Artykuł metodologiczny

Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów

24.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56085

⸱

12 grudnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Michael Smith Laboratories Centre for High-Throughput Biology, University of British Columbia, 2Canada's Michael Smith Genome Science Center, BC Cancer Agency

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy zmodyfikowaną metodologię sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny natywnej (ChIP-seq) do generowania zestawów danych sekwencji odpowiednich dla struktury analitycznej gęstości nukleosomów ChIP-seq integrującej dostępność nukleazy mikrokokowej (MNazy) z pomiarami modyfikacji histonów.

Streszczenie

Prezentujemy zmodyfikowany protokół eksperymentalny sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny (ChIP-seq) zgodny z metodologią analizy opartej na dystrybucji mieszaniny Gaussa (gęstość nukleosomów ChIP-seq; ndChIP-seq), która umożliwia generowanie połączonych pomiarów dostępności nukleazy mikrokokowej (MNazy) z modyfikacją histonów w całym genomie. Pozycja nukleosomów i gęstość lokalna oraz potranslacyjna modyfikacja ich podjednostek histonów działają zgodnie w celu regulacji lokalnych stanów transkrypcji. Kombinatoryczne pomiary dostępności nukleosomów z modyfikacją histonów generowane przez ndChIP-seq pozwalają na jednoczesne badanie tych cech. Metodologia ndChIP-seq ma zastosowanie do niewielkiej liczby komórek pierwotnych, niedostępnych dla protokołów ChIP-seq opartych na sieciowaniu. Podsumowując, ndChIP-seq umożliwia pomiar modyfikacji histonów w połączeniu z lokalną gęstością nukleosomów w celu uzyskania nowych informacji na temat wspólnych mechanizmów regulujących transkrypcję RNA w rzadkich pierwotnych populacjach komórek.

Wprowadzenie

Genom eukariotyczny jest upakowany w chromatynę za pomocą powtarzających się struktur nukleosomów, które składają się z dwóch kopii czterech białek histonowych (np. H2A, H2B, H3 i H4) ograniczonych przez 146 par zasad DNA1,2. Kompleksy przebudowujące chromatynę kontrolują położenie nukleosomów w granicach promotora genów i uczestniczą w regulacji ekspresji genów poprzez zmianę dostępności DNA dla czynników transkrypcyjnych i maszynerii polimerazy RNA3,4.

Końcowe ogony aminowe histonów w nukleosomie są poddawane różnym modyfikacjom kowalencyjnym, w tym acetylacji, metylacji, fosforylacji, ubikwitylacji, sumoilacji, formylacji i hydroksylacji określonych aminokwasów5,6,7,8. Pozycje i stopnie tych modyfikacji dyktują stan chromatyny, który wpływa na strukturę chromatyny i kontroluje dostęp kompleksów molekularnych, które umożliwiają aktywację transkrypcji7. Biorąc pod uwagę, że zarówno gęstość nukleosomów, jak i modyfikacja histonów odgrywają rolę w lokalnej kontroli transkrypcji genów, opracowaliśmy natywne podejście ChIP, które umożliwia jednoczesny pomiar gęstości nukleosomów i modyfikacji histonów9,10.

Native ChIP-seq wykorzystuje endonukleazę mikrokokowca (MNazę) do trawienia nienaruszonej chromatyny w jej natywnym stanie w jądrze11,12, właściwość, która została wykorzystana do mapowania pozycjonowania nukleosomów13,14,15. Gęstość nukleosomów ChIP-seq (ndChIP-seq) wykorzystuje właściwość preferencyjnego dostępu MNazy do otwartych regionów chromatyny w celu wygenerowania pomiarów, które łączą dostępność MNazy z modyfikacją histonów10. ndChIP-seq nadaje się do profilowania modyfikacji histonów w rzadkich komórkach pierwotnych, tkankach i hodowanych komórkach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, który umożliwia generowanie zestawów danych sekwencji odpowiednich dla wcześniej opisanej ramy analitycznej work10, która integruje rozmiar fragmentu po immunoprecypitacji, określony przez granice odczytu sparowanych końców, w celu jednoczesnego zbadania dostępności MNazy z pomiarami modyfikacji histonów. Wcześniej zastosowanie tego protokołu do 10 000 pierwotnych komórek CD34 + pochodzących z ludzkiej krwi pępowinowej i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych ujawniło unikalne relacje między strukturą chromatyny a modyfikacjami histonów w tych typach komórek10. Biorąc pod uwagę jego zdolność do jednoczesnego pomiaru dostępności nukleosomów i modyfikacji histonów, ndChIP-seq jest w stanie ujawnić cechy epigenomiczne w populacji komórek na poziomie pojedynczego nukleosomu i rozdzielić heterogeniczne sygnatury na ich elementy składowe. Przykładem eksploracji heterogenicznych populacji komórkowych przez ndChIP-seq jest badanie promotorów biwalentnych, w których obecne są zarówno H3K4me3, znak aktywny, jak i H3K27me3, znak represyjny10.

Protokół

UWAGA: Minimalne dane wejściowe dla tego protokołu to 10 000 komórek na pojedynczą reakcję immunoprecypitacji (IP). Wydrukuj dostarczony arkusz eksperymentu i wykorzystaj go jako wskazówkę do zaplanowania eksperymentu. Przyjmuje się, że inkubacja w temperaturze pokojowej odbywa się w temperaturze ~22 °C. Wszystkie receptury buforowe przedstawiono w tabeli 1. Wszystkie powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C i przechowywane na lodzie podczas zabiegu, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotowanie komórek

  1. Hodowane komórki
    1. Umyj komórki 1 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i dokładnie określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Jeśli jest więcej niż milion komórek, zwiększ objętość PBS.
    2. Na podstawie liczby komórek podamulować równoważnik 70 000-100 000 komórek do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i wirować w dół przy 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety powoli usunąć i wyrzucić supernatant (nie naruszając osadu komórkowego) i ponownie zawiesić osad w lodowatym buforze do lizy + 1x koktajl inhibitorów proteazy () do stężenia 1000 komórek/μl. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół 20-30 razy. Bardzo ważne jest, aby grudki komórek zostały zakłócone. Staraj się nie tworzyć bąbelków.
    3. Przejdź bezpośrednio do dnia 1 (sekcja 2) protokołu ndChIP-seq lub błyskawicznie zamroź osad komórkowy w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  2. Posortowane komórki
    1. Zbierz 70 000-100 000 posortowanych16 komórek do probówki o pojemności 1,5 ml z 350 μl buforowanego roztworu soli Hanka (HBSS) lub PBS + 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    2. Odwirować każdą porcję komórek w temperaturze 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety powoli usunąć supernatant (nie naruszając osadu komórkowego) i ponownie zawiesić w lodowatym buforze do lizy + 1x do końcowego stężenia 1 000 komórek/μl. Dobrze wymieszać w buforze do lizy, pipetując w górę i w dół 20-30 razy. Upewnij się, że grudki komórek są zakłócone. Staraj się nie tworzyć bąbelków.
    3. Przejdź bezpośrednio do dnia 1 (sekcja 2) protokołu ndChIP-seq lub błyskawicznie zamroź osad komórkowy w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.

2. DZIEŃ 1: ndChIP-seq

  1. Przygotowanie kompleksu przeciwciało-kulka
    1. Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 37 °C i wiadro na lód. Pracując na lodzie, przygotuj 1x bufor IP/1x i 1x bufor rozcieńczający przeciwciała (Ab) i trzymaj je na lodzie. Pobrać kulki magnetyczne białka A (lub G) (patrz Dyskusja w celu zapoznania się z kryteriami wyboru) z magazynu w temperaturze 4 °C i bardzo dobrze wymieszać przez delikatne wirowanie impulsowe. Trzymaj go na lodzie.
      UWAGA: Wirowanie impulsowe oznacza, że wirowanie jest zatrzymywane za każdym razem, gdy w rurze tworzy się pełny wir.
    2. Przenieś 24 μl kulek magnetycznych białka A (lub G) na reakcję IP do nowej probówki o pojemności 2 ml. Zapisz objętość kulek i trzymaj rurkę na lodzie. Na przykład dla 7 adresów IP użyj 24 μL x 7 = 168 μL.
    3. Umieść rurkę na magnesie rurki i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny, wskazując na oddzielenie kulek. Nie naruszając kulek, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i wyrzucić. Zdejmij rurkę z magnesu rurki i umieść ją na lodzie.
    4. Dodaj równą objętość (tj. początkową objętość kulek) lodowatego bufora IP + 1x mix. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Nie wirować.
    5. Umieść bufor IP + 1x koraliki + z powrotem na magnesie rurkowym i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny, wskazując na separację kulek. Nie naruszając kulek, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i wyrzucić. Powtórz zimny bufor IP + 1X pranie jeszcze dwa razy, co daje w sumie 3 prania.
    6. Po końcowym myciu ponownie zawiesić kulki w równej objętości (tj. początkowej objętości kulek) lodowatego bufora IP + 1x mieszanka. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Nie wirować. Trzymaj probówkę na lodzie.
    7. Na lodzie wlać 10 ml buforu IP + do 25 ml zbiornika w kształcie litery V. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 130 μl lodowatego buforu IP + 1x mieszaninę do indywidualnych dołków czystej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Napełnij jedną studzienkę na każdy adres IP. Oznacz tabliczkę jako "Ab-bead complex".
    8. Dodać 12 μl przemytych kulek magnetycznych białka A (lub G) do każdej studzienki zawierającej bufor IP + i mieszać pipetując w górę i w dół. Pozostałe umyte koraliki trzymaj na lodzie.
    9. Uzyskać zwalidowane przeciwciała z ich chłodni i w razie potrzeby rozmrozić na lodzie. Pracując na lodzie, rozcieńczyć przeciwciała 1x buforem rozcieńczającym Ab do stężeń pokazanych w tabeli 2.
    10. Do każdej studzienki płytki z kompleksem Ab-bead dodać 1 μl odpowiedniego, rozcieńczonego przeciwciała (Tabela 1). Nagraj studzienkę do klucza przeciwciała. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj każdy rząd, pipetując w górę i w dół 20 razy. Zmieniaj końcówki między rzędami. Bardzo dobrze uszczelnić płytkę złożoną z koralików Ab aluminiową pokrywą płytki i inkubować w temperaturze 4 °C na platformie obrotowej przez co najmniej 2 godziny
      UWAGA: Ta inkubacja może być kontynuowana, dopóki nie będzie gotowa do rozpoczęcia kroku 2.4.
  2. Liza komórek i trawienie chromatyny
    1. Pracując na lodzie, przygotuj 1x bufor do lizy + 1x i 1 ml buforu rozcieńczającego MNazę I (Tabela 3) i trzymaj je na lodzie.
    2. Odzyskać granulki komórek z ich przechowywania w temperaturze -80 °C (lub z lodu, jeśli są świeżo przygotowane). Rozmrozić każdą komórkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 s, a następnie przenieść do lodu.
    3. Do każdej komórki natychmiast dodaj lodowaty 1x bufor do lizy + 1x do końcowego stężenia 10 000 komórek/20 μL i wymieszaj 10 razy, pipetując w górę iw dół, bez tworzenia pęcherzyków. Na przykład dla 70 000 komórek końcowa objętość wynosi 140 μl.
    4. Pracując na lodzie, podwielokrotność 20 μl/basenik otrzymanych lizatów na płytkę 96-dołkową. Przykryj płytkę plastikową uszczelką i inkubuj na lodzie przez 20 minut. Oznacz płytkę "Trawienie MNazy" i zapisz studzienki do klucza szablonu. Aby zapewnić dokładny czas reakcji trawienia chromatyny, nie należy przystępować do trawienia z więcej niż 2 rzędami próbek na raz.
    5. Tuż przed zakończeniem 20-minutowej lizy rozcieńczyć enzym MNazy I buforem rozcieńczającym MNazę I do końcowego stężenia 20 U/μl i przechowywać na lodzie.
    6. Pracując z lodem, przygotować główną mieszankę mineralizacji MNazy I zgodnie z tabelą 4 i poddzielić 20 μl mieszanki na każdy rząd próbek plus 5 μl martwej objętości w jednym rzędzie 96-dołkowej płytki zbiornika i przechowywać ją na lodzie. W przypadku dwóch rzędów objętość powinna wynosić: (20 μL x 2) + 5 μL = 45 μL.
    7. Po zakończeniu inkubacji lizatów wyjmij płytkę do wytrawiania MNazy z lodu. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 20 μl głównej mieszanki mineralizacyjnej MNazy I do każdego rzędu próbek i wymieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować w temperaturze pokojowej dokładnie przez 5 minut.
    8. Po 5 minutach, aby zatrzymać reakcję, za pomocą wielokanałowej pipety dodać 6 μl 250 μM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do każdego rzędu próbek i kilkakrotnie wymieszać w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Po dodaniu EDTA zmień ustawienie pipety na 20 μl i wymieszaj 10 razy, pipetując w górę i w dół, aby zapewnić całkowite zatrzymanie reakcji trawienia. Zmieniaj końcówki między rzędami.
    9. Za pomocą pipety wielokanałowej do każdego rzędu próbek trawionych przez MNazę dodać 6 μl 10-krotnego buforu do lizy i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Przykryj plastikową uszczelką i inkubuj na lodzie przez 15 minut.
  3. Separacja wejść i wstępne rozliczanie
    1. Po 15 minutowej inkubacji, pracując na lodzie, zbierz wszystkie studzienki dla tego samego granulatu / matrycy komórkowej w jednej sterylnej, wstępnie schłodzonej na lodzie probówce o pojemności 1,5 ml (wstępnie oznaczonej identyfikatorem szablonu) i dokładnie, ale powoli wymieszaj za pomocą pipety, aby uniknąć pienienia się detergentu.
    2. Dla każdej osadki/matrycy komórkowej przenieść 8 μl strawionej chromatyny do nowej sterylnej probówki o pojemności 0,5 ml (wstępnie oznaczonej identyfikatorem matrycy) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Będzie to służyć jako kontrolka wejściowa.
    3. Rozprowadzić pozostałą objętość strawionej chromatyny w 48 μl podwielokrotnościach do nowej 96-dołkowej płytki. Osad komórkowy / szablon 1 trafia do studzienek A01-A06, granulat komórkowy / szablon 2 trafia do studzienek A07-A12 itd. Zapisz studnie do klucza szablonu. Oznacz tabliczkę "Wstępne czyszczenie".
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 120 μl 1x buforu IP + 1x i 12 μl przemytych kulek magnetycznych białka A (lub G) do każdego dołka płytki do wstępnego czyszczenia z kroku 2.3.3. Wymieszaj każdy rząd, pipetując w górę i w dół 10 razy. Zmieniaj końcówki między rzędami. Bardzo dobrze uszczelnić płytkę aluminiową osłoną płytki i inkubować na platformie obrotowej w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
  4. Reakcja immunoprecypitacji
    1. Przed rozpoczęciem tego etapu należy upewnić się, że płytka złożona z kulkami Ab (krok 2.1.10) i płytka do wstępnego czyszczenia (etap 2.3.4) były inkubowane przez co najmniej 2 godziny. Szybko obracaj obie płytki, wirując przez 10 s przy 200 x g.
    2. Umieść płytkę zespoloną Ab-bead (z kroku 2.1.10) na płycie magnetycznej i odczekaj 15 sekund, aż roztwór stanie się klarowny. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety, nie naruszając kulek. Zdejmij płytkę z płyty magnetycznej i trzymaj ją na lodzie.
    3. Umieścić płytkę reakcyjną przed czyszczeniem (z kroku 2.3.4) na płycie magnetycznej i odczekać 15 sekund, aż kulki się rozdzielą, a roztwór stanie się przezroczysty. Nie naruszając kulek, ostrożnie przenieść supernatant za pomocą pipety do odpowiednich dołków na płytce złożonej z kulkami Ab trzymanej na lodzie i delikatnie wymieszać 15 razy, pipetując w górę i w dół. Dobrze uszczelnić płytkę aluminiową pokrywą płytki i inkubować przez noc (12-18 godzin) w temperaturze 4 °C na obrotowej platformie. Ponownie oznacz tabliczkę jako "Reakcja IP".

