Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Inokulacja dotchawicza szczurów Fischer 344 w Francisella tularensis

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56123

⸱

30 września 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1South Texas Center for Emerging Infectious Diseases, University of Texas San Antonio, 2Midwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje dotchawicze szczepienia szczurów Fischer 344 z Francisella tularensis. Procedura ta naśladuje narażenie płuc ludzi na ten potencjalny czynnik zagrożenia biologicznego i może być wykorzystana do przetestowania skuteczności szczepionki i terapii przeciwko tularemii płucnej.

Streszczenie

Zakażenie płuc bakterią Francisella tularensis może prowadzić do poważnej i potencjalnie śmiertelnej choroby, tularemii, u ludzi. Ze względu na obecny brak zatwierdzonej szczepionki przeciwko tularemii dla ludzi, badania koncentrują się na opracowaniu szczepionki z wykorzystaniem odpowiednich modeli zwierzęcych. Szczur Fischer 344 okazał się modelem, który odzwierciedla podatność człowieka na zakażenie F. tularensis, a tym samym jest atrakcyjnym modelem do opracowania szczepionki przeciwko tularemii. Inokulacja dotchawicza szczura Fischer 344 F. tularensis naśladuje ekspozycję płucną u ludzi. Pomyślne dostarczenie do tchawicy szczura ma kluczowe znaczenie dla porodu płucnego. Laryngoskop z oświetleniem służy do prawidłowej intubacji tchawicy znieczulonych szczurów; Prawidłowe umiejscowienie w tchawicy określa proste urządzenie do wykrywania oddechu. Po intubacji posiew F. tularensis jest dostarczany w odmierzonej dawce za pomocą strzykawki. Technika ta standaryzuje dostarczanie F. tularensis do płuc w tchawicy szczura w celu oceny skuteczności szczepionki.

Wprowadzenie

F. tularensis (Ft) powoduje chorobę człowieka, tularemię. Kiedy bakterie są nabywane drogą płucną, prowadzi to do tularemii płucnej, która charakteryzuje się wysoką zachorowalnością i śmiertelnością1. F. tularensis jest uważany za czynnik zagrożenia biologicznego ze względu na niebezpieczeństwo związane z formami aerozolowymi i obecnie nie ma szczepionki zatwierdzonej do stosowania u ludzi w USA. Obecnie trwają intensywne prace nad opracowaniem szczepionek i środków terapeutycznych przeciwko tularemii płucnej, aby chronić populację ludzką przed nielegalnym stosowaniem tego bakteryjnego zagrożenia biologicznego.

Znaczna część badań nad tularemią skupia się na modelu mysim, ze względu na ekstremalną wrażliwość myszy na infekcję F. tularensis i rozpowszechnienie odczynników. Jednak myszy okazały się trudnym modelem do opracowania szczepionki, ze względu na trudności w wykazaniu skuteczności szczepionki w tym modelu2. Ostatnio szczur Fischer 344 został opracowany jako model do opracowania szczepionki przeciwko tularemii3. Wrażliwość szczura Fischer 344 na różne podgatunki F. tularensis naśladuje ludzką wrażliwość4, a szczury mogą być chronione przed prowokacją płucną F. tularensis poprzez szczepienie żywym szczepem szczepionki, o którym wiadomo, że chroni ludzi5,6,7. Ponieważ szczur Fischer 344 modeluje niektóre cechy zakażenia F. tularensis u ludzi, może być niezwykle użytecznym modelem do opracowania szczepionki, która chroni przed narażeniem na F. tularensis w płucach.

Skuteczna szczepionka musi chronić ludzi przed narażeniem płuc na F. tularensis. Najbardziej prawdopodobnym narażeniem płuc na uzbrojony F. tularensis byłyby bakterie w aerozolu wdychane do płuc 8. Jednak wytwarzanie aerozoli przez F. tularensis jest zarówno niebezpieczne, jak i uciążliwe oraz wymaga specjalistycznego sprzętu i środków zabezpieczających. Alternatywną drogą narażenia płucnego u szczura, która jest być może bardziej przystosowana do wielu laboratoriów pozbawionych specjalistycznego sprzętu, jest inokulacja dotchawicza6. Technika ta wykorzystuje laryngoskop do prawidłowego umieszczenia cewnika w tchawicy znieczulonego szczura. Umieszczenie w tchawicy, a nie w przełyku, jest weryfikowane przez proste urządzenie, które wizualizuje przepływ powietrza z płuc. F. tularensis jest następnie dostarczany do płuc przez cewnik poprzez podanie za pomocą strzykawki, a następnie wprowadzenie powietrza do cewnika, aby zapewnić dostarczenie bakterii do płuc. W przeciwieństwie do tego, Jemski5 wcześniej informował, że F. tularensis zaszczepiony szczurom Fischer 344 drogą donosową nie mógł być hodowany z płuc do 3 dni po inokulacji, co wskazuje, że inokulacja donosowa u szczurów nie powoduje bezpośredniego dostarczenia bakterii do płuc.

