Artykuł metodologiczny

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

DOI:

10.3791/56094

⸱

13 lipca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University, 2Department of Chemistry, University of California-Davis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki pokryte są płaszczem łańcuchów węglowodanowych (glikanów), który jest często zmieniany w raku i który zawiera zmiany w ekspresji kwasu sjalowego (Sia). Są to kwaśne cukry, które mają 9-węglowy szkielet i zamykają glikany kręgowców na powierzchni komórek. Dwie z głównych form Sia u ssaków to kwas N-acetyloneuraminowy (Neu5Ac) i jego hydroksylowana forma, kwas N-glikolyloneuraminowy (Neu5Gc). Ludzie nie mogą wytwarzać endogennego Neu5Gc z powodu inaktywacji genu kodującego hydroksylazę 5'monofosforanu cytydyny-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) (CMAH). Obcy Neu5Gc jest pozyskiwany przez komórki ludzkie poprzez dietetyczne spożywanie czerwonego mięsa i nabiału, a następnie pojawia się na różnych glikanach na powierzchni komórki, gromadząc się głównie na rakach. W związku z tym ludzie mają krążące przeciwciała anty-Neu5TGC, które odgrywają różne role w raku i innych przewlekłych chorobach o podłożu zapalnym i które stają się potencjalnymi celami diagnostycznymi i terapeutycznymi. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustowy test mikromacierzy sialoglikanu do oceny takich przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicy ludzkiej. Glikany zawierające Neu5Gc i ich dopasowane pary kontrolne (glikany zawierające Neu5Ac), z których każdy ma rdzeń aminy pierwszorzędowej, są kowalencyjnie połączone ze szkiełkami szklanymi pokrytymi żywicą epoksydową. Przykładem jest drukowanie 56 slajdów w formacie 16-dołkowym przy użyciu specjalnej nanodrukarki zdolnej do wygenerowania do 896 tablic na wydruk. Każdy preparat może być używany do badania przesiewowego 16 różnych próbek surowic ludzkich w celu oceny swoistości, intensywności i różnorodności przeciwciał anty-Neu5Gc. Protokół opisuje złożoność tego solidnego narzędzia i zawiera podstawowe wytyczne dla osób dążących do zbadania odpowiedzi na dietetyczny antygen węglowodanowy Neu5Gc w różnych próbkach klinicznych w formacie tablicowym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sias to kwaśne cukry pokrywające łańcuchy glikanów na powierzchni komórki glikoproteiny i glikolipidy u kręgowców. Ekspresja Sia jest modyfikowana w komórkach nowotworowych1 i koreluje z progresją i/lub przerzutami2,3. Dwie z głównych form Sia u ssaków to Neu5Ac i jego hydroksylowana forma, Neu5Gc2. Ludzie nie mogą syntetyzować Neu5Gc z powodu specyficznej inaktywacji genu kodującego enzym CMAH . Ta nie-ludzka Sia metabolicznie włącza się do ludzkich komórek jako "ja", pochodząca z pokarmów bogatych w Neu5Gc (np. czerwone mięso)4,5. Neu5Gc występuje w niewielkich ilościach na powierzchni komórek ludzkiego nabłonka i śródbłonka, ale szczególnie kumuluje się w rakach. Neu5Gc jest rozpoznawany jako obcy przez ludzki humoralny układ odpornościowy2,6. Złożoność antygenowa glikanów Neu5Gc może powstać na wielu poziomach, w tym modyfikacji Neu5Tc, wiązania, leżących u podstaw glikanów i rusztowań oraz ich gęstości, a wszystko to odzwierciedla złożoność odpowiedzi przeciwciał anty-Neu5Gc u ludzi6. Niektóre z tych przeciwciał służą jako biomarkery raka i potencjalne immunoterapeutyki7. Pojawienie się chemoenzymatycznej syntezy różnych sialoglikanów8 utorowało drogę do bardziej dogłębnej analizy takich przeciwciał, ułatwionej dzięki zastosowaniu technologii mikromacierzy glikanowej9,10. W ten sposób, dzięki ułatwionemu przygotowywaniu i manipulowaniu dużymi bibliotekami naturalnych i syntetycznych węglowodanów, mikromacierze glikanowe stały się potężną, wysokowydajną technologią do badania interakcji węglowodanów z niezliczonymi biomolekułami10,11,12,13. W formacie matrycowym używane są minimalne ilości materiałów, a ten wielowartościowy wyświetlacz biologicznie istotnych glikanów pozwala na badanie tysięcy interakcji wiążących w jednym eksperymencie. Co ważne, technologia ta może być również stosowana do odkrywania biomarkerów i monitorowania odpowiedzi immunologicznej w różnych próbkach7,12.

Udana produkcja mikromacierzy glikanowej wymaga rozważenia trzech ważnych aspektów: typu robota drukarki, chemii koniugacji glikanów i optyki detekcyjnej. Jeśli chodzi o rozważania dotyczące przyrządów drukujących, dostępne są dwie techniki: drukarki kontaktowe i bezdotykowe. W druku kontaktowym 1-48 stalowych kołków zanurza się w wielodołkowej płytce źródłowej zawierającej roztwór glikanu i nakraplacza się je na funkcjonalizowanych szkiełkach podstawowych poprzez bezpośredni kontakt z powierzchnią szkiełka. Ilość roztworu dostarczonego do szkiełka jest funkcją czasu utrzymywania się na powierzchni szkiełka. Zazwyczaj próbki są najpierw wstępnie nakrapiane na pustaku szklanym (w celu uzyskania jednorodnych miejsc), zanim zostaną wydrukowane na powierzchni szkiełka. W drukarkach bezdotykowych (np. drukarkach piezoelektronicznych) glikany są drukowane ze szklanej kapilary za pomocą kontrolowanych sygnałów elektrycznych. Sygnał elektryczny można precyzyjnie skalibrować, aby uzyskać bardziej precyzyjne drukowanie w porównaniu z drukowaniem kontaktowym. Wielkość i morfologia plam są również stosunkowo bardziej jednorodne. Dodatkowym atutem jest recykling próbki z powrotem na płytę źródłową po wydrukowaniu. Niemniej jednak główną wadą drukarek piezoelektronicznych jest ograniczenie końcówek drukujących (4 lub 8), co skutkuje bardzo długim czasem drukowania, co wymaga szczególnej uwagi na stabilność suwaka, temperaturę, wilgotność i parowanie próbki. Bezdotykowa drukarka atramentowa wymaga większych objętości próbek14.