3. DZIEŃ 2: ndCHIP-seq

  1. Przemywania i elucja
    1. Ustawić baterię grzewczą na 65 °C. Na lodzie przygotuj bufor do płukania o niskiej zawartości soli i bufor do płukania o wysokiej zawartości soli. Szybko obracać płytkę reakcyjną IP z kroku 2.4.3 przez 10 s przy 200 x g.
    2. Umieść płytkę reakcyjną IP na płycie magnetycznej i odczekaj 15 sekund, aż roztwór stanie się klarowny. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant. Zdejmij płytkę z płyty magnetycznej i umieść ją na lodzie.
    3. Do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP dodać 150 μl lodowatego buforu do przemywania o niskiej zawartości soli i powoli mieszać 10 razy w górę iw dół, aby całkowicie zawiesić kulki.
    4. Umieść płytkę reakcyjną IP z powrotem na płycie magnetycznej, poczekaj, aż kulki się rozdzielą, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, usuń i wyrzuć supernatant. Umieść płytkę z powrotem na lodzie i powtórz kroki 3.1.3 i 3.1.4, co daje w sumie 2 prania.
    5. Na lodzie, do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP, dodać 150 μl buforu do płukania o wysokiej zawartości soli i powoli mieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół, aby całkowicie zawiesić kulki.
    6. Umieść płytkę reakcyjną IP z powrotem na płycie magnetycznej, poczekaj, aż kulki się rozdzielą, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, usuń i wyrzuć supernatant. Umieść płytkę reakcyjną IP na lodzie i wstępnie schłodź nową 96-dołkową płytkę obok niej.
    7. Do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP dodać 150 μl buforu do przemywania o wysokiej zawartości soli i powoli mieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół, aby całkowicie zawiesić kulki. Po ponownym zawieszeniu przenieść każdy rząd próbek do odpowiedniego rzędu nowej, wstępnie schłodzonej, 96-dołkowej płytki. Oznacz tabliczkę "Reakcja IP". Wyrzuć starą płytę.
    8. Umieść nową płytkę reakcyjną IP na płycie magnetycznej i poczekaj, aż koraliki się rozdzielą. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant. Utrzymuj talerz w temperaturze pokojowej.
    9. Do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP dodać 30 μl buforu elucyjnego ChIP (EB) i powoli mieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół. Upewnij się, że nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków.
    10. Dobrze uszczelnić płytkę pokrywką z PCR i inkubować w mieszalniku grzewczym w temperaturze 65 °C przez 1,5 godziny z prędkością mieszania 1 350 obr./min.
    11. Po 1,5 h inkubacji odwirować płytkę reakcyjną IP przy 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Zmienić ustawienie mieszacza grzewczego na 50 °C.
    12. Po odwirowaniu umieść płytkę reakcyjną IP na płycie magnetycznej i poczekaj, aż roztwór się usunie. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie przenieść 30 μl supernatantu do nowej płytki 96-dołkowej. Używaj nowych wskazówek dla każdego rzędu. Oznacz płytkę "Reakcja IP" i przechowuj ją w temperaturze pokojowej.
  2. Trawienie białek
    1. Pobrać 30% roztwór kulki magnetycznej PEG/1 M NaCl17 (tabela składu bufora) z lodówki o temperaturze 4 °C i przechowywać go w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Krytyczne: Przed kontynuowaniem upewnij się, że roztwór kulki w pełni osiągnie temperaturę pokojową.
    2. Pobrać wejściowe próbki kontrolne z magazynu w temperaturze 4 °C (krok 2.3.2) i szybko odwirować. Zmierzyć objętość za pomocą pipety i dodać ultraczystą wodę do każdej kontrolki wejściowej, aby uzyskać końcową objętość 30 μl. Przenieść wejściowe próbki kontrolne do wstępnie wybranych studzienek wejściowych (pustych studzienek) na płytce reakcyjnej IP (krok 3.1.12). Nagraj studnię do klucza próbki.
    3. Na lodzie przygotować główną mieszankę do trawienia białek, jak pokazano w tabeli 5, i podzielić równą objętość na jeden rząd 96-dołkowej płytki zbiornika.
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP dodać 40 μl mieszanki Protein Digestion Master Mix i powoli mieszać 10 razy w górę iw dół. Dobrze zamknąć płytkę pokrywką z PCR, odwirowywać w temperaturze 200 x g przez 1 minutę i inkubować w mieszarce grzewczej w temperaturze 50 °C przez 30 minut przy prędkości 650 obr./min. Podczas inkubacji płytki przygotuj świeży 70% etanol (EtOH) i utrzymuj go w temperaturze pokojowej.
    5. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji obracać płytkę reakcyjną IP przy 200 x g przez 1 min, 4 °C. Przechowywać płytkę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Całkowita objętość powinna teraz wynosić ~70 μL/studzienkę.
  3. Czyszczenie ściegu za pomocą 30% roztworu kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl
    1. Podzielić 30% roztworu kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl na temperaturę pokojową do jednego rzędu czystej 96-dołkowej płytki zbiornika (75 μl na próbkę x # rzędów).
    2. Pracując w temperaturze pokojowej, używając pipety wielokanałowej, dodaj 70 μl (stosunek 1:1) 30% roztworu kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP i wymieszaj 10 razy, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umieść płytkę na płycie magnetycznej i inkubuj przez 5 minut, aby kulki się rozdzieliły.
    4. Za pomocą pipety, nie naruszając kulek, ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Zachowaj koraliki.
    5. Podczas gdy płytka reakcyjna IP nadal znajduje się na płycie magnetycznej, za pomocą pipety wielokanałowej, do każdego rzędu próbek dodać 150 μl 70% EtOH o temperaturze pokojowej i inkubować przez 30 s. Po 30 sekundach, za pomocą pipety wielokanałowej, usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok jeszcze raz, w sumie 2 prania.
    6. Po drugim płukaniu EtOH inkubuj "suchą" płytkę na płycie magnetycznej przez 3 minuty. Sprawdź wzrokowo płytkę, aby upewnić się, że cały EtOH został odparowany. Jeśli nie, inkubować płytkę przez 1 minutę. Nadmierne suszenie kulek skutkuje niższą wydajnością.
    7. Zdejmij płytkę z płyty magnetycznej i za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 35 μl EB (tabela materiałów). Dobrze wymieszaj, pipetując 10 razy w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty do elucji.
    8. Po inkubacji umieścić płytkę reakcyjną IP z powrotem na płycie magnetycznej i inkubować przez 2 minuty. Koraliki powinny się rozdzielić, a roztwór stanie się klarowny.
    9. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie przenieś supernatant do odpowiednich studzienek nowej 96-dołkowej płytki.
    10. Uszczelnij płytkę aluminiową pokrywą, oznacz etykietą "IPed + Input DNA" i przechowuj w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze -20 °C do długotrwałego (>48 h) przechowywania.

4. DZIEŃ 3: Budowa biblioteki

  1. Koniec naprawy i fosforylacji
    1. Danymi wejściowymi dla reakcji naprawy końcowej/fosforylacji jest płytka wejściowa IPed + z kroku 3.3.10. Po rozmrożeniu obracać płytkę o masie 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i trzymać ją na lodzie.
    2. Pobrać z zamrażarki o temperaturze -20 °C wszystkie odczynniki (z wyjątkiem enzymów) wymagane do reakcji naprawy/fosforylacji końcowej (tabela 6) i rozmrozić je w temperaturze pokojowej, a następnie natychmiast przenieść do lodu.
    3. Pracując na lodzie, postępuj zgodnie z Tabelą 6, aby ustawić główną mieszankę do naprawy końcowej/fosforylacji w sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Po dodaniu wszystkich składników nieenzymatycznych dobrze wymieszaj przez wirowanie impulsowe i umieść probówkę z powrotem na lodzie.
    4. Pobrać odpowiednie enzymy z chłodni i przetransportować na stół w chłodzonym stojaku do chłodzenia rurami. Wymieszaj każdy enzym, przesuwając probówkę, szybko odwiruj i umieść go z powrotem w schłodzonej rurce. Podczas pipetowania enzymu należy zasysać powoli, aby zapewnić dokładny transfer objętości. Po dodaniu umyj końcówkę w mieszance wzorcowej, pipetując w górę i w dół.
    5. Po dodaniu enzymów delikatnie przekręć pulsacyjnie mieszankę główną 5 razy, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wszystkich składników, a następnie szybko odwiruj i natychmiast umieść probówkę z powrotem na lodzie.
    6. Na lodzie podsycić odpowiednią objętość End Repair/Phosphorylation Master Mix do jednego rzędu nowej 96-dołkowej płytki zbiornika; objętość do podania: (15 μL x # rzędów) + 5 μL objętości martwej. Przykładowe obliczenie dla dwóch rzędów: (15 μL x 2) + 5 μL = 35 μL/studzienkę.
    7. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 15 μl End Repair/Phosphorylation Master Mix do każdego rzędu próbek i wymieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Uszczelnić płytkę plastikową pokrywą, wirować w temperaturze 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  2. Czyszczenie kulek po naprawie końcówki i fosforylacji
    1. Z lodówki o temperaturze 4 °C pobrać 20% roztwór kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl i 30% roztwór PEG/1 M NaCl i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut
      UWAGA: 30% roztwór PEG/1 M NaCl NIE zawiera kulek magnetycznych.
    2. Gdy oba roztwory osiągną temperaturę pokojową, dla każdej próbki przygotuj 80 μl mieszanki 1:2 30% roztworów kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl i 20% PEG/1 M NaCl. Przykład dla 24 próbek: 80 μL x 24 = 1,920 μL (640 μL 30% PEG/1 M NaCl i 1,288 μL 20% roztworów kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl).
    3. Roztwór kulki wymieszać w równej objętości do jednego rzędu 96-dołkowej płytki zbiornika i utrzymywać w temperaturze pokojowej. Podwielokrotność buforu EB (40 μl na próbkę x # rzędów) do jednego rzędu czystej 96-dołkowej płytki zbiornika. Przykład dla dwóch rzędów: 40 μL x 2 = 80 μL/studzienkę.
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 75 μl mieszanki kulek przygotowanej w kroku 4.2.2 do każdego rzędu próbek z kroku 4.1.7 i mieszać w górę i w dół 10 razy. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Kontynuuj procedurę czyszczenia ściegu zgodnie z opisem w krokach 3.3.3-3.3.10. Przykryj talerz plastikową uszczelką, szybko odkręć i umieść go na lodzie. Przejdź do kroku 4.3.
  3. Reakcja A-Tailing
    1. Pobrać z zamrażarki o temperaturze -20 °C wszystkie odczynniki (z wyjątkiem enzymów) wymagane w reakcji ogoniastej A (tabela 7), rozmrozić je w temperaturze pokojowej, a następnie natychmiast przenieść do lodu.
    2. Pracując na lodzie, postępuj zgodnie z Tabelą 7, aby ustawić A-Tailing Master Mix w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Postępuj zgodnie z ogólnymi instrukcjami konfiguracji naparu enzymatycznego, jak opisano w krokach 4.1.4-4.1.6.
    3. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 15 μl mieszanki głównej A-Tailing Master Mix do każdego rzędu próbek i wymieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Uszczelnić płytkę pokrywką do PCR, wirować w temperaturze 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i inkubować w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji obracać płytkę o masie 200 x g przez 1 minutę i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Czyszczenie ściegu po A-Tailing
    1. Wykonaj czynności opisane w kroku 4.2. Przykryj talerz plastikową uszczelką, oznacz "A-tail + BC", szybko odkręć i umieść na lodzie. Przejdź do kroku 4.5.
  5. Podwiązanie adaptera
    1. Pobrać z zamrażarki w temperaturze -20 °C wszystkie odczynniki (z wyjątkiem enzymów) wymagane w reakcji ligacji adaptera (tabela 8), rozmrozić je w temperaturze pokojowej, a następnie natychmiast przenieść do lodu.
    2. Pobrać roztwór podstawowy 10 μM z adaptera PE (tabela uzupełniająca 1) i rozcieńczyć do 0,5 μM za pomocą EB. Dobrze wymieszaj przez wirowanie pulsacyjne. Wymagana objętość to 3 μl x # próbek. Pracując na lodzie, podwielokrotnić adapter PE 0,5 μM o równej objętości do 12 dołków czystej 96-dołkowej płyty zbiornika. Trzymaj go na lodzie.
    3. Pracując na lodzie, postępuj zgodnie z Tabelą 8, aby ustawić Adapter Ligation Master Mix w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Postępuj zgodnie z ogólnymi instrukcjami konfiguracji naparu enzymatycznego, jak opisano w krokach 4.1.4-4.1.6. Przed użyciem upewnij się, że bufor 5X Quick Ligation jest całkowicie rozmrożony i bardzo dobrze wymieszany.
    4. Na lodzie rozdzielić odpowiednią objętość Adapter Ligation Master Mix do jednego rzędu nowej 96-dołkowej płytki zbiornika. Na przykład obliczenie dla dwóch rzędów: (23 μL x 2) + 5 μL = 51 μL/studzienkę. Trzymaj talerz na lodzie.
    5. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 2 μl adaptera 0,5 μM z parzystym końcem (PE) do każdego rzędu próbek z kroku 4.4.1 i wymieszać. Zmieniaj końcówki między rzędami.
    6. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 23 μl mieszanki głównej do ligacji za pomocą adaptera do każdego rzędu próbek i wymieszać 15 razy, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Uszczelnić płytkę metalową pokrywą, oznaczyć etykietą "Podwiązanie", wirować w temperaturze 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
  6. Dzień 4: Czyszczenie koralików #1 po podwiązaniu adaptera
    1. Z lodówki o temperaturze 4 °C pobrać 20% roztwór kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Podczas gdy roztwór się równoważy, przygotuj świeże 70% EtOH.
    2. Podwielokrotnić 20% roztwór kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl, 55 μl na próbkę, do jednego rzędu 96-dołkowej płytki zbiornika i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przykład dla dwóch rzędów: 55 μL x 2 = 110 μL/studzienkę.
    3. Podwielokrotność buforu EB, 50 μl na próbkę, do jednego rzędu czystej 96-dołkowej płytki zbiornika. Przykład dla dwóch rzędów: 50 μL x 2 = 100 μL/studzienkę.
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 48 μl roztworu kulek magnetycznych 20% PEG/1 M NaCl do każdego rzędu próbek na płytce ligacyjnej z kroku 4.5.6 i wymieszać w górę i w dół 10 razy. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Kontynuuj procedurę czyszczenia ściegu zgodnie z opisem w krokach 3.3.3-3.3.7.
    5. Zdejmij płytkę z płyty magnetycznej i za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 45 μl EB (tabela materiałów). Dobrze wymieszaj, pipetując 10 razy w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty do elucji.
    6. Po inkubacji umieścić płytkę reakcyjną IP z powrotem na płytce magnetycznej i inkubować przez 2 minuty. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie przenieść supernatant do odpowiednich studzienek nowej płytki 96-dołkowej. Oznacz tabliczkę "Podwiązanie + 1 BC".
    7. Do każdego dołka dodaj 5 μl 10x buforu o wysokiej wierności PCR i dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Przykryj talerz plastikową uszczelką, szybko odwiruj i utrzymuj w temperaturze pokojowej.
  7. Czyszczenie ściegu #2 po podwiązaniu adaptera
    1. Przeprowadzić czyszczenie kulek zgodnie z opisem w sekcji 4.6 z następującymi zmianami: dodać 60 μl 20% roztworu kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl do każdej aktywnej studzienki w płytce Ligation + 1 BC (krok 4.6.7) i wymyć z kulek za pomocą 35 μl buforu EB. Oznacz płytkę "Podwiązanie + 2 BC" i trzymaj ją na lodzie.
  8. Amplifikacja PCR
    1. Pobrać z zamrażarki w temperaturze -20 °C wszystkie odczynniki (z wyjątkiem enzymów) wymagane do przeprowadzenia reakcji PCR (tabela 9), rozmrozić je w temperaturze pokojowej, a następnie natychmiast umieścić na lodzie.
    2. Pracując na lodzie, postępuj zgodnie z Tabelą 9, aby ustawić PCR Master Mix w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Postępuj zgodnie z ogólnymi instrukcjami konfiguracji parzenia, jak opisano w krokach 4.1.4-4.1.5. Na lodzie podniec odpowiednią objętość PCR Master Mix do jednego rzędu nowej 96-dołkowej płytki zbiornika. Trzymaj go na lodzie. Zobacz krok 4.5.4, aby zapoznać się z przykładowymi obliczeniami.
    3. Pracując na lodzie, używając pipety wielokanałowej, dodaj 2 μl każdego unikalnego 12,5 μM startera do odwróconego indeksowania PCR (tabela uzupełniająca 2) do każdego dołka w płytce Ligation + 2 BC (krok 4.7.1) i powoli mieszaj w górę iw dół. Zmieniaj końcówki między rzędami. Trzymaj talerz na lodzie.
    4. Pracując z lodem, używając pipety wielokanałowej, dodać 23 μl głównej mieszanki PCR do każdego rzędu próbek z kroku 4.8.3 i wymieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół. Uszczelnić płytkę pokrywką do PCR, odwirować ją w temperaturze 200 x g przez 1 minutę i inkubować w termocyklerze (patrz Tabela 10 dla warunków cyklicznych PCR).
  9. Oczyszczanie kulek po amplifikacji PCR
    1. Po amplifikacji PCR obracać płytkę przy 200 x g przez 1 minutę, 4 °C. Przeprowadzić czyszczenie kulki zgodnie z opisem w sekcji 4.6 z następującymi zmianami: dodać 51 μl 20% roztworu kulek magnetycznych PEG/1 M NaCl do każdej reakcji PCR i wymyć z kulek za pomocą 25 μl buforu EB. Uszczelnij płytkę aluminiową osłoną i wiruj z prędkością 200 x g przez 1 min. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Aby zweryfikować skonstruowane biblioteki, należy przeprowadzić kwantyfikację DNA za pomocą testu opartego na fluorescencji, zwizualizować produkt końcowy za pomocą analizatora elektroforezy kapilarnej opartego na chipie (test o wysokiej czułości) i uruchomić ilościowy PCR wzbogacający (qPCR) (patrz Reprezentatywne wyniki, Walidacja jakości biblioteki ndChIP-seq przez qPCR).

Wyniki

Profile trawienia chromatyny
Optymalizacja trawienia MNazą jest niezbędna dla powodzenia tego protokołu. Kluczowe jest uzyskanie profilu trawienia zdominowanego przez wielkości fragmentów pojedynczych nukleosomów, przy jednoczesnym uniknięciu nadmiernego trawienia, aby umożliwić odzyskanie fragmentów nukleosomów wyższego rzędu. Idealny profil trawienia składa się z większości fragmentów pojedynczych nukleosomów oraz niewielkiej frakcji reprezentującej fragmenty mniejsze i większe od pojedynczych nukleosomów. Rysunek 1 przedstawia przykłady idealnego, nadmiernego oraz niewystarczającego profilu rozkładu wielkości. Należy zauważyć, że suboptymalne trawienie chromatyny będzie widoczne również w profilu biblioteki sekwencjonowania wygenerowanej z materiału IP (Rysunek 2).

Walidacja jakości biblioteki ndChIP-seq za pomocą qPCR
qPCR jest uznaną metodą oceny jakości ChIP18,19,20. Podczas przeprowadzania ndChIP-seq na 10 000 komórkach wydajność kwasów nukleinowych po IP będzie niższa niż 1 ng. Dlatego po przygotowaniu biblioteki niezbędne jest przeprowadzenie qPCR w celu oceny względnego wzbogacenia regionów docelowych względem tła. Aby uzyskać szacunek tła, generowane są biblioteki przygotowane z chromatyny trawionej MNazą (Input). Dla każdej biblioteki IP potrzebne są dwa zestawy starterów (lista starterów dla powszechnie stosowanych modyfikacji histonowych znajduje się w SuplemencieTabela 3). Jeden zestaw starterów powinien być specyficzny dla regionu genomowego, który jest konsekwentnie powiązany z badaną modyfikacją histonową (cel pozytywny), a drugi dla regionu, który nie jest znakowany badaną modyfikacją histonową (cel negatywny). Jakość biblioteki ChIP-seq zostanie oceniona jako krotność wzbogacenia (fold enrichment) w stosunku do biblioteki input. Krotność wzbogacenia można obliczyć za pomocą następującego równania, które zakłada wykładniczą amplifikację docelowego regionu genomowego: 2Ctinput- CtIP. Nasz autorski pakiet oprogramowania statystycznego R, qcQpcr_v1.2, jest odpowiedni do analizy wzbogacenia qPCR dla bibliotek native ChIP-seq z niskim wkładem materiału (Suplementarne Pliki Kodu). Rysunek 3 przedstawia wyniki qPCR dla udanych i nieudanych bibliotek ChIP-seq. Minimalna oczekiwana wartość krotności wzbogacenia dla wysokiej jakości bibliotek ndChIP-seq wynosi 16 dla wąskich znaczników, takich jak H3K4me3, oraz 7 dla znaczników szerokich, na przykład H3K27me3.

Modelowanie dostępności MNazy
Analiza obliczeniowa ChIP-seq jest złożona i unikalna dla każdego układu eksperymentalnego. Do oceny jakości bibliotek ChIP-seq można wykorzystać zestaw wytycznych opracowanych przez International Human Epigenomic Consortium (IHEC) oraz The Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE)21. Należy zwrócić uwagę, że głębokość sekwencjonowania bibliotek wpływa na detekcję i rozdzielczość wzbogaconych regionów20. Liczba wykrytych peaków rośnie i dąży do plateau wraz ze zwiększaniem głębokości odczytów. Zalecamy, aby biblioteki ndChIP-seq były sekwencjonowane zgodnie z rekomendacjami IHEC: 50 milionów odczytów parowanych (25 milionów fragmentów) dla marków wąskich (np. H3K4me3) oraz 100 milionów odczytów parowanych (50 milionów fragmentów) dla marków szerokich (np. H3K27me3) i prób kontrolnych (input)22. Takie głębokości sekwencjonowania zapewniają wystarczającą liczbę dopasowań sekwencji do detekcji najistotniejszych peaków przy użyciu powszechnie stosowanych programów do wywoływania peaków ChIP-seq, takich jak MACS2 i HOMER, bez osiągania stanu nasycenia23,24. Wysokiej jakości biblioteka ndChIP-seq ssaków charakteryzuje się współczynnikiem duplikatów PCR <10% i współczynnikiem dopasowania do genomu referencyjnego > 90% (wliczając odczyty zduplikowane). Pomyślnie przygotowane biblioteki ndChIP-seq będą zawierać silnie skorelowane replikaty, w których znacząca część (> 40%) dopasowanych odczytów znajduje się w obszarach wzbogaconych zidentyfikowanych przez MACS222, a analiza dopasowanych odczytów w przeglądarce genomu powinna ujawnić wizualnie wykrywalne wzbogacenia w porównaniu z biblioteką input (Rysunek 4). Dodatkowo ndChIP-seq może być wykorzystany do oceny gęstości nukleosomów poprzez zastosowanie algorytmu mieszaniny rozkładów Gaussa (w1 * n(x; μ1,σ1) + w2 * n(x; μ2,σ2) = 1) w regionach wzbogaconych zidentyfikowanych przez MACS2, aby zamodelować gęstość nukleosomów zdefiniowaną przez granice dostępne dla MNazy. W tym modelu w1 reprezentuje wagę rozkładu mononukleosomów, a w2 wagę rozkładu dinukleosomów. Gdy w1 jest większe od w2, dominuje fragmenty mononukleosomowe i na odwrót. Analiza ta wymaga, aby biblioteki były sekwencjonowane w trybie paired-end, tak aby można było określić rozmiary fragmentów. W celu zastosowania algorytmu mieszaniny rozkładów Gaussa w pierwszej kolejności identyfikuje się statystycznie istotne regiony wzbogacone. Sugerujemy wywoływanie peaków za pomocą MACS2, używając Input jako kontroli oraz domyślnych ustawień dla marków wąskich i wartości odcięcia q = 0,01 dla marków szerokich. Liczne pakiety statystyczne wykorzystujące algorytm mieszaniny rozkładów Gaussa są dostępne w powszechnie używanym oprogramowaniu statystycznym. Wykorzystując średnią wielkość fragmentu, określoną przez granice odczytów parowanych próbek IP, rozkłady w zidentyfikowanych przez MACS2 wzbogaconych promotorach oraz algorytm mieszaniny rozkładów Gaussa, można obliczyć rozkład ważony dla każdego promotora przy użyciu pakietu statystycznego R Mclust w wersji 3.025. W tej aplikacji zalecamy odrzucenie promotorów zawierających mniej niż 30 dopasowanych fragmentów, ponieważ poniżej tego progu otrzymane szacunki wag stają się niewiarygodne. Wysokiej jakości biblioteka ndChIP-seq generuje mieszaninę rozkładów Gaussa składającą się z dwóch głównych komponentów, których wartości średnie odpowiadają długościom fragmentów mononukleosomowych i dinukleosomowych.

