Artykuł metodologiczny

3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

13.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56129

⸱

10 października 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Computational and Systems Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Swiss Institute of Bioinformatics, Biozentrum, University of Basel

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

Streszczenie

Badania przeprowadzone w ostatniej dekadzie ujawniły złożoną i dynamiczną różnorodność reakcji rozszczepienia i poliadenylacji pre-mRNA. mRNA z długimi regionami nieulegającymi translacji 3' (UTR) są generowane w zróżnicowanych komórkach, podczas gdy komórki proliferujące preferencyjnie wyrażają transkrypty z krótkimi 3'UTR. Opisujemy protokół A-seq, obecnie w swojej drugiej wersji, który został opracowany w celu mapowania miejsc poliadenylacji w całym genomie i badania regulacji przetwarzania końcowego pre-mRNA 3'. Również ten obecny protokół wykorzystuje ogony poliadenylowe (poli(A)), które są dodawane podczas biogenezy większości mRNA ssaków w celu wzbogacenia na w pełni przetworzone mRNA. Adaptor DNA z deoksyuracylem w czwartej pozycji umożliwia precyzyjne przetwarzanie fragmentów końcowych mRNA 3' do sekwencjonowania. Nie wliczając hodowli komórkowej i ligacji przez noc, protokół wymaga około 8 godzin czasu praktycznego. Wraz z nim dostarczany jest łatwy w użyciu pakiet oprogramowania do analizy uzyskanych danych sekwencjonowania. A-seq2 i związane z nim oprogramowanie analityczne zapewniają wydajne i niezawodne rozwiązanie do mapowania końców pre-mRNA 3' w szerokim zakresie warunków, od 106 lub mniej komórek.

Wprowadzenie

Wychwytywanie i sekwencjonowanie końcówek mRNA 3' pozwala na badanie przetwarzania mRNA i kwantyfikację ekspresji genów. Ze względu na swoje ogony poli(A), eukariotyczne mRNA mogą być skutecznie oczyszczane z całkowitych lizatów komórkowych za pomocą unieruchomionych cząsteczkami oligo-deoksytymidyny (oligo(dT)) unieruchomionymi kulkami, które mogą również inicjować syntezę cDNA. Takie podejście ma jednak dwie wady. Po pierwsze, odcinki A, które są wewnętrzne dla transkryptów, mogą również inicjować syntezę cDNA, co skutkuje fałszywymi miejscami poli(A). Po drugie, jednorodne odcinki poli(A) stanowią szczególne wyzwanie dla sekwencjonowania, oprócz tego, że nie dostarczają informacji do identyfikacji transkryptów. Zaproponowano różne podejścia w celu obejścia tych ograniczeń, takie jak odwrotna transkrypcja przez ogony poli(A), a następnie trawienie RNazy H (3P-seq 1), użycie niestandardowego startera sekwencjonowania kończącego się na 20 Ts (2P-seq 2), wstępna selekcja fragmentów RNA z ogonami poli(A) ponad 50 nukleotydów ze starterem CU5T45, a następnie trawienie RNazy H (3'READS 3) oraz użycie podkładu oligo-dT, który zawiera adapter 3' w spince do włosów (A-seq 4).

Niedawno opracowana metoda A-seq2 5 ma na celu ominięcie sekwencjonowania przez poli(A) i jednocześnie zminimalizowanie proporcji dimerów, które są generowane przez samoligaturację adapterów, szczególnie występujących, gdy stężenie molowe adapterów przeważa nad stężeniem insertu. Problem ten można wyeliminować, gdy oba adaptery są ligowane do tego samego typu końcówek polinukleotydowych, jak w A-seq2, gdzie adaptery 3' są ligowane do końca 5' fragmentów RNA, a adaptery 5' do końców 5' cDNA po odwrotnej transkrypcji. Metoda jest wygodniejsza niż nasza wcześniej proponowana sekwencja A-seq - w której sekwencjonowanie odbywało się w kierunku od 5' do 3', co wymagało precyzyjnie kontrolowanej fragmentacji RNA - przy zachowaniu wysokiej dokładności identyfikacji miejsca poli(A). Około 80% zsekwencjonowanych odczytów w typowych próbkach odwzorowuje jednoznacznie genom i prowadzi do identyfikacji ponad 20 000 klastrów poli(A), z których ponad 70% pokrywa się z adnotowanymi 3'UTR.