W przeciwieństwie do ograniczonych dostępnych opcji metod drukowania, chemia koniugacji glikanów jest bardziej złożonym rozważaniem, z wieloma opcjami do wyboru. Wybrana chemia immobilizacji musi uwzględniać zarówno grupy aktywne glikanów, jak i reaktywność powierzchni szkiełka. Glikany, które mają być unieruchomione na określonej powierzchni mikromacierzy, syntetyzowane syntetycznie lub naturalnie izolowane, wymagają identycznej grupy reaktywnej. Ponadto glikany muszą być czyste i jednorodne. Z drugiej strony, powierzchnia unieruchomienia i skład chemiczny powinny zapewniać powtarzalność i niezawodną gęstość przyczepu. Opracowano wiele metod immobilizacji z kowalencyjnym lub niekowalencyjnym (absorpcja fizyczna) attachment10,11,12,13. Aby uzyskać bardzo szczegółowe informacje na temat technologii drukowanych mikromacierzy glikanowych dla niewtajemniczonych badaczy, zapoznaj się z tymi doskonałymi recenzjami 13,15. Co ważne, niedawna inicjatywa Minimum Informacji Wymaganych w Eksperymencie Glikomiksowym (MIRAGE) opisuje wytyczne dotyczące przygotowywania próbek16 oraz raportowania danych z analiz mikromacierzy glikanów17 w celu poprawy standardów w tej rozwijającej się dziedzinie.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół wytwarzania mikromacierzy sialoglykanów przy użyciu specjalnej nano-drukarki kontaktowej w formacie 16-dołkowym. Każdy z glikanów ma pierwszorzędową aminę, która pośredniczy w ich kowalencyjnym połączeniu ze szkiełkami aktywowanymi żywicą epoksydową. Opisujemy również opracowanie i analizę jednego preparatu przy użyciu różnych próbek surowic ludzkich, przeciwciał i lektyn roślinnych wiążących Sia. Testy mikromacierzy Sialoglycan obejmują kilka głównych etapów, które obejmują wytwarzanie, przetwarzanie, opracowywanie i analizę. Produkcja macierzy wymaga zaplanowania układu matrycy, przygotowania glikanów i płytki źródłowej, zaprogramowania nanodrukarki i wydrukowania slajdów. Następnie slajdy są przetwarzane, wywoływane i analizowane (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki surowicy ludzkiej zostały pobrane z Izraelskiego Banku Krwi i zostały użyte zgodnie z Deklaracją Helsińską i Instytucjonalną Komisją Rewizyjną Uniwersytetu w Tel Awiwie.

1. Planowanie i układ produkcji tablic

  1. Określanie układu slajdu.
    UWAGA: Każdy slajd zawiera 16 podtablic podzielonych na 16 identycznych bloków ponumerowanych od B1 do B16 (Rysunek 1B, Rysunek uzupełniający 1A).
  2. Określ układ pinów. Użyj czterech pinów, z których każdy drukuje cztery podtablice (bloki) na slajd:
    Pin 1 drukuje bloki 1, 2, 9 i 10;
    Pin 2 drukuje bloki 3, 4, 11 i 12;
    Pin 3 drukuje bloki 5, 6, 13 i 14; oraz
    Pin 4 drukuje bloki 7, 8, 15 i 16 (rysunek uzupełniający 1A).
  3. Określ układ bloków i płytek 384-dołkowych.
    UWAGA: Kolejność, w jakiej glikany pojawiają się w każdym bloku, wymaga starannego planowania. W tej przykładowej tablicy wydrukuj każdą próbkę w czterech powtórzeniach, zaprojektuj plamki znaczników fluorescencyjnych tak, aby znajdowały się w prawym dolnym rogu (aby ułatwić analizę punktową) i wydrukuj plamki IgG (STD) o krzywej standardowej przy sześciu rosnących stężeniach (rysunek uzupełniający 1B).
    1. Dla każdego wydrukowanego miejsca najpierw dozuj materiał do czterech dołków (po jednym na każdą szpilkę) w płytce 384-dołkowej.
      UWAGA: Kolejność materiałów w płytce 384-dołkowej zależy od zaprojektowanego układu bloków (rysunek uzupełniający 1B-C).

2. Przygotowanie glikanów i płytki źródłowej

  1. Przygotować bufor do drukowania glikanów (50 ml 300 mM buforu fosforanowego, pH 8,4). Odważyć 58,5 mg jednowodnego fosforanu sodu (NaH2PO 4,1H 2O) i 3,9 g siedmiowodnego fosforanu disodowego (Na2HPO4,7H 2O) w 40 ml wody dejonizowanej (DIW). Miareczkować do pH 8,4 przy użyciu 4 M NaOH. Dostosuj objętość do 50 ml i przefiltruj przez membranę 0,2 μm w celu sterylizacji.
  2. Przygotować bufor znacznikowy (50 ml 187 mM buforu fosforanowego, pH 5). Odważyć 289 mg jednowodnego fosforanu sodu (NaH2PO 4,1H 2O) i 1,94 g siedmiowodnego fosforanu disodowego (Na2HPO4,7H 2O) w 40 ml DIW. Miareczkować do pH 5 za pomocą 1 M HCl. Dostosuj objętość do 50 ml i przefiltruj przez membranę 0,2 μm w celu sterylizacji.
  3. Przygotuj bufor krzywej STD (50 ml PBS-glicerolu: sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4, uzupełniona 10% glicerolem ze 100% glicerolu) i przefiltruj go przez membranę 0,2 μm do sterylizacji.
  4. Przygotować każdy podstawowy roztwór glikanu o stężeniu 10 mM w DIW. Sprawdź stężenia glikanów sjalowanych przez detekcję fluorescencji w analizie wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami18.
  5. Rozcieńczyć każdy glikan do 100 μM w całkowitej objętości 100 μl buforu do drukowania glikanów w probówkach do mikrowirówek.
  6. Przygotować pierwszorzędową aminę zawierającą barwnik fluorescencyjny. Rozpuścić solubilizować Alexa 555-hydrazyd do 1 mg/ml z buforem markerowym, a następnie rozcieńczyć do 1 μg/ml w całkowitej objętości 1 ml.
    UWAGA: Każdy inny pierwszorzędowy barwnik zawierający aminy może być używany o odpowiedniej długości fali zgodnie ze skanerem slajdów.
    UWAGA: Punkty znaczników ułatwiają wyrównanie siatki w każdym bloku podczas analizy.
  7. Przygotować rozcieńczenia ludzkiej krzywej IgG STD: przygotować 0,5 ml roztworu podstawowego ludzkiej IgG o stężeniu 160 ng / μL w buforze krzywej STD. Seryjnie rozcieńczyć materiał 1:1 sześć razy, aby uzyskać 80, 40, 20, 10, 5 i 2,5 ng/μl, wszystko w buforze krzywej STD o całkowitej objętości 200 μl każdy.
    UWAGA: Inne izotypy Ig mogą być użyte, jeśli są odpowiednie dla eksperymentu (np. ludzkie IgA, IgM, IgE lub Ig innego organizmu).
  8. Umieść płytkę 384-dołkową na lodzie. Za pomocą elektronicznej pipety wielofunkcyjnej podwielokrotnić po 7 μl każdego glikanu, markera i krzywej IgG-four krzywej STD każdego z nich zgodnie z układem płytek (rysunek uzupełniający 1C). Aby uzyskać lepszą dokładność, załadować 35 μl każdej próbki i podwielokrotność 7 μl do każdego z czterech dołków próbki. Umieść pozostałe 7 μl każdego glikanu z powrotem w oryginalnej probówce.
  9. Przykryj płytkę parafilmem i wiruj przez 2 minuty w temperaturze 250 g i temperaturze 12 °C. Umieść płytkę w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem. Nie odsłaniaj płyty, zanim wilgotność w pomieszczeniu nie osiągnie 60-70%.

3. Programowanie nano-drukarki

  1. Otwórz oprogramowanie "Microarray Manager". Użyj okna "Właściwości metody".
  2. Ustaw układ stołu roboczego: wybierz "Konfigurację 56 slajdów".
    UWAGA: Jest to predefiniowana konfiguracja, która pozwala na wydrukowanie 56 slajdów. Skalibruj dla każdego typu płyty, kołka i formatu wydruku (Rysunek uzupełniający 2, krok 1).
  3. Wybierz "Konfiguracja pinów" | "Narzędzie do kołków 1x4 9 mm."
    UWAGA: Jest to wstępnie zdefiniowana konfiguracja do korzystania z czterech pinów (Rysunek uzupełniający 2, krok 2).
  4. Zdefiniuj "Typ pinu". Oblicz i utwórz typ pinu, który jest odpowiedni do drukowania.
    UWAGA: Ten krok określa, ile plamek powinien wydrukować szpilka przed ponownym zanurzeniem w próbce 384-dołkowej i powinna być zoptymalizowana pod kątem różnych typów pinów i chemii powierzchni szkiełka.
    UWAGA: Korzystając z pinów 946MP3, należy wziąć pod uwagę dwie ważne kwestie: 1) każdy pin może wydrukować do 140 jednorodnych plamek oraz 2) wstępne plamienie jest niezbędne, aby spuścić nadmiar płynu z końcówki pinu przed drukowaniem na slajdach. Dlatego zaprogramuj każdy pin tak, aby wydrukował 20 punktów wstępnych na bloku wstępnym (zoptymalizowanym dla pinów 946MP3 na slajdach pokrytych żywicą epoksydową).
    1. Oblicz całkowitą liczbę wydrukowanych plamek na próbkę.
      UWAGA: W tym przypadku każdy pin drukuje 4 plamki na podtablicę (blok); Łącznie 4 podtablice na slajdy = 16 miejsc/slajd. Po 7 slajdach każdy pin drukuje 16 x 7 = 112 miejsc. Ponadto 20 punktów wstępnych przed drukowaniem daje 132 punkty na zanurzenie. W związku z tym typ pinu jest zdefiniowany jako "946MP3-132 spots" (4 plamki na próbkę na blok x 4 bloki x 7 slajdów + 20 punktów wstępnych = 132).
    2. Utwórz "Typ pinu" (Rysunek uzupełniający 2, krok 3). Naciśnij "Setup" (lewy panel oprogramowania) | "Szpilki do mikroplamek" | "New Name" (946MP3-132 miejsca). Określ liczbę plamek na zanurzenie (132), średnicę plamki (100 μm), wychwyt (0,25 μl), dopływ (0,7 nl) i minimalny odstęp między plamkami (100 μm). Naciśnij "OK" | – Dobrze.
    3. W oknie "Właściwości metody" wybierz utworzony typ pinu: "946MP3-132 spots".
  5. Określ warunki prania. Ustaw "Pranie przed rozpoczęciem" i "Pranie po zakończeniu" na "Normalne pranie" (Rysunek uzupełniający 2, krok 4).
  6. Zdefiniuj "Listę płyt"."
    UWAGA: Jest to wzór pobierania próbek z płytki (kolejność zanurzeń z płytki 384-dołkowej) zgodnie z układem płytki. Aby przesłać blachę do listy płyt, należy skonfigurować wzorzec próbkowania blachy.
    1. Utwórz tabliczkę "Wzór próbkowania". Przejdź do "Szablony" (Rysunek uzupełniający 3) | "Wzorce próbkowania". Nadaj nową nazwę (np. tablica JoVE) i wybierz "Wstaw" | "Wypełnij góra-dół" | "Narzędzie do kołków 1 x4 9 mm". Wybierz kolejność pobierania odwiertów zgodnie z predefiniowanym układem płyt (rysunek uzupełniający 1A). Naciśnij "OK" | – Dobrze.
    2. Załaduj wzór próbkowania płyty. Kliknij po prawej stronie komórki "Lista płyt" (Rysunek uzupełniający 3) | "Dodaj płytkę" i wybierz właściwy wzorzec próbkowania płytki ("Tablica JoVE" opisana w kroku 3.6.1.). Wybierz "Normalne pranie". Naciśnij "OK" | – Dobrze.
  7. Przejdź do sekcji "Sample Plates" (Płytki próbne) i zmień przesunięcie pozycji na 1 (które określa, gdzie płyta znajduje się na pokładzie tablicy).
    UWAGA: Pozycja przesunięcia 0 jest bliższa kąpieli sonitora.
  8. Zdefiniuj "Projekt wydruku mikromacierzy". Oblicz odległości i odstępy między blokami.
    1. Weź pod uwagę wymiary narzędzia do wywoływania, które dzieli szkiełko na 16 dołków o wymiarach 7 x 7 mm, z odstępami 2 mm między podtablicami (łącznie 9 mm między blokami; Rysunek uzupełniający 4).
    2. Rozważmy tablicę podrzędną dimensions.
      UWAGA: Odstęp między plamkami wynosi 0,275 mm, a w tym projekcie nadruku jest 12 kolumn i 18 rzędów; Wymiary całkowite to: szerokość (11 x 0,275 mm = 3,025 mm) i wysokość (17 x 0,275 mm = 4,675 mm). Oblicz odstęp poziomy: 9 mm - (11 0,275) = 5,97 mm. Oblicz odstęp pionowy: 9 mm - (17 x 0,275) = 4,325 mm. Oblicz odległość od lewej strony prowadnicy: 4,43 mm + 1,07 mm = 5,5 mm. Oblicz odległość od górnej strony szkiełka: 2,95 mm + 0,55 mm = 3,5 mm (rysunek uzupełniający 4).
    3. Zdefiniuj "Projekty wydruku" (rysunek uzupełniający 5). Wybierz "Szablony" | "Projekty do druku" | – Nowy.
      1. Wybierz "Konfiguracja pinów" | "Narzędzie do szpilek 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 miejsca." W zakładce "General" zmień "Nazwę druku mikrotablicy" (np. "Tablica JoVE"). Wybierz "Prędkość punktowa" | "Powtórzony numer" (4) | "Wysokość punktu dotykowego" (0 mm) | "Miękka w dotyku wysokość" (3 mm) | "Drukuj do wszystkich dostępnych pozycji" (rysunek uzupełniający 5A).
      2. W zakładce "Mikromacierz" wybierz odstępy poziome i pionowe (5,9 mm i 4,325 mm od kroku 3.8.2) oraz liczbę mikrotablic poziomych i pionowych (2). Wybierz "Drukuj mikromacierz w poziomie" | "Drukuj zduplikowaną mikrotablicę" (rysunek uzupełniający 5B).
      3. Na karcie tablicy podrzędnej wybierz maksymalną liczbę kolumn (12), maksymalną liczbę wierszy (18) oraz odległość między kolumnami i wierszami (275 μm) (rysunek uzupełniający 5C).
      4. Na karcie pomiarów wybierz odległość od lewej strony slajdu (5,5 mm), odległość od górnej krawędzi slajdu (3,5 mm, obliczona w kroku 3.8.2), szerokość slajdu wydruku (25 mm) oraz wysokość slajdu wydruku (75 mm) (rysunek uzupełniający 5D). Naciśnij "OK" | – Dobrze.
  9. Kliknij prawą stronę komórki "Microarray Print Designs" i wybierz zdefiniowany projekt ("Tablica JoVE" z kroku 3.8.3; Rysunek uzupełniający 6).
  10. Zdefiniuj "Liczbę slajdów" (56) i zmień "Przesunięcie pozycji" (0). Określa to pozycję pierwszego slajdu, który ma zostać wydrukowany na pokładzie macierzy (rysunek uzupełniający 6).
  11. Zdefiniuj "Projekt wstępnego wydruku mikromacierzy" (rysunek uzupełniający 6). Wybierz "Pustak szklany" | "Narzędzie do wstępnego drukowania 1 x 4 mm Pin Tool"
    UWAGA: To ustawienie odstępów między punktami pozwala na 46 464 punktów wstępnych (dla wszystkich 4 pinów) na puszbiecie szklanym, a zatem 46 464 / 4 = 11 616 punktów wstępnych na szpilkę. Gdy miejsce na bloku wstępnego wydruku zostanie zużyte, drukarka zatrzyma się i konieczne będzie odwrócenie bloku.
    UWAGA: Aby obliczyć, po ilu próbkach blok wstępnego wydruku jest pełny, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie: każda próbka zostanie pobrana przez 8 zanurzeń szpilkowymi w płytce 384-dołkowej, aby ukończyć 56 szkiełek (7 szkiełek na zanurzenie), a każde zanurzenie ma dodatkowe 20 punktów wstępnych, co daje w sumie 160 punktów wstępnych na próbkę. Zatem 11 616 / 160 = 72,6 próbek. W związku z tym szklany blok przed wydrukiem musiałby zostać odwrócony po 72 próbkach (aby ocenić czas odwracania, zmierz, ile czasu zajmuje jednej próbce ukończenie pełnego cyklu na 56 szkiełkach, a następnie pomnóż przez 72).
  12. Wybierz "Użyj projektu PrePrint" | "Tak" | "Skanuj kody kreskowe" (Nie) | "Drukuj pojedynczą replikę" (Nie) (Rysunek uzupełniający 6).
  13. Kliknij "Zatwierdź" (Rysunek uzupełniający 6).
  14. Kliknij "Zapisz" i zapisz metodę jako plik arr (np. "JoVE array.arr", Rysunek uzupełniający 6).

4. Drukowanie zaprojektowanych tablic

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w czystym pomieszczeniu o wilgotności 60-70% oraz w odpowiednich rękawicach i odzieży ochronnej

  1. Włącz nano-drukarkę i nawilżacz.
  2. W celu bufora myjącego i nawilżania napełnij wodą DI. Opróżnij butelkę do mycia (odpływ) i pojemnik syfonu nawilżającego (rysunek uzupełniający 7A).
  3. Ustaw nawilżacz na 70% wilgotności i rozpocznij nawilżanie.
  4. Wyczyść wszystkie piny przed drukowaniem. Przygotować 50 ml gorącego (65 °C) roztworu do czyszczenia końcówek szpilek (15 g odczynnika do czyszczenia końcówek szpilek i 50 ml wody o temperaturze 65 °C, dokładnie wymieszać, aż odczynnik w postaci stałej całkowicie się rozpuści).
    1. Nałóż roztwór czyszczący na każdą końcówkę szpilki, zanurzając szczoteczkę do końcówek szpilek (drobną) w roztworze do czyszczenia końcówek szpilek i szczotkując powierzchnię każdej końcówki szpilki.
      UWAGA: Roztwór do czyszczenia końcówek szpilek jest i toksyczny. Upewnij się, że podczas korzystania z tego rozwiązania zawsze nosisz rękawice i okulary ochronne. Moczenie szpilek w roztworze do czyszczenia końcówek szpilek przez więcej niż kilka minut może spowodować trwałe uszkodzenie szpilki.
    2. Napełnij kąpiel ultradźwiękową 1 litrem wody destylowanej i umieść kołki w pływającym stojaku do czyszczenia szpilek w wannie. Sonic przez 5 minut i usuń szpilki. Pozostaw do wyschnięcia i delikatnie wytrzyj specjalnymi chusteczkami do pomieszczeń czystych.
  5. Otwórz oprogramowanie drukarki "Microarray Manager"; po nawiązaniu połączenia zaświeci się kontrolka drukarki (czerwona/zielona). Naciśnij "Stop" | "Czysty" | "Init" (rysunek uzupełniający 7B, kroki 1-3); ramię głowicy drukującej zresetuje następnie wyrównania X, Y, Z.
  6. Aby załadować kołki do głowicy drukującej, naciśnij przycisk "Załaduj" (Rysunek uzupełniający 7B, krok 4) i umieść kołki w głowicy drukującej zgodnie ze zdefiniowaną konfiguracją układu narzędzi drukujących/przypinających (Rysunek uzupełniający 7C); ten układ wykorzystuje 4 piny, z których każdy drukuje 4 podtablice na każdym slajdzie, aby uzyskać łącznie 16 podtablic na slajd (Rysunek uzupełniający 1A). Po umieszczeniu kołków ponownie naciśnij "Init".
  7. Zamontuj slajdy na pokładzie tablicy. Otwórz pudełko ze szkiełkami i wyczyść każde szkiełko, przedmuchując azot o bardzo wysokiej czystości. Umieść żądaną liczbę slajdów na platformie tablicy. Przytrzymaj szkiełka dwoma palcami w dolnych rogach, a następnie umieść suwak na swoim miejscu. Przytrzymaj dwa prawe rogi i delikatnie popchnij lewe rogi, aż suwak ciasno dopasuje się do swojej pozycji. Delikatnie popchnij w kierunku lewego dolnego rogu, aby zapewnić ciasne dopasowanie (rysunek uzupełniający 7D).
  8. Wyczyść szybę wstępnie blokową wodą destylowaną, 70% etanolem i 100% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu (używaj tylko dedykowanych chusteczek do pomieszczeń czystych). Umieść szybę wstępnie blokową na swoim miejscu na pokładzie.
  9. Napełnij wannę sonikatora (Rysunek Uzupełniający 7B). Naciśnij "Fill" przez 55 sekund, a następnie naciśnij "OK". Opróżnij sonikator, klikając "Drain" przez 20 s, a następnie naciskając "OK". Powtórz napełnianie i opróżnianie jeszcze raz, a następnie napełniaj ponownie przez 55 s.
  10. Napełnij kąpiel myjącą (rysunek uzupełniający 7B): naciśnij "Prime" przez 40 s, a następnie naciśnij "OK".
  11. Umieścić 384-dołkową płytkę z porcjowanymi próbkami w jej miejscu na pokładzie matrycy i zdjąć osłonę parafilmu.
  12. Rozpocznij drukowanie.
  13. Po zakończeniu drukowania opróżnij kąpiel sonikatora (Rysunek Uzupełniający 7B) i wyłącz nawilżacz.
  14. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na pokładzie tablicy przez 16-24 godziny bez nawilżania.
  15. Ponumeruj szkiełka pisakiem do znakowania odpornym na działanie alkoholu/rozpuszczalników i przechowuj je w zamkniętym próżniowo pudełku w ciemności.

5. Przetwarzanie i rozwijanie tablic

  1. Wyjmij szkiełko z zamkniętego próżniowo pudełka i umieść je w okapie chemicznym na 5 minut, układem skierowanym do góry, aby odparować nadmiar płynu.
  2. Zeskanuj slajd z najwyższym wzmocnieniem (950 PMT), aby upewnić się, że wszystkie plamki zostały wydrukowane.
  3. Kontynuuj chemiczne blokowanie grup epoksydowych na szkiełku
    1. Przygotować 50 ml roztworu blokującego etanoloaminę (0,1 M Tris-HCl, pH 8 i 0,05 M etanoloaminy). Wymieszaj 140 ml DIW z 8,8 ml Tris-HCl (1,7 M, pH 8) i 0,45 ml etanoloaminy (16,6 M). Przenieść do probówki barwiącej o pojemności 50 ml (rysunek uzupełniający 8A) i ogrzać do temperatury 50 °C.
    2. Nawodnij zjeżdżalnię. Umieść szkiełko w probówce barwiącej wypełnionej DIW, przykryj folią i inkubuj przez 5 minut, powoli i delikatnie potrząsając w temperaturze pokojowej.
    3. Zablokuj reaktywne grupy epoksydowe na szkiełku. Zanurz szkiełko w probówce barwiącej o pojemności 50 ml wypełnionej wstępnie podgrzanym roztworem blokującym etanoloaminę, przykryj folią i inkubuj przez 30 minut, powoli i delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
    4. Wyrzuć roztwór blokujący etanoloaminy do odpowiedniego pojemnika na śmieci stanowiące zagrożenie biologiczne i umieść szkiełko w nowej, czystej probówce barwiącej wypełnionej DIW o temperaturze 50 °C. Przykryj folią i inkubuj przez 10 minut, powoli i delikatnie potrząsając w temperaturze suchej stężenia.
    5. Wylać wodę i przenieść szkiełka do szklanego uchwytu do barwienia (rysunek uzupełniający 8B). Umieść uchwyt do barwienia szkła w wahadłowym uchwycie na płytkę i odwiruj suszenie szkiełka przez 5 minut przy 200 x g i RT.
  4. Ustaw rozdzielacz i kontynuuj blokowanie biologiczne.
    1. Umieść szkiełko na 16-dołkowej przegrodzie (rysunek uzupełniający 8C).
    2. Przygotować roztwór myjący PBST: 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4 + 0,1% Tween-20.
    3. Przygotować biologiczny roztwór blokujący (PBS-OVA): 5 ml PBS, pH 7,4 + 1% albuminy jaja kurzego (10 mg/mL).
      UWAGA: Wybór odczynnika blokującego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia wykrywania przeciwciał anty-Neu5Gc. Albumina jaja kurzego jest wytwarzana u kurczaków, które, podobnie jak ludzie, nie mogą syntetyzować Neu5Gc, co powoduje brak ekspresji tego Sia. W przypadku wykrywania Neu5Gc, nawet niewielkie zanieczyszczenia mogą radykalnie zmniejszyć czułość testu, czasami nawet nie wykrywając żadnej reaktywności anty-Neu5Gc. Na przykład najczęściej stosowany odczynnik blokujący, albumina surowicy bydlęcej (BSA), chociaż sama w sobie nie jest glikozylowana, zawiera zanieczyszczenia bydlęcą IgG, które przenoszą ugrupowania Neu5Gc, a zatem konkurują z drukowanymi glikanami podczas wiązania się z próbką za pomocą przeciwciał anty-Neu5Gc19,20.
    4. Wstępnie zwilż studzienki. Za pomocą pipety wielopipetowej wlej 200 μl PBST do studzienek szkiełkowych, umieść je w zakrytej wilgotnej komorze i wstrząsaj przez 5 min.
      UWAGA: Komora wilgotnościowa to szklana taca z mokrym ręcznikiem papierowym, pokryta nylonową folią i folią w celu ochrony próbek przed światłem.
    5. Usunąć PBST, delikatnie strzepując i stukając w czysty ręcznik papierowy i wsypać 200 μl buforu blokującego PBS-OVA do każdej studzienki. Umieścić w wilgotnej komorze i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
  5. Przygotować detekcję pierwotną rozcieńczoną w buforze blokującym PBS-OVA, zgodnie z tabelą 2.
    UWAGA: Do oceny jakości (QC) tej mikromacierzy sialoglikanu należy użyć kilku białek wiążących Sia: Oczekuje się, że lektyna Sambucus nigra (SNA), wyizolowana z kory czarnego bzu, rozpozna Siaα26; Oczekuje się, że Maackia Amurensis Lectin II (MALII) rozpozna Siaα23; i oczekuje się, że kurczak anty-Neu5Gc IgY rozpozna wszystkie sialoglikany zawierające Neu5Gc. Ponadto należy użyć różnych próbek surowic ludzkich do profilowania odpowiedzi anty-Neu5Gc IgG. Stężenie lektyn/przeciwciał/surowic powinno być skalibrowane doświadczalnie.
  6. Wysuszyć bufor blokujący PBS-OVA i dodać 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego do studzienki (minimalna objętość na studzienkę: 70 μl), inkubować w wilgotnej komorze przez 2 godziny.
  7. Wysuszyć detekcję pierwotną i przemyć 4 razy PBST (między 3. a 4. płukaniem inkubować szkiełko w PBST przez 5 minut w wilgotnej komorze). Umyj raz za pomocą PBS.
  8. Przygotować przeciwciało drugorzędowe w PBS, zgodnie z wykazem w Tabeli 2.
  9. Osusz PBS i dodaj 200 μl przeciwciała drugorzędowego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.
  10. Wysuszyć przeciwciało drugorzędowe i przemyć czterokrotnie PBST (między 3. a 4. płukaniem inkubować szkiełko w PBST przez 5 minut w wilgotnej komorze).
  11. Ostrożnie zdejmij ramkę i umieść szkiełka w probówce do barwienia szkiełek o pojemności 50 ml wypełnionej PBS i potrząsaj przez 5 minut.
  12. Napełnij dwie wanny do barwienia szkiełek (rysunek uzupełniający 8D) DIW, umieść szkiełko w uchwycie szkiełka i zanurz je w wannie. Szybko zanurz 10 razy, a następnie przenieś do drugiej kąpieli i zanurz jeszcze 10 razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.
  13. Wylej wodę i przenieś szkiełko do szklanego uchwytu do barwienia (Rysunek uzupełniający 8B; pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu). Umieść uchwyt do barwienia szkła w uchwycie na obrotową płytkę i odwiruj suszenie szkiełka przez 5 minut w temperaturze 200 g i RT.
  14. Zeskanuj szkiełko, a następnie przechowuj je w zamkniętym próżniowo pudełku w ciemności.

6. Skanowanie tablic i analiza danych

  1. Otwórz skaner do slajdów fluorescencyjnych i pozwól mu się ogrzać przez 5 minut. Otwórz oprogramowanie do skanowania i analizy.
  2. Ustaw parametry skanowania (rysunek uzupełniający 9A): skanowanie przy długości fali 532 nm i 100% mocy ze wzmocnieniem 350 PMT, z jedną linią do średniej i pozycją ostrości 0 μm. Użyj rozdzielczości piksela 10,0 μm.
    UWAGA: Parametry skanowania można dostosować do różnych typów slajdów, fluorescencji i rozdzielczości.
  3. Zeskanuj wywołany slajd. Otwórz drzwiczki skanera i umieść w nich szkiełko skierowanym w dół. Rozpocznij skanowanie (zielony przycisk "Odtwórz" w menu panelu nawigacji oprogramowania, Rysunek uzupełniający 9B).
  4. Zapisz zeskanowane slajdy jako plik TIFF.
  5. Przygotuj slajd do analizy. Wybierz opcję "Załaduj listę tablic" i prześlij odpowiedni plik GAL, który odwzorowuje tablice w każdym bloku na slajdzie (Rysunek uzupełniający 9C).
    UWAGA: Plik GAL zawiera informacje dotyczące zarówno tożsamości, jak i lokalizacji (X, Y) każdego miejsca na slajdzie. Plik ten może zostać utworzony przez oprogramowanie drukarki eksportujące plik tekstowy rozdzielany tabulatorami na podstawie tożsamości próbek w 384-dołkowej płycie źródłowej i zdefiniowanego projektu druku.
  6. Ustaw parametry wyrównania i analizy. Naciśnij przycisk "Opcja" w menu panelu nawigacji oprogramowania (Rysunek uzupełniający 10).
  7. Określ parametry wyrównania. Znajdź obiekty kołowe, zmień rozmiar obiektów podczas wyrównywania o 50 - 350%, ogranicz ruch elementów do maksymalnej translacji 40 μm, odznacz obiekty, które nie osiągną progu tła (próg CPI 0), oszacuj zawijanie i obracanie podczas znajdowania bloków oraz zautomatyzuj rejestrację obrazu (10 pikseli) (Rysunek uzupełniający 10).
  8. Umożliwia zdefiniowanie parametrów analizy: współczynnik W1/532, normalne odchylenie standardowe, analiza nieobecnych elementów i odejmowanie tła. Kliknij "wybierz", a następnie "mediana tła obiektu lokalnego" i ustaw 2 piksele do wykluczenia i 3-pikselową szerokość tła. Naciśnij "OK". Ustaw domyślny poziom nasycenia skanera (Rysunek uzupełniający 10).
    UWAGA: Metoda odejmowania tła zależy od projektu eksperymentalnego i może być modyfikowana zgodnie z konkretnymi potrzebami.
  9. Wyrównaj mapy obiektów. Ustaw program w trybie blokowym (naciśnij "B"), zaznacz wszystkie bloki (Ctrl+A), ustaw siatki mapy tablicy i wyrównaj wszystkie bloki (Alt+Shift+F7) (Rysunek uzupełniający 11).
  10. Udoskonal wyrównanie elementów w każdym bloku. Powiększ (naciśnij "Z", aby przejść do trybu powiększenia) do lewego górnego bloku, ponownie naciśnij "B" (tryb bloku) i naciśnij siatkę tego bloku. Przesuwaj siatkę tego bloku tylko do momentu, gdy idealnie wyrówna się z punktami bloku, a następnie naciśnij F5, aby wyrównać obiekty w tym wybranym bloku. Powtórz ruch siatki i wyrównanie F5, aż plamy zostaną idealnie zakreślone. Zrób to samo dla każdego z 16 bloków, aż wszystkie siatki zostaną na swoim miejscu.
  11. Analizuj i zapisuj dane. Zaznacz wszystkie bloki (Crtl+A), a następnie przeanalizuj dane (Alt+A). Zapisz wyniki analizy (Ctrl + U) jako plik .gpr.
  12. Otwórz zapisany plik .gpr w arkuszu kalkulacyjnym i przeanalizuj intensywność każdego punktu na podstawie fluorescencji po odjęciu lokalnego tła (F532-B532).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drukowanie, rozwój i analiza tablicy:

Drukowanie mikromacierzy sialoglikanu z wieloma próbkami glikanów i ludzkimi krzywymi IgG STD w 16 różnych blokach wymaga dokładnej kalibracji, aby zapewnić, że wszystkie próbki są drukowane tak równomiernie, jak to możliwe, we wszystkich 16 blokach na slajdzie i na wszystkich slajdach w tym samym nakładzie druku. W związku z tym przed określeniem określonych parametrów drukowania wymaganych je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udana produkcja mikromacierzy glikanowej wymaga starannego planowania i obejmuje kilka ważnych kroków w protokole. Obejmują one: (1) planowanie układów bloków i płyt, które definiują wszystkie kolejne parametry (np. odległości, odstępy, ilość próbek i druk); (2) czyszczenie kołków i zapewnienie integralności sworzni, co ma kluczowe znaczenie dla kontrolowania jednorodności plamki; (3) utrzymywanie wysokiej wilgotności podczas drukowania, co ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia parowania próbki podczas długich na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Nagrodę Rozwoju Kariery Badawczej z Izraelskiego Funduszu Badań nad Rakiem, grant od Izraelskiej Narodowej Inicjatywy Nanotechnologicznej i Helmsley Charitable Trust for a Focal Technology Area on Nanomedicines for Personalized Theranostics (V.P-K), oraz grant National Institutes of Health R01GM076360 (dla X.C.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pierwszorzędowe aminy zawierające sialoglikanyGlycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)Skontaktuj się z info@glycohubusa.com w sprawie zapytań dotyczących związkówGlikany drukowane
Fosforan sodowy jednowodnySigmaS9638Drukujący składnik buforowy
Fosforan disodowy siedmiowodnySigmaS9390Drukujący składnik buforowy
Fosforan buforowana sól fizjologicznaHy-LabsBP-507/500DBufor do drukowania / bufor inkubacyjny / myjący
Tris-baseSigmaT1503Odczynnik blokujący szkiełko
GlicerolSigmaG-7893Składnik buforowy do druku
EtanoloaminaThermo-Fisher Scientific0700/08Odczynnik blokujący szkiełko
Albumina jaja kurzego (klasa V)SigmaA5503Białko blokujące slajdy
Tween-20SigmaP7949Płyn do prania szkiełek
Alexa 555-HydrazideThermo-Fisher ScientificA20501MPMarker na tablicy
ChromPure Human IgG, cała cząsteczkaJackson Immunoresearch009-000-003Komponent drukarski
Biotynylowany- SNAVector LaboratoriesB-1305Roślinny lektyn – wiązanie Sia-alpha2– 6-linked
Biotinylated-MALIIVector LaboratoriesB-1265Lektyna roślinna – wiązanie Sia-alpha2– 3-linkowany
kurczak-anty Neu5Gc IgYBioLegend146903Pierwotne wykrywanie
Cy3-StreptavidinJackson Immunoresearch016-160-0848Wiązanie biotyny
Cy3-anty Human IgGJackson Immunoresearch109-165-088Wtórne wykrywanie przeciwko ludzkiej
IgG Cy3-anti Chicken IgYJackson Immunoresearch703-165-155Wtórne wykrywanie przeciwko kurczakom IgY
Próbki surowic ludzkichIzraelski BankKrwi Wykrywanie pierwotne
Sprężony azot (klasa 5)Ogólne narzędzie do odkurzania/suszenia
Prowadnice z powłoką epoksydowąCorning40044Slajdy
Prowadnice z powłoką epoksydowąPolyAn2D 104-00-221Slajdów. W tego typu szkiełkach powierzchnia jest bardziej hydrofobowa (w porównaniu do szkiełek rdzeniowych), dlatego glikany Print Buffer musiałyby być uzupełnione o 0,005% Tween-20, aby uzyskać 100 &mikro; plamki o rozmiarze m.
384-dołkowa płytka do mikromiareczkowaniaGenetix2070Płyta drukarska
Marker laboratoryjny VWRVWR52877-310Etykietowanie szkiełek
Rurka do barwieniaArrayItMSTNarzędzie do wywoływania szkiełek
Kąpiel barwiącaVWR25608-904Narzędzie do wywoływania szkiełek
Uchwyty do szkieł VWR631-9321Narzędzie
do wywoływania slajdówSkaner GenePixUrządzenia molekularne4000BSkaner slajdów
LM-60 NanoPrinterArrayItLM-60Drukarka
tablicowa PinyArrayIt946MP3Piny drukarskie
Moduł ProPlate GraceBio-LabsP37004Moduł wywoływania slajdów
Woda destylowanaBio-Lab2321020500Wymagany do matrycy i nawilżacza
Elektroniczny Multi Pippete, 8-kanałowy, zakres głośności 2-125 μ LThermo-Fisher Scientific (Matrix)MA-2131 Korektor Impact2 384Wielopipet do rozsiewania próbek na płytce 384-dołkowej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
  2. Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
  3. Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
  4. Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
  5. Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
  6. Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
  7. Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
  8. Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
  9. Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
  10. Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
  11. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
  12. Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
  13. Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
  14. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
  15. Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
  16. Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
  17. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
  18. Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
  19. Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
  20. Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
  21. Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
  22. Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
  23. Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
  24. Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
  25. Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
  26. Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
  27. Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Drukowanie glikan wprofilowanie przeciwciaanaliza ludzkich surowicdetekcja fluorescencyjnaszkie ka powlekane epoksydemtechnologia nanodrukarkiprzemywanie w PBSTprzeciwcia o wt rne

Powiązane artykuły