Analiza fragmentów DNA; wyniki elektroforezy pokazujące intensywność pików; rozdział w żelu według wielkości.
Rycina 1: Ocena trawienia MNazą przed generowaniem biblioteki. Profile z analizatora elektroforezy kapilarnej opartego na chipie dla chromatyny trawionej optymalnie (A), niedostatecznie (B) oraz nadmiernie (C) przez MNazę. Powtórzenia biologiczne przedstawiono jako ślady niebieskie, czerwone i zielone. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Elektroforeogramy analizy fragmentów DNA, wykres, pary zasad, jednostki fluorescencji, profilowanie genetyczne.
Rysunek 2: Ocena trawienia MNazą po przygotowaniu biblioteki. (A) Profile po konstrukcji biblioteki dla optymalnie strawionego wejściowego materiału kontrolnego (input) (replikaty biologiczne; czerwony, zielony, czarny) oraz dla próbek IP (replikaty biologiczne; cyjanowy, fioletowy, niebieski) oraz (B) bibliotek z suboptymalnie strawionego materiału kontrolnego (input) (replikaty biologiczne; czerwony, zielony, niebieski) oraz próbek IP (replikaty biologiczne; cyjanowy, fioletowy, pomarańczowy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy przedstawiający krotność wzbogacenia (2^ΔCt) dla celów pozytywnych/negatywnych w bibliotekach nieudanych/udanych.
Rysunek 3: Ilościowa PCR po konstrukcji biblioteki może być wykorzystana do oceny jakości bibliotek ndChIP-seq. Krotność wzbogacenia bibliotek IP H3K4me3 w stosunku do bibliotek input oblicza się jako 2(Ct input - Ct IP) dla celów pozytywnych i negatywnych przy użyciu qcQpcr_v1.2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Równowaga statyczna w ChIP-seq; wykresy, analiza gęstości odczytów, porównanie ChIP-seq ze sprzęganiem i ndChIP-seq.
Rysunek 4: Reprezentatywna biblioteka ndChIP-seq przygotowana z 10 000 pierwotnych komórek krwi pępowinowej CD34+. Korelacja Pearsona sygnału H3K4me3 (liczba odczytów na milion zmapowanych odczytów) obliczona w promotorach (TSS+/-2Kb) pomiędzy 3 powtórzeniami biologicznymi: (A) powtórzenie 1 i 2, (B) powtórzenie 1 i 3, (C) powtórzenie 2 i 3. (D) Widok w przeglądarce UCSC dla klastra genów HOXA z ChIP-seq ze sprzęganiem generowanego z 1 miliona komórek na IP, udanego ndChIP-seq z 10 000 komórek na IP oraz nieudanego ndChIP-seq z 10 000 komórek na IP. (kolor czerwony: H3K27me3, zielony: H3K4me3 i czarny: Input). (E) Frakcja zmapowanych odczytów w regionach wzbogaconych H3K4me3 (czarne) i H3K27me3 (szare) zidentyfikowanych przez MACS2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Skład buforu 
A.1. Bufor do immunoprecypitacji (IP)
 20 mM Tris-HCl pH 7,5
 2 mM EDTA
 150 mM NaCl
 0,1% Triton X-100
 0,1% deoksycholan
10 mM maślan sodu
A.2. Bufor do płukania z niską zawartością soli
 20 mM Tris-HCl pH 8,0
 2 mM EDTA
 150 mM NaCl
 1% Triton X-100
 0,1% SDS
A.3. Bufor do płukania z wysokim stężeniem soli
 20 mM Tris-HCl pH 8,0
 2 mM EDTA
 500 mM NaCl
 1% Triton X-100
 0,1% SDS
A.4. Bufor do elucji ChIP
 100 mM NaHCO33
 1% SDS
A.5. Bufor lizujący 1x – 1 ml
0,1% Triton
0,1% deoksycholan
10 mM maślan sodu
A.6. Bufor do rozcieńczania przeciwciał
0,05% (m/v) azotek
0,05% szerokospektrowy środek przeciwdrobnoustrojowy (np. ProClin 300)
w PBS
A.7. Roztwór kulek magnetycznych 30% PEG/1M NaCl (referencyjny16)
30% PEG
1 M NaCl
10 mM Tris-HCl pH 7,5
1 mM EDTA
1 ml wypłukanych kuleczek superparamagnetycznych
A.8. Roztwór kulek magnetycznych 20% PEG/1M NaCl (referencyjny16)
30% PEG
1 M NaCl
10 mM Tris-HCl pH 7,5
1 mM EDTA
1 ml wypłukanych kulek superparamagnetycznych

Tabela 1: skład buforu do ndChIP-seq.

Modyfikacja histonówStężenie (µg/µL)
H3K4me30.125
H3K4me10.25
H3K27me30.125
H3K9me30.125
H3K36me30.125
H3K27ac0.125

Tabela 2: Ilość przeciwciał wymagana do ndChIP-seq.

ReganetObjętość (µL)
Woda ultraczysta478
1 M Tris-HCl pH 7,510
0,5 M EDTA10
5 M NaCl2
Glicerol500
Objętość całkowita1,000

Tabela 3: Skład buforu do rozcieńczania MNazy.

OdczynnikObjętość (µL)
Woda ultrapure13
20 mM DTT1
10x Bufor MNase4
20 U/µl Mnase2
Objętość całkowita20

Tabela 4: Skład mieszaniny Master Mix dla MNazy.

OdczynnikObjętość (µL)
Bufor elucyjny30
Bufor G28
Proteaza2
Objętość całkowita40

Tabela 5: Skład mieszaniny głównej (Master Mix) do oczyszczania DNA.

OdczynnikObjętość (µL)
Woda ultraczysta3.3
10x bufor do restrykcyjnych endonukleaz (np. NEBuffer)5
25 mM ATP2
10 mM dNTP2
T4 polinukleotydowa kinaza (10 U/µl)1
polimeraza DNA T4 (3 U/µl)1.5
polimeraza DNA I, duży (Klenowa) fragment (5 U/µl)0.2
Objętość całkowita15

Tabela 6: Skład mieszaniny Master Mix do naprawy końców.

OdczynnikObjętość (µL)
Woda ultra czysta8
10x Bufor do endonukleaz restrykcyjnych (np. NEBuffer)5
10 mM dATP1
Klenow (3'-5' exo-)1
Objętość całkowita15

Tabela 7: Skład mieszaniny głównej (Master Mix) do A-tailingu.

OdczynnikObjętość (µL)
Woda ultrapure4.3
Bufor do szybkiej ligacji 5x12
ligaza DNA T4 (2000 U/µl)6.7
Objętość całkowita23

Tabela 8: Skład mieszaniny Master Mix do ligacji adapterów.

OdczynnikObjętość (µL)
Woda ultrazczysta7
Startery do PCR 25 uM 1.02
bufor HF 5x12
DMSO1.5
Polimeraza DNA0.5
Objętość całkowita23

Tabela 9: Skład mieszaniny PCR Master Mix.

Temperatura (°C)Czas trwania (s)Liczba cykli
98601
9830
651510
7215
723001
4podtrzymajpodtrzymaj

Tabela 10: Metoda przebiegu PCR.

OligoSekwencjaModyfikacja
PE_adapter 15’- /5Phos/GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG -3’Modyfikacja 5’: Fosforylacja
PE_adapter 25’ - ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC*T - 3’Modyfikacja 3’: *T to wiązanie fosforotionianowe

Tabela uzupełniająca 1: Sekwencje oligonukleotydów do generowania adaptera PE.

Nazwa starteraSekwencjaIndeksIndexRevC (do sekwencjonowania)
Odwrócony starter indeksujący PCR 1CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCGTGATatcacg
Odwrócony starter indeksujący PCR 2CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCTGATCgatcag
Odwrócony starter indeksujący PCR 3CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGGGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGGGGTTaacccc
Odwrócony starter indeksujący PCR 4CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCTGGGTacccag
Odwrócony starter indeksujący PCR 5CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAGCGCTagcgct
Odwrócony starter indeksujący PCR 6CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCTTTTGcaaaag
Odwrócony starter indeksujący PCR 7CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTTGTTGGccaaca
Odwrócony starter indeksujący PCR 8CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAGCTAGctagct
Odwrócony starter indeksujący PCR 9CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAGCATCgatgct
Odwrócony starter indeksujący PCR 10CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCGATTAtaatcg
Odwrócony starter indeksujący PCR 11CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATTCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCATTCAtgaatg
Odwrócony starter indeksujący PCR 12CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGGAACTagttcc
Odwrócony starter indeksujący PCR 13CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTACATCGcgatgt
Odwrócony starter indeksujący PCR 14CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAAGCTAtagctt
Odwrócony starter indeksujący PCR 15CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAAGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCAAGTTaacttg
Odwrócony starter indeksujący PCR 16CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGCCGGTaccggc
Odwrócony starter indeksujący PCR 17CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGCCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCGGCCTaggccg
Odwrócony starter indeksujący PCR 18CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTTAGTTGcaacta
Odwrócony starter indeksujący PCR 19CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGCGTGGccacgc
Odwrócony starter indeksujący PCR 20CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTATAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGTATAGctatac
Odwrócony starter indeksujący PCR 21CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTTGCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCCTTGCgcaagg
Odwrócony starter indeksujący PCR 22CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTGTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGCTGTAtacagc
Odwrócony starter indeksujący PCR 23CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGGCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTATGGCAtgccat
Odwrócony starter indeksujący PCR 24CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTTGACATatgtca

Tabela uzupełniająca 2: Sekwencje odwróconych starterów indeksujących do PCR.

StarterySekwencja
ZNF333_geniczny_H3K9me3_F5'-AGCCTTCAATCAGCCATCATCCCT-3'
ZNF333_geniczne_H3K9me3_R5'-TCTGGTATGGGTTCGCAGATGTGT-3'
HOXA9-10_F5'-ACTGAAGTAATGAAGGCAGTGTCGT-3'
HOXA9-10_R5'-GCAGCAYCAGAACTGGTCGGTG-3'
GAPDH_genowy_H3K36me3_F5'-AGGCAACTAGGATGGTGTGG-3'
GAPDH_geniczny_H3K36me3_R5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'
GAPDH-F5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'
GAPDH-R5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'
Modyfikacje histonówPozytywna kontrola celuCel negatywny
H3K4me3GAPDHHOXA9-10
H3K4me1GAPDH_genicznyZNF333
H3K27me3HOXA9-10ZNF333
H3K27acGAPDHZNF333
H3K9me3ZNF333HOXA9-10
H3K36me3GAPDH_genicznyZNF333

Tabela uzupełniająca 3: Lista starterów dla powszechnie stosowanych modyfikacji histonów (H3K4me3, H3K4me1, H3K27me3, H3K27ac, H3K9me3 oraz H3K36me3).

Plik uzupełniający 1: Arkusz roboczy ndChIP-seq. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniające pliki kodu: qcQpcr_v1.2. Pakiet oprogramowania statystycznego R do analizy wzbogacenia qPCR bibliotek natywnego ChIP-seq o niskim wkładzie materiału wyjściowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Biorąc pod uwagę kombinatoryczny charakter modyfikacji chromatyny i pozycjonowania nukleosomów w regulacji transkrypcji, metoda, która umożliwia jednoczesne pomiary tych cech, prawdopodobnie dostarczy nowych informacji na temat regulacji epigenetycznej. Przedstawiony tutaj protokół ndChIP-seq jest natywnym protokołem ChIP-seq zoptymalizowanym pod kątem umożliwienia jednoczesnego badania modyfikacji histonów i gęstości nukleosomów w rzadkich komórkach pierwotnych 9,10. ndChIP-seq wykorzystuje enzymatyczne trawienie chromatyny, które w połączeniu z masowo równoległym sekwencjonowaniem parowanym końcem i modelem dystrybucji mieszaniny Gaussa pozwala na badanie modyfikacji histonów na poziomie pojedynczego nukleosomu i dekonwolucję profili epigenomicznych napędzanych heterogenicznością w populacji. Korzystając z tego protokołu, wcześniej informowaliśmy o unikalnym rozkładzie rozmiarów fragmentów wytrąconych immunologicznie, określonych przez granice odczytu sparowanych końców, związanych ze specyficznymi stanami chromatyny zdefiniowanymi przez ChromHMM10,24.

Jakość biblioteki ndChIP-seq zależy od wielu czynników, takich jak swoistość i czułość przeciwciał, optymalne warunki trawienia MNazy oraz jakość chromatyny. Specyficzność zastosowanych przeciwciał ma kluczowe znaczenie dla stworzenia udanej biblioteki ndChIP-seq. Idealne przeciwciało wykazuje wysokie powinowactwo do epitopu będącego przedmiotem zainteresowania przy niewielkiej reaktywności krzyżowej z innymi epitopami. Równie ważne jest, aby wybrać kulki magnetyczne o najwyższym powinowactwie do wybranego przeciwciała.

Trawienie MNazy jest krytyczną i wrażliwą na czas i stężenie reakcją w tym protokole. Dlatego przy przetwarzaniu wielu próbek ważne jest, aby każda reakcja była inkubowana przez równoważny czas (patrz krok 2.2). Jakość chromatyny jest kolejnym czynnikiem, który znacząco wpływa na wynik sekwencji ndChIP. Rozdrobniona chromatyna prowadzi do nieoptymalnego profilu trawienia MNazy i skutkuje bibliotekami o niskim stosunku sygnału do szumu. Próbki pierwotne o niskiej żywotności komórek lub zdegradowanej chromatynie, takie jak tkanka zatopiona w parafinie (FFPE) utrwalona w formalinie, nie są zalecane do tego protokołu.

Dodanie podczas ekstrakcji chromatyny zmniejsza niepożądaną (tj. losową) fragmentację chromatyny i zachowuje integralność ogonów histonowych. W związku z tym należy dodać do buforu do lizy i buforu immunoprecypitacyjnego tuż przed użyciem. Wybierając komórki za pomocą cytometrii przepływowej, należy wybrać żywe komórki i upewnić się, że komórki są sortowane przy niskim natężeniu przepływu, aby zwiększyć dokładność oszacowania liczby komórek i żywotności komórek. Unikaj sortowania komórek bezpośrednio do buforu do lizy. Bufor osłonki rozcieńcza bufor do lizy i zapobiega skutecznemu przenikaniu błony komórkowej do MNazy. W zależności od rodzaju komórek lub organizmu, może być wymagane miareczkowanie MNazy w celu uzyskania optymalnego trawienia.

ndChIP-seq na komórkach ssaków wymaga minimalnej głębokości sekwencjonowania 50 milionów sparowanych odczytów (25 milionów fragmentów) dla wąskich znaczników i 100 milionów sparowanych odczytów (50 milionów fragmentów) dla szerokich znaczników i danych wejściowych. Algorytm dystrybucji mieszanin Gaussa nie będzie działał optymalnie w bibliotekach, które zostały zsekwencjonowane do głębokości znacznie poniżej tego zalecenia. ndChIP-seq nie sklasyfikuje promotorów z niewielką separacją między ważoną wartością rozkładu dla długości fragmentów mono- i dinukleosomów na promotory zdominowane przez mono- lub dinukleosom. W związku z tym promotory te muszą zostać usunięte w późniejszej analizie. Można wygenerować kontrpróby biologiczne w celu zwiększenia pewności przewidywanych rozkładów i identyfikacji zmienności technicznej w trawieniu MNazy i budowie biblioteki.

W przeciwieństwie do poprzednich iteracji natywnych protokołów ChIP-seq, ndChIP-seq zapewnia środki do badania kombinatorycznego wpływu struktury chromatyny i modyfikacji histonów poprzez wykorzystanie wielkości fragmentu po immunoprecypitacji do integracji gęstości nukleosomów, określonej przez dostępność MNazy, z pomiarami modyfikacji histonów. Zastosowanie ndChIP-seq do pierwotnych komórek i tkanek dostarczy nowych informacji na temat integracyjnej natury regulacji epigenetycznej i umożliwi identyfikację sygnatur epigenetycznych wynikających z heterogeniczności w populacji.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

A.L. był wspierany przez Kanadyjskie Stypendium Absolwentów z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem. Praca ta była wspierana przez granty z Genome British Columbia i Canadian Institutes of Health Research (CIHR-120589) w ramach Canadian Epigenetics, Environment and Health Research Consortium Initiative oraz przez Terry Fox Research Institute Program Project Grant #TFF-122869 dla M.H. oraz Terry Fox Research Institute New Investigator Award (Grant # 1039) dla M.H.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1M Tris-HCl – pH 7,5Thermo Scientific15567-027
1M Tris-HCl – pH 8Thermo Scientific15568-025
0,5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
5 m NaClSigma 1001385276
Triton X-100Sigma1001412354
SDSThermo Scientific15525-017
Wodorowęglan soduFisherScientific S233-500
100% EtOHNA
V-dolna 96-dołkowa płytka (AB 1400)Thermo ScientificAB-1400-L
Pikuler Gilson P2MandelF144801
Pikulator Gilson P10MandelF144802
Gilson P20 PikulerMandelF123600
Pikuler Gilson P100MandelF123615
Pikularz Gilson P200MandelF123601
Pikularz Gilson P1000MandelF123603
Nukleaza mikrokokowa NEBM0247S
Thermo Mixer C (Mieszarka z blokiem grzewczym)Eppendorf5382000023
Multi 12-kanałowy Pippet P20Rainin17013803
Multi 12-kanałowy Pippet P200Rainin17013805
1,5 ml Rurka LoBindEppendorf22431021
0,5 mlEppendorf22431005
Plastikowa osłona płytyEdge Bio48461
Pokrywa PCRBio RadMSD-1001
Aluminiowa pokrywa płytyBio RadMSF-1001
Bufor elucyjny (bufor EB)Wirówka Qiagen19086
1M DTTSigma646563
Eppendorf 5810R Eppendorf22625004
Woda ultraczystaThermo Scientific10977-015
Białko G dynabeadsyThermo Scientific10001D
Białko A dynabeadsThermo Scientific10001D
Inhibitor proteazy KoktajlCalbiochem539134
Platforma obrotowaMandel1b109-12052010
Magnes płytkowyAlpaqua2523
Wypukły pasek 12-nasadkowyBio RadTCS1201
Bufor G2Qiagen1014636
ProteazaQiagen19155
Magnes rurkowy (DynaMag-2)Thermo Scientific12321D
Magnes rurkowy (DynaMag-2)LabCore730-006
Plastikowy zbiornik w kształcie litery VMandelS0100A
VortexMandelC1801
Mini FugeMettler ToledoXS2035
Waga analitycznaMandelLB109-12052010
Bufor reakcyjny do szybkiej ligacji, 5XNEBB6058S
Polimeraza DNA I, duży (Klenow) fragmentNEBM0210S
Fragment Klenowa (egzo 3'-5')NEBM0212S
Polimeraza DNA T4NEBM0203S
Kinaza polinukleotydowaT4 NEBM0201S Mieszanina roztworów
deoksynukleotydów, 10mMNEBN0447S
Roztwór dATP 10mMNEBN0440S
Szybka ligazaDNA T4NEBM0202T
Adenozyno-5'-trifosforan (ATP), 25mMNEBP0756S
Polimeraza DNAThermo ScientificF549L
NEBuffer 2NEBB7002S
Bufor soli HankaThermo Scientific14025076
Surowica bydlęca płodu Thermo ScientificA3160702
Bufor fosforanowy solny Thermo Scientific10010023
Sygnalizacja komórkowaH3K4me39751S
H3K4me1DiagenodeC15410037
H3K27me3DiagenodepAb-069-050
H3K36me3Abcamab9050
H3K9me3DiagenodeC15410056
SeraMag  superparamagnetyczny Koraliki
Deoksycholan sodu Sigma 1001437582

Bibliografia

  1. Simpson, R. T. Nucleosome Positioning: Occurrence, Mechanisms, and Functional Consequences. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 40, Issue C 143-184 (1991).
  2. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundmamental particle of the eukaryotic chromosome. Cell. 98, 285-294 (1999).
  3. Schones, D. E., et al. Dynamic regulation of nucleosome positioning in the human genome. Cell. 132 (5), 887-898 (2008).
  4. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
  5. Shiio, Y., Eisenman, R. N. Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. PNAS. 100 (23), 13225-13230 (2003).
  6. Li, L., Lorzadeh, A., Hirst, M. Regulatory variation: An emerging vantage point for cancer biology. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 6 (1), 37-59 (2014).
  7. Jiang, J., et al. Investigation of the acetylation mechanism by GCN5 histone acetyltransferase. PLoS ONE. 7 (5), (2012).
  8. Kouzarides, T. Histone methylation in transcriptional control. Curr. Opin. Genet. Dev. 12 (2), 198-209 (2002).
  9. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat. Commun. 6, 6033(2015).
  10. Lorzadeh, A., et al. Nucleosome Density ChIP-Seq Identifies Distinct Chromatin Modification Signatures Associated with MNase Accessibility. Cell Rep. 17 (8), 2112-2124 (2016).
  11. Noll, M., Kornberg, R. D. Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1. J. Mol. Biol. 109 (3), 393-404 (1977).
  12. Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome wide protein binding. eLife. 4, 09225(2015).
  13. Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. -P., Widom, J. A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution. Nature. , (2012).
  14. Cui, K., Zhao, K. Genome-wide approaches to determining nucleosome occupancy in metazoans using MNase-Seq. Methods Mol. Biol. 833, 413-419 (2012).
  15. Mieczkowski, J., et al. MNase titration reveals differences between nucleosome occupancy and chromatin accessibility. Nat. Commun. 7, 11485(2016).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). JOVE. (41), (2010).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
  18. Zheng, Y., Josefowicz, S. Z., Kas, A., Chu, T. T., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 445 (7130), 936-940 (2007).
  19. Krishnakumar, R., Gamble, M. J., Frizzell, K. M., Berrocal, J. G., Kininis, M., Kraus, W. L. Reciprocal Binding of PARP-1 and Histone H1 at Promoters Specifies Transcriptional Outcomes. Science. 319 (5864), 819-821 (2008).
  20. Mendenhall, E. M., et al. Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers. Nat. Biotechnol. 31 (12), 1133-1136 (2013).
  21. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  22. Reference Epigenome Standards - IHEC. , Available from: http://ihec-epigenomes.org/research/reference-epigenome-standards/ (2017).
  23. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  24. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat. Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  25. Fraley, C., Raftery, A. E. MCLUST: Software for Model-Based Cluster Analysis. J. Classif. 16 (2), 297-306 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar dostępności MNaseanaliza modyfikacji histonowychbufor do płukania niskosolnegobufor do płukania wysokosolnegoinkubacja z magnesem na płytceprotokół trawienia białekmetoda konstrukcji biblioteki
Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.