3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Summary

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

Abstract

Badania przeprowadzone w ostatniej dekadzie ujawniły złożoną i dynamiczną różnorodność reakcji rozszczepienia i poliadenylacji pre-mRNA. mRNA z długimi regionami nieulegającymi translacji 3' (UTR) są generowane w zróżnicowanych komórkach, podczas gdy komórki proliferujące preferencyjnie wyrażają transkrypty z krótkimi 3'UTR. Opisujemy protokół A-seq, obecnie w swojej drugiej wersji, który został opracowany w celu mapowania miejsc poliadenylacji w całym genomie i badania regulacji przetwarzania końcowego pre-mRNA 3'. Również ten obecny protokół wykorzystuje ogony poliadenylowe (poli(A)), które są dodawane podczas biogenezy większości mRNA ssaków w celu wzbogacenia na w pełni przetworzone mRNA. Adaptor DNA z deoksyuracylem w czwartej pozycji umożliwia precyzyjne przetwarzanie fragmentów końcowych mRNA 3' do sekwencjonowania. Nie wliczając hodowli komórkowej i ligacji przez noc, protokół wymaga około 8 godzin czasu praktycznego. Wraz z nim dostarczany jest łatwy w użyciu pakiet oprogramowania do analizy uzyskanych danych sekwencjonowania. A-seq2 i związane z nim oprogramowanie analityczne zapewniają wydajne i niezawodne rozwiązanie do mapowania końców pre-mRNA 3' w szerokim zakresie warunków, od 10⁶ lub mniej komórek.

Introduction

Wychwytywanie i sekwencjonowanie końcówek mRNA 3' pozwala na badanie przetwarzania mRNA i kwantyfikację ekspresji genów. Ze względu na swoje ogony poli(A), eukariotyczne mRNA mogą być skutecznie oczyszczane z całkowitych lizatów komórkowych za pomocą unieruchomionych cząsteczkami oligo-deoksytymidyny (oligo(dT)) unieruchomionymi kulkami, które mogą również inicjować syntezę cDNA. Takie podejście ma jednak dwie wady. Po pierwsze, odcinki A, które są wewnętrzne dla transkryptów, mogą również inicjować syntezę cDNA, co skutkuje fałszywymi miejscami poli(A). Po drugie, jednorodne odcinki poli(A) stanowią szczególne wyzwanie dla sekwencjonowania, oprócz tego, że nie dostarczają informacji do identyfikacji transkryptów. Zaproponowano różne podejścia w celu obejścia tych ograniczeń, takie jak odwrotna transkrypcja przez ogony poli(A), a następnie trawienie RNazy H (3P-seq ¹), użycie niestandardowego startera sekwencjonowania kończącego się na 20 Ts (2P-seq ²), wstępna selekcja fragmentów RNA z ogonami poli(A) ponad 50 nukleotydów ze starterem CU₅T₄₅, a następnie trawienie RNazy H (3'READS ³) oraz użycie podkładu oligo-dT, który zawiera adapter 3' w spince do włosów (A-seq ⁴).

Niedawno opracowana metoda A-seq2 ⁵ ma na celu ominięcie sekwencjonowania przez poli(A) i jednocześnie zminimalizowanie proporcji dimerów, które są generowane przez samoligaturację adapterów, szczególnie występujących, gdy stężenie molowe adapterów przeważa nad stężeniem insertu. Problem ten można wyeliminować, gdy oba adaptery są ligowane do tego samego typu końcówek polinukleotydowych, jak w A-seq2, gdzie adaptery 3' są ligowane do końca 5' fragmentów RNA, a adaptery 5' do końców 5' cDNA po odwrotnej transkrypcji. Metoda jest wygodniejsza niż nasza wcześniej proponowana sekwencja A-seq - w której sekwencjonowanie odbywało się w kierunku od 5' do 3', co wymagało precyzyjnie kontrolowanej fragmentacji RNA - przy zachowaniu wysokiej dokładności identyfikacji miejsca poli(A). Około 80% zsekwencjonowanych odczytów w typowych próbkach odwzorowuje jednoznacznie genom i prowadzi do identyfikacji ponad 20 000 klastrów poli(A), z których ponad 70% pokrywa się z adnotowanymi 3'UTR.

W skrócie, protokół A-seq2 zaczyna się od fragmentacji mRNA i ligacji adapterów 3' odwróconego dopełniacza do końców 5' fragmentów RNA. RNA zawierające poli(A) są następnie odwrotnie transkrybowane za pomocą startera oligo(dT) o długości 25 nukleotydów (nt), który zawiera nukleotyd kotwiczący na końcu 3', dU na pozycji 4 i biotynę na końcu 5', umożliwiając wiązanie cDNA z magnetycznymi kulkami streptawidyny. Większość startera, w tym biotyna, jest usuwana z cDNA przez rozszczepienie w dU przez mieszaninę enzymów USER, zawierającą glikozylazę DNA uracylu (UDG) i glikozylazę DNA Endonukleazę VIII. Ta reakcja pozostawia nienaruszone końce do podwiązania adaptera 5', a trzy T pozostałe po rozszczepieniu pozostają, aby zaznaczyć położenie ogona poli(A). Ponieważ zarówno adaptery 5', jak i 3' są przymocowane przez ligację do końcówek 5' odbiorcy, nie są generowane żadne dimery adaptera. Cztery losowe mery nukleotydowe wprowadzone na początku odczytów umożliwiają rozdzielczość klastra na najnowocześniejszych instrumentach sekwencjonowania, a także mogą służyć jako unikalny identyfikator molekularny (UMI) do wykrywania i usuwania artefaktów amplifikacji PCR. Rozmiar UMI można jeszcze bardziej zwiększyć, tak jak to miało miejsce w innych badaniach ⁶. Protokół generuje odczyty, które są odwrotnie komplementarne do końców mRNA 3', wszystkie zaczynające się od randomizowanego tetrameru, po którym następują 3 Ts. Przetwarzanie odczytów, które mają 3 diagnostyczne T na końcu 5', rozpoczyna się od korekcji artefaktów amplifikacji PCR poprzez wykorzystanie UMI, usunięcie sekwencji adaptera 3' i odwrotną komplementację. Odczyty, które mogły pochodzić z primingu oligo(dT) w wewnętrznych miejscach bogatych w A, są również identyfikowane obliczeniowo i odrzucane. Miejsca fałszywe na ogół nie mają jednego z 18 dobrze scharakteryzowanych i konserwatywnych sygnałów poli(A), które powinny znajdować się ~21 nukleotydów przed pozornym miejscem rozszczepienia ⁷.

Protokół wymaga około 8 godzin praktycznego czasu, nie licząc hodowli komórkowych i nocnych ligacji. Powiązane oprogramowanie do analizy odczytu umożliwia bardzo dokładną identyfikację lokalizacji poli(A). Z klastrów poli(A) utworzonych na podstawie 4 próbek szczegółowo opisanych w tym manuskrypcie (dwie biologiczne repliki kontrolnych komórek siRNA i komórek traktowanych si-HNRNPC) 84% pokrywa się z opisanym genem, a spośród nich 75% pokrywa się z 3' UTR, a 86% z 3' UTR lub końcowym eksonem. Współczynnik korelacji Pearsona końca 3' w próbkach powtórzonych wynosi 0,92, a za pomocą tej metody zwykle uzyskuje się wartości powyżej 0,9. Tak więc A-seq2 jest wygodną metodą, która daje bardzo powtarzalne wyniki.

Protocol

1. Wzrost komórek i izolacja mRNA

1. Hoduj komórki zgodnie z projektem eksperymentalnym na płytkach 6-dołkowych do ~1 x 10⁶ komórek na dołek przy 80% konfluencji.
2. Usuń pożywkę wzrostową i raz umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Bezpośrednio poddać lizie komórki na płytce, dodając 1 ml buforu do lizy z zestawu do izolacji mRNA. Przenieś lepki lizat do plastikowej probówki o pojemności 15 ml z końcówką do pipety o pojemności 1 ml. Użyj gumowej szpatułki, aby całkowicie oderwać materiał komórkowy od powierzchni płytki.
3. Ścinać lizat zawierający lepkie DNA za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml przymocowanej do igły podskórnej o sile 23 G, wykonując kilka energicznych ruchów tłoka w górę i w dół, aż lizat przestanie być lepki. Skieruj igłę strzykawki na środek dna, aby uniknąć wyrzucenia lizatu z probówki.
4. Przenieść lizat do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą strzykawki. Wirować przez 5 minut w temperaturze 20 000 x g i 4 °C, aby usunąć zanieczyszczenia. Używaj fiolek o niskim poziomie wiązania DNA 1,5 ml przez cały czas trwania protokołu.
5. Podczas pracy wirówki przemyć 300 μl zawieszonych kulek magnetycznych oligo (dT)₂₅ na stojaku magnetycznym z 500 μl buforu do lizy. Wymieszaj probówki 2-3 razy na ruszcie. Usunąć bufor po tym, jak roztwór będzie klarowny. Zebrać klarowny supernatant z kroku 1.4 i dodać do kulek. Ponownie zawieś i umieść rurki na obracającym się kole na 10 minut.
6. Umieść rurki na stojaku magnetycznym. Usuń klarowny płyn po 2 minutach. Dodaj 0,8 ml buforu A z zestawu do izolacji mRNA. Obróć rurkę o 180° stopni na stojaku 2-3 razy. Powtórz ten etap mycia jeszcze raz z buforem A.
7. Umyj kulki 2 razy 0,8 ml buforu B, jak opisano w kroku 1.6.
8. Aby wymyć związane mRNA z kulek, dodaj 33 μl H₂O i ponownie zawieś kulki. Podgrzewać do 75 °C przez 5 minut na rozgrzanym bloku. Natychmiast obracaj rurki przez 1 s i umieść je na stojaku magnetycznym. Przenieść supernatant do nowej probówki. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego wykorzystania.
9. Dodać 66 μl alkalicznego buforu hydrolitycznego do 33 μl mRNA (krok 1.8), wymieszać i podgrzewać dokładnie przez 5 minut w temperaturze 95 °C na bloku grzewczym. Natychmiast schłodzić rurki na lodzie.
10. Wyizoluj RNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA.
    UWAGA: Potwierdź głośność; powinno to być 100 μL.
    1. Dodaj 350 μl buforu RLT z zestawu i 250 μl etanolu. Załaduj na kolumnę i wiruj przez 30 s przy 8 000 x g w temperaturze pokojowej (RT). Przemyć 500 μl buforu RPE z zestawu. Umyć 500 μl 80% etanolu. Wirować przez 5 minut w temperaturze 20 000 x g, aby wysuszyć kolumnę. Dodać 36 μL H₂O do kolumny i wirować przez 1 minutę w temperaturze 20 000 x g. Wyrzuć kolumnę i zachowaj eluat.

2. 5' koniec fosforylacji i leczenia DNazą

1. Dodać 5 μl buforu kinazy polinukleotydowej, 5 μl 10 mM ATP, 1 μl inhibitora rybonukleazy, 1 μl DNazy i 2 μl kinazy polinukleotydowej do próbek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Opcjonalnie przygotować główne mieszaniny reakcyjne w całym protokole, mieszając 1,1 objętości x n (n = liczba próbek) każdego składnika.
2. Zmień bufor i usuń ATP z kolumny wirowej, aby zapobiec dodawaniu poli(A) w następnym kroku.
   1. Wstępnie wirować kolumny przy 735 x g przez 1 min. Przenieść kolumny do nowych fiolek o pojemności 1,5 ml i załadować reakcje kinazy na kolumny. Obracaj kolumny 2 minuty przy 735 x g. Odrzucić kolumny i umieścić probówki z zebranymi reakcjami na lodzie lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Blokowanie 3' kończy się trifosforanem kordycepiny

UWAGA: Istotne jest, aby zablokować 3' końce fragmentów RNA, aby uniknąć ich konkategoryzacji w kolejnych reakcjach ligacji. Końce 3', które nie są jeszcze zablokowane przez (cykliczny) fosforan po hydrolizie, są traktowane przez dodanie nukleotydu terminatora łańcucha 3' dATP (trifosforan kordycepiny) za pomocą polimerazy poli(A). W tym przypadku zastosowano polimerazę poli(A) drożdży (yPAP), która została wyrażona i oczyszczona zgodnie z opisem w ⁸ w stężeniu 0,5 mg/mL. Drożdże lub E. coli PAP mają prawie taką samą aktywność przy dodawaniu 3'dATP i można je kupić na rynku (patrz tabela materiałów).

1. Dodać 13,5 μl 5x skoncentrowany bufor reakcyjny polimerazy poli(A), 2 μl 10 mM 3' dATP, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl polimerazy poli(A) do reakcji z kroku 2.2.1. Mieszaj i wiruj przez 1 s. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Dodać 32,5 μl_H2Odo każdej reakcji. Oczyść RNA jak w kroku 1.10.1. Eluować RNA za pomocą 14 μl_H2O.

4. Ligacja odwróconych adapterów 3' do końca 5' fragmentów RNA

1. Umieścić reakcje w koncentratorze próżniowym na 10 minut, aby zmniejszyć objętość do 6 μL. Dodać 3 μL 10x bufor ligacyjny T4 RNA, 3 μL 10 mM ATP, 15 μL PEG-8000, 1 μL inhibitora RNazy, 1 μL 0,1 mM adaptera 3' z odwróconym dopełniaczem "revRA3" (patrz Tabela Materiałów) i 1 μL ligazy RNA o wysokim stężeniu 1, mieszać.
2. Inkubować reakcje w temperaturze 24 °C przez 16 godzin na podgrzewanym mieszalniku z przerywanym mieszaniem przy 1 000 obr./min. Dodać 70 μl H₂O do każdej reakcji i wymieszać. Oczyść RNA jak w kroku 1.10.1. Eluować RNA za pomocą 14 μL_H2O. W tym momencie próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Odwrotna transkrypcja (RT)

1. Umieścić eluaty w koncentratorze próżniowym na 3 minuty, aby zmniejszyć objętość do 11 μl. Przenieść reakcje do probówek PCR o pojemności 200 μl. Dodać 1 μl 0,05 mM podkładu RT "Bio-dU-dT25". Podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 70 °C w cyklerze PCR i pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.
2. Dodaj 1 μl 10 mM dNTP, 4 μL 5x bufor odwrotnej transkryptazy, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy. Mieszać i podgrzewać reakcje przez 10 minut do 55 °C i od 10 minut do 80 °C w cyklerze PCR. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze -80°C dla dłuższego przechowywania.

6. Trawienie mieszanką enzymów glikozylazy DNA uracylu

1. Odpipetować 100 μl kulek streptawidyny do fiolki o pojemności 1,5 ml, ponownie zawiesić w 800 μl buforu wiążącego biotynę i umieścić na stojaku magnetycznym. Odwróć rurki 2-3 razy. Usuń bufor, gdy jest czysty. Powtórz krok prania. Ponownie zawiesić kulki w 200 μl buforu wiążącego biotynę.
2. Dodać reakcję odwrotnej transkrypcji do roztworu kulek i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C na obracającym się kole. Umyj koraliki 2x buforem wiążącym biotynę, jak w kroku 6.1 i 2x buforem TEN na stojaku magnetycznym. Zawiesić kulki w 50 μl buforu TEN, dodać 2 μl mieszanki enzymów glikozylazy DNA uracylu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w mieszalniku z przerywanym mieszaniem.
3. Dodać do reakcji 50 μl_H2O, 11 μl buforu RNazy H i 1 μl RNazy H. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i przenieś płyn zawierający rozszczepione cDNA do nowej probówki
4. Oczyść rozszczepione cDNA.
   1. Dodać 550 μl buforu PB z zestawu do oczyszczania PCR do reakcji rozszczepiania. Dodać 10 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2, aby obniżyć pH. Załadować reakcje na kolumny wirowe o minimalnej elucji i wirować z prędkością 17 000 x g przez 1 min.
   2. Dodać 750 μl buforu PE do kolumn i wirować z prędkością 17 000 x g przez 1 min. Wyrzuć przepływ. Obracaj kolumny z prędkością 17 000 x g przez 1 minutę do wyschnięcia. Przenieść kolumny do fiolki o pojemności 1,5 ml, dodać 16 μl H₂O i wirować w temperaturze 17 000 x g przez 1 minutę. Umieścić reakcje w koncentratorze próżniowym na 8 minut, aby zagęścić się do objętości 7 μl.

7. Ligacja adapterów 5' do końców 5' cDNA

1. Do wyizolowanego cDNA dodaj 3 μl 10x bufor ligazy RNA T4 1, 3 μl 10 mM ATP, 15 μL PEG-8000, 1 μL 50 μM oligo "revDA5" i 1 μl ligazy T4 RNA o wysokim stężeniu 1. Inkubować w temperaturze 24 °C przez 20 godzin. Dodać 70 μl H₂O do każdej reakcji. W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

8. Pilotażowy PCR, Amplifikacja Bibliotek i Wybór Rozmiaru

1. W reakcji pilotażowej określ optymalną liczbę cykli PCR, aby osiągnąć amplifikację biblioteki w fazie wykładniczej.
   1. Odpipetować 25 μl mieszaniny polimerazy DNA, 20 μl reakcji ligacji, 2 μl_H2O, 1,5 μL 10 μM startera do przodu PCR (RP1) i 1,5 μl 10 μM startera indeksu reverse PCR do probówki 200 μL.
   2. Uruchom cykler z następującym programem: 3 min 95 °C, a następnie 20 cykli po 20 s 98 °C, 20 s 67 °C i 30 s 72 °C. Zebrać 7 μl porcji po 6, 8, 10, 12, 14, 16 i 18 cyklach bezpośrednio z cyklera. Dodać 1 μl 10x bufor ładujący (50% glicerolu, 0,05% cyjanolu ksylenowego). Uwaga: W przypadku korzystania z multipleksowania podczas łączenia kodów kreskowych należy postępować zgodnie z zaleceniami dostawcy.
   3. Oddzielić produkty w małych szczelinach na 2% żelu agarozowym w 1x buforze TBE zawierającym rozcieńczenie 1:10,00 fluorescencyjnego zielonego barwnika.
      1. Załaduj porcje na 2% żel agarozowy i uruchom żel pod napięciem 100 V przez 15 minut. Wizualizacja migracji produktów PCR w systemie dokumentacji żelu.
2. Użyj liczby cykli na początku amplifikacji wykładniczej w reakcji pilotażowej dla reakcji PCR na dużą skalę z dwukrotnie większymi objętościami niż w reakcji pilotażowej (Rysunek 2).
   1. W przypadku reakcji PCR na dużą skalę, najpierw zagęścić i odsolić reakcje za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, a następnie oddzielić produkty na szerokich szczelinach na 2% żelach agarozowych w 1x buforze TBE.
3. Wytnij plastry żelu zawierające 200-350 nt produktów DNA. Rozpuść żel w buforze chaotropowym w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 30 minut. Wyekstrahuj DNA z plastrów żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Nie podgrzewać do 50 °C, aby zapobiec odchyleniu w wiązaniu DNA bogatego w A ⁹.
4. Prześlij do sekwencjonowania.
   UWAGA: Zazwyczaj wystarczy 50 cykli pojedynczego odczytu (SR50) (patrz np. https://www.illumina.com/technology/next-generation-sequencing.html).

9. Przetwarzanie danych

UWAGA: Wynikowe dane sekwencjonowania (w formacie fastq) są przetwarzane za pomocą oprogramowania dostępnego w repozytorium gitlab (https://git.scicore.unibas.ch/zavolan_public/A-seq2-processing). Analiza obejmuje cztery główne kroki: (1) pobranie repozytorium git, (2) instalację środowiska wirtualnego, (3) ustawienie określonych parametrów w pliku konfiguracyjnym oraz (4) uruchomienie analizy poprzez 'snakemake' ¹⁰. Cała analiza wykonana w kroku 4 wymaga tylko jednego polecenia. Szczegółowy opis analizy krok po kroku znajduje się w pliku README w repozytorium gitlab, a krótki opis dostępny jest poniżej. Wszystkie poszczególne etapy przetwarzania są realizowane poprzez wykonanie publicznie dostępnych narzędzi, pochodzących ze źródeł zewnętrznych lub przygotowanych we własnym zakresie. Potok obliczeniowy zależy od opartego na anakondzie środowiska wirtualnego ¹¹ python 3 z dostępnym pakietem snakemake ¹⁰. Działa na maszynach z systemem operacyjnym podobnym do Uniksa i został przetestowany w środowisku Linux z zainstalowanym systemem operacyjnym CentOS 6.5 i dostępnymi 40 GB pamięci RAM. Zależności oprogramowania są automatycznie kontrolowane w środowisku wirtualnym. Wymagane są następujące publicznie dostępne narzędzia programowe, które są instalowane wraz ze środowiskiem: snakemake (v3.9.1) ^10,fastx toolkit (v0.0.14) ¹², STAR (v2.5.2a) ¹³, cutadapt (v1.12) ¹⁴, samtools (v1.3.1) ^14,15, bedtools (v2.26.0) ^16,17.

1. Wstępne przetwarzanie danych z odczytów do cDNAs
   UWAGA: Głębokość sekwencjonowania może się różnić w zależności od serii i, w zależności od urządzenia, dane z jednej próbki mogą być podzielone na wiele plików sekwencji. W takim przypadku połącz pliki odpowiadające jednej próbce w jeden plik wejściowy, który jest używany w poniższych krokach.
   1. Konwertuj plik z formatu fastq na fasta.
   2. Odczyty ekstraktu o prawidłowej strukturze (3 tymidyny w pozycjach 5, 6 i 7 odczytu).
      UWAGA: Odczyt, który jest prawidłowo przygotowany zgodnie z opisanym powyżej protokołem eksperymentalnym, powinien mieć strukturę (od końca 5'): 4-nukleotydowy kod kreskowy - 3 tymidyny - odwrotne uzupełnienie końca transkryptu 3'.
   3. Przechowuj informacje o początkowym tetramerze w wierszu opisu sekwencji.
      UWAGA: Tetramer służy jako unikalny identyfikator molekularny (UMI), który ułatwia korektę artefaktów amplifikacji w dalszej części analizy.
   4. Usuń pierwsze siedem nukleotydów z końca 5' odczytu.
   5. Popraw artefakty wzmocnienia, zachowując tylko jedną kopię odczytów z tą samą sekwencją wstawiania i UMI.
   6. Usuń część końca 3', która pasuje do sekwencji adaptera, a następnie odwróć uzupełnienie sekwencji. Kontynuuj tylko z odczytami, które mają minimalną długość (domyślnie: 15 nt).
      UWAGA: W zależności od długości oryginalnego fragmentu mRNA i liczby cykli sekwencjonowania, koniec 3' odczytu może zawierać część adaptera 3', która jest usuwana na tym etapie.
2. Wyodrębnij wszystkie odczyty, które spełniają następujące kryteria: maksymalnie 2 nieznane nukleotydy ("N"), maksymalnie 80 % As i ostatni nukleotyd odczytanego nukleotydu nie A. Odczyty te uważa się za wystarczająco wysokiej jakości, aby można je było wykorzystać w analizie.
3. Zamapuj odczyty do genomu za pomocą narzędzia, które obsługuje odczyty złożone i generuje plik wyjściowy w formacie BAM.
   1. Jeśli używany jest STAR, utwórz plik z indeksem genomu, do którego powinny być mapowane odczyty. W przypadku ludzkiego genomu ten krok wymaga 35 GB pamięci (RAM).
   2. Mapuj odczyty do genomu.
      UWAGA: (uwagi specyficzne dla STAR) Miękkie przycinanie jest wyłączone, aby wymusić mapowanie końca 3' każdego odczytu, ponieważ jest to nukleotyd znajdujący się bezpośrednio przed miejscem rozszczepienia.
4. Przekonwertuj BAM na plik BED. Jeśli odczyt jest mapowany do wielu lokalizacji, zachowaj tylko te o najmniejszej odległości edycji.
   UWAGA: Jako punktacja używany jest numer kopii odczytu zmapowanego w określonej lokalizacji. Odczyty, które są mapowane do wielu lokalizacji, są liczone ułamkowo w każdej lokalizacji z wagą równą 1/liczbę lokalizacji, do których odczyt jest mapowany.
5. Zwijanie odczytów, które różnią się prawdopodobnym błędem sekwencjonowania. Jeśli dwa różne odczyty są mapowane do tej samej lokalizacji (pozycja początkowa i końcowa mapowań jest identyczna) i mają ten sam UMI, należy je traktować jako duplikaty PCR i zachować tylko jeden.
6. Wywnioskuj wszystkie indywidualne końcowe miejsca przetwarzania pre-mRNA 3'.
   UWAGA: Indywidualny odczyt dostarcza dowodów na koniec 3', gdy jego ostatnie cztery nukleotydy są mapowane do genomu bez błędu. Pozycja, do której zapisany jest koniec 3' odczytywanych map jako miejsce rozszczepienia.
7. Wykryj 3-calowe miejsca końcowe, które mogły pochodzić z wewnętrznego gruntowania. Zdefiniuj miejsce jako wewnętrzny artefakt gruntowania, gdy 10 nt za miejscem rozszczepienia w genomie spełnia jedno z następujących kryteriów: zawiera więcej niż sześć As, zawiera sześć kolejnych As lub zaczyna się od jednego z następujących tetramerów: AAAA, AGAA, AAGA, AAAG.
8. Wygeneruj tabelę poszczególnych 3-calowych miejsc obróbki końcowej w formacie BED.
9. Zidentyfikuj niezależnie regulowane klastry poli(A).
   UWAGA: Opisane tutaj kroki są zgodne z procedurą, która została wprowadzona w poprzedniej publikacji ⁵.
   1. Zacznij od zebrania poszczególnych 3' końcowych miejsc przetwarzania, które uzyskano we wszystkich próbkach badania.
   2. Opisz znane sygnały poli(A) ⁷ w obszarze od -60 do +10 nukleotydów wokół każdego indywidualnego miejsca przetwarzania na końcu 3'.
   3. Zidentyfikuj miejsca poli(A) wyrażone powyżej tła w każdej próbce w następujący sposób.
      1. Posortuj witryny według ich nieprzetworzonego wyrażenia w bieżącym przykładzie. Przechodzenie przez listę witryn od góry do dołu, kojarząc witryny o niższej pozycji z witryną o wyższej pozycji, jeśli znajdują się w określonej odległości w genomie (domyślnie: 25 nt w górę lub w dół) od witryny o wysokiej pozycji.
         UWAGA: Wszystkie witryny o niskiej pozycji w rankingu skojarzone z witryną o wysokiej klasyfikacji definiują klaster, którego wyrażeniem jest liczba odczytów dokumentujących wszystkie te witryny.
      2. Sortuje te klastry według wyrażeń i przesiewa listę klastrów od najwyższego do najniższego wyrażenia, określając próg wyrażenia c, przy którym odsetek klastrów z adnotacją sygnałową poly(A) spada poniżej wstępnie zdefiniowanego progu (domyślnie: 90%).
      3. Odrzuć lokacje z dowolnego klastra poniżej wartości granicznej.
   4. Grupowanie blisko rozmieszczonych 3' miejsc końcowych uzyskanych w próbkach.
      UWAGA: Sortuj 3-calowe końcowe miejsca przetwarzania najpierw według liczby próbek pomocniczych, a następnie według sumy znormalizowanej liczby odczytów (odczytów na milion (RPM)) w próbkach. Przechodzenie przez listę od góry do dołu, kojarzenie witryn o niższej pozycji w rankingu z witrynami o wyższej pozycji, gdy ich odległość do witryny o wyższej pozycji nie jest większa niż wstępnie zdefiniowany limit (domyślnie: 12 nt). Za każdym razem, gdy którykolwiek z elementów składowych 3' końcowych nakłada się na sygnał poli(A) z adnotacjami lub ma sygnał poli(A) bezpośrednio za nim, odpowiedni klaster jest oznaczany do dalszej kontroli w celu wykrycia wewnętrznego zalewania.
   5. Scalanie klastrów lokacji poly(A).
      UWAGA: Gdy klaster jest oznaczony jako przypuszczalny kandydat na wewnętrzny sygnał, jest on albo łączony z klastrem podrzędnym, jeśli te dwie klastry współdzielą swoje sygnały poli(A), albo zachowywany, jeśli najbardziej wysunięte miejsce w klastrze ma sygnał poli(A) zlokalizowany w minimalnej odległości przed klastrem (domyślnie: 15 nt). Wreszcie, gęsto rozmieszczone klastry są łączone, jeśli: (i) dzielą ten sam sygnał poli(A), lub (ii) rozpiętość wynikowego klastra nie przekracza maksimum (domyślnie: 25 nt).
   6. Przechowuj klastry w formacie pliku BED z łączną znormalizowaną liczbą odczytów ze wszystkich 3-calowych lokacji końcowych w każdym klastrze jako wynik.

Results

RNA zawierające poli(A) zostało wyizolowane z hodowanych komórek, rozdrobnione przez hydrolizę alkaliczną, a cDNA wytworzono przez odwrotną transkrypcję za pomocą starterów oligo(dT). Otrzymane cDNA unieruchomiono na kulkach streptawidyny, dU rozszczepiono w reakcji wycinania specyficznego dla uracylu, łączniki podwiązano do końców 5' i 3' rozszczepionego fragmentu, a wstawki zsekwencjonowano. Rysunek 1 przedstawia graficzny zarys eksperymentu.

Dla komórek HeLa i HEK293, 10⁶ komórek było wystarczających do zidentyfikowania miejsc poli(A) dla zdecydowanej większości genów kodujących białka pod koniec procedury. Jednak w przypadku innych typów komórek lub tkanek może być konieczne zbadanie nasycenia liczby zidentyfikowanych miejsc poli(A) wraz ze wzrostem liczby komórek użytych w eksperymencie. Reprezentatywne wyniki etapu pilotażowego PCR i analizy fragmentu DNA próbki przed sekwencjonowaniem przedstawiono na rysunku Rysunek 2.

Rysunek 3 pokazuje etapy wstępnego przetwarzania analizy obliczeniowej, zaczynając od pliku fastq uzyskanego z sekwencera, a kończąc na sprawdzonych jakościowo, przyciętych za pomocą adaptera odczytach, które są gotowe do zmapowania do genomu. Rysunek 4 pokazuje etapy analizy, które rozpoczynają się od mapowania odczytów do odpowiedniego genomu, a kończą na katalogu końcowych miejsc przetwarzania mRNA 3', które są zidentyfikowane w konkretnej próbce. Gdy analizowanych jest wiele próbek, przeprowadza się dodatkowe kroki w celu dopasowania 3-calowych miejsc przetwarzania końców, które znaleziono w poszczególnych próbkach i podania ich obfitości w próbkach. Te kroki są pokazane w Rysunek 5.

Tak więc, po zsekwencjonowaniu próbek, analiza wynikowych plików odczytu sekwencjonowania (w formacie fastq) przez dostępny potok przetwarzania jest prosta. Po dodaniu informacji o próbkach do pliku konfiguracyjnego, wykonanie potoku spowoduje powstanie dwóch głównych typów plików wyjściowych: 1) plików BED ze wszystkimi miejscami przetwarzania końcowego 3' zidentyfikowanymi w poszczególnych próbkach (np. "sample1.3pSites.noIP.bed.gz"), oraz 2) pliku BED ze wszystkimi klastrami miejsc poli(A) (clusters.merged.bed) we wszystkich próbkach badania. Dane wyjściowe zawierają również współrzędne genomu dla wszystkich odczytów z każdej pojedynczej próbki (np. "próbka1. STAR_out/Aligned.sortedByCoord.out.bam"), które można później wyświetlić w przeglądarce genomu, takiej jak IGV¹⁶. Oględziny odczytywanych profili na ogół dają pierwszy wgląd w rozmieszczenie miejsc poli(A) w genomie i zmiany, które zachodzą w określonych perturbacjach, które zostały przeprowadzone w badaniu. Na przykład w Rysunek 6 pokazana jest odpowiedź określonego genu na knock-down białka HNRNPC.

Podsumowania tych rozkładów w całym genomie są również dostępne (Tabela 1). W szczególności pliki wyjściowe w katalogu "counts/annotation_overlap" zawierają ułamki witryn, które nakładają się na określone cechy z adnotacjami (z pliku gtf dostarczonego jako dane wejściowe; adnotacje to: 3' UTR, ekson końcowy, ekson, intron, międzygenowy). Na koniec dla każdej próbki zapisywane są również wyniki poszczególnych etapów przetwarzania (np. "sample1.summary.tsv"). Obejmuje to liczby: odczytów surowych w każdej próbce, odczytów, które mają oczekiwaną strukturę końca 5', odczytów, które pozostają po złożeniu pełnych duplikatów PCR, odczytów wysokiej jakości zgodnie z kryteriami zdefiniowanymi w kroku 9.2, odczytów, które jednoznacznie odwzorowują genom (po zwinięciu tych, które wynikały z błędów sekwencjonowania, patrz krok 9.5), Odczyty wielokrotnego mapowania (po zwinięciu tych, które wynikały z błędów sekwencjonowania, patrz krok 9.5), surowe (nie zgrupowane) miejsca przetwarzania końcowego 3' w każdej próbce, surowe 3' końcowe miejsca przetwarzania bez potencjalnych wewnętrznych kandydatów do gruntowania, unikalne miejsca przetwarzania końcowego 3' ze wszystkich próbek bez wewnętrznych kandydatów do gruntowania oraz końcowy zestaw klastrów miejsc poli(A).

Rysunek 1: Główne kroki protokołu A-seq2. Poszczególne kroki są wskazane po lewej stronie rysunku. Fragmenty wstawionego RNA są przedstawione jako zielone linie, które zmieniają kolor na czerwony dla cDNA po odwrotnej transkrypcji; Adaptery są w kolorze jasnoniebieskim lub pomarańczowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Pilotażowy PCR i końcowy profil produktu. a) Podwielokrotności z reakcji PCR zebrano w różnych cyklach i rozdzielono na 2% żelach agarozowych. Liczby po lewej stronie wskazują rozmiar w nukleotydach odpowiednich prążków w drabinie DNA. W tym eksperymencie wybrano 12 cykli (*) dla wielkoskalowej reakcji PCR. (b) Przykład próbki po wybraniu wielkości przeprowadzonej na analizatorze wielkości fragmentów, która ujawnia średnią wielkość około 280 nukleotydów. Liczby po lewej stronie [FU] wskazują względną intensywność sygnału. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zarys wstępnego przetwarzania odczytów sekwencjonowania. Pliki fastq z odczytami, które są generowane przez oprogramowanie powiązane z instrumentem do sekwencjonowania, są przetwarzane w celu zidentyfikowania odczytów wysokiej jakości, które zostaną zmapowane do odpowiedniego genomu. Rysunek przedstawia specyfikację wejścia/wyjścia poszczególnych kroków w potoku, wraz z linkami do poszczególnych kroków protokołu opisanego w sekcji "Przetwarzanie danych". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zarys przetwarzania odczytu sekwencji, od etapu mapowania do genomu do generowania poszczególnych końcowych miejsc przetwarzania 3'. Rysunek przedstawia specyfikację wejścia/wyjścia poszczególnych kroków w potoku, wraz z linkami do poszczególnych kroków protokołu opisanego w sekcji "Przetwarzanie danych". Główny plik wyjściowy, który jest dostarczany do użytkownika, jest oznaczony pogrubioną czcionką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Zarys kroków, które są podejmowane w celu wygenerowania klastrów współregulowanych miejsc sekwencjonowania końca 3'. Rysunek przedstawia specyfikację wejścia/wyjścia poszczególnych kroków w potoku, wraz z linkami do poszczególnych kroków protokołu opisanego w sekcji "Przetwarzanie danych". Główny plik wyjściowy jest zaznaczony pogrubioną czcionką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Przykładowe wyniki profilu przetwarzania końca 3' odczytują się wzdłuż końcowego eksonu genu NUP214, pokazanego w przeglądarce genomu IGV ¹⁶. Odczyty A-seq2 przygotowano z dwóch próbek komórek HEK 293, potraktowanych kontrolnym siRNA lub siRNA HNRNPC. Odczyty, które dokumentowały miejsca poli(A), które zostały oznaczone przez potok analizy, zostały zapisane w formacie BAM, który był używany jako dane wejściowe do przeglądarki genomu IGV. Końce 3' odczytanych pików są mapowane na końce mRNA 3', które są oznaczone w Ensembl. Profile wskazują na zwiększone wykorzystanie długiej izoformy UTR 3' po powaleniu HNRNPC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

	si-Control replicate 1	si-Control replicate 2
	Numer identyfikacyjny: 29765	Numer identyfikacyjny: 32682
Liczba odczytów RAW	44210258	68570640
liczba prawidłowych odczytów po przycięciu i filtrowaniu	14024538	21211793
Liczba unikatowych odczytów mapowania	6953674	13946436
Liczba odczytów odwzorowanych na wiele loci	2040646	2925839
liczba poszczególnych 3' końcowych miejsc przetwarzania	1107493	1710353

Tabela 1: Przykładowy wynik potoku analizy. Podsumowania odczytów, które zostały uzyskane na poszczególnych etapach.

Discussion

Mnogość czynników rdzeniowych i pomocniczych, które są zaangażowane w przetwarzanie końcowe pre-mRNA 3', znajduje odzwierciedlenie w odpowiednio złożonym krajobrazie poliadenylacji. Ponadto poliadenylacja reaguje również na zmiany w innych procesach, takich jak transkrypcja i splicing. Końcowe miejsca cięcia 3' w pre-mRNA są zwykle identyfikowane na podstawie charakterystycznych ogonów poli(A), które są dodawane do produktów cięcia 5'. Większość metod wykorzystuje startery oligo(dT) o zmiennej długości, które umożliwiają specyficzną konwersję mRNA zawierających poli(A) do cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. Częstym problemem tego podejścia jest wewnętrzne torowanie do sekwencji bogatych w A, co skutkuje sztucznymi miejscami cięcia. Zaproponowano dwie metody, które mają na celu obejście tego artefaktu na etapie przygotowania próbki. W metodzie 3P-seq ¹ adaptery są specyficznie ligowane do końców ogonów poli(A) za pomocą oligo szyny, a następnie częściowe trawienie RNazy T1 i odwrotna transkrypcja z TTP w reakcji jako jedynym deoksynukleotydem. Powstałe heterodupleksy poli(A)-poli(dT) są następnie trawione za pomocą RNazy H, a pozostałe fragmenty RNA są izolowane, ligowane do adapterów i sekwencjonowane. Prostsza i bardziej elegancka metoda, 2P-seq, która wykorzystuje niestandardowy starter sekwencjonowania, pomijając pozostały odcinek oligo(dT) w reakcji sekwencjonowania, została opisana przez tych samych autorów ². W pokrewnej metodzie, 3'READS ³, niezwykle długi starter składający się z 5 Us i 45 T, zawierający również biotynę, jest wyżarzany do rozdrobnionego RNA, a następnie poddawany rygorystycznym płukaniom w celu wyselekcjonowania cząsteczek RNA z ogonami poli(A) ponad 50 nukleotydów. Chociaż 3'READS drastycznie zmniejsza częstotliwość wewnętrznego gruntowania, nie eliminuje go całkowicie ³. Zaproponowano również protokoły bezpośredniego sekwencjonowania RNA, ale wynikowe odczyty są krótkie i mają wysoki poziom błędu, a podejście to nie było dalej rozwijane 18,19,20. Protokoły PolyA-Seq i skomercjalizowane Quant Seq łączą priming oparty na oligo(dT) z losowym etapem primingu do syntezy drugiej nici cDNA ²⁰. Zastosowanie reakcji odwrotnej transkrypcji przełącznika matrycowego z odwrotną transkryptazą wirusa mysiej białaczki Moloneya (MMLV) prowadzi do wytworzenia cDNA z łącznikami w jednym kroku, a zatem w metodach PAS-Seq i SAPAS nie mogą pojawić się żadne dimery adapterowe ^21,22.

Przedstawiona tutaj metoda A-seq2 wyróżnia się wykorzystaniem łupliwego nukleotydu (dU) w biotynylowanym starterze oligo(dT). Modyfikacja ta łączy w sobie użyteczność wzbogacania zhybrydyzowanych oligo(dT), poliadenylowanych celów z usunięciem większości sekwencji oligo (dT)₂₅ z izolowanych fragmentów przed przygotowaniem bibliotek i zachowaniem trzech T, które wskazują na wcześniejszą obecność ogona poli(A). W przeciwieństwie do tego, metody, które wykorzystują RNazę H do usuwania poli(A) z cząsteczek RNA, losowo pozostawiają kilka As. Ponieważ w A-seq2 sekwencjonowanie odbywa się od końca 3' nici antysensownych, przewiduje się, że miejsca rozszczepienia będą zlokalizowane po odczytaniu motywu NNNNTTT na początku surowej sekwencji. Randomizowane tetramery służą nie tylko do umożliwienia wywoływania bazy, ale także do eliminacji artefaktów amplifikacji PCR. Można również pomieścić dłuższe moduły UMI. Możliwość wewnętrznego torowania pozostaje w A-seq2 i jest rozpatrywana obliczeniowo, najpierw poprzez odrzucenie końców 3' z zakodowaną genomowo, bogatą w A sekwencją dalszą, a następnie poprzez odrzucenie klastrów końcowych 3', które można wyjaśnić wewnętrznym torowaniem w samym sygnale poli(A) bogatym w A. Niedawna analiza miejsc poli(A) wywnioskowanych jednoznacznie przez dużą liczbę protokołów wskazuje, że miejsca, które są unikalne dla A-seq2, mają oczekiwaną dystrybucję nukleotydów i lokalizację w genach, podobnie jak inne protokoły sekwencjonowania końca 3'.

Krytycznym krokiem w A-seq2 jest selekcja poliadenylowanego RNA i usunięcie rybosomalnego RNA i różnych małych RNA. Najłatwiej jest to osiągnąć za pomocą zestawu do izolacji mRNA z kulkami magnetycznymi oligo (dT)₂₅ . Zasadniczo całkowite RNA wyizolowane roztworami zawierającymi fenol daje również wysokiej jakości RNA, które można dalej poddawać selekcji za pomocą zestawu do izolacji mRNA lub agarozy oligo(dT). Etapem, który można zmieniać w A-seq2, jest leczenie hydrolizą alkaliczną, którą można skrócić lub wydłużyć w celu uzyskania fragmentów RNA o różnych rozmiarach. Kluczowe jest również to, że dodawanie 3'dATP do końców 3' fragmentów RNA przez polimerazę poli(A) jest wydajne. W opisanym tutaj protokole zabieg ten stosuje się do wszystkich fragmentów RNA, aby uniknąć konkategoryzacji podczas reakcji ligacji. Na koniec zauważamy, że chociaż ligaza RNA 1 jest zwykle używana jako ligaza RNA, skutecznie liguje również jednoniciowe DNA, tak jak zrobiliśmy to tutaj, aby podwiązać adapter do końca 5' cząsteczek cDNA.

Tak więc A-seq2 jest wydajnym i łatwym do wdrożenia protokołem do identyfikacji końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'. Przyszłe rozwiązania mogą obejmować dalsze zmniejszanie złożoności protokołu i ilości wymaganego materiału. Powiązany zestaw narzędzi do obliczeniowej analizy danych umożliwia ponadto jednorodne przetwarzanie odczytów sekwencjonowania końca 3' uzyskanych za pomocą szerokiej gamy protokołów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiały
Agaroza, ultra czysty	Invitrogen	16500-500
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2940CA
Trifosforan kordycepiny (3' dATP)	SIGMA	C9137
DNA fiolki o niskim poziomie wiązania, 1,5 ml	Eppendorf	22431021
Dulbecco’ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	SIGMA	D8637
Dynabeads mRNA-DIRECT Kit	Ambion	AM61012
GR-Green barwnik	Excellgen	EG-1071	zastosowanie rozcieńczenia 1:10 000
HiSeq 2500 lub NextSeq 500 sekwencery nowej generacji	Illumina	zapytaj dostawcę
KAPA HiFi Hotstart Mieszanka polimerazy DNA	KAPA/Roche	KK2602
Woda wolna od nukleaz	Ambion	AM9937
Polimeraza poli(A), drożdże	Thermo Fisher Scientific	74225Z25KU
Polimeraza poli(A), E.coli	New England Biolabs	M0276L
Kinaza polinukleotydowa	Thermo Fisher Scientific	EK0032
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAEX II	Qiagen	20021
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	28104
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu	Qiagen	28704
Ligaza RNA 1, wysokie stężenie	New England Biolabs	M0437M	zawiera zestaw do czyszczenia RNA PEG-8000
RNeasy MinElute	Qiagen	74204
RNase H	New England Biolabs	M0279
RNasin Plus, inhibitor rybonukleazy	Promega	N2618
Indeks górny IV odwrotna transkryptaza	Thermo Fisher Scientiific	18090050
Turbo DNase	Ambion	AM2238
UŻYTKOWNIK mieszanka enzymów	New England Biolabs	M5505
Dyna-Mag-2 stojak magnetyczny	Thermo Fisher Scientific	12321D
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	Podgrzewany mikser z podgrzewaną pokrywą
Kolumny MicroSpin	GE-Healthcare	27-5325-01
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Buffers
Alkaliczny bufor do hydrolizy, 1,5 x			Wymieszaj 1 część 0,1 M Na2CO3 i 9 części 0,1 M NaHCO3. Dodaj EDTA do 1 mM. Dostosuj pH do 9,2. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
5x bufor poli(A) polimerazy	Thermo Fisher Scientiific		100 mM Tris-HCl, pH 7,0, 3 mM MnCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mg/ml acetylowany BSA, 50% glicerol
Bufor wiążący biotynę			20 mM Tris­ Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,1% NP­ 40
bufor			10 mM Tris­ Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,02% NP­ 40
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Sequence
Oligonukleotydy według zestawów do przygotowywania małych próbek RNA Illumina TruSeq, do sekwencerów GA-IIx i Hiseq2000/2500	Microsynth
revRA3 (RNA)	Mikrosyntezator		5' aminowy & nieśmiały; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&nieśmiały; 3'
revDA5	Microsynth		5' amino&nieśmiały; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3'
Bio-dU-dT25, RT starter	Microsynth		5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3' (V = G, A lub C)
Starter PCR do przodu, RP1	Microsynth Microsynth		5' AATGATACGGGGCGGACCACCGAGA TCTACACGTGTGTTCTCTACAG TCCGA 3'PCR
starter reverse, RPI1, kod kreskowy pogrubioną czcionką	Microsynth		5' CAAGCAGAAGGGCATACGAG ATCGTGATGTGACTGGAGTTCCT TGGCACCCGAGAATTCCA 3'
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
>Oligonukleotydy według zestawów do przygotowywania próbek Illumina TruSeq HT-Small RNA, dla sekwencerów HiSeq2000/2500 i NextSeq500
HT-rev3A (DNA/RNA)	Mikrosyntezator		5'-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG CTCTTCCrGrAUrC-3'HT-rev5A
	Mikrosyntezator		5' amino-ACACTCTCTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCTNNNN
3'Bio-dU-dT25, RT starter	Microsynth		3'PCR
startery do przodu (D501-506)	Microsynth lub Illumina		5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA CGACGCTCTCTCCCCGATCT -3'PCR
startery odwrotne (D701-D712)	Microsynth lub Illumina		5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3'Dokumentacja
multipleksowania Illumina:	Illumina		https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf