Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56093

⸱

21 września 2017

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Neuropharmacology and Genetics Laboratory, Lundbeck Foundation Center for Biomembranes in Nanomedicine, Department of Neuroscience and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Laboratory of Neuropsychiatry, Psychiatric Center Copenhagen and Department of Neuroscience and Pharmacology, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

Wychwyt synaptosomalnej dopaminy i wysokosprawna chromatografia cieczowa stanowią eksperymentalne narzędzia do badania homeostazy dopaminy u myszy, oceniając odpowiednio funkcję transportera dopaminy i poziom dopaminy w tkance prążkowia. W tym miejscu przedstawiamy protokoły pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz oceny funkcjonalności transportera dopaminy.

Streszczenie

Dopamina (DA) jest modulującym neuroprzekaźnikiem kontrolującym aktywność motoryczną, procesy nagradzania i funkcje poznawcze. Upośledzenie neuroprzekaźnictwa dopaminergicznego (DAergic) jest silnie związane z kilkoma chorobami związanymi z ośrodkowym układem nerwowym, takimi jak choroba Parkinsona, zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi i uzależnienie od narkotyków1,2,3,4. Nakreślenie mechanizmów chorobowych związanych z brakiem równowagi DA jest krytycznie zależne od modeli zwierzęcych w naśladowaniu aspektów chorób, a zatem protokoły oceniające określone części homeostazy DA są ważne dla zapewnienia nowych spostrzeżeń i możliwych celów terapeutycznych dla tych chorób.

Tutaj prezentujemy dwa użyteczne protokoły eksperymentalne, które w połączeniu zapewniają funkcjonalny odczyt systemu DAergic u myszy. Parametry biochemiczne i funkcjonalne homeostazy DA uzyskuje się poprzez ocenę poziomu DA i funkcjonalności transportera dopaminy (DAT)5. Podczas badania systemu DA niezbędna jest możliwość wiarygodnego pomiaru endogennych poziomów DA w dorosłym mózgu. Dlatego przedstawiamy, jak przeprowadzić wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) na tkance mózgowej myszy w celu określenia poziomów DA. Eksperyment przeprowadzamy na tkance z prążkowia grzbietowego (dStr) i jądra półleżącego (NAc), ale metoda jest również odpowiednia dla innych obszarów mózgu unerwionych DA.

DAT jest niezbędny do wychwytu zwrotnego DA do terminala presynaptycznego, tym samym kontrolując czasową i przestrzenną aktywność uwolnionego DA. Znajomość poziomów i funkcjonalności DAT w prążkowiu ma ogromne znaczenie przy ocenie homeostazy DA. W tym miejscu udostępniamy protokół, który pozwala jednocześnie wydedukować informacje o poziomach powierzchniowych i funkcji za pomocą testu wychwytu DA synaptosomal6.

Obecne metody w połączeniu ze standardowymi protokołami immunoblottingu dostarczają badaczowi odpowiednich narzędzi do scharakteryzowania systemu DAergic.

Wprowadzenie

Dopamina (DA) jest modulującym neuroprzekaźnikiem krytycznym dla zachowania motorycznego, nagrody i funkcji poznawczych1,7,8,9. Nierównowaga w homeostazie DA jest związana z kilkoma chorobami neuropsychiatrycznymi, takimi jak zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi, uzależnienie od narkotyków, depresja i choroba Parkinsona1. DA jest uwalniany z neuronu presynaptycznego do szczeliny synaptycznej, gdzie wiąże się i aktywuje receptory na błonie pre- i postsynaptycznej, przekazując w ten sposób dalej sygnał. Poziom DA w synapsie po uwolnieniu jest przestrzennie i czasowo kontrolowany przez DAT3,10. Transporter sekwestruje DA z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, a tym samym utrzymuje fizjologiczne poziomy DA3,11. Genetyczne usunięcie DAT u myszy powoduje fenotyp hiperdopaminergiczny charakteryzujący się podwyższonym poziomem synaptycznego DA, wyczerpaniem wewnątrzkomórkowych pul DA i głębokimi zmianami w postsynaptycznej sygnalizacji DAergic class<="xref">10,12.

Tutaj prezentowane są dwa oddzielne protokoły, jeden do pomiaru zawartości tkanki DA, a drugi do oceny funkcjonalności DAT. W połączeniu z testem biotynylacji powierzchniowej opisanym przez Gabriela i wsp.13 te dwie metody dostarczają informacji o zawartości DA i funkcjonalnych poziomach DAT dla dokładnej oceny homeostazy DA. Dzięki tym metodom można scharakteryzować i opisać homeostazę DA różnych myszy transgenicznych lub modeli chorób. Narzędzia te zostały wdrożone i zoptymalizowane i są standardowym zastosowaniem w naszych laboratoriach. Obecne testy posłużyły do zbadania wpływu na homeostazę DA zmiany C-końca DAT14 lub ekspresji rekombinazy Cre pod promotorem hydroksylazy tyrozynowej (TH) 5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Postępowano zgodnie z wytycznymi duńskiego Inspektoratu Eksperymentów na Zwierzętach (numer pozwolenia: 2017-15-0201-01160), a doświadczenia przeprowadzono w placówce z pełną akredytacją AAALAC pod nadzorem lokalnej komisji ds. dobrostanu zwierząt.

1. Pobór dopaminy przez synaptosomy (Metoda 1)

UWAGA: Niniejszy protokół służy do równoległej oceny dwóch mózgów, ale może zostać z powodzeniem wykorzystany do przeprowadzenia eksperymentów dotyczących poboru DA przez synaptosomy z czterech mózgów równolegle.

