Artykuł metodologiczny

Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów

DOI:

10.3791/56085

⸱

12 grudnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Michael Smith Laboratories Centre for High-Throughput Biology, University of British Columbia, 2Canada's Michael Smith Genome Science Center, BC Cancer Agency

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy zmodyfikowaną metodologię sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny natywnej (ChIP-seq) do generowania zestawów danych sekwencji odpowiednich dla struktury analitycznej gęstości nukleosomów ChIP-seq integrującej dostępność nukleazy mikrokokowej (MNazy) z pomiarami modyfikacji histonów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy zmodyfikowany protokół eksperymentalny sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny (ChIP-seq) zgodny z metodologią analizy opartej na dystrybucji mieszaniny Gaussa (gęstość nukleosomów ChIP-seq; ndChIP-seq), która umożliwia generowanie połączonych pomiarów dostępności nukleazy mikrokokowej (MNazy) z modyfikacją histonów w całym genomie. Pozycja nukleosomów i gęstość lokalna oraz potranslacyjna modyfikacja ich podjednostek histonów działają zgodnie w celu regulacji lokalnych stanów transkrypcji. Kombinatoryczne pomiary dostępności nukleosomów z modyfikacją histonów generowane przez ndChIP-seq pozwalają na jednoczesne badanie tych cech. Metodologia ndChIP-seq ma zastosowanie do niewielkiej liczby komórek pierwotnych, niedostępnych dla protokołów ChIP-seq opartych na sieciowaniu. Podsumowując, ndChIP-seq umożliwia pomiar modyfikacji histonów w połączeniu z lokalną gęstością nukleosomów w celu uzyskania nowych informacji na temat wspólnych mechanizmów regulujących transkrypcję RNA w rzadkich pierwotnych populacjach komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genom eukariotyczny jest upakowany w chromatynę za pomocą powtarzających się struktur nukleosomów, które składają się z dwóch kopii czterech białek histonowych (np. H2A, H2B, H3 i H4) ograniczonych przez 146 par zasad DNA1,2. Kompleksy przebudowujące chromatynę kontrolują położenie nukleosomów w granicach promotora genów i uczestniczą w regulacji ekspresji genów poprzez zmianę dostępności DNA dla czynników transkrypcyjnych i maszynerii polimerazy RNA3,4.

Końcowe ogony aminowe histonów w nukleosomie są poddawane różnym modyfikacjom kowalencyjnym, w tym acetylacji, metylacji, fosforylacji, ubikwitylacji, sumoilacji, formylacji i hydroksylacji określonych aminokwasów5,6,7,8. Pozycje i stopnie tych modyfikacji dyktują stan chromatyny, który wpływa na strukturę chromatyny i kontroluje dostęp kompleksów molekularnych, które umożliwiają aktywację transkrypcji7. Biorąc pod uwagę, że zarówno gęstość nukleosomów, jak i modyfikacja histonów odgrywają rolę w lokalnej kontroli transkrypcji genów, opracowaliśmy natywne podejście ChIP, które umożliwia jednoczesny pomiar gęstości nukleosomów i modyfikacji histonów9,10.

Native ChIP-seq wykorzystuje endonukleazę mikrokokowca (MNazę) do trawienia nienaruszonej chromatyny w jej natywnym stanie w jądrze11,12, właściwość, która została wykorzystana do mapowania pozycjonowania nukleosomów13,14,15. Gęstość nukleosomów ChIP-seq (ndChIP-seq) wykorzystuje właściwość preferencyjnego dostępu MNazy do otwartych regionów chromatyny w celu wygenerowania pomiarów, które łączą dostępność MNazy z modyfikacją histonów10. ndChIP-seq nadaje się do profilowania modyfikacji histonów w rzadkich komórkach pierwotnych, tkankach i hodowanych komórkach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, który umożliwia generowanie zestawów danych sekwencji odpowiednich dla wcześniej opisanej ramy analitycznej work10, która integruje rozmiar fragmentu po immunoprecypitacji, określony przez granice odczytu sparowanych końców, w celu jednoczesnego zbadania dostępności MNazy z pomiarami modyfikacji histonów. Wcześniej zastosowanie tego protokołu do 10 000 pierwotnych komórek CD34 + pochodzących z ludzkiej krwi pępowinowej i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych ujawniło unikalne relacje między strukturą chromatyny a modyfikacjami histonów w tych typach komórek10. Biorąc pod uwagę jego zdolność do jednoczesnego pomiaru dostępności nukleosomów i modyfikacji histonów, ndChIP-seq jest w stanie ujawnić cechy epigenomiczne w populacji komórek na poziomie pojedynczego nukleosomu i rozdzielić heterogeniczne sygnatury na ich elementy składowe. Przykładem eksploracji heterogenicznych populacji komórkowych przez ndChIP-seq jest badanie promotorów biwalentnych, w których obecne są zarówno H3K4me3, znak aktywny, jak i H3K27me3, znak represyjny10.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Minimalne dane wejściowe dla tego protokołu to 10 000 komórek na pojedynczą reakcję immunoprecypitacji (IP). Wydrukuj dostarczony arkusz eksperymentu i wykorzystaj go jako wskazówkę do zaplanowania eksperymentu. Przyjmuje się, że inkubacja w temperaturze pokojowej odbywa się w temperaturze ~22 °C. Wszystkie receptury buforowe przedstawiono w tabeli 1. Wszystkie powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C i przechowywane na lodzie podczas zabiegu, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotowanie komórek

  1. Hodowane komórki
    1. Umyj komórki 1 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i dokładnie określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Jeśli jest więcej niż milion komórek, zwiększ objętość PBS.
    2. Na podstawie liczby komórek podamulować równoważnik 70 000-100 000 komórek do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i wirować w dół przy 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety powoli usunąć i wyrzucić supernatant (nie naruszając osadu komórkowego) i ponownie zawiesić osad w lodowatym buforze do lizy + 1x koktajl inhibitorów proteazy () do stężenia 1000 komórek/μl. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół 20-30 razy. Bardzo ważne jest, aby grudki komórek zostały zakłócone. Staraj się nie tworzyć bąbelków.
    3. Przejdź bezpośrednio do dnia 1 (sekcja 2) protokołu ndChIP-seq lub błyskawicznie zamroź osad komórkowy w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  2. Posortowane komórki
    1. Zbierz 70 000-100 000 posortowanych16 komórek do probówki o pojemności 1,5 ml z 350 μl buforowanego roztworu soli Hanka (HBSS) lub PBS + 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    2. Odwirować każdą porcję komórek w temperaturze 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety powoli usunąć supernatant (nie naruszając osadu komórkowego) i ponownie zawiesić w lodowatym buforze do lizy + 1x do końcowego stężenia 1 000 komórek/μl. Dobrze wymieszać w buforze do lizy, pipetując w górę i w dół 20-30 razy. Upewnij się, że grudki komórek są zakłócone. Staraj się nie tworzyć bąbelków.
    3. Przejdź bezpośrednio do dnia 1 (sekcja 2) protokołu ndChIP-seq lub błyskawicznie zamroź osad komórkowy w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.