W skrócie, protokół A-seq2 zaczyna się od fragmentacji mRNA i ligacji adapterów 3' odwróconego dopełniacza do końców 5' fragmentów RNA. RNA zawierające poli(A) są następnie odwrotnie transkrybowane za pomocą startera oligo(dT) o długości 25 nukleotydów (nt), który zawiera nukleotyd kotwiczący na końcu 3', dU na pozycji 4 i biotynę na końcu 5', umożliwiając wiązanie cDNA z magnetycznymi kulkami streptawidyny. Większość startera, w tym biotyna, jest usuwana z cDNA przez rozszczepienie w dU przez mieszaninę enzymów USER, zawierającą glikozylazę DNA uracylu (UDG) i glikozylazę DNA Endonukleazę VIII. Ta reakcja pozostawia nienaruszone końce do podwiązania adaptera 5', a trzy T pozostałe po rozszczepieniu pozostają, aby zaznaczyć położenie ogona poli(A). Ponieważ zarówno adaptery 5', jak i 3' są przymocowane przez ligację do końcówek 5' odbiorcy, nie są generowane żadne dimery adaptera. Cztery losowe mery nukleotydowe wprowadzone na początku odczytów umożliwiają rozdzielczość klastra na najnowocześniejszych instrumentach sekwencjonowania, a także mogą służyć jako unikalny identyfikator molekularny (UMI) do wykrywania i usuwania artefaktów amplifikacji PCR. Rozmiar UMI można jeszcze bardziej zwiększyć, tak jak to miało miejsce w innych badaniach 6. Protokół generuje odczyty, które są odwrotnie komplementarne do końców mRNA 3', wszystkie zaczynające się od randomizowanego tetrameru, po którym następują 3 Ts. Przetwarzanie odczytów, które mają 3 diagnostyczne T na końcu 5', rozpoczyna się od korekcji artefaktów amplifikacji PCR poprzez wykorzystanie UMI, usunięcie sekwencji adaptera 3' i odwrotną komplementację. Odczyty, które mogły pochodzić z primingu oligo(dT) w wewnętrznych miejscach bogatych w A, są również identyfikowane obliczeniowo i odrzucane. Miejsca fałszywe na ogół nie mają jednego z 18 dobrze scharakteryzowanych i konserwatywnych sygnałów poli(A), które powinny znajdować się ~21 nukleotydów przed pozornym miejscem rozszczepienia 7.

Protokół wymaga około 8 godzin praktycznego czasu, nie licząc hodowli komórkowych i nocnych ligacji. Powiązane oprogramowanie do analizy odczytu umożliwia bardzo dokładną identyfikację lokalizacji poli(A). Z klastrów poli(A) utworzonych na podstawie 4 próbek szczegółowo opisanych w tym manuskrypcie (dwie biologiczne repliki kontrolnych komórek siRNA i komórek traktowanych si-HNRNPC) 84% pokrywa się z opisanym genem, a spośród nich 75% pokrywa się z 3' UTR, a 86% z 3' UTR lub końcowym eksonem. Współczynnik korelacji Pearsona końca 3' w próbkach powtórzonych wynosi 0,92, a za pomocą tej metody zwykle uzyskuje się wartości powyżej 0,9. Tak więc A-seq2 jest wygodną metodą, która daje bardzo powtarzalne wyniki.

Protokół

1. Wzrost komórek i izolacja mRNA

  1. Hoduj komórki zgodnie z projektem eksperymentalnym na płytkach 6-dołkowych do ~1 x 106 komórek na dołek przy 80% konfluencji.
  2. Usuń pożywkę wzrostową i raz umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Bezpośrednio poddać lizie komórki na płytce, dodając 1 ml buforu do lizy z zestawu do izolacji mRNA. Przenieś lepki lizat do plastikowej probówki o pojemności 15 ml z końcówką do pipety o pojemności 1 ml. Użyj gumowej szpatułki, aby całkowicie oderwać materiał komórkowy od powierzchni płytki.
  3. Ścinać lizat zawierający lepkie DNA za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml przymocowanej do igły podskórnej o sile 23 G, wykonując kilka energicznych ruchów tłoka w górę i w dół, aż lizat przestanie być lepki. Skieruj igłę strzykawki na środek dna, aby uniknąć wyrzucenia lizatu z probówki.
  4. Przenieść lizat do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą strzykawki. Wirować przez 5 minut w temperaturze 20 000 x g i 4 °C, aby usunąć zanieczyszczenia. Używaj fiolek o niskim poziomie wiązania DNA 1,5 ml przez cały czas trwania protokołu.
  5. Podczas pracy wirówki przemyć 300 μl zawieszonych kulek magnetycznych oligo (dT)25 na stojaku magnetycznym z 500 μl buforu do lizy. Wymieszaj probówki 2-3 razy na ruszcie. Usunąć bufor po tym, jak roztwór będzie klarowny. Zebrać klarowny supernatant z kroku 1.4 i dodać do kulek. Ponownie zawieś i umieść rurki na obracającym się kole na 10 minut.
  6. Umieść rurki na stojaku magnetycznym. Usuń klarowny płyn po 2 minutach. Dodaj 0,8 ml buforu A z zestawu do izolacji mRNA. Obróć rurkę o 180° stopni na stojaku 2-3 razy. Powtórz ten etap mycia jeszcze raz z buforem A.
  7. Umyj kulki 2 razy 0,8 ml buforu B, jak opisano w kroku 1.6.
  8. Aby wymyć związane mRNA z kulek, dodaj 33 μl H2O i ponownie zawieś kulki. Podgrzewać do 75 °C przez 5 minut na rozgrzanym bloku. Natychmiast obracaj rurki przez 1 s i umieść je na stojaku magnetycznym. Przenieść supernatant do nowej probówki. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego wykorzystania.
  9. Dodać 66 μl alkalicznego buforu hydrolitycznego do 33 μl mRNA (krok 1.8), wymieszać i podgrzewać dokładnie przez 5 minut w temperaturze 95 °C na bloku grzewczym. Natychmiast schłodzić rurki na lodzie.
  10. Wyizoluj RNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA.
    UWAGA: Potwierdź głośność; powinno to być 100 μL.
    1. Dodaj 350 μl buforu RLT z zestawu i 250 μl etanolu. Załaduj na kolumnę i wiruj przez 30 s przy 8 000 x g w temperaturze pokojowej (RT). Przemyć 500 μl buforu RPE z zestawu. Umyć 500 μl 80% etanolu. Wirować przez 5 minut w temperaturze 20 000 x g, aby wysuszyć kolumnę. Dodać 36 μL H2O do kolumny i wirować przez 1 minutę w temperaturze 20 000 x g. Wyrzuć kolumnę i zachowaj eluat.

2. 5' koniec fosforylacji i leczenia DNazą

  1. Dodać 5 μl buforu kinazy polinukleotydowej, 5 μl 10 mM ATP, 1 μl inhibitora rybonukleazy, 1 μl DNazy i 2 μl kinazy polinukleotydowej do próbek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Opcjonalnie przygotować główne mieszaniny reakcyjne w całym protokole, mieszając 1,1 objętości x n (n = liczba próbek) każdego składnika.
  2. Zmień bufor i usuń ATP z kolumny wirowej, aby zapobiec dodawaniu poli(A) w następnym kroku.
    1. Wstępnie wirować kolumny przy 735 x g przez 1 min. Przenieść kolumny do nowych fiolek o pojemności 1,5 ml i załadować reakcje kinazy na kolumny. Obracaj kolumny 2 minuty przy 735 x g. Odrzucić kolumny i umieścić probówki z zebranymi reakcjami na lodzie lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Blokowanie 3' kończy się trifosforanem kordycepiny

UWAGA: Istotne jest, aby zablokować 3' końce fragmentów RNA, aby uniknąć ich konkategoryzacji w kolejnych reakcjach ligacji. Końce 3', które nie są jeszcze zablokowane przez (cykliczny) fosforan po hydrolizie, są traktowane przez dodanie nukleotydu terminatora łańcucha 3' dATP (trifosforan kordycepiny) za pomocą polimerazy poli(A). W tym przypadku zastosowano polimerazę poli(A) drożdży (yPAP), która została wyrażona i oczyszczona zgodnie z opisem w 8 w stężeniu 0,5 mg/mL. Drożdże lub E. coli PAP mają prawie taką samą aktywność przy dodawaniu 3'dATP i można je kupić na rynku (patrz tabela materiałów).

  1. Dodać 13,5 μl 5x skoncentrowany bufor reakcyjny polimerazy poli(A), 2 μl 10 mM 3' dATP, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl polimerazy poli(A) do reakcji z kroku 2.2.1. Mieszaj i wiruj przez 1 s. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Dodać 32,5 μlH2Odo każdej reakcji. Oczyść RNA jak w kroku 1.10.1. Eluować RNA za pomocą 14 μlH2O.

4. Ligacja odwróconych adapterów 3' do końca 5' fragmentów RNA

  1. Umieścić reakcje w koncentratorze próżniowym na 10 minut, aby zmniejszyć objętość do 6 μL. Dodać 3 μL 10x bufor ligacyjny T4 RNA, 3 μL 10 mM ATP, 15 μL PEG-8000, 1 μL inhibitora RNazy, 1 μL 0,1 mM adaptera 3' z odwróconym dopełniaczem "revRA3" (patrz Tabela Materiałów) i 1 μL ligazy RNA o wysokim stężeniu 1, mieszać.
  2. Inkubować reakcje w temperaturze 24 °C przez 16 godzin na podgrzewanym mieszalniku z przerywanym mieszaniem przy 1 000 obr./min. Dodać 70 μl H2O do każdej reakcji i wymieszać. Oczyść RNA jak w kroku 1.10.1. Eluować RNA za pomocą 14 μLH2O. W tym momencie próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Odwrotna transkrypcja (RT)

  1. Umieścić eluaty w koncentratorze próżniowym na 3 minuty, aby zmniejszyć objętość do 11 μl. Przenieść reakcje do probówek PCR o pojemności 200 μl. Dodać 1 μl 0,05 mM podkładu RT "Bio-dU-dT25". Podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 70 °C w cyklerze PCR i pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.
  2. Dodaj 1 μl 10 mM dNTP, 4 μL 5x bufor odwrotnej transkryptazy, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy. Mieszać i podgrzewać reakcje przez 10 minut do 55 °C i od 10 minut do 80 °C w cyklerze PCR. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze -80°C dla dłuższego przechowywania.

6. Trawienie mieszanką enzymów glikozylazy DNA uracylu

  1. Odpipetować 100 μl kulek streptawidyny do fiolki o pojemności 1,5 ml, ponownie zawiesić w 800 μl buforu wiążącego biotynę i umieścić na stojaku magnetycznym. Odwróć rurki 2-3 razy. Usuń bufor, gdy jest czysty. Powtórz krok prania. Ponownie zawiesić kulki w 200 μl buforu wiążącego biotynę.
  2. Dodać reakcję odwrotnej transkrypcji do roztworu kulek i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C na obracającym się kole. Umyj koraliki 2x buforem wiążącym biotynę, jak w kroku 6.1 i 2x buforem TEN na stojaku magnetycznym. Zawiesić kulki w 50 μl buforu TEN, dodać 2 μl mieszanki enzymów glikozylazy DNA uracylu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w mieszalniku z przerywanym mieszaniem.
  3. Dodać do reakcji 50 μlH2O, 11 μl buforu RNazy H i 1 μl RNazy H. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i przenieś płyn zawierający rozszczepione cDNA do nowej probówki
  4. Oczyść rozszczepione cDNA.
    1. Dodać 550 μl buforu PB z zestawu do oczyszczania PCR do reakcji rozszczepiania. Dodać 10 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2, aby obniżyć pH. Załadować reakcje na kolumny wirowe o minimalnej elucji i wirować z prędkością 17 000 x g przez 1 min.
    2. Dodać 750 μl buforu PE do kolumn i wirować z prędkością 17 000 x g przez 1 min. Wyrzuć przepływ. Obracaj kolumny z prędkością 17 000 x g przez 1 minutę do wyschnięcia. Przenieść kolumny do fiolki o pojemności 1,5 ml, dodać 16 μl H2O i wirować w temperaturze 17 000 x g przez 1 minutę. Umieścić reakcje w koncentratorze próżniowym na 8 minut, aby zagęścić się do objętości 7 μl.

7. Ligacja adapterów 5' do końców 5' cDNA

  1. Do wyizolowanego cDNA dodaj 3 μl 10x bufor ligazy RNA T4 1, 3 μl 10 mM ATP, 15 μL PEG-8000, 1 μL 50 μM oligo "revDA5" i 1 μl ligazy T4 RNA o wysokim stężeniu 1. Inkubować w temperaturze 24 °C przez 20 godzin. Dodać 70 μl H2O do każdej reakcji. W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

8. Pilotażowy PCR, Amplifikacja Bibliotek i Wybór Rozmiaru

  1. W reakcji pilotażowej określ optymalną liczbę cykli PCR, aby osiągnąć amplifikację biblioteki w fazie wykładniczej.
    1. Odpipetować 25 μl mieszaniny polimerazy DNA, 20 μl reakcji ligacji, 2 μlH2O, 1,5 μL 10 μM startera do przodu PCR (RP1) i 1,5 μl 10 μM startera indeksu reverse PCR do probówki 200 μL.
    2. Uruchom cykler z następującym programem: 3 min 95 °C, a następnie 20 cykli po 20 s 98 °C, 20 s 67 °C i 30 s 72 °C. Zebrać 7 μl porcji po 6, 8, 10, 12, 14, 16 i 18 cyklach bezpośrednio z cyklera. Dodać 1 μl 10x bufor ładujący (50% glicerolu, 0,05% cyjanolu ksylenowego). Uwaga: W przypadku korzystania z multipleksowania podczas łączenia kodów kreskowych należy postępować zgodnie z zaleceniami dostawcy.
    3. Oddzielić produkty w małych szczelinach na 2% żelu agarozowym w 1x buforze TBE zawierającym rozcieńczenie 1:10,00 fluorescencyjnego zielonego barwnika.
      1. Załaduj porcje na 2% żel agarozowy i uruchom żel pod napięciem 100 V przez 15 minut. Wizualizacja migracji produktów PCR w systemie dokumentacji żelu.
  2. Użyj liczby cykli na początku amplifikacji wykładniczej w reakcji pilotażowej dla reakcji PCR na dużą skalę z dwukrotnie większymi objętościami niż w reakcji pilotażowej (Rysunek 2).
    1. W przypadku reakcji PCR na dużą skalę, najpierw zagęścić i odsolić reakcje za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, a następnie oddzielić produkty na szerokich szczelinach na 2% żelach agarozowych w 1x buforze TBE.
  3. Wytnij plastry żelu zawierające 200-350 nt produktów DNA. Rozpuść żel w buforze chaotropowym w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 30 minut. Wyekstrahuj DNA z plastrów żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Nie podgrzewać do 50 °C, aby zapobiec odchyleniu w wiązaniu DNA bogatego w A 9.
  4. Prześlij do sekwencjonowania.
    UWAGA: Zazwyczaj wystarczy 50 cykli pojedynczego odczytu (SR50) (patrz np. https://www.illumina.com/technology/next-generation-sequencing.html).

9. Przetwarzanie danych

UWAGA: Wynikowe dane sekwencjonowania (w formacie fastq) są przetwarzane za pomocą oprogramowania dostępnego w repozytorium gitlab (https://git.scicore.unibas.ch/zavolan_public/A-seq2-processing). Analiza obejmuje cztery główne kroki: (1) pobranie repozytorium git, (2) instalację środowiska wirtualnego, (3) ustawienie określonych parametrów w pliku konfiguracyjnym oraz (4) uruchomienie analizy poprzez 'snakemake' 10. Cała analiza wykonana w kroku 4 wymaga tylko jednego polecenia. Szczegółowy opis analizy krok po kroku znajduje się w pliku README w repozytorium gitlab, a krótki opis dostępny jest poniżej. Wszystkie poszczególne etapy przetwarzania są realizowane poprzez wykonanie publicznie dostępnych narzędzi, pochodzących ze źródeł zewnętrznych lub przygotowanych we własnym zakresie. Potok obliczeniowy zależy od opartego na anakondzie środowiska wirtualnego 11 python 3 z dostępnym pakietem snakemake 10. Działa na maszynach z systemem operacyjnym podobnym do Uniksa i został przetestowany w środowisku Linux z zainstalowanym systemem operacyjnym CentOS 6.5 i dostępnymi 40 GB pamięci RAM. Zależności oprogramowania są automatycznie kontrolowane w środowisku wirtualnym. Wymagane są następujące publicznie dostępne narzędzia programowe, które są instalowane wraz ze środowiskiem: snakemake (v3.9.1) 10,fastx toolkit (v0.0.14) 12, STAR (v2.5.2a) 13, cutadapt (v1.12) 14, samtools (v1.3.1) 14,15, bedtools (v2.26.0) 16,17.

  1. Wstępne przetwarzanie danych z odczytów do cDNAs
    UWAGA: Głębokość sekwencjonowania może się różnić w zależności od serii i, w zależności od urządzenia, dane z jednej próbki mogą być podzielone na wiele plików sekwencji. W takim przypadku połącz pliki odpowiadające jednej próbce w jeden plik wejściowy, który jest używany w poniższych krokach.
    1. Konwertuj plik z formatu fastq na fasta.
    2. Odczyty ekstraktu o prawidłowej strukturze (3 tymidyny w pozycjach 5, 6 i 7 odczytu).
      UWAGA: Odczyt, który jest prawidłowo przygotowany zgodnie z opisanym powyżej protokołem eksperymentalnym, powinien mieć strukturę (od końca 5'): 4-nukleotydowy kod kreskowy - 3 tymidyny - odwrotne uzupełnienie końca transkryptu 3'.
    3. Przechowuj informacje o początkowym tetramerze w wierszu opisu sekwencji.
      UWAGA: Tetramer służy jako unikalny identyfikator molekularny (UMI), który ułatwia korektę artefaktów amplifikacji w dalszej części analizy.
    4. Usuń pierwsze siedem nukleotydów z końca 5' odczytu.
    5. Popraw artefakty wzmocnienia, zachowując tylko jedną kopię odczytów z tą samą sekwencją wstawiania i UMI.
    6. Usuń część końca 3', która pasuje do sekwencji adaptera, a następnie odwróć uzupełnienie sekwencji. Kontynuuj tylko z odczytami, które mają minimalną długość (domyślnie: 15 nt).
      UWAGA: W zależności od długości oryginalnego fragmentu mRNA i liczby cykli sekwencjonowania, koniec 3' odczytu może zawierać część adaptera 3', która jest usuwana na tym etapie.
  2. Wyodrębnij wszystkie odczyty, które spełniają następujące kryteria: maksymalnie 2 nieznane nukleotydy ("N"), maksymalnie 80 % As i ostatni nukleotyd odczytanego nukleotydu nie A. Odczyty te uważa się za wystarczająco wysokiej jakości, aby można je było wykorzystać w analizie.
  3. Zamapuj odczyty do genomu za pomocą narzędzia, które obsługuje odczyty złożone i generuje plik wyjściowy w formacie BAM.
    1. Jeśli używany jest STAR, utwórz plik z indeksem genomu, do którego powinny być mapowane odczyty. W przypadku ludzkiego genomu ten krok wymaga 35 GB pamięci (RAM).
    2. Mapuj odczyty do genomu.
      UWAGA: (uwagi specyficzne dla STAR) Miękkie przycinanie jest wyłączone, aby wymusić mapowanie końca 3' każdego odczytu, ponieważ jest to nukleotyd znajdujący się bezpośrednio przed miejscem rozszczepienia.
  4. Przekonwertuj BAM na plik BED. Jeśli odczyt jest mapowany do wielu lokalizacji, zachowaj tylko te o najmniejszej odległości edycji.
    UWAGA: Jako punktacja używany jest numer kopii odczytu zmapowanego w określonej lokalizacji. Odczyty, które są mapowane do wielu lokalizacji, są liczone ułamkowo w każdej lokalizacji z wagą równą 1/liczbę lokalizacji, do których odczyt jest mapowany.
  5. Zwijanie odczytów, które różnią się prawdopodobnym błędem sekwencjonowania. Jeśli dwa różne odczyty są mapowane do tej samej lokalizacji (pozycja początkowa i końcowa mapowań jest identyczna) i mają ten sam UMI, należy je traktować jako duplikaty PCR i zachować tylko jeden.
  6. Wywnioskuj wszystkie indywidualne końcowe miejsca przetwarzania pre-mRNA 3'.
    UWAGA: Indywidualny odczyt dostarcza dowodów na koniec 3', gdy jego ostatnie cztery nukleotydy są mapowane do genomu bez błędu. Pozycja, do której zapisany jest koniec 3' odczytywanych map jako miejsce rozszczepienia.
  7. Wykryj 3-calowe miejsca końcowe, które mogły pochodzić z wewnętrznego gruntowania. Zdefiniuj miejsce jako wewnętrzny artefakt gruntowania, gdy 10 nt za miejscem rozszczepienia w genomie spełnia jedno z następujących kryteriów: zawiera więcej niż sześć As, zawiera sześć kolejnych As lub zaczyna się od jednego z następujących tetramerów: AAAA, AGAA, AAGA, AAAG.
  8. Wygeneruj tabelę poszczególnych 3-calowych miejsc obróbki końcowej w formacie BED.
  9. Zidentyfikuj niezależnie regulowane klastry poli(A).
    UWAGA: Opisane tutaj kroki są zgodne z procedurą, która została wprowadzona w poprzedniej publikacji 5.
    1. Zacznij od zebrania poszczególnych 3' końcowych miejsc przetwarzania, które uzyskano we wszystkich próbkach badania.
    2. Opisz znane sygnały poli(A) 7 w obszarze od -60 do +10 nukleotydów wokół każdego indywidualnego miejsca przetwarzania na końcu 3'.
    3. Zidentyfikuj miejsca poli(A) wyrażone powyżej tła w każdej próbce w następujący sposób.
      1. Posortuj witryny według ich nieprzetworzonego wyrażenia w bieżącym przykładzie. Przechodzenie przez listę witryn od góry do dołu, kojarząc witryny o niższej pozycji z witryną o wyższej pozycji, jeśli znajdują się w określonej odległości w genomie (domyślnie: 25 nt w górę lub w dół) od witryny o wysokiej pozycji.
        UWAGA: Wszystkie witryny o niskiej pozycji w rankingu skojarzone z witryną o wysokiej klasyfikacji definiują klaster, którego wyrażeniem jest liczba odczytów dokumentujących wszystkie te witryny.
      2. Sortuje te klastry według wyrażeń i przesiewa listę klastrów od najwyższego do najniższego wyrażenia, określając próg wyrażenia c, przy którym odsetek klastrów z adnotacją sygnałową poly(A) spada poniżej wstępnie zdefiniowanego progu (domyślnie: 90%).
      3. Odrzuć lokacje z dowolnego klastra poniżej wartości granicznej.
    4. Grupowanie blisko rozmieszczonych 3' miejsc końcowych uzyskanych w próbkach.
      UWAGA: Sortuj 3-calowe końcowe miejsca przetwarzania najpierw według liczby próbek pomocniczych, a następnie według sumy znormalizowanej liczby odczytów (odczytów na milion (RPM)) w próbkach. Przechodzenie przez listę od góry do dołu, kojarzenie witryn o niższej pozycji w rankingu z witrynami o wyższej pozycji, gdy ich odległość do witryny o wyższej pozycji nie jest większa niż wstępnie zdefiniowany limit (domyślnie: 12 nt). Za każdym razem, gdy którykolwiek z elementów składowych 3' końcowych nakłada się na sygnał poli(A) z adnotacjami lub ma sygnał poli(A) bezpośrednio za nim, odpowiedni klaster jest oznaczany do dalszej kontroli w celu wykrycia wewnętrznego zalewania.
    5. Scalanie klastrów lokacji poly(A).
      UWAGA: Gdy klaster jest oznaczony jako przypuszczalny kandydat na wewnętrzny sygnał, jest on albo łączony z klastrem podrzędnym, jeśli te dwie klastry współdzielą swoje sygnały poli(A), albo zachowywany, jeśli najbardziej wysunięte miejsce w klastrze ma sygnał poli(A) zlokalizowany w minimalnej odległości przed klastrem (domyślnie: 15 nt). Wreszcie, gęsto rozmieszczone klastry są łączone, jeśli: (i) dzielą ten sam sygnał poli(A), lub (ii) rozpiętość wynikowego klastra nie przekracza maksimum (domyślnie: 25 nt).
    6. Przechowuj klastry w formacie pliku BED z łączną znormalizowaną liczbą odczytów ze wszystkich 3-calowych lokacji końcowych w każdym klastrze jako wynik.