  1. Przygotowania
    1. Oznakuj 48 probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zgodnie z Tabelą 1 (24 dla każdego mózgu). Użyj różnych kolorów dla probówek należących do każdego mózgu, aby zapobiec pomieszaniu próbek
    2. Oznakuj 51 probówek do pomiarów scyntylacyjnych numerami #1-51.
    3. Umieść roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w lodzie. Będzie on służył do chłodzenia mózgów.
    4. Włącz wirówkę, aby umożliwić jej schłodzenie do 4 °C.
    5. Zważ wcześniej dwie probówki do mikrocentryfugi, aby uzyskać dokładną masę tkanki podczas przygotowania synaptosomów (sekcja 2.6).
    6. Przygotuj bufor do homogenizacji, mieszając 4 mM HEPES i 0,32 M sacharozy. Dostosuj pH do 7,4 i przechowuj w lodzie.
      UWAGA: Bufor do homogenizacji można przechowywać w alikwotach w temperaturze -20 °C i rozmrozić w dniu eksperymentu.
    7. Przygotuj bufor do pobierania (uptake buffer), łącząc następujące składniki: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM kwasu askorbinowego (0,194 g/L), 5 mM D-glukozy (0,991 g/L). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH (co prowadzi do uzyskania stężenia sodu na poziomie około 130 mM) i przechowuj w lodzie.
      UWAGA: Dla 2 mózgów przygotuj 1500 mL buforu do pobierania. Przygotuj bufor do pobierania jako 10-krotny roztwór stokowy bez kwasu askorbinowego i glukozy, przechowywany w temperaturze 4 °C. Świeżo w dniu badania przygotuj 1-krotny roztwór roboczy, uzupełniając go o kwas askorbinowy i glukozę. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH.
    8. Przygotuj bufor do pobierania + ligand, łącząc następujące składniki: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM kwasu askorbinowego (0,194 g/L), 5 mM D-glukozy (0,991 g/L), 1 μM pargyliny, 100 nM desipraminy, 10 nM inhibitora katechol-O-metylotransferazy (COMT). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH i przechowuj w lodzie.
      UWAGA: Użyj 50 mL buforu do pobierania i dodaj ligand. Pargylinę dodaje się, aby zapobiec degradacji DA poprzez utlenianie przez monoaminooksydazę (MAO). Inhibitor COMT (RO-41-0960) dodaje się w celu zapobieżenia degradacji DA (ogólnie katecholamin) przez COMT. Desipraminę dodaje się, aby zahamować pobieranie przez transportery norepinefryny i serotoniny, czyniąc tym samym wyniki pobierania specyficznymi dla DAT.
    9. Przygotuj bufor do pobierania + ligand + kokaina, łącząc następujące składniki: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM kwasu askorbinowego (0,194 g/L), 5 mM D-glukozy (0,991 g/L), 1 μM pargyliny, 100 nM desipraminy, 10 nM inhibitora COMT, 500 μM kokainy. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH i przechowuj w lodzie.
      UWAGA: Użyj 7 mL buforu do pobierania + ligand i dodaj kokainę. Kokainę dodaje się w celu uzyskania pomiaru tła niespecyficznego pobierania DA, który należy odjąć od danych, pozostawiając jedynie pobieranie specyficzne dla DAT (ponieważ SERT i NET są hamowane przez desipraminę, jak opisano powyżej). Alternatywnie można użyć bardzo silnego i specyficznego inhibitora DAT, GBR-12935.
      Ważne: Od tego momentu wszystko należy przechowywać w lodzie.
  2. Przygotowanie synaptosomów
    1. Uśmierć myszy pojedynczo poprzez zwichnięcie szyi i dekapitację.
    2. Nacinij skórę nożyczkami, aby odsłonić czaszkę, i odetnij nadmiar tkanki za czaszką pozostały po dekapitacji. Przetnij czaszkę małymi prostymi nożyczkami wzdłuż sutura sagittalis, przesuwając się jak najdalej w kierunku przednim.
    3. Umieść końcówki nożyczek w każdym oku myszy i przetnij czaszkę, aby usunąć resztę kości oraz nienaruszony mózg. Szybko wyjmij mózg i umieść go w lodowatym PBS. Pozwoli to utrzymać go w niskiej temperaturze podczas preparowania drugiego mózgu.
    4. Używając matrycy do mózgu, wytnij 3 mm coronal slice prążkowia (oś przednio-tylna: +1,5 mm do -1,5 mm), a następnie wykonaj precyzyjniejszą dyssekcję za pomocą wycinaka. Obszar wycinania przedstawiono na Rysunku 1.
    5. Dalej przez cały czas utrzymuj tkankę w lodzie.
    6. Przenieś tkankę do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL w celu zważenia.
      UWAGA: Masa ta zostanie wykorzystana w kroku 1.2.14.
    7. Powtórz kroki 1.2.1-1.2.6 dla drugiego mózgu.
    8. Po uzyskaniu masy dla obu mózgów, przenieś tkankę do szklanego homogenizatora zawierającego 1 mL lodowatego buforu do homogenizacji.
    9. Zhomogenizuj tkankę za pomocą tłuczka napędzanego silnikiem przy 800 rpm, wykonując 10 równomiernych pociągnięć.
      UWAGA: Jedno pociągnięcie to jeden ruch w górę i w dół; pierwsze pociągnięcie powinno trwać około 5 s, a kolejne 3-4 s. Homogenizacja w medium izotonicznym jest ważna, aby zapobiec pękaniu synaptosomów6. Zastosowanie odpowiedniej siły i medium izotonicznego pozwoli zakończeniom presynaptycznym na ponowne zamknięcie, zamykając wewnątrz cytoplazmę, pęcherzyki synaptyczne, mitochondria i cytoszkielet15.
    10. Przenieś homogenat do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i zbierz pozostały homogenat ze szklanego homogenizatora, płucząc go dodatkowymi 0,5 mL buforu do homogenizacji.
    11. Przechowuj próbkę w lodzie, podczas gdy homogenizowana jest tkanka z drugiego mózgu. Przetwarzaj oba mózgi równolegle w krokach 1.2.12-1.2.13.
    12. Odwirowaj jądra i szczątki komórkowe (1 000 x g, 10 min, 4°C).
    13. Przenieś nadsącz (S1) (zawierający błony komórkowe i cytoplazmę) do nowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i wiruj przy 16 000 x g przez 20 min w temperaturze 4°C.
    14. Odlej nadsącz (zawierający cytoplazmę) i resuspenduj osad (P2) (zawierający surowe synaptosomy) w 40 μL buforu do homogenizacji na mg tkanki (na podstawie masy uzyskanej w kroku 1.2.6). Delikatnie resuspenduj surową frakcję synaptosomów pipetą p1000, ponieważ zbyt duża siła zniszczy synaptosomy.
      UWAGA: Ważne jest, aby otrzymać co najmniej 280 μL. Jeśli nie, konieczne będzie rozcieńczenie w ilości większej niż 40 μL na mg. Kroki 1.2.1-1.2.13 muszą być wykonane tak szybko, jak to możliwe, a wszystko musi być utrzymywane w lodzie. Po resuspendowaniu surowych synaptosomów w buforze do homogenizacji są one dość stabilne, pod warunkiem przechowywania ich w lodzie6,15,16.

2. Eksperyment z pobieraniem

  1. Do wyznaczonych 12 probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL dodać 440 μL buforu do poboru + ligand + kokainę, a do pozostałych 36 probówek 1.5 mL dodać 440 μL buforu do poboru + ligand (układ przedstawiono w Tabeli 1).
    UWAGA: Wyjąć probówki z lodu 15 min przed rozpoczęciem eksperymentu, aby osiągnęły temperaturę pokojową, jednak do tego czasu przechowywać je w lodzie w celu zachowania inhibitorów.
  2. Przygotowanie krzywej nasycenia (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamina) (91.1 Ci/mmol) w różnych stężeniach końcowych (0.031, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 i 1.0 μM)).
    1. Oznaczyć sześć probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL jako 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 i 0.31.
    2. Do 5 probówek z najniższymi numerami dodać 750 μL buforu do poboru + ligand.
    3. Do probówki oznaczonej jako 10 dodać 1,455.4 μL buforu do poboru + ligand, 14.6 μL dopaminy (1 mM) oraz 30 μl 3-H dopaminy (11 μM).
    4. Przenieść 750 μL z probówki oznaczonej jako 10 do probówki oznaczonej jako 5. Dobrze wymieszać, a następnie przenieść 750 μL z tej probówki do probówki 2.5. Powtórzyć to rozcieńczanie dla pozostałych probówek.
  3. Przepłukać wstępnie szklane filtry z włókna szklanego 4 mL buforu do poboru po umieszczeniu ich w 12-dołkowym uchwycie do filtrów.
  4. Do pierwszych 24 probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL (układ przedstawiono w Tabeli 1) zawierających 440 μL buforu dodać 10 μL zawiesiny błon synaptosomalnych. Ostrożnie wymieszać w wirówce (vortex) i krótko odwirować, aby synaptosomy zostały całkowicie zanurzone w buforze. Inkubować w temperaturze 37 oC przez 10 min.
    UWAGA: Dla rzetelnego porównania wyników między różnymi mózgami ważne jest dokładne przestrzeganie czasu podczas eksperymentu z poborem. Do precyzyjnego pomiaru czasu należy użyć stoperem.
  5. Do dwóch pierwszych kolumn dodać 50 μL dopaminy o stężeniu 10 i 5 μM (sekcja 2.2) i inkubować w 37 oC przez 5 min przy mieszaniu. Po dokładnie 5 min zatrzymać reakcję, dodając 1 mL lodowatego buforu do poboru. Postąpić analogicznie dla stężeń 2.5 i 1.25 μM (sekcja 2.2), a następnie dla stężeń 0.62 i 0.31 μM.
  6. Przenieść próbki na wstępnie przepłukane filtry z włókna szklanego i przemyć 5 x 4 mL lodowatego buforu do poboru. Po naniesieniu pierwszych 12 próbek na filtry, przenieść je do probówek scyntylacyjnych. Powtórzyć czynność dla kolejnych 12 próbek.
  7. Powtórzyć kroki 2.4-2.6 dla kolejnego mózgu.
  8. Przygotować 3 probówki do pomiaru maksymalnego liczenia, umieszczając filtr z włókna szklanego na dnie probówek scyntylacyjnych 49-51 i dodając na wierzch 25 µL dopaminy o maksymalnym stężeniu (10 μM).
  9. Pozostawić wszystkie 51 probówek scyntylacyjnych w dygestorium na 1 h.
  10. Do każdej probówki scyntylacyjnej dodać 3 mL płynu scyntylacyjnego i energicznie mieszać na mieszalniku przez 1 h.
  11. Zliczyć [3H]-DA w liczniku beta przez 1 min.
    1. Uruchomić program i wybrać: Label: H-3, Plate/Filter: 4 mL vial, 4 by 6, Assay type: Normal oraz Counting time: 1 min.
      UWAGA: Ten krok można wykonać następnego dnia, jeśli jest to wygodniejsze. Próbki należy pozostawić przykryte folią aluminiową przez noc.
  12. Oznaczenie białka
    1. Użyć standardowego zestawu BCA Protein Assay do oznaczenia stężeń białka w synaptosomach w celu przeliczenia wyników z zliczeń na minutę (cpm) na fmol/min/μg oraz do prawidłowego porównania poboru między próbkami.

3. Analiza danych

  1. Wykorzystaj dane z eksperymentu dotyczącego wychwytu do stworzenia krzywej nasycenia dla każdej grupy oraz oblicz szybkość reakcji (Vmax) i stałą Michaelisa-Menten (KM).
    UWAGA: Wartość KM odzwierciedla stężenie substratu wymagane do osiągnięcia połowy Vmax. W związku z tym Vmax bezpośrednio odzwierciedla funkcję DAT (maksymalną wydajność wychwytu), która zależy od liczby białek DAT na powierzchni oraz od tego, jak ich aktywność może być modulowana przez modyfikacje potranslacyjne i/lub białka oddziałujące, a także od zmian w gradientach jonowych. Wartość KM jest pośrednią miarą powinowactwa substratu do transportera, która – co istotne – również może być modulowana przez modyfikacje potranslacyjne i/lub białka oddziałujące. Aby w pełni ocenić zmiany funkcjonalne, ważne jest zatem bezpośrednie określenie poziomów ekspresji powierzchniowej, na przykład za pomocą testu biotinylacji powierzchniowej. Opis wychwytu dopaminy oraz szczegółowe omówienie znaczenia wartości KM i Vmax zostały przedstawione w przeglądzie Schmitz i wsp.17.

4. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (Metoda 2)

  1. Disekcja mózgu
    1. Oznakować i zważyć probówki do mikrowirówki; jedna na region dla każdej myszy.
    2. Uśmiercać myszy pojedynczo poprzez zwichnięcie stawów szyjnych i dekapitację. Szybko usunąć mózg zgodnie z opisem w sekcji 1.2. Niezwłocznie przeprowadzić dalszą dysekcję.
    3. Używając matrycy mózgu, wyciąć koronalny plaster prążkowia o grubości 3 mm, a następnie przeprowadzić precyzyjniejszą obustronną dysekcję NAc i dStr za pomocą wycinaka (punchera). Obszar wycinania przedstawiono na Rysunku 3.
    4. Przenieść tkankę do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i szybko umieścić na suchym lodzie. Zważyć tkankę i natychmiast ponownie umieścić ją na suchym lodzie.
      UWAGA: Masa tkanki jest istotna dla późniejszego obliczenia stężenia.
    5. Powtórzyć kroki 4.1.1-4.1.4 dla kolejnej myszy.
      UWAGA: Przechowywać tkankę w temperaturze 80oC do czasu dalszej obróbki lub bezzwłocznie przystąpić do przetwarzania tkanki.

5. Przygotowanie tkanki

  1. Włącz wirówkę, aby umożliwić jej wstępne schłodzenie do 4 °C
  2. Przygotuj roztwór do homogenizacji (0,1 N kwas nadchlorowy (HClO4)) i przechowuj go w lodzie.
  3. Używając roztworu do homogenizacji, przygotuj świeży standard dopaminy o stężeniu 0,1 pmol/μL z roztworu zapasowego 1 mM (rozcieńczenie 10 000 x).
    UWAGA: Roztwór zapasowy przygotowuje się poprzez rozpuszczenie dopaminy w buforze do homogenizacji do stężenia 1 mM, który można przechowywać w 20 °C przez około miesiąc. Jeśli przedmiotem zainteresowania są inne obszary mózgu, stężenie standardu będzie musiało zostać zmodyfikowane, ponieważ inne obszary mózgu, w tym kora przedczołowa, hipokamp, istota czarna i pole brzuszne nakrywki, posiadają do 100 razy mniej DA w porównaniu do prążkowia.
  4. Dodaj 500 μL roztworu do homogenizacji do każdej próbki (t.j. tkanki NAc i dStr; sekcja 4.1) i zhomogenizuj próbki za pomocą ultra-homogenizatora z maksymalną prędkością przez około 30 s. Podczas homogenizacji utrzymuj próbkę w lodowatej wodzie. Pomiędzy każdą próbką oczyść ultra-homogenizator wodą (maksymalna prędkość przez 30 s).
  5. Wiruj próbki przez 30 min w 4 °C przy 14 000 x g.
  6. Przenieś około 200 μL próbki na szklany filtr 0,22 μm (średnica 1 cm) za pomocą plastikowej strzykawki 1 mL.
    UWAGA: Użycie filtrów szklanych nie jest istotne, o ile wybrane filtry mają rozmiar 0,22 μm w celu usunięcia substancji o wysokiej masie cząsteczkowej.
  7. Przeanalizuj próbki metodą detekcji elektrochemicznej (EC)-HPLC18 zgodnie z opisem w sekcji 6.

6. Analiza metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej

  1. Przygotować następujący roztwór fazy ruchomej: octan sodu 55 mM, kwas oktanosulfonowy 1 mM, Na2EDTA 0,1 mM, acetonitryl 8 %, kwas octowy 0,1 M, pH = 3,2.
    UWAGA: pH należy skorygować za pomocą 0,1 M kwasu octowego. Ważne jest, aby precyzyjnie ustawić wartość pH. Roztwór powinien zostać odgazowany przez odgazowywacz on-line (zintegrowany element systemu HPLC). Należy przygotować 2 L fazy ruchomej i wymieniać ją około raz w miesiącu (wymienić w momencie, gdy szumy staną się zauważalne). Ze względu na fluktuacje stabilizacja po wymianie fazy ruchomej trwa około 24 h.
  2. Konfiguracja detektora:
    1. Ustawić wyjściowe napięcie na 700 mV oraz temperaturę w termostacie detektora na 32 °C; jest to bardzo ważne. Stworzyć program zakresu, korzystając z instrukcji online (szczegóły znajdują się w instrukcji). Dodać program czasu zgodnie z Tabelą 2.
      UWAGA: W niniejszym badaniu program został ustawiony tak, aby automatycznie zmieniać natężenie prądu w określonych czasach retencji, w celu utrzymania optymalnego prądu w systemie HPLC oraz maksymalnego powiększenia pików na chromatogramie, przy jednoczesnym zachowaniu ich w polu widzenia. Program ten został zoptymalizowany dla lizatów prążkowia mózgu myszy.
  3. Po wprowadzeniu programu do detektora należy sporządzić 3-punktową krzywą kalibracyjną, wstrzykując standard trzy razy (5, 10 i 15 μL).
    UWAGA: Standard (10 μL (10 μL x 0,1 pmol/μL = 1 pmol DA)) należy wstrzykiwać co dziesiątą próbkę, a próbki kalibrować do najbliższego standardu. Dzień wcześniej należy dostroić system poprzez regulację standardu 3-punktowego i sprawdzenie, czy chromatogram mieści się w oczekiwanym zakresie. W przypadku zaobserwowania znacznych szumów należy wymienić fazę ruchomą. Jeśli pik jest wyższy niż 990 mV, należy ponownie wstrzyknąć próbkę w mniejszej objętości lub stworzyć nowy program zakresu i nową krzywą standardową. Granica detekcji jest mierzona jako 3-krotność wartości szumu w mV w stosunku do najniższej wartości piku wstrzykniętego dla każdego standardu (NA, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT i 5-HT).
    1. Skonfigurować system, otwierając oprogramowanie LC i aktywując analizę 1; uruchamia to tryb online. Wpisać identyfikator użytkownika i hasło, a następnie kliknąć ok. Poczekać, aż oprogramowanie LC połączy się z instrumentami. Przejść do tabeli partii (batch table) i wypełnić informacje o danych (np. typ próbki: unknown dla próbek i std dla standardu, typ analizy: IT QT, objętość wtrysku: 10, ilość ISTD: Level 1 con). Zapisać plik (File -> save Batch file as -> Save).
    2. Uruchomić wstrzykiwanie pierwszej próbki, naciskając „Start Batch”. Spowoduje to wstrzyknięcie 10 μL próbki przez autowstrzykiwacz z modułem dostarczania rozpuszczalnika.
      UWAGA: Należy zastosować przepływ pompy 0,15 mL/min i kolumnę C18 w fazie odwróconej. W tym przypadku do detekcji elektrochemicznej użyto detektora amperometrycznego. Elektrodę z węgla szklistego należy ustawić na 0,8 V z elektrodą odniesienia Ag/AgCl. W celu oznaczania dopaminy należy użyć kolumny Chromatography 3 µ ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, wielkość cząstek 3 µm), aby uzyskać rozdzielenie chromatograficzne.
    3. Wyeksportować zarejestrowane i obliczone pola pików.
      1. Przejść do akwizycji danych, aby śledzić chromatogram po zakończeniu analizy próbek. Przejść do Lc post run analysis -> wybrać nazwę pliku (otworzy się chromatogram) -> kliknąć view. Na pasku integracji manualnej dodać wszystkie piki do zintegrowania -> przejść do raportu danych (data report) i wydrukować odczyt.
        UWAGA: Do analizy danych i sterowania systemem wykorzystano oprogramowanie LC solution.
  4. Na podstawie pól pików obliczyć stężenie dopaminy w próbce w następujący sposób, wykorzystując znane stężenie standardu:
    1. Użyć pola piku standardu (równym 1 pmol), aby wyznaczyć czynnik A.
      Wzór na czynnik A: 1 pmol/pole piku standardu, równanie do analizy ilościowej.
    2. Wykorzystać czynnik A do wyznaczenia stężenia w próbkach.
      Stężenie próbki (w pmol na 10 μL) = Czynnik A × pole piku próbki
    3. Użyć poniższego wzoru, aby uzyskać stężenie próbki w ng.
      Stężenie próbki pmol / 10 µL x 500 µL x MW dopaminy = stężenie próbki w ng
      Stężenie próbki (w ng) = Stężenie próbki (w pmol na 10 μL) x 500 μL x MW dopaminy
    4. Wykorzystać stężenie próbki w ng, aby uzyskać stężenie próbki w pg/g tkanki (stężenie próbki w pg / g tkanki = pg/g tkanki).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obecny protokół pobierania DA (Rysunek 1) obejmuje wszystkie kroki niezbędne do oceny funkcjonalności DAT w synaptosomach myszy. Nasze reprezentatywne dane z metody pobierania DA (Rysunek 2) przedstawiają krzywą nasycenia z danymi nieskorygowanymi (Rysunek 2B) oraz danymi skorygowanymi (Rysunek 2A). Krzywa nasycenia obrazuje pobieranie u myszy typu dzikiego. Zazwyczaj po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten manuskrypt opisuje przydatne protokoły eksperymentalne do nakreślenia homeostazy DA w dowolnym wybranym modelu myszy. Zapewniamy szczegółowe protokoły pomiaru poziomów DA w tkance mózgowej myszy za pomocą HPLC i wychwytu synaptosomalnego DA w celu oceny funkcjonalnego transportu DA przez DAT. Procedury, protokoły i limity dla eksperymentu HPLC i testu wychwytu synaptosomalnego DA zostaną omówione poniżej.

Protokół wychwytu synaptosomalnego może dostarczyć użytecznych informacji na temat fu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Program Doskonałości UCPH 2016 (U.G., A.R., K.J.), Fundację Lundbecka (M.R.), Centrum Biomembran w Nanomedycynie Fundacji Lundbecka (U.G.), National Institute of Health Grants P01 DA 12408 (U.G.), Duńską Radę ds. Niezależnych Badań - Nauk Medycznych (U.G.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inhibitor COMTSigma Aldrich, NiemcyRO-41-0960Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
[3H]-DopaminaPerkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USANET67-3001MCDo protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
Filtry z mikrowłókna szklanegoGF / C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire1822-024Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
HiSafe Płyn scyntylacyjnyPerkin Elmer1200-437Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
MicroBeta2Perkin ElmerDo protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
Zestaw do oznaczania białka BCAThermo Scientific Pierce23225Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
HEPESSigma Life ScienceH3375Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
SacharozaSigma Life ScienceS7903Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
NaClSigma Life ScienceS3014Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
KClSigma Life ScienceP9541Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
CaCl2Merck KGaA10043-52-4Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
MgSO4Sigma Life Science63065Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
Kwas askorbinowySigma Life ScienceA0278Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
D-GlucoseSigma Life ScienceG7021Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
PargylineSigma AldrichP-8013Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
DezypraminaSigma AldrichD3900Dla wychwytu synaptosomalnego DA
protokół DopaminaSigma Life ScienceH8502Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
KokainaSigma Life ScienceC5776Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
Instrumenty ASImózguRBM2000CDla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA
Cafano Mechaniczny zakłócacz teflonu& HolmwycofanyDla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA (homogenizacja)
Antec Decade (detektor amperometryczny)Antec, Leiden, HolandiaWycofane: nowy model DECADE Elite / Lite™ Detektor elektrochemiczny typu 175 i 176Do protokołu HPLC
Avantec 0.22 μ m filtr szklanyFrisenette ApS, Dania13CP020ASDo protokołu HPLC
Kolumna: Prodigy 3 μ ODS-3 C18Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, NiemcyNumer części: 00A-3300-E0Dla protokołu HPLC
Oprogramowanie rozwiązania LCStacja robocza ShimadzuLabSolutionsSeries do protokołu HPLC
Kwas nadchlorowy 0,1 MFluka Analytical35418-500mlDo protokołu HPLC (przygotowanie tkanki)
EDTASigmaE5134-50gDo protokołu
HPLCNatriumdihydrogenphospharBie& Berntsen1.06346 1000gDo protokołu HPLC
Monohydrat 1-oktanosulfonianu soduAldrich74885 -10gDo protokołu HPLC
Acetonitryl, izokratyczny stopień HPLCScharlauAC03402500Dla protokołu HPLC
Filtre 0,22umFrisenette ApS, DaniaAvantec 13CP020ASDo protokołu HPLC (Przygotowanie tkanek)
Kwas ortofosforowy 85%Merck1.00563. 1000 mldla protokołu HPLC
ElektrodaAntec, Leiden, HolandiaAN1161300Dla protokołu HPLC (patrz instrukcja online)
Program detektora na detektorze elektrochemicznym DECADE IIAntec, Leiden, HolandiaLite™ Detektor elektrochemiczny typu 175 i 176dla protokołu HPLC
macierzy

Bibliografia

  1. Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
  2. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  3. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
  4. Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
  5. Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
  6. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
  7. Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
  8. Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
  9. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  10. Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
  11. Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
  12. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
  13. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
  14. Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580(2013).
  15. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  16. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
  17. Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
  18. Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
  19. Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
  20. Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
  21. Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
  22. Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
  23. Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
  24. Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
  25. Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
  26. Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
  27. Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
  28. Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
  29. Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
  30. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
  31. Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
  32. Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
  33. Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
  34. Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
  35. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
  36. Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468(2015).
  37. Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  38. Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Homeostaza dopaminytransporter dopaminypoziomy dopaminytkanka pr kowiatest poboru dopaminyanaliza tkanki m zgowejfunkcja transportera dopaminykinetyka transportera dopaminy
Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.