2. DZIEŃ 1: ndChIP-seq

  1. Przygotowanie kompleksu przeciwciało-kulka
    1. Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 37 °C i wiadro na lód. Pracując na lodzie, przygotuj 1x bufor IP/1x i 1x bufor rozcieńczający przeciwciała (Ab) i trzymaj je na lodzie. Pobrać kulki magnetyczne białka A (lub G) (patrz Dyskusja w celu zapoznania się z kryteriami wyboru) z magazynu w temperaturze 4 °C i bardzo dobrze wymieszać przez delikatne wirowanie impulsowe. Trzymaj go na lodzie.
      UWAGA: Wirowanie impulsowe oznacza, że wirowanie jest zatrzymywane za każdym razem, gdy w rurze tworzy się pełny wir.
    2. Przenieś 24 μl kulek magnetycznych białka A (lub G) na reakcję IP do nowej probówki o pojemności 2 ml. Zapisz objętość kulek i trzymaj rurkę na lodzie. Na przykład dla 7 adresów IP użyj 24 μL x 7 = 168 μL.
    3. Umieść rurkę na magnesie rurki i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny, wskazując na oddzielenie kulek. Nie naruszając kulek, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i wyrzucić. Zdejmij rurkę z magnesu rurki i umieść ją na lodzie.
    4. Dodaj równą objętość (tj. początkową objętość kulek) lodowatego bufora IP + 1x mix. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Nie wirować.
    5. Umieść bufor IP + 1x koraliki + z powrotem na magnesie rurkowym i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny, wskazując na separację kulek. Nie naruszając kulek, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i wyrzucić. Powtórz zimny bufor IP + 1X pranie jeszcze dwa razy, co daje w sumie 3 prania.
    6. Po końcowym myciu ponownie zawiesić kulki w równej objętości (tj. początkowej objętości kulek) lodowatego bufora IP + 1x mieszanka. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Nie wirować. Trzymaj probówkę na lodzie.
    7. Na lodzie wlać 10 ml buforu IP + do 25 ml zbiornika w kształcie litery V. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 130 μl lodowatego buforu IP + 1x mieszaninę do indywidualnych dołków czystej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Napełnij jedną studzienkę na każdy adres IP. Oznacz tabliczkę jako "Ab-bead complex".
    8. Dodać 12 μl przemytych kulek magnetycznych białka A (lub G) do każdej studzienki zawierającej bufor IP + i mieszać pipetując w górę i w dół. Pozostałe umyte koraliki trzymaj na lodzie.
    9. Uzyskać zwalidowane przeciwciała z ich chłodni i w razie potrzeby rozmrozić na lodzie. Pracując na lodzie, rozcieńczyć przeciwciała 1x buforem rozcieńczającym Ab do stężeń pokazanych w tabeli 2.
    10. Do każdej studzienki płytki z kompleksem Ab-bead dodać 1 μl odpowiedniego, rozcieńczonego przeciwciała (Tabela 1). Nagraj studzienkę do klucza przeciwciała. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj każdy rząd, pipetując w górę i w dół 20 razy. Zmieniaj końcówki między rzędami. Bardzo dobrze uszczelnić płytkę złożoną z koralików Ab aluminiową pokrywą płytki i inkubować w temperaturze 4 °C na platformie obrotowej przez co najmniej 2 godziny
      UWAGA: Ta inkubacja może być kontynuowana, dopóki nie będzie gotowa do rozpoczęcia kroku 2.4.
  2. Liza komórek i trawienie chromatyny
    1. Pracując na lodzie, przygotuj 1x bufor do lizy + 1x i 1 ml buforu rozcieńczającego MNazę I (Tabela 3) i trzymaj je na lodzie.
    2. Odzyskać granulki komórek z ich przechowywania w temperaturze -80 °C (lub z lodu, jeśli są świeżo przygotowane). Rozmrozić każdą komórkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 s, a następnie przenieść do lodu.
    3. Do każdej komórki natychmiast dodaj lodowaty 1x bufor do lizy + 1x do końcowego stężenia 10 000 komórek/20 μL i wymieszaj 10 razy, pipetując w górę iw dół, bez tworzenia pęcherzyków. Na przykład dla 70 000 komórek końcowa objętość wynosi 140 μl.
    4. Pracując na lodzie, podwielokrotność 20 μl/basenik otrzymanych lizatów na płytkę 96-dołkową. Przykryj płytkę plastikową uszczelką i inkubuj na lodzie przez 20 minut. Oznacz płytkę "Trawienie MNazy" i zapisz studzienki do klucza szablonu. Aby zapewnić dokładny czas reakcji trawienia chromatyny, nie należy przystępować do trawienia z więcej niż 2 rzędami próbek na raz.
    5. Tuż przed zakończeniem 20-minutowej lizy rozcieńczyć enzym MNazy I buforem rozcieńczającym MNazę I do końcowego stężenia 20 U/μl i przechowywać na lodzie.
    6. Pracując z lodem, przygotować główną mieszankę mineralizacji MNazy I zgodnie z tabelą 4 i poddzielić 20 μl mieszanki na każdy rząd próbek plus 5 μl martwej objętości w jednym rzędzie 96-dołkowej płytki zbiornika i przechowywać ją na lodzie. W przypadku dwóch rzędów objętość powinna wynosić: (20 μL x 2) + 5 μL = 45 μL.
    7. Po zakończeniu inkubacji lizatów wyjmij płytkę do wytrawiania MNazy z lodu. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 20 μl głównej mieszanki mineralizacyjnej MNazy I do każdego rzędu próbek i wymieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować w temperaturze pokojowej dokładnie przez 5 minut.
    8. Po 5 minutach, aby zatrzymać reakcję, za pomocą wielokanałowej pipety dodać 6 μl 250 μM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do każdego rzędu próbek i kilkakrotnie wymieszać w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Po dodaniu EDTA zmień ustawienie pipety na 20 μl i wymieszaj 10 razy, pipetując w górę i w dół, aby zapewnić całkowite zatrzymanie reakcji trawienia. Zmieniaj końcówki między rzędami.
    9. Za pomocą pipety wielokanałowej do każdego rzędu próbek trawionych przez MNazę dodać 6 μl 10-krotnego buforu do lizy i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Przykryj plastikową uszczelką i inkubuj na lodzie przez 15 minut.
  3. Separacja wejść i wstępne rozliczanie
    1. Po 15 minutowej inkubacji, pracując na lodzie, zbierz wszystkie studzienki dla tego samego granulatu / matrycy komórkowej w jednej sterylnej, wstępnie schłodzonej na lodzie probówce o pojemności 1,5 ml (wstępnie oznaczonej identyfikatorem szablonu) i dokładnie, ale powoli wymieszaj za pomocą pipety, aby uniknąć pienienia się detergentu.
    2. Dla każdej osadki/matrycy komórkowej przenieść 8 μl strawionej chromatyny do nowej sterylnej probówki o pojemności 0,5 ml (wstępnie oznaczonej identyfikatorem matrycy) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Będzie to służyć jako kontrolka wejściowa.
    3. Rozprowadzić pozostałą objętość strawionej chromatyny w 48 μl podwielokrotnościach do nowej 96-dołkowej płytki. Osad komórkowy / szablon 1 trafia do studzienek A01-A06, granulat komórkowy / szablon 2 trafia do studzienek A07-A12 itd. Zapisz studnie do klucza szablonu. Oznacz tabliczkę "Wstępne czyszczenie".
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 120 μl 1x buforu IP + 1x i 12 μl przemytych kulek magnetycznych białka A (lub G) do każdego dołka płytki do wstępnego czyszczenia z kroku 2.3.3. Wymieszaj każdy rząd, pipetując w górę i w dół 10 razy. Zmieniaj końcówki między rzędami. Bardzo dobrze uszczelnić płytkę aluminiową osłoną płytki i inkubować na platformie obrotowej w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
  4. Reakcja immunoprecypitacji
    1. Przed rozpoczęciem tego etapu należy upewnić się, że płytka złożona z kulkami Ab (krok 2.1.10) i płytka do wstępnego czyszczenia (etap 2.3.4) były inkubowane przez co najmniej 2 godziny. Szybko obracaj obie płytki, wirując przez 10 s przy 200 x g.
    2. Umieść płytkę zespoloną Ab-bead (z kroku 2.1.10) na płycie magnetycznej i odczekaj 15 sekund, aż roztwór stanie się klarowny. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety, nie naruszając kulek. Zdejmij płytkę z płyty magnetycznej i trzymaj ją na lodzie.
    3. Umieścić płytkę reakcyjną przed czyszczeniem (z kroku 2.3.4) na płycie magnetycznej i odczekać 15 sekund, aż kulki się rozdzielą, a roztwór stanie się przezroczysty. Nie naruszając kulek, ostrożnie przenieść supernatant za pomocą pipety do odpowiednich dołków na płytce złożonej z kulkami Ab trzymanej na lodzie i delikatnie wymieszać 15 razy, pipetując w górę i w dół. Dobrze uszczelnić płytkę aluminiową pokrywą płytki i inkubować przez noc (12-18 godzin) w temperaturze 4 °C na obrotowej platformie. Ponownie oznacz tabliczkę jako "Reakcja IP".

3. DZIEŃ 2: ndCHIP-seq

  1. Przemywania i elucja
    1. Ustawić baterię grzewczą na 65 °C. Na lodzie przygotuj bufor do płukania o niskiej zawartości soli i bufor do płukania o wysokiej zawartości soli. Szybko obracać płytkę reakcyjną IP z kroku 2.4.3 przez 10 s przy 200 x g.
    2. Umieść płytkę reakcyjną IP na płycie magnetycznej i odczekaj 15 sekund, aż roztwór stanie się klarowny. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant. Zdejmij płytkę z płyty magnetycznej i umieść ją na lodzie.
    3. Do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP dodać 150 μl lodowatego buforu do przemywania o niskiej zawartości soli i powoli mieszać 10 razy w górę iw dół, aby całkowicie zawiesić kulki.
    4. Umieść płytkę reakcyjną IP z powrotem na płycie magnetycznej, poczekaj, aż kulki się rozdzielą, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, usuń i wyrzuć supernatant. Umieść płytkę z powrotem na lodzie i powtórz kroki 3.1.3 i 3.1.4, co daje w sumie 2 prania.
    5. Na lodzie, do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP, dodać 150 μl buforu do płukania o wysokiej zawartości soli i powoli mieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół, aby całkowicie zawiesić kulki.
    6. Umieść płytkę reakcyjną IP z powrotem na płycie magnetycznej, poczekaj, aż kulki się rozdzielą, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, usuń i wyrzuć supernatant. Umieść płytkę reakcyjną IP na lodzie i wstępnie schłodź nową 96-dołkową płytkę obok niej.
    7. Do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP dodać 150 μl buforu do przemywania o wysokiej zawartości soli i powoli mieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół, aby całkowicie zawiesić kulki. Po ponownym zawieszeniu przenieść każdy rząd próbek do odpowiedniego rzędu nowej, wstępnie schłodzonej, 96-dołkowej płytki. Oznacz tabliczkę "Reakcja IP". Wyrzuć starą płytę.
    8. Umieść nową płytkę reakcyjną IP na płycie magnetycznej i poczekaj, aż koraliki się rozdzielą. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant. Utrzymuj talerz w temperaturze pokojowej.
    9. Do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP dodać 30 μl buforu elucyjnego ChIP (EB) i powoli mieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół. Upewnij się, że nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków.
    10. Dobrze uszczelnić płytkę pokrywką z PCR i inkubować w mieszalniku grzewczym w temperaturze 65 °C przez 1,5 godziny z prędkością mieszania 1 350 obr./min.
    11. Po 1,5 h inkubacji odwirować płytkę reakcyjną IP przy 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Zmienić ustawienie mieszacza grzewczego na 50 °C.
    12. Po odwirowaniu umieść płytkę reakcyjną IP na płycie magnetycznej i poczekaj, aż roztwór się usunie. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie przenieść 30 μl supernatantu do nowej płytki 96-dołkowej. Używaj nowych wskazówek dla każdego rzędu. Oznacz płytkę "Reakcja IP" i przechowuj ją w temperaturze pokojowej.
  2. Trawienie białek
    1. Pobrać 30% roztwór kulki magnetycznej PEG/1 M NaCl17 (tabela składu bufora) z lodówki o temperaturze 4 °C i przechowywać go w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Krytyczne: Przed kontynuowaniem upewnij się, że roztwór kulki w pełni osiągnie temperaturę pokojową.
    2. Pobrać wejściowe próbki kontrolne z magazynu w temperaturze 4 °C (krok 2.3.2) i szybko odwirować. Zmierzyć objętość za pomocą pipety i dodać ultraczystą wodę do każdej kontrolki wejściowej, aby uzyskać końcową objętość 30 μl. Przenieść wejściowe próbki kontrolne do wstępnie wybranych studzienek wejściowych (pustych studzienek) na płytce reakcyjnej IP (krok 3.1.12). Nagraj studnię do klucza próbki.
    3. Na lodzie przygotować główną mieszankę do trawienia białek, jak pokazano w tabeli 5, i podzielić równą objętość na jeden rząd 96-dołkowej płytki zbiornika.
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP dodać 40 μl mieszanki Protein Digestion Master Mix i powoli mieszać 10 razy w górę iw dół. Dobrze zamknąć płytkę pokrywką z PCR, odwirowywać w temperaturze 200 x g przez 1 minutę i inkubować w mieszarce grzewczej w temperaturze 50 °C przez 30 minut przy prędkości 650 obr./min. Podczas inkubacji płytki przygotuj świeży 70% etanol (EtOH) i utrzymuj go w temperaturze pokojowej.
    5. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji obracać płytkę reakcyjną IP przy 200 x g przez 1 min, 4 °C. Przechowywać płytkę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Całkowita objętość powinna teraz wynosić ~70 μL/studzienkę.
  3. Czyszczenie ściegu za pomocą 30% roztworu kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl
    1. Podzielić 30% roztworu kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl na temperaturę pokojową do jednego rzędu czystej 96-dołkowej płytki zbiornika (75 μl na próbkę x # rzędów).
    2. Pracując w temperaturze pokojowej, używając pipety wielokanałowej, dodaj 70 μl (stosunek 1:1) 30% roztworu kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP i wymieszaj 10 razy, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umieść płytkę na płycie magnetycznej i inkubuj przez 5 minut, aby kulki się rozdzieliły.
    4. Za pomocą pipety, nie naruszając kulek, ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Zachowaj koraliki.
    5. Podczas gdy płytka reakcyjna IP nadal znajduje się na płycie magnetycznej, za pomocą pipety wielokanałowej, do każdego rzędu próbek dodać 150 μl 70% EtOH o temperaturze pokojowej i inkubować przez 30 s. Po 30 sekundach, za pomocą pipety wielokanałowej, usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok jeszcze raz, w sumie 2 prania.
    6. Po drugim płukaniu EtOH inkubuj "suchą" płytkę na płycie magnetycznej przez 3 minuty. Sprawdź wzrokowo płytkę, aby upewnić się, że cały EtOH został odparowany. Jeśli nie, inkubować płytkę przez 1 minutę. Nadmierne suszenie kulek skutkuje niższą wydajnością.
    7. Zdejmij płytkę z płyty magnetycznej i za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 35 μl EB (tabela materiałów). Dobrze wymieszaj, pipetując 10 razy w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty do elucji.
    8. Po inkubacji umieścić płytkę reakcyjną IP z powrotem na płycie magnetycznej i inkubować przez 2 minuty. Koraliki powinny się rozdzielić, a roztwór stanie się klarowny.
    9. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie przenieś supernatant do odpowiednich studzienek nowej 96-dołkowej płytki.
    10. Uszczelnij płytkę aluminiową pokrywą, oznacz etykietą "IPed + Input DNA" i przechowuj w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze -20 °C do długotrwałego (>48 h) przechowywania.

4. DZIEŃ 3: Budowa biblioteki

  1. Koniec naprawy i fosforylacji
    1. Danymi wejściowymi dla reakcji naprawy końcowej/fosforylacji jest płytka wejściowa IPed + z kroku 3.3.10. Po rozmrożeniu obracać płytkę o masie 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i trzymać ją na lodzie.
    2. Pobrać z zamrażarki o temperaturze -20 °C wszystkie odczynniki (z wyjątkiem enzymów) wymagane do reakcji naprawy/fosforylacji końcowej (tabela 6) i rozmrozić je w temperaturze pokojowej, a następnie natychmiast przenieść do lodu.
    3. Pracując na lodzie, postępuj zgodnie z Tabelą 6, aby ustawić główną mieszankę do naprawy końcowej/fosforylacji w sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Po dodaniu wszystkich składników nieenzymatycznych dobrze wymieszaj przez wirowanie impulsowe i umieść probówkę z powrotem na lodzie.
    4. Pobrać odpowiednie enzymy z chłodni i przetransportować na stół w chłodzonym stojaku do chłodzenia rurami. Wymieszaj każdy enzym, przesuwając probówkę, szybko odwiruj i umieść go z powrotem w schłodzonej rurce. Podczas pipetowania enzymu należy zasysać powoli, aby zapewnić dokładny transfer objętości. Po dodaniu umyj końcówkę w mieszance wzorcowej, pipetując w górę i w dół.
    5. Po dodaniu enzymów delikatnie przekręć pulsacyjnie mieszankę główną 5 razy, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wszystkich składników, a następnie szybko odwiruj i natychmiast umieść probówkę z powrotem na lodzie.
    6. Na lodzie podsycić odpowiednią objętość End Repair/Phosphorylation Master Mix do jednego rzędu nowej 96-dołkowej płytki zbiornika; objętość do podania: (15 μL x # rzędów) + 5 μL objętości martwej. Przykładowe obliczenie dla dwóch rzędów: (15 μL x 2) + 5 μL = 35 μL/studzienkę.
    7. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 15 μl End Repair/Phosphorylation Master Mix do każdego rzędu próbek i wymieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Uszczelnić płytkę plastikową pokrywą, wirować w temperaturze 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  2. Czyszczenie kulek po naprawie końcówki i fosforylacji
    1. Z lodówki o temperaturze 4 °C pobrać 20% roztwór kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl i 30% roztwór PEG/1 M NaCl i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut
      UWAGA: 30% roztwór PEG/1 M NaCl NIE zawiera kulek magnetycznych.
    2. Gdy oba roztwory osiągną temperaturę pokojową, dla każdej próbki przygotuj 80 μl mieszanki 1:2 30% roztworów kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl i 20% PEG/1 M NaCl. Przykład dla 24 próbek: 80 μL x 24 = 1,920 μL (640 μL 30% PEG/1 M NaCl i 1,288 μL 20% roztworów kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl).
    3. Roztwór kulki wymieszać w równej objętości do jednego rzędu 96-dołkowej płytki zbiornika i utrzymywać w temperaturze pokojowej. Podwielokrotność buforu EB (40 μl na próbkę x # rzędów) do jednego rzędu czystej 96-dołkowej płytki zbiornika. Przykład dla dwóch rzędów: 40 μL x 2 = 80 μL/studzienkę.
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 75 μl mieszanki kulek przygotowanej w kroku 4.2.2 do każdego rzędu próbek z kroku 4.1.7 i mieszać w górę i w dół 10 razy. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Kontynuuj procedurę czyszczenia ściegu zgodnie z opisem w krokach 3.3.3-3.3.10. Przykryj talerz plastikową uszczelką, szybko odkręć i umieść go na lodzie. Przejdź do kroku 4.3.
  3. Reakcja A-Tailing
    1. Pobrać z zamrażarki o temperaturze -20 °C wszystkie odczynniki (z wyjątkiem enzymów) wymagane w reakcji ogoniastej A (tabela 7), rozmrozić je w temperaturze pokojowej, a następnie natychmiast przenieść do lodu.
    2. Pracując na lodzie, postępuj zgodnie z Tabelą 7, aby ustawić A-Tailing Master Mix w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Postępuj zgodnie z ogólnymi instrukcjami konfiguracji naparu enzymatycznego, jak opisano w krokach 4.1.4-4.1.6.
    3. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 15 μl mieszanki głównej A-Tailing Master Mix do każdego rzędu próbek i wymieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Uszczelnić płytkę pokrywką do PCR, wirować w temperaturze 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i inkubować w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji obracać płytkę o masie 200 x g przez 1 minutę i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Czyszczenie ściegu po A-Tailing
    1. Wykonaj czynności opisane w kroku 4.2. Przykryj talerz plastikową uszczelką, oznacz "A-tail + BC", szybko odkręć i umieść na lodzie. Przejdź do kroku 4.5.
  5. Podwiązanie adaptera
    1. Pobrać z zamrażarki w temperaturze -20 °C wszystkie odczynniki (z wyjątkiem enzymów) wymagane w reakcji ligacji adaptera (tabela 8), rozmrozić je w temperaturze pokojowej, a następnie natychmiast przenieść do lodu.
    2. Pobrać roztwór podstawowy 10 μM z adaptera PE (tabela uzupełniająca 1) i rozcieńczyć do 0,5 μM za pomocą EB. Dobrze wymieszaj przez wirowanie pulsacyjne. Wymagana objętość to 3 μl x # próbek. Pracując na lodzie, podwielokrotnić adapter PE 0,5 μM o równej objętości do 12 dołków czystej 96-dołkowej płyty zbiornika. Trzymaj go na lodzie.
    3. Pracując na lodzie, postępuj zgodnie z Tabelą 8, aby ustawić Adapter Ligation Master Mix w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Postępuj zgodnie z ogólnymi instrukcjami konfiguracji naparu enzymatycznego, jak opisano w krokach 4.1.4-4.1.6. Przed użyciem upewnij się, że bufor 5X Quick Ligation jest całkowicie rozmrożony i bardzo dobrze wymieszany.
    4. Na lodzie rozdzielić odpowiednią objętość Adapter Ligation Master Mix do jednego rzędu nowej 96-dołkowej płytki zbiornika. Na przykład obliczenie dla dwóch rzędów: (23 μL x 2) + 5 μL = 51 μL/studzienkę. Trzymaj talerz na lodzie.
    5. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 2 μl adaptera 0,5 μM z parzystym końcem (PE) do każdego rzędu próbek z kroku 4.4.1 i wymieszać. Zmieniaj końcówki między rzędami.
    6. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 23 μl mieszanki głównej do ligacji za pomocą adaptera do każdego rzędu próbek i wymieszać 15 razy, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Uszczelnić płytkę metalową pokrywą, oznaczyć etykietą "Podwiązanie", wirować w temperaturze 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
  6. Dzień 4: Czyszczenie koralików #1 po podwiązaniu adaptera
    1. Z lodówki o temperaturze 4 °C pobrać 20% roztwór kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Podczas gdy roztwór się równoważy, przygotuj świeże 70% EtOH.
    2. Podwielokrotnić 20% roztwór kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl, 55 μl na próbkę, do jednego rzędu 96-dołkowej płytki zbiornika i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przykład dla dwóch rzędów: 55 μL x 2 = 110 μL/studzienkę.
    3. Podwielokrotność buforu EB, 50 μl na próbkę, do jednego rzędu czystej 96-dołkowej płytki zbiornika. Przykład dla dwóch rzędów: 50 μL x 2 = 100 μL/studzienkę.
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 48 μl roztworu kulek magnetycznych 20% PEG/1 M NaCl do każdego rzędu próbek na płytce ligacyjnej z kroku 4.5.6 i wymieszać w górę i w dół 10 razy. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Kontynuuj procedurę czyszczenia ściegu zgodnie z opisem w krokach 3.3.3-3.3.7.
    5. Zdejmij płytkę z płyty magnetycznej i za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 45 μl EB (tabela materiałów). Dobrze wymieszaj, pipetując 10 razy w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty do elucji.
    6. Po inkubacji umieścić płytkę reakcyjną IP z powrotem na płytce magnetycznej i inkubować przez 2 minuty. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie przenieść supernatant do odpowiednich studzienek nowej płytki 96-dołkowej. Oznacz tabliczkę "Podwiązanie + 1 BC".
    7. Do każdego dołka dodaj 5 μl 10x buforu o wysokiej wierności PCR i dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Przykryj talerz plastikową uszczelką, szybko odwiruj i utrzymuj w temperaturze pokojowej.
  7. Czyszczenie ściegu #2 po podwiązaniu adaptera
    1. Przeprowadzić czyszczenie kulek zgodnie z opisem w sekcji 4.6 z następującymi zmianami: dodać 60 μl 20% roztworu kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl do każdej aktywnej studzienki w płytce Ligation + 1 BC (krok 4.6.7) i wymyć z kulek za pomocą 35 μl buforu EB. Oznacz płytkę "Podwiązanie + 2 BC" i trzymaj ją na lodzie.
  8. Amplifikacja PCR
    1. Pobrać z zamrażarki w temperaturze -20 °C wszystkie odczynniki (z wyjątkiem enzymów) wymagane do przeprowadzenia reakcji PCR (tabela 9), rozmrozić je w temperaturze pokojowej, a następnie natychmiast umieścić na lodzie.
    2. Pracując na lodzie, postępuj zgodnie z Tabelą 9, aby ustawić PCR Master Mix w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Postępuj zgodnie z ogólnymi instrukcjami konfiguracji parzenia, jak opisano w krokach 4.1.4-4.1.5. Na lodzie podniec odpowiednią objętość PCR Master Mix do jednego rzędu nowej 96-dołkowej płytki zbiornika. Trzymaj go na lodzie. Zobacz krok 4.5.4, aby zapoznać się z przykładowymi obliczeniami.
    3. Pracując na lodzie, używając pipety wielokanałowej, dodaj 2 μl każdego unikalnego 12,5 μM startera do odwróconego indeksowania PCR (tabela uzupełniająca 2) do każdego dołka w płytce Ligation + 2 BC (krok 4.7.1) i powoli mieszaj w górę iw dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Trzymaj talerz na lodzie.
    4. Pracując z lodem, używając pipety wielokanałowej, dodać 23 μl głównej mieszanki PCR do każdego rzędu próbek z kroku 4.8.3 i wymieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół. Uszczelnić płytkę pokrywką do PCR, odwirować ją w temperaturze 200 x g przez 1 minutę i inkubować w termocyklerze (patrz Tabela 10 dla warunków cyklicznych PCR).
  9. Oczyszczanie kulek po amplifikacji PCR
    1. Po amplifikacji PCR obracać płytkę przy 200 x g przez 1 minutę, 4 °C. Przeprowadzić czyszczenie kulki zgodnie z opisem w sekcji 4.6 z następującymi zmianami: dodać 51 μl 20% roztworu kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl do każdej reakcji PCR i wymyć z kulek za pomocą 25 μl buforu EB. Uszczelnij płytkę aluminiową osłoną i wiruj z prędkością 200 x g przez 1 min. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Aby zweryfikować skonstruowane biblioteki, należy przeprowadzić kwantyfikację DNA za pomocą testu opartego na fluorescencji, zwizualizować produkt końcowy za pomocą analizatora elektroforezy kapilarnej opartego na chipie (test o wysokiej czułości) i uruchomić ilościowy PCR wzbogacający (qPCR) (patrz Reprezentatywne wyniki, Walidacja jakości biblioteki ndChIP-seq przez qPCR).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Profile trawienia chromatyny
Optymalizacja trawienia MNazy jest niezbędna dla powodzenia tego protokołu. Kluczowe znaczenie ma wygenerowanie profilu trawienia zdominowanego przez pojedyncze rozmiary fragmentów nukleosomów, a jednocześnie nie trawionego w nadmiarze, aby umożliwić odzyskanie fragmentów nukleosomów wyższego rzędu. Idealny profil trawienia składa się z większości pojedynczych fragmentów nukleosomów, przy czym niewielka frakcja reprezentuje fragmenty mniejsze i większe niż pojedyncze nukleosomy. Rysunek 1 pokazuje przykłady idealnych, nadmiernie trawionych i niedostatecznie trawionych profili rozkładu wielkości. Należy zauważyć, że nieoptymalne trawienie chromatyny będzie również widoczne w profilu biblioteki sekwencjonowania wygenerowanej z materiału IP (Rysunek 2).

Walidacja jakości biblioteki ndChIP-seq przez qPCR
qPCR to sprawdzona metoda oceny jakości ChIP18,19,20. Podczas wykonywania sekwencji ndChIP na 10 000 komórek wydajność kwasu nukleinowego po IP będzie poniżej 1 ng. Dlatego ważne jest, aby przeprowadzić qPCR po zbudowaniu biblioteki, aby ocenić względne wzbogacenie regionów docelowych w porównaniu z tłem. Aby zapewnić oszacowanie tła, generowane są biblioteki zbudowane z chromatyny trawionej przez MNazę (dane wejściowe). Dla każdej biblioteki IP potrzebne są dwa zestawy starterów (patrz Tabela uzupełniająca3, aby uzyskać listę starterów dla powszechnie stosowanych znaczników histonowych). Jeden zestaw starterów powinien być specyficzny dla regionu genomu, który jest konsekwentnie związany z modyfikacją histonów będącą przedmiotem zainteresowania (cel dodatni) i innego regionu, który nie jest oznaczony modyfikacją histonów będącą przedmiotem zainteresowania (cel ujemny). Jakość biblioteki ChIP-seq będzie oceniana jako wzbogacenie fałdy w odniesieniu do biblioteki wejściowej. Wzbogacenie krotności można obliczyć za pomocą następującego równania, które zakłada wykładniczą amplifikację docelowego regionu genomowego: 2Ctwejście - CtIP. Nasz niestandardowy pakiet oprogramowania statystycznego R, qcQpcr_v1.2, jest odpowiedni do analizy wzbogacania qPCR natywnych bibliotek ChIP-seq (Supplemental Code Files) o niskim nakładzie wejściowym. Rysunek 3 przedstawia wynik qPCR dla udanych i nieudanych bibliotek ChIP-seq. Minimalna oczekiwana wartość wzbogacenia składania dla dobrej jakości bibliotek ndChIP-seq wynosi 16 dla wąskich znaczników, takich jak H3K4me3, i 7 dla szerokich znaczników, na przykład H3K27me3.

Modelowanie dostępności MNase
Analiza obliczeniowa sekwencji ChIP jest złożona i unikalna dla każdego środowiska eksperymentalnego. Zestaw wytycznych opracowanych przez Międzynarodowe Konsorcjum Epigenomiczne Człowieka (IHEC) i Encyklopedię Elementów DNA (ENCODE) można wykorzystać do oceny jakości bibliotek ChIP-seq21. Ważne jest, aby pamiętać, że głębokość sekwencjonowania bibliotek ma wpływ na wykrywanie i rozpoznawanie wzbogaconych regionów20. Liczba wykrytych pików wzrasta i zbliża się do plateau wraz ze wzrostem głębokości odczytu. Zalecamy, aby biblioteki ndChIP-seq były sekwencjonowane zgodnie z zaleceniami IHEC dotyczącymi 50 milionów sparowanych odczytów (25 milionów fragmentów) dla wąskich znaczników (np. H3K4me3) i 100 milionów sparowanych odczytów (50 milionów fragmentów) dla szerokich znaczników (np. H3K27me3) i input22. Te głębokości sekwencjonowania zapewniają wystarczające wyrównanie sekwencji do wykrywania najważniejszych pików przy użyciu powszechnie używanych wywołujących piki ChIP-seq, takich jak MACS2 i HOMER, bez osiągania nasycenia23,24. Wysokiej jakości biblioteka ndChIP-seq ssaków ma wskaźnik duplikacji PCR <10% i wskaźnik wyrównania genomu referencyjnego > 90% (w tym zduplikowane odczyty). Udane biblioteki ndChIP-seq będą zawierały wysoce skorelowane repliki, przy czym znaczna część (> 40%) wyrównanych odczytów w MACS222 zidentyfikowanych wzbogaconych pików, a inspekcja wyrównanych odczytów w przeglądarce genomu powinna ujawnić wizualnie wykrywalne wzbogacenia w porównaniu z biblioteką wejściową (Rysunek 4). Ponadto ndChIP-seq może być używany do oceny gęstości nukleosomów przy użyciu algorytmu rozkładu mieszaniny Gaussa (w1 * n(x; μ1,σ 1) + w2 * n(x; μ2,σ 2) = 1) w MACS2 zidentyfikowano wzbogacone regiony do modelowania gęstości nukleosomów zdefiniowanej przez granice dostępne dla MNazy. W tym modelu w1 oznacza masę dystrybucji mononukleosomów, a w2 oznacza masę dystrybucji dinukleosomów. Gdzie w1 jest większe niż w2, występuje dominacja fragmentów mononukleosomów i odwrotnie. Ta analiza wymaga, aby biblioteki były sekwencjonowane w sposób sparowany, aby można było zdefiniować rozmiary fragmentów. Aby zastosować algorytm rozkładu mieszaniny Gaussa, najpierw identyfikuje się statystycznie istotne regiony wzbogacone. Sugerujemy wywołanie wartości szczytowej za pomocą MACS2 przy użyciu Input jako kontrolki i z domyślnymi ustawieniami dla wąskich znaków i odcięciem wartości q wynoszącym 0,01 dla szerokich znaków. Szereg pakietów statystycznych wykorzystujących algorytm rozkładu mieszaniny Gaussa jest dostępnych w powszechnie stosowanych pakietach oprogramowania statystycznego. Wykorzystując średni rozmiar fragmentu, określony przez granice odczytu sparowanych końców próbek IPed, rozkłady w MACS2 zidentyfikowały wzbogacone promotory, a algorytm rozkładu mieszaniny Gaussa można zastosować do każdego promotora przy użyciu pakietu R-statistical Mclust w wersji 3.025 w celu obliczenia rozkładu ważonego. W tym zastosowaniu zalecamy wyeliminowanie promotorów zawierających mniej niż 30 wyrównanych fragmentów, ponieważ poniżej tego progu wynikowe szacunki masy stają się niewiarygodne. Dobrej jakości biblioteka ndChIP-seq generuje rozkład mieszaniny Gaussa, który składa się z dwóch głównych składników o średnich wartościach odpowiadających długościom fragmentów mono-, dinukleosomów.

figure-results-1
Rysunek 1: Ocena trawienia MNazy przed wygenerowaniem biblioteki. Profile analizatora elektroforezy kapilarnej opartej na chipach optymalnej chromatyny trawionej (A), niedostatecznie trawionej (B) i nadmiernie trawionej (C) chromatyny. Kontrpróby biologiczne są pokazane jako niebieskie, czerwone i zielone ślady. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Ocena trawienia MNazy po wygenerowaniu biblioteki. (A) Profile konstrukcji po bibliotece optymalnie strawionych danych wejściowych (kontrpróby biologiczne; czerwony, zielony,) i IP (repliki biologiczne; cyjan, fioletowy, niebieski) oraz (B) nieoptymalnych danych wejściowych (repliki biologiczne; czerwony, zielony, niebieski) i IP (repliki biologiczne; cyjan, fioletowy, pomarańczowy) bibliotek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Ilościowy PCR po budowie biblioteki może być użyty do oceny jakości bibliotek ndChIP-seq. Wzbogacenie w krotność bibliotek IP H3K4me3 w odniesieniu do bibliotek wejściowych oblicza się jako 2 (Ct danych wejściowych - Ct adresu IP) dla celów dodatnich i ujemnych przy użyciu qcQpcr_v1.2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywna biblioteka ndChIP-seq zbudowana z 10 000 pierwotnych komórek krwi pępowinowej CD34+. Korelacja Pearsona sygnału H3K4me3 (odczyty na milion zmapowanych odczytów) obliczona w promotorach (TSS+/-2Kb) między 3 kontrpróbami biologicznymi, (A) replikatem 1 i 2, (B) powtórzeniem 1 i 3, (C) powtórzeniem 2 i 3. (D) Widok przeglądarki UCSC na klaster genów HOXA usieciowanych ChIP-seq wygenerowanych z 1 miliona komórek na IP, udany ndChIP-seq z 10 000 komórek na IP i nieudany ndChIP-seq z 10 000 komórek na IP. (czerwony: H3K27me3, zielony: H3K4me3 i: Wejście). (E) Frakcja zmapowanych odczytów w MACS2 zidentyfikowała wzbogacone regiony H3K4me3 () i H3K27me3 (szary). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Skład bufora A.1. Bufor immunoprecypitacyjny (IP) 20 mM Tris-HCl pH 7,5 2 mM EDTA 150 mM NaCl 0,1% Tryton X-100 0,1% Deoksycholan 10 mM maślanu sodu A.2. Bufor o niskiej zawartości soli 20 mM Tris-HCl pH 8,0 2 mM EDTA 150 mM NaCl 1% Tryton X-100 0,1% SDS A.3. Bufor do przemywania o wysokiej zawartości soli 20 mM Tris-HCl pH 8,0 2 mM EDTA 500 mM NaCl 1% Tryton X-100 0,1% SDS A.4. Bufor elucyjny ChIP 100 mM NaHCO3 1% SDS A.5. 1x Bufor do lizy – 1 ml 0,1% Tryton 0,1% Deoksycholan 10 mM maślanu sodu A.6. Bufor do rozcieńczania Ab 0,05% (w/v) Azydek 0,05% środki przeciwdrobnoustrojowe o szerokim spektrum działania (np. ProClin 300) w PBS A.7. 30% roztwór kulek magnetycznych PEG/1M NaCl (odniesienie16) 30% PEG 1 M NaCl 10 mM Tris HCl pH 7,5 1 mM EDTA 1 ml umytych kulek superparamagnetycznych A.8. 20% roztwór kulek magnetycznych PEG/1M NaCl (odniesienie16) 30% PEG 1 M NaCl 10 mM Tris HCl pH 7,5 1 mM EDTA 1 ml umytych kulek superparamagnetycznych

Tabela 1: kompozycja bufora ndChIP-seq.

Modyfikacja histonu Stężenie (μg/μL) H3K4me3 powiedział: 0,125 pkt. H3K4me1 powiedział: 0,25 pkt. H3K27me3 powiedział: 0,125 pkt. H3K9me3 powiedział: 0,125 pkt. H3K36me3 powiedział: 0,125 pkt. H3K27ac powiedział: 0,125 pkt.

Tabela 2: Ilość przeciwciał wymagana dla ndChIP-seq.

powiedział: szt. szt.
ReganetObjętość (μL)
Ultra czysta wodaZ numerem 478
1 M Tris-HCl pH 7,510
0,5 mln EDTA10
5 M NaClcyfra arabska
glicerol500
Całkowita objętość1 000

Tabela 3: Przepis na bufor rozcieńczający MNazę.

Odczynnik Objętość (μL) Ultra czysta woda 13 Naziemna telewizja cyfrowa 20 mM 1 10x Bufor MNazy 4 20 U/μl Mnase cyfra arabska Całkowita objętość 20

Tabela 4: Przepis na MNase Master Mix.

Odczynnik Objętość (μL) Bufor elucyjny Rozdział 30 Bufor G2 8 Proteazy cyfra arabska Całkowita objętość Rozdział 40

Tabela 5: Przepis na Mistrza Oczyszczania DNA.

Odczynnik Objętość (μL) Ultra czysta woda 3.3 10x represyjny bufor endonukleazy (np. NEBuffer) 5 25 mM ATP cyfra arabska 10 mM dNTP cyfra arabska Kinaza polinukleotydowa T4 (10 U/μl) 1 Polimeraza DNA T4 (3 U/μl) 1,5 Polimeraza DNA I, duży (Klenow) fragment (5 U/μl) 0,2 pkt. Całkowita objętość 15

Tabela 6: Przepis na Mistrz Naprawy Końcowej.

Odczynnik Objętość (μL) Ultra czysta woda 8 10x represyjny bufor endonukleazy (np. NEBuffer) 5 10 mM dATP 1 Klenow (3'-5' egzo-) 1 Całkowita objętość 15

Tabela 7: Przepis na A-Tailing Master Mix.

Odczynnik Objętość (μL) Ultra czysta woda 4.3 5x bufor do szybkiego podwiązywania 12 Ligaza DNA T4 (2000 U/μl) 6.7 Całkowita objętość 23

Tabela 8: Przepis na Mieszankę Główną Podwiązania Adaptera.

Odczynnik Objętość (μL) Ultra czysta woda 7 Starter do PCR 25 uM 1.0 cyfra arabska 5x bufor HF 12 Dmso 1,5 Polimeraza DNA 0,5 Całkowita objętość 23

Tabela 9: Przepis na PCR Master Mix.

Temperatura (°C) Czas trwania (s) Liczba cykli Rozdział 98 60 Rozdział 1 Rozdział 98 Rozdział 30 65 Rozdział 15 10 72 Rozdział 72 15 72 Rozdział 72 300 szt. 1 4 trzymać trzymać

Tabela 10: Metoda uruchamiania PCR.

Oligo (Oligo) kolejność Modyfikacji PE_adapter 1 5'- /5Phos/GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG -3' Modyfikacja 5': fosforylacja PE_adapter 2 5' - ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA CGA TC*T - 3' Modyfikacja 3': *T jest wiązaniem fosforotionowym

Tabela uzupełniająca 1: Sekwencje oligologiczne do generowania adaptera PE.

Nazwa podkładu Sekwencja indeks IndexRevC (do użycia do sekwencjonowania) Starter do odwrotnego indeksowania PCR 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATCGGTCTCTCCTCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CGTGAT (Organizacja Zdrowia) ATCACG (Biblioteka ATCACG) Starter do odwróconego indeksowania PCR 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCCGGTCTCTCTCCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT Protokół CTGATC (CTGATC) gatcag powiedział: Starter do odwróconego indeksowania PCR 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGGGTCTCTCTCTCCTGCTCTGCTGCTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT GGGGTT (Język gggtt) Biblioteka AACCCC Starter do odwróconego indeksowania PCR 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGGTCGGTCTCTCTCCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CTGGGT powiedział: Acccag Podkład do odwróconego indeksowania PCR 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGCTCGGTCTCTCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT AGCGCT powiedział: agcgct powiedział: Starter do odwrotnego indeksowania PCR 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTGCGGTCTCTCTCCTGCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT Protokół CTTTTG (Mechanizm Monitorowania Terroryzmu CAAAAG powiedział: Starter do odwrotnego indeksowania PCR 7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGGTCTCTCTCCTGCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT TGTTGG powiedział: CCAACA (Ccaaca) Podkład do odwrotnego indeksowania PCR 8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTAGCGGTCTCTCCTCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT Znacznik AGCTAG ctagct powiedział: Podkład do odwróconego indeksowania PCR 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCATCCGGTCTCTCCTCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT AGCATC (Organizacja AGCATC) Biblioteka GATGCT Podkład do odwrotnego indeksowania PCR 10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATTCGGTCTCTCCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CGATTA (język komputerowy) Taatcg powiedział: Starter do odwrotnego indeksowania PCR 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCACGGTCTCTCTCCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CATTCA (Kotka) tgaatg powiedział: Podkład do odwróconego indeksowania PCR 12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTCGGTCTCTCCTCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT GGAAKT agttcc powiedział: Starter do odwrotnego indeksowania PCR 13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGCGGTCTCTCCTGCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT ACATCG (Organizacja Współpracy Gospodarczej) cgatgt powiedział: Podkład do odwrotnego indeksowania PCR 14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTACGGTCTCTCCTGCTGCTGAACCGCTCTCTCTCTCTCTCT AAGCTA (Agencja Kontroli Środowiska) tagctt powiedział: Podkład do odwrotnego indeksowania PCR 15 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAAGTTCGGTCTCTCCTGCTGCTGCTGCTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT CAAGTT (Biblioteka Główna) Biblioteka AACTTG Starter do odwróconego indeksowania PCR 16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCGGTCTCTCTCCTGCTGCTGCTGCTGCTCTTCCGATCT GCCGGT (Zatoka Tysiąclecia) Certyfikat Podkład do odwrotnego indeksowania PCR 17 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCTCTCTCTCCTGCTGCTGCTGCTGCTCTCTCTCTCT CGGCCT powiedział: aggccg powiedział: Podkład do odwrotnego indeksowania PCR 18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGCGGTCTCTCCTGCTGCTGCTGCTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT TAGTTG (Biblioteka TAGTTG) Caacta (Grzybica) Podkład do odwrotnego indeksowania PCR 19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGTGGTCTCTCTCCTGCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT Biblioteka GCGTGG CCACGC powiedział: Podkład do odwróconego indeksowania PCR 20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTATAGCGGTCTCTCCTGCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT GTATAG (Znacznik GTATAG) ctatac powiedział: Podkład do odwrotnego indeksowania PCR 21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTTGCCGGTCTCTCTCTCCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT Konferencja CCTTGC (Międzynarodowa Organizacja Przemysł gcaagg powiedział: Starter do odwróconego indeksowania PCR 22 CAAGCAGAGACGGCATACGAGATGCTCTACGGTCTCTCTCCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT GCTGTA (Liga Mistrzowska) tacagc powiedział: Podkład do odwróconego indeksowania PCR 23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGGCACGGTCTCTCCTGCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT ATGGCA (Międzynarodowa Sieć Operacyjna tgccat powiedział: Podkład do odwróconego indeksowania PCR 24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATCGGTCTCTCCTCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT TGACAT (Dyrekcja Generalna) ATGTCA

Tabela uzupełniająca 2: Sekwencje starterów z odwróconym indeksowaniem PCR.

Podkłady Sekwencja ZNF333_genic_H3K9me3_F 5'-AGCCTTCAATCAGCCATCATCCCT-3' ZNF333_genic_H3K9me3_R 5'-TCTGGTATGGGTTCGCAGATGTGT-3' HOXA9-10_F 5'-ACTGAAGTAATGAAGGCAGTGTCGT-3' HOXA9-10_R 5'-GCAGCAYCAGAACTGGTCGGTG-3' GAPDH_genic_H3K36me3_F 5'-AGGCAACTAGGATGGTGTGG-3' GAPDH_genic_H3K36me3_R 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3' GAPDH-F 5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3' GAPDH-R 5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGA-3' Modyfikacja histonów Pozytywny cel Negatywny cel H3K4me3 powiedział: GAPDH HOXA9-10 powiedział: H3K4me1 powiedział: GAPDH_genic Zobacz materiał ZNF333 H3K27me3 powiedział: HOXA9-10 powiedział: Zobacz materiał ZNF333 H3K27ac powiedział: GAPDH Zobacz materiał ZNF333 H3K9me3 powiedział: Zobacz materiał ZNF333 HOXA9-10 powiedział: H3K36me3 powiedział: GAPDH_genic Zobacz materiał ZNF333

Tabela uzupełniająca 3: Lista starterów dla powszechnie używanych znaczników histonów (H3K4me3, H3K4me1, H3K27me3, H3K27ac, H3K9me3 i H3K36me3).

Plik uzupełniający 1: ndChIP-seq WorkSheet. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Pliki kodu uzupełniającego: qcQpcr_v1.2. Pakiet oprogramowania statystycznego R do analizy wzbogacania qPCR natywnych bibliotek ChIP-seq o niskim nakładzie wejściowym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę kombinatoryczny charakter modyfikacji chromatyny i pozycjonowania nukleosomów w regulacji transkrypcji, metoda, która umożliwia jednoczesne pomiary tych cech, prawdopodobnie dostarczy nowych informacji na temat regulacji epigenetycznej. Przedstawiony tutaj protokół ndChIP-seq jest natywnym protokołem ChIP-seq zoptymalizowanym pod kątem umożliwienia jednoczesnego badania modyfikacji histonów i gęstości nukleosomów w rzadkich komórkach pierwotnych 9,10. ndChIP-seq wykorzystuje enzymatyczne trawienie chromatyny, które w połączeniu z masowo równoległym sekwencjonowaniem parowanym końcem i modelem dystrybucji mieszaniny Gaussa pozwala na badanie modyfikacji histonów na poziomie pojedynczego nukleosomu i dekonwolucję profili epigenomicznych napędzanych heterogenicznością w populacji. Korzystając z tego protokołu, wcześniej informowaliśmy o unikalnym rozkładzie rozmiarów fragmentów wytrąconych immunologicznie, określonych przez granice odczytu sparowanych końców, związanych ze specyficznymi stanami chromatyny zdefiniowanymi przez ChromHMM10,24.

Jakość biblioteki ndChIP-seq zależy od wielu czynników, takich jak swoistość i czułość przeciwciał, optymalne warunki trawienia MNazy oraz jakość chromatyny. Specyficzność zastosowanych przeciwciał ma kluczowe znaczenie dla stworzenia udanej biblioteki ndChIP-seq. Idealne przeciwciało wykazuje wysokie powinowactwo do epitopu będącego przedmiotem zainteresowania przy niewielkiej reaktywności krzyżowej z innymi epitopami. Równie ważne jest, aby wybrać kulki magnetyczne o najwyższym powinowactwie do wybranego przeciwciała.

Trawienie MNazy jest krytyczną i wrażliwą na czas i stężenie reakcją w tym protokole. Dlatego przy przetwarzaniu wielu próbek ważne jest, aby każda reakcja była inkubowana przez równoważny czas (patrz krok 2.2). Jakość chromatyny jest kolejnym czynnikiem, który znacząco wpływa na wynik sekwencji ndChIP. Rozdrobniona chromatyna prowadzi do nieoptymalnego profilu trawienia MNazy i skutkuje bibliotekami o niskim stosunku sygnału do szumu. Próbki pierwotne o niskiej żywotności komórek lub zdegradowanej chromatynie, takie jak tkanka zatopiona w parafinie (FFPE) utrwalona w formalinie, nie są zalecane do tego protokołu.

Dodanie podczas ekstrakcji chromatyny zmniejsza niepożądaną (tj. losową) fragmentację chromatyny i zachowuje integralność ogonów histonowych. W związku z tym należy dodać do buforu do lizy i buforu immunoprecypitacyjnego tuż przed użyciem. Wybierając komórki za pomocą cytometrii przepływowej, należy wybrać żywe komórki i upewnić się, że komórki są sortowane przy niskim natężeniu przepływu, aby zwiększyć dokładność oszacowania liczby komórek i żywotności komórek. Unikaj sortowania komórek bezpośrednio do buforu do lizy. Bufor osłonki rozcieńcza bufor do lizy i zapobiega skutecznemu przenikaniu błony komórkowej do MNazy. W zależności od rodzaju komórek lub organizmu, może być wymagane miareczkowanie MNazy w celu uzyskania optymalnego trawienia.

ndChIP-seq na komórkach ssaków wymaga minimalnej głębokości sekwencjonowania 50 milionów sparowanych odczytów (25 milionów fragmentów) dla wąskich znaczników i 100 milionów sparowanych odczytów (50 milionów fragmentów) dla szerokich znaczników i danych wejściowych. Algorytm dystrybucji mieszanin Gaussa nie będzie działał optymalnie w bibliotekach, które zostały zsekwencjonowane do głębokości znacznie poniżej tego zalecenia. ndChIP-seq nie sklasyfikuje promotorów z niewielką separacją między ważoną wartością rozkładu dla długości fragmentów mono- i dinukleosomów na promotory zdominowane przez mono- lub dinukleosom. W związku z tym promotory te muszą zostać usunięte w późniejszej analizie. Można wygenerować kontrpróby biologiczne w celu zwiększenia pewności przewidywanych rozkładów i identyfikacji zmienności technicznej w trawieniu MNazy i budowie biblioteki.

W przeciwieństwie do poprzednich iteracji natywnych protokołów ChIP-seq, ndChIP-seq zapewnia środki do badania kombinatorycznego wpływu struktury chromatyny i modyfikacji histonów poprzez wykorzystanie wielkości fragmentu po immunoprecypitacji do integracji gęstości nukleosomów, określonej przez dostępność MNazy, z pomiarami modyfikacji histonów. Zastosowanie ndChIP-seq do pierwotnych komórek i tkanek dostarczy nowych informacji na temat integracyjnej natury regulacji epigenetycznej i umożliwi identyfikację sygnatur epigenetycznych wynikających z heterogeniczności w populacji.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.L. był wspierany przez Kanadyjskie Stypendium Absolwentów z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem. Praca ta była wspierana przez granty z Genome British Columbia i Canadian Institutes of Health Research (CIHR-120589) w ramach Canadian Epigenetics, Environment and Health Research Consortium Initiative oraz przez Terry Fox Research Institute Program Project Grant #TFF-122869 dla M.H. oraz Terry Fox Research Institute New Investigator Award (Grant # 1039) dla M.H.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1M Tris-HCl – pH 7,5Thermo Scientific15567-027
1M Tris-HCl – pH 8Thermo Scientific15568-025
0,5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
5 m NaClSigma 1001385276
Triton X-100Sigma1001412354
SDSThermo Scientific15525-017
Wodorowęglan soduFisherScientific S233-500
100% EtOHNA
V-dolna 96-dołkowa płytka (AB 1400)Thermo ScientificAB-1400-L
Pikuler Gilson P2MandelF144801
Pikulator Gilson P10MandelF144802
Gilson P20 PikulerMandelF123600
Pikuler Gilson P100MandelF123615
Pikularz Gilson P200MandelF123601
Pikularz Gilson P1000MandelF123603
Nukleaza mikrokokowa NEBM0247S
Thermo Mixer C (Mieszarka z blokiem grzewczym)Eppendorf5382000023
Multi 12-kanałowy Pippet P20Rainin17013803
Multi 12-kanałowy Pippet P200Rainin17013805
1,5 ml Rurka LoBindEppendorf22431021
0,5 mlEppendorf22431005
Plastikowa osłona płytyEdge Bio48461
Pokrywa PCRBio RadMSD-1001
Aluminiowa pokrywa płytyBio RadMSF-1001
Bufor elucyjny (bufor EB)Wirówka Qiagen19086
1M DTTSigma646563
Eppendorf 5810R Eppendorf22625004
Woda ultraczystaThermo Scientific10977-015
Białko G dynabeadsyThermo Scientific10001D
Białko A dynabeadsThermo Scientific10001D
Inhibitor proteazy KoktajlCalbiochem539134
Platforma obrotowaMandel1b109-12052010
Magnes płytkowyAlpaqua2523
Wypukły pasek 12-nasadkowyBio RadTCS1201
Bufor G2Qiagen1014636
ProteazaQiagen19155
Magnes rurkowy (DynaMag-2)Thermo Scientific12321D
Magnes rurkowy (DynaMag-2)LabCore730-006
Plastikowy zbiornik w kształcie litery VMandelS0100A
VortexMandelC1801
Mini FugeMettler ToledoXS2035
Waga analitycznaMandelLB109-12052010
Bufor reakcyjny do szybkiej ligacji, 5XNEBB6058S
Polimeraza DNA I, duży (Klenow) fragmentNEBM0210S
Fragment Klenowa (egzo 3'-5')NEBM0212S
Polimeraza DNA T4NEBM0203S
Kinaza polinukleotydowaT4 NEBM0201S Mieszanina roztworów
deoksynukleotydów, 10mMNEBN0447S
Roztwór dATP 10mMNEBN0440S
Szybka ligazaDNA T4NEBM0202T
Adenozyno-5'-trifosforan (ATP), 25mMNEBP0756S
Polimeraza DNAThermo ScientificF549L
NEBuffer 2NEBB7002S
Bufor soli HankaThermo Scientific14025076
Surowica bydlęca płodu Thermo ScientificA3160702
Bufor fosforanowy solny Thermo Scientific10010023
Sygnalizacja komórkowaH3K4me39751S
H3K4me1DiagenodeC15410037
H3K27me3DiagenodepAb-069-050
H3K36me3Abcamab9050
H3K9me3DiagenodeC15410056
SeraMag  superparamagnetyczny Koraliki
Deoksycholan sodu Sigma 1001437582

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simpson, R. T. Nucleosome Positioning: Occurrence, Mechanisms, and Functional Consequences. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 40, Issue C 143-184 (1991).
  2. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundmamental particle of the eukaryotic chromosome. Cell. 98, 285-294 (1999).
  3. Schones, D. E., et al. Dynamic regulation of nucleosome positioning in the human genome. Cell. 132 (5), 887-898 (2008).
  4. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
  5. Shiio, Y., Eisenman, R. N. Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. PNAS. 100 (23), 13225-13230 (2003).
  6. Li, L., Lorzadeh, A., Hirst, M. Regulatory variation: An emerging vantage point for cancer biology. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 6 (1), 37-59 (2014).
  7. Jiang, J., et al. Investigation of the acetylation mechanism by GCN5 histone acetyltransferase. PLoS ONE. 7 (5), (2012).
  8. Kouzarides, T. Histone methylation in transcriptional control. Curr. Opin. Genet. Dev. 12 (2), 198-209 (2002).
  9. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat. Commun. 6, 6033(2015).
  10. Lorzadeh, A., et al. Nucleosome Density ChIP-Seq Identifies Distinct Chromatin Modification Signatures Associated with MNase Accessibility. Cell Rep. 17 (8), 2112-2124 (2016).
  11. Noll, M., Kornberg, R. D. Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1. J. Mol. Biol. 109 (3), 393-404 (1977).
  12. Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome wide protein binding. eLife. 4, 09225(2015).
  13. Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. -P., Widom, J. A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution. Nature. , (2012).
  14. Cui, K., Zhao, K. Genome-wide approaches to determining nucleosome occupancy in metazoans using MNase-Seq. Methods Mol. Biol. 833, 413-419 (2012).
  15. Mieczkowski, J., et al. MNase titration reveals differences between nucleosome occupancy and chromatin accessibility. Nat. Commun. 7, 11485(2016).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). JOVE. (41), (2010).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
  18. Zheng, Y., Josefowicz, S. Z., Kas, A., Chu, T. T., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 445 (7130), 936-940 (2007).
  19. Krishnakumar, R., Gamble, M. J., Frizzell, K. M., Berrocal, J. G., Kininis, M., Kraus, W. L. Reciprocal Binding of PARP-1 and Histone H1 at Promoters Specifies Transcriptional Outcomes. Science. 319 (5864), 819-821 (2008).
  20. Mendenhall, E. M., et al. Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers. Nat. Biotechnol. 31 (12), 1133-1136 (2013).
  21. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  22. Reference Epigenome Standards - IHEC. , Available from: http://ihec-epigenomes.org/research/reference-epigenome-standards/ (2017).
  23. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  24. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat. Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  25. Fraley, C., Raftery, A. E. MCLUST: Software for Model-Based Cluster Analysis. J. Classif. 16 (2), 297-306 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Native Chromatin ImmunoprecipitationNucleosome Density AnalysisMNase Accessibility MeasurementHistone Modification AnalysisChromatin Immunoprecipitation SequencingLow Salt Wash BufferHigh Salt Wash BufferPlate Magnet IncubationProtein Digestion ProtocolLibrary Construction Method

Powiązane artykuły