Wyniki

RNA zawierający poli(A) wyizolowano z hodowli komórkowych, poddano fragmentacji poprzez hydrolizę alkaliczną, a następnie otrzymano cDNA w procesie odwrotnej transkrypcji z użyciem starterów oligo(dT). Uzyskane cDNA unieruchomiono na kuleczkach z streptawidyną, dU usunięto w reakcji specyficznej wycinania uracylu, do końców 5' i 3' odciętego fragmentu przyłączono adaptery, a następnie zsekwencjonowano inserty. Rysunek 1 przedstawia graficzny schemat eksperymentu.

W przypadku komórek HeLa i HEK293, 106 komórek było wystarczającą liczbą, aby zidentyfikować miejsca poli(A) dla zdecydowanej większości genów kodujących białka pod koniec procedury. Jednak w przypadku innych typów komórek lub tkanek może być konieczne przetestowanie nasycenia liczby zidentyfikowanych miejsc poli(A) wraz ze wzrostem liczby komórek wykorzystanych w eksperymencie. Reprezentatywne wyniki etapu pilotażowego PCR oraz analizy fragmentów DNA próbki przed sekwencjonowaniem przedstawiono na Rysunku 2.

Rysunek 3 przedstawia etapy wstępnego przetwarzania analizy obliczeniowej, rozpoczynając od pliku fastq uzyskanego z sekwenatora, a kończąc na odczytach po kontroli jakości i przycięciu adapterów, które są gotowe do zmapowania do genomu. Rysunek 4 przedstawia kroki analizy, które zaczynają się od mapowania odczytów do odpowiedniego genomu i kończą na katalogu miejsc przetwarzania końców 3' mRNA zidentyfikowanych w konkretnej próbce. W przypadku analizy wielu próbek wykonywane są dodatkowe kroki w celu dopasowania miejsc przetwarzania końców 3' znalezionych w poszczególnych próbkach oraz określenia ich liczności w obrębie próbek. Kroki te przedstawiono na Rysunku 5.

Zatem po zsekwencjonowaniu próbek analiza wynikowych plików z odczytami sekwencjonowania (w formacie fastq) za pomocą dostępnego potoku przetwarzania jest prosta. Po dodaniu informacji o próbkach do pliku konfiguracyjnego wykonanie potoku spowoduje wygenerowanie dwóch głównych typów plików wyjściowych: 1) plików BED ze wszystkimi zidentyfikowanymi miejscami procesowania końca 3' w poszczególnych próbkach (np. "sample1.3pSites.noIP.bed.gz") oraz 2) pliku BED ze wszystkimi klastrami miejsc poli(A) (clusters.merged.bed) we wszystkich próbkach badania. Wyniki obejmują również współrzędne genomowe dla wszystkich odczytów z każdej poszczególnej próbki (np. "sample1.STAR_out/Aligned.sortedByCoord.out.bam"), które można później wyświetlić w przeglądarce genomu, takiej jak IGV16. Wizualna inspekcja profilu(ów) odczytów zazwyczaj pozwala na wstępny wgląd w rozkład miejsc poli(A) w genomie oraz zmiany zachodzące pod wpływem specyficznych perturbacji przeprowadzonych w badaniu. Na przykład na Rysunku 6 przedstawiono odpowiedź konkretnego genu na knock-down białka HNRNPC.

Dostarczono również podsumowania tych rozkładów w całej genomie (Tabela 1). W szczególności pliki wyjściowe w katalogu „counts/annotation_overlap” zawierają ułamki miejsc pokrywających się z określonymi adnotacjami cech (z pliku gtf dostarczonego jako dane wejściowe; adnotacje obejmują: 3' UTR, egzon terminalny, egzon, intron, region międzygenowy). Na koniec, dla każdej próbki zapisywane są również wyniki poszczególnych etapów przetwarzania (np. „sample1.summary.tsv”). Obejmuje to liczbę: surowych odczytów w każdej próbce, odczytów o oczekiwanej strukturze końca 5', odczytów pozostałych po usunięciu pełnych duplikatów PCR, odczytów wysokiej jakości zgodnie z kryteriami zdefiniowanymi w kroku 9.2, odczytów mapujących się unikalnie do genomu (po usunięciu tych wynikających z błędów sekwencjonowania, patrz krok 9.5), odczytów mapujących się wielokrotnie (po usunięciu tych wynikających z błędów sekwencjonowania, patrz krok 9.5), surowych (niezgrupowanych) miejsc przetwarzania końca 3' w każdej próbce, surowych miejsc przetwarzania końca 3' bez potencjalnych kandydatów na wewnętrzne inicjowanie syntezy (internal priming), unikalnych miejsc przetwarzania końca 3' ze wszystkich próbek bez kandydatów na wewnętrzne inicjowanie syntezy oraz końcowego zestawu klastrów miejsc poly(A).

