebienia, ale obiektywy 40x zapewnią lepszą rozdzielczość obrazu, aby zbadać szczegółowe ruchy komórkowe w głębszych pozycjach Z. Krzywizna jest wysoka w środkowej części podniebienia. Podniebienie przednie i tylne są stosunkowo płaskie w porównaniu z podniebieniem środkowym. Często obrazujemy w kierunku środkowej przedniej części podniebienia wtórnego, aby uniknąć obszarów o największej krzywiźnie.
    4. Skanuj wiele stosów Z z 5 μm każdy krok przez 16-24 godziny przy użyciu odpowiedniego wzbudzenia laserowego (488 nm dla GFP i 532/561 nm dla RFP) (Rysunek 2).
      UWAGA: Aby zmniejszyć potencjalną fototoksyczność, należy użyć minimalnej mocy lasera i czasu ekspozycji. Jest to ważne zwłaszcza w przypadku obrazowania wielokolorowego. Wykorzystaj 22% mocy lasera 552 nm dla membrany Tomato (mT), 30% mocy lasera 495 nm dla membrany GFP (mG) i 25% mocy lasera 561 nm dla membraneRFP. Średni czas naświetlania wynosił 550 ms.
    5. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby wykonać śledzenie komórek i analizę ilościową.

4. Analiza obrazu danych

UWAGA: Tutaj użyto Imaris. Podobne analizy danych mogą być również wykonywane za pomocą pakietów oprogramowania ImageJ lub Volocity.

  1. Renderowanie powierzchni trójwymiarowych (3D) z sekwencji obrazów.
    UWAGA: Ta sekcja umożliwia wygenerowanie powierzchni z filmu wygenerowanego za pomocą membranowego sygnału GFP.
    1. Kliknij Edytuj | Pokaż regulację wyświetlania i użyj suwaka histogramu, aby dostosować intensywność sygnału tak, aby sygnał membranowy był wyraźny przez cały czas trwania filmu (Rysunek 3A).
    2. Korygowanie wybielonego sygnału za pomocą funkcji Przetwarzanie obrazu | Korekcja tłumienia. Dostosuj wartości Intensywność z przodu i Intensywność z tyłu, tak aby sygnał membranowy był wyraźny przez cały czas trwania filmu. Ustawienie tych wartości może wymagać kilku prób i błędów.
      UWAGA: Wartość intensywności z tyłu (głębsza pozycja Z) będzie mniejsza niż wartość intensywności z przodu (pozycja Z powierzchni) ze względu na ograniczoną penetrację lasera. Wartości te można zatem również zmienić w celu normalizacji intensywności sygnału w serii Z. Obie wartości można dostosować, aby uzyskać korekcję bielenia. Korekcja tłumienia jest również nazywana korekcją tłumienia emisji19.
    3. Aby wygenerować powierzchnię na podstawie sygnału membranowego, wybierz opcję Przekrocz | Powierzchnie, wybierz kanał źródłowy i typ progu (intensywność bezwzględna), a następnie w ustawieniach algorytmu wybierz Segmentuj tylko obszar zainteresowania i proces całego obrazu, a następnie kliknij strzałkę do przodu; kontynuuj naciskanie strzałki do przodu (użyj ustawień domyślnych lub określ poziomy szczegółowości powierzchni i metodę progowania metodą prób i błędów), sprawdzając, czy wygenerowana powierzchnia odbija sygnał fluorescencji. Aby określić obszar zainteresowania, wybierz region i czas, które mają być renderowane, przycinając pozycje X, Y, Z.
      UWAGA: Na końcu wybierz opcję Process of whole image (Przetwarzaj cały obraz), aby korekty i progi zostały zastosowane w całym filmie.
    4. Wygeneruj powierzchnię, klikając ponownie przycisk strzałki do przodu. Następnie dostosuj próg, zmieniając histogram w Filtrach, aby odpowiadał sygnałowi membranowemu.
    5. Po wygenerowaniu powierzchni wybierz powierzchnię w Powierzchniach/Ustawieniach, aby zwizualizować sygnał powierzchni i zakończyć proces generowania powierzchni, naciskając przycisk podwójnej strzałki do przodu (Rysunek 3B).
    6. Przejdź do tabletu Surface | Edytuj i kliknij opcję Maskuj wszystko w oknie Właściwości maski, aby wygenerować zamaskowany obraz kanału.
    7. Po kliknięciu ok, automatycznie otworzy się okno Mask Channel; wybierz kanał GFP, ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na maksymalną wartość natężenia sygnału (znajdującą się w Edit | Regulacja wyświetlania) i wokseli wewnątrz powierzchni do minimalnej wartości intensywności GFP (dostępnej również w menu Edycja | Regulacja wyświetlacza) w Ustawieniach maski, aby wygenerować maskę sygnału membranowego.
    8. Ponieważ maska sygnału membranowego zostanie pokazana w widoku głośności, wygeneruj odwrócone obrazy za pomocą opcji Przetwarzanie obrazu | Zmiana kontrastu | Odwrócenie (Rysunek 3C).
  2. Wykrywanie plam na obrazach odwróconej powierzchni.
    UWAGA: Ta sekcja umożliwia oznaczenie środka każdej komórki unikalnym miejscem i śledzenie w czasie i przestrzeni.
    1. Wybierz opcję Przekrocz scenę | Spoty | Tworzyć; W Ustawieniach algorytmu wybierz Segmentuj tylko obszar zainteresowania, Na końcu procesu całego obrazu i Śledź miejsca (w czasie).
    2. Kliknij strzałkę do przodu i określ Obszar Zainteresowania; wybierz region i czas, w którym chcesz śledzić spoty; kontynuuj naciskanie strzałki do przodu, wybierz zamaskowany kanał jako kanał źródłowy i określ szacowaną średnicę XY spotów.
    3. Kliknięcie przycisku strzałki do przodu automatycznie otworzy okno filtra; dostosuj próg wykrywania punktu, zmieniając wartości w histogramie, aby wygenerować pojedyncze punkty w środku każdej komórki (Rysunek 3D).
    4. Gdy ponowne kliknięcie przycisku strzałki do przodu otworzy okno Algorytm, wybierz Autoregresywny model śledzenia ruchu20 i określ maksymalną odległość śledzenia oraz maksymalny rozmiar odstępu, aby połączyć ścieżki, które stają się nieciągłe przez krótki okres czasu.
    5. Ponieważ ponowne kliknięcie przycisku strzałki do przodu otworzy okno Filtry, ustaw próg czasu trwania ścieżki, dostosowując histogram tak, aby każda komórka była śledzona. Kliknięcie przycisku podwójnej strzałki do przodu zakończy wykrywanie miejsca.
    6. Aby skorygować dryf tkanki, kliknij Plamy | Edytor ścieżek i wybierz opcję Correct Drift (Popraw dryf). Okno Algorytm otworzy się automatycznie; wybierz pozycje Wybierz Dryf translacyjny, Uwzględnij cały wynik i Popraw pozycje obiektów.
  3. Generowanie wykresów widokowych do analizy ilościowej.
    UWAGA: Wykres rozrzutu programu to narzędzie do generowania wykresów wielowymiarowych (X, Y, Z, kolor i skala) z wieloma obiektami. Wykresy te są przydatne do przedstawiania trendów wielu ruchów komórek w czasie.
    1. Twórz wykresy 2D lub 3D danych śledzenia komórek za pomocą menu wykresu Vantage-Add New Vantage (Rysunek 3E i 3F).
    2. Wybierz Objętość lub Miejsca i wybierz Utwórz/ Kategoria i Typ wydruku
    3. Dostosuj wartości wykresu, aby wygenerować różne wykresy Vantage.
    4. Eksportowanie wykresów za pomocą funkcji Snapshot.
      UWAGA: Dane statystyczne można również wyeksportować jako arkusz kalkulacyjny w celu dalszej analizy ilościowej, klikając opcję Obszar numerów działek | Zapisz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazowanie na żywo hodowli eksplantów podniebienia ujawniło liczne procesy komórkowe pośredniczące w fuzji podniebienia6. Pierwsze kontakty między dwiema komórkami nabłonkowymi są nawiązywane za pomocą wypustek błonowych (Rycina 2B-2E). Gdy dwie warstwy nabłonka spotykają się, tworzą wielowarstwową MES, po czym następuje interkalacja prowadząca do powstania zintegrowanej, jednowarstwowej MES poprzez konwergencję nabło...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obrazowanie morfogenezy tkanek na żywo za pomocą hodowli eksplantatów narządów 3D może dostarczyć szczegółowych informacji na temat procesów komórkowych, których nie można pokazać w konwencjonalnej analizie barwienia utrwalonych skrawków tkanek. Korzystając z hodowli eksplantatów in vitro embrionalnego wtórnego podniebienia myszy, zaobserwowaliśmy kilka interesujących zachowań komórkowych, co skłoniło nas do zaproponowania nowego mechanizmu fuzji podniebienia, który obejmuje konwergencję nabłonka i ekstruzję kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy M. Douglasowi Bensonowi za wstępne rozmowy na temat wtórnego obrazowania podniebienia. Dziękujemy również Davidowi Castaneda-Castellanosowi (Leica) i Chrisowi Riekenowi (Zeiss) za ich pomoc w dostosowaniu warunków obrazowania w mikroskopii konfokalnej. Dziękujemy Lynsey Hamilton (Bitplane) za pomocne sugestie dotyczące ilościowej analizy obrazu za pomocą oprogramowania Imaris. Ta praca została sfinansowana przez NIH/NIDCR R01 DE025887.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
DMEM/F12Life technology11330-032
Fetal bydlęca surowicaLife technology16000-044
L-glutaminaLife technology25030-081
Kwas L-askorbinowySigmaA4544-100G
Pennicylina/StreptomycynaTechnologia życia15140-122
Agaroza niskotopliwaBioExpressE-3111-125
Naczynie ze szklanym dnem 35 mmMatTekP35G-1.5-10-C
Wazelina (wazelina)Sigma16415-1Kg
Myszy
Keratin14-creMGI: J:65294Allel = Tg(KRT14-cre)1Amc
ROSA26mTmGMGI: J:124702Allel = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo
Lifeact-mRFPrubyMGI: J:164274Allel = Tg(CAG-mRuby)#Rows
mikroskop
White Light SP5 mikroskop konfokalnyLeica Microsystems
Cell Observer mikroskop konfokalny z wirującym dyskiemZeiss Microscopy

Bibliografia

  1. Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
  2. Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
  3. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
  4. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
  5. Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
  6. Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122(2015).
  7. Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
  8. Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
  9. Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
  10. Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
  11. Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
  12. Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
  13. Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
  14. Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  15. Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
  16. Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
  17. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
  18. Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
  19. Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
  20. Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
  21. Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
  22. Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikroskopia konfokalnazarodki mysieKeratin14-CreROSA26-mTmGLifeact-mRFPrubyhodowla na agarozieśledzenie komórek nabłonkowychaktyna filamentowa
Obrazowanie na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.