Wybrane formy czynnika F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) wymagają procedur bezpiecznego przechowywania na poziomie 3 (BSL3), co uniemożliwiłoby filmowanie. Jednak F. novicida (Fn) jest zwolniony ze statusu wybranego czynnika ze względu na jego zjadliwość u zdrowych ludzi i może być bezpiecznie stosowany w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) 9,10. Co więcej, Fn służy jako podstawa dla żywych atenuowanych szczepionek, które mogą chronić przed narażeniem płuc F. tularensis, gdy są dostarczane za pomocą inokulacji dotchawiczej11,12,13. Przedstawiona tutaj technika pozwala na badanie infekcji, które zachodzą drogą płucną, wykorzystując szczury jako model dla ludzi. Technikę tę można wykonać bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu do wytwarzania aerozoli. Fn został użyty do sfilmowanych tu technik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ta praca została wykonana ściśle zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokoły dotyczące zwierząt z udziałem gryzoni zostały zatwierdzone przez University of Texas at San Antonio Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na mocy protokołu MU009(RA).

1. Przygotuj cewnik, wskaźnik tchawicy i inokulum F. tularensis

  1. Przygotuj cewnik (20 G x 2 cale)
    1. Przeciąć igłę 20 G x 2 i zmielić końcówkę igły do i gładkiego wykończenia za pomocą narzędzia obrotowego.
      UWAGA: Długość stępionej igły powinna umożliwiać cofnięcie się metalowej końcówki o około 3 mm do tulei cewnika, gdy jest całkowicie osadzona na stępionej igle. igła nadaje cewnikowi sztywność strukturalną, aby umożliwić umieszczenie cewnika w tchawicy, a brak stępionej końcówki igły wystającej z tulei cewnika zapobiega uszkodzeniom tchawicy.
    2. Oczyść igły i cewniki za pomocą 70% etanolu i sterylizuj w świetle UV przez 15 minut.
  2. Przygotuj wskaźnik tchawicy
    1. Przyciąć końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl, aby końcówka mogła zamieścić się w otworze cewnika i utworzyć hermetyczne uszczelnienie.
    2. Wyjmij filtr z końcówki pipety z barierą aerozolową o pojemności 200 μl i umieść ją w uprzednio przyciętej końcówce do pipety o pojemności 1 000 μl.
    3. Upewnij się, że filtr może swobodnie poruszać się wewnątrz końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, gdy końcówka jest skierowana końcówką w dół.
  3. Inokulum F. tularensis
    1. Wyhodować F. tularensis przez noc na odpowiedniej płytce agarowej w temperaturze 37 °C. Zeskrobać około 100 μl bakteryjnego trawnika z płytki agarowej za pomocą sterylnej pętli zaszczepiającej i użyć do zaszczepienia 500 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 250 ml odpowiedniej płynnej pożywki wzrostowej (dla Fn: bulion sojowy tryptyczny (TSB) uzupełniony 0,1% monohydratu chlorowodorku L-cysteiny) i inkubować wstrząsając przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: F. novicida użyta w filmie była hodowana na płytce z tryptycznym agarem sojowym (TSA) uzupełnionym 0,1% monohydratem chlorowodorku L-cysteiny.
    2. Odwirować wyhodowaną przez noc płynną kulturę o sile 4,221 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut i usunąć supernatant bez naruszania osadu bakteryjnego.
      UWAGA: Należy postępować zgodnie z zaleceniami instytucji dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego, aby odrzucić supernatant.
    3. Delikatnie zawiesić osad bakteryjny w 25 ml odpowiedniej pożywki płynnej (Fn: TSB uzupełniony 0,1% monohydratem chlorowodorku L-cysteiny) zawierającego 10% glicerolu, używając pipety o pojemności 25 ml.
    4. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml podwielokrotność zawieszonej kultury bakteryjnej rozdzielić na 500 μl porcji w fiolkach, zamrozić w kąpieli suchego lodu i etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    5. W celu określenia miana zamrożonych fiolek z kulturami należy wyjąć dwie zamrożone fiolki przechowywane w temperaturze -80 °C, rozmrozić na lodzie i przeprowadzić seryjne rozcieńczenia w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), a następnie posiać na odpowiedniej pożywce wzrostowej (Fn: TSA zawierająca 0,1% chlorowodorku L-cysteiny). Płytki inkubuje się 24 - 48 godzin w temperaturze 37 °C, a jednostki tworzące kolonie (CFU) są liczone w celu obliczenia liczby komórek bakteryjnych w zamrożonych fiolkach do hodowli (średnio dwie fiolki).
    6. Przygotować inokulum bakteryjne przez rozmrożenie zamrożonej fiolki na lodzie, a następnie rozcieńczyć kulturę PBS do końcowego stężenia10-7 jtk/100 μl. Inokulum powinno mieć stężenie, które da pożądany CFU w 100 μL (końcowe stężenie glicerolu w inokulum nie może przekraczać 3%, aby zapobiec uduszeniu szczura). Zamrożone fiolki z kulturami bakterii przechowywane w temperaturze -80 °C mogą być używane do sześciu miesięcy po przygotowaniu.

2. Znieczulenie na szczury

  1. Podłącz komorę anestezjoterapeutyczną do prawidłowo działającego parownika izofluranu w aparacie anestezjologicznym.
  2. Podłącz rurkę do oczyszczania gazu w komorze anestezjologicznej do systemu oczyszczania gazu.
  3. Otwórz przepływ tlenu w aparacie anestezjologicznym do 4 l/min.
  4. Ustaw waporyzator izofluranu na 5%.
  5. Umieść szczura w komorze anestezjologicznej.
    UWAGA: Zazwyczaj wykorzystujemy szczury w wieku od 8 do 10 tygodni (130 - 180 g); Młodsze szczury są trudne do zaszczepienia tą techniką ze względu na mały rozmiar jamy ustnej.
  6. Gdy nastąpi indukcja znieczulenia, utrzymuj szczura na poziomie 5% izofluranu, 2 l / min tlenu do efektu. Trwa to około 3 - 10 minut.
  7. Określ głębokość znieczulenia na podstawie jakości i szybkości oddychania i bicia serca oraz reakcji na stymulację odruchową, jak w teście szczypania palców u stóp. Idealna głębokość znieczulenia jest wskazywana przez 1 - 1,5 s między każdym oddechem.

3. Inokulacja dotchawicza

  1. Wyjmij szczura z komory anestezjologicznej i umieść szczura grzbietowo na stanowisku do intubacji gryzoni. Przymocuj przednie zęby szczura do uchwytu, aby utrzymać szczura na miejscu.
    UWAGA: Jeśli szczur zacznie się budzić podczas zabiegu, cewnik można usunąć, a szczur wrócić do komory anestezjologicznej, aby osiągnąć głębszą płaszczyznę znieczulenia.
  2. Użyj dominującej ręki, aby przesunąć język w tę samą stronę, co ręka podpierająca, z kleszczami do kciuków z szerokim czubkiem.
  3. Użyj ręki podtrzymującej i przymocuj język laryngoskopem do dolnej szczęki szczura i uwidocznij tchawicę i przełyk zwierzęcia. Tchawica będzie się otwierać i zamykać, gdy szczur oddycha.
  4. Wprowadzić do tchawicy cewnik zawierający igłę w rozmiarze 20G, przygotowaną w kroku 1.1. Może wystąpić niewielki opór, a wprowadzenie do tchawicy może być "wyboiste" z powodu pocierania chrząstek tchawicy przez cewnik. Z powodu wilgoci lub płytkiego oddychania tchawica może zostać pokryta nagłośnią, co uniemożliwia wizualizację tchawicy. Delikatne dotknięcie krawędzi chrząstki nagłośni spowoduje otwarcie płata chrząstki i odsłonięcie tchawicy.
  5. Usuń igłę z cewnika, upewniając się, że cewnik pozostaje w tchawicy.
  6. Odczekaj kilka sekund, aby szczur był w stanie oddychać wokół cewnika wprowadzonego do tchawicy.
  7. Mocno osadzić wskaźnik tchawicy na otworze cewnika. Ruch bariery aerozolowej będzie wskazywał, że cewnik jest prawidłowo wprowadzony do tchawicy.
  8. Upewnij się, że szczur leży na stanowisku do intubacji w taki sposób, aby klatka piersiowa zwierzęcia była skierowana prostopadle do płaszczyzny stanowiska do intubacji.
  9. Wyjąć wskaźnik tchawicy i dostarczyć 100 μl (107 CFU) inokulum zawierającego F. tularensis za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl, mocno przytrzymując końcówkę przy otworze cewnika.
  10. Podłączyć strzykawkę tuberkulinową o pojemności 1 ml wypełnioną powietrzem i dostarczyć 300 μl powietrza, aby zapewnić, że inokulum dotrze do płuc szczura.
  11. Usuń cewnik z tchawicy i usuń szczura z platformy chirurgicznej.
  12. Pozwól szczurowi się obudzić i wrócić do klatki. Upewnij się, że oddech wrócił do normy.
  13. Oznaczyć jtk w inokulum F. tularensis zgodnie z opisem w kroku 1.3.5, aby potwierdzić jtk dostarczony do tchawicy.
  14. Powtórzyć kroki 3.1 - 3.9 na nieszczepionych (nieleczonych) zwierzętach z 100 μl PBS zamiast inokulum.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Odpowiedź humoralna na doksztrakealną inokulację F. tularensis u szczura może być określona za pomocą enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA) przeciwko bakteriom inaktywowanym promieniami UV, zgodnie z wcześniejszym opisem11. Całkowita odpowiedź immunoglobuliny G (IgG) szczurów szczepu Fischer 344 na inaktywowane całe komórki bakterii była oceniana po doksztrakealnej inokulacji atenuowanym szczepem Fn (inakulum 107 CFU) w 14. i 28. dniu (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szczur Fischer 344 staje się ważnym modelem do opracowania szczepionki przeciwko tularemii3. Narażenie na F. tularensis drogą płucną ma kluczowe znaczenie dla wykazania skuteczności przeciwko uzbrojonym formom F. tularensis, ponieważ są one dostarczane w postaci aerozoli. Inokulacja dotchawicza szczura ułatwia narażenie płuc szczura na F. tularensis bez potrzeby stosowania dużych, drogich i skomplikowanych urządzeń do wytwarzania aerozoli. Wszystkie eksperymenty wykorzys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Defense Threat Reduction Agency (DTRA) w ramach kontraktu HDTRA1-14-C-0116 oraz Center for Excellence in Infection Genomics (DOD #W911NF-11-1-0136).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ostrze światłowodowe GreenLine rozmiar 0Carefusion5-5231-00Macintosh Uchwyt
laryngoskopowy o profilu amerykańskim GreenLight Carefusion4559GSP
Cewnik dożylny Exel International Safelet EXELINTERNATIONAL26743
Sterylne strzykawki z końcówką ślizgową 1 mlBD309659
Szczypce do opatrunku na kciuk z szerokim punktemThermo Scientific76-302
200 μ Końcówka barierowa LGeneseeScientific24-142
1,000 μ L końcówka do pipetOlympus Plastics24-173
Dremel 3000-2/28 Zestaw narzędzi obrotowychDremel
BraintreeScientificRIS 200
IsofluraneButler ScheinNDC 11695-6776-2
Aparat do znieczulania gryzoniSurgivetVTC302 Klasyczna
Braintree ScientificAB 1
Stojak do intubacji gryzoni 3000228 komora do znieczulenia gryzoni T3

Bibliografia

  1. Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. Tularemia. Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).
  2. Lyons, C. R., Wu, T. H. Animal models of Francisella tularensis infection. Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).
  3. Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4. Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).
  4. Ray, H. J., et al. The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies. PloS one. 5, e9952(2010).
  5. Jemski, J. V. Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats. Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).
  6. Wu, T. H., et al. Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains. Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).
  7. Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains. Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).
  8. Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis. Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).
  9. Kingry, L. C., Petersen, J. M. Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida. Front Cell Infect Microbiol. 4, 35(2014).
  10. Rohmer, L., et al. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 8 (6), R102(2007).
  11. Chu, P., et al. Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates. PLoS Pathog. 10 (10), e1004439(2014).
  12. Signarovitz, A. L., et al. Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112ΔiglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model. PloS one. 7 (10), e47639(2012).
  13. Cunningham, A. L., et al. Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB. Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Szczur Fischer 344płucna tularemiaskuteczność szczepionkiintubacja laryngoskopowawprowadzenie cewnika do tchawicyodpowiedź przeciwciał w teście ELISAfiltr barierowy do aerozolistatyw do intubacji gryzoni
Inokulacja dotchawicza szczurów Fischer 344 w Francisella tularensis
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.