Schemat procesu sekwencjonowania RNA przedstawiający fragmentację, ligację adapterów, odwrotną transkrypcję i PCR.
Rycina 1: Główne etapy protokołu A-seq2. Poszczególne kroki są wskazane po lewej stronie ryciny. Wstawione fragmenty RNA przedstawiono jako zielone linie, które po odwrotnej transkrypcji zmieniają kolor na czerwony (cDNA); adaptery są oznaczone kolorem jasnoniebieskim lub pomarańczowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki amplifikacji PCR; schemat elektroforezy w żelu i wykres intensywności fluorescencji; analiza DNA.
Rycina 2: Pilotowy PCR i profil produktu końcowego. (a) Alikwoty z reakcji PCR pobrano w różnych cyklach i rozdzielono na 2% żelach agarozowych. Liczby po lewej stronie wskazują wielkość w nukleotydach odpowiadających prążków w drabinie DNA. W tym doświadczeniu dla reakcji PCR w dużej skali wybrano 12 cykli (*). (b) Przykład próbki po selekcji rozmiaru poddanej analizie w analizatorze wielkości fragmentów, wykazujący średnią wielkość około 280 nukleotydów. Liczby po lewej stronie [FU] wskazują względną intensywność sygnału. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces konwersji FASTQ na FASTA; schemat przepływu bioinformatycznego dla przetwarzania sekwencji i obsługi UMI.
Rysunek 3: Schemat wstępnego przetwarzania odczytów sekwencjonowania. Pliki fastq z odczytami generowanymi przez oprogramowanie powiązane z sekwenatorem są przetwarzane w celu zidentyfikowania wysokiej jakości odczytów, które zostaną zmapowane do odpowiedniego genomu. Rysunek przedstawia specyfikację wejść/wyjść poszczególnych kroków w potoku przetwarzania, wraz z odnośnikami do poszczególnych etapów protokołu opisanych w sekcji „Przetwarzanie danych”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat przepływu sekwencjonowania RNA: mapowanie, konwersja BAM-do-BED, kolaps UMI, dane wyjściowe, miejsca inicjacji.
Rysunek 4: Schemat przetwarzania odczytów sekwencji, od etapu mapowania do genomu po wygenerowanie poszczególnych miejsc przetwarzania końców 3'. Rysunek przedstawia specyfikację danych wejściowych i wyjściowych poszczególnych kroków w potoku obliczeniowym wraz z odniesieniami do poszczególnych kroków protokołu opisanych w sekcji „Przetwarzanie danych”. Główny plik wyjściowy dostarczany użytkownikowi został zaznaczony pogrubieniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat przetwarzania miejsc poli(A), szczegółowo przedstawiający łączenie próbek, przypisywanie sygnałów oraz skrypty klastrowania.
Rycina 5: Schemat kroków podejmowanych w celu wygenerowania klastrów współregulowanych miejsc sekwencjonowania końca 3'. Rycina przedstawia specyfikację wejścia/wyjścia poszczególnych etapów potoku przetwarzania, wraz z odnośnikami do poszczególnych kroków protokołu opisanych w sekcji „Przetwarzanie danych”. Główny plik wyjściowy został zaznaczony pogrubioną czcionką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres analizy RNA-seq, kontrola vs HNRPNC-siRNA; porównanie ekspresji genów; adnotacja Ensembl.
Rysunek 6: Przykładowe wyniki profilu odczytów przetwarzania końca 3' wzdłuż egzonu końcowego genu NUP214, przedstawione w przeglądarce genomu IGV 16. Odczyty A-seq2 przygotowano z dwóch próbek komórek HEK 293, traktowanych odpowiednio kontrolnym siRNA lub siRNA przeciwko HNRNPC. Odczyty dokumentujące miejsca poli(A), które zostały zanotowane przez potok analizy, zapisano w formacie BAM i wykorzystano jako dane wejściowe do przeglądarki genomu IGV. Szczyty odczytów końców 3' mapują się do końców 3' mRNA zanotowanych w Ensembl. Profile wskazują na zwiększone wykorzystanie izoformy z długim 3' UTR po wyciszeniu HNRNPC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

powtórzenie 1 si-Controlreplikacja 2 si-Control
id: 29765id: 32682
liczba surowych odczytów4421025868570640
liczba poprawnych odczytów po przycinaniu i filtrowaniu1402453821211793
liczba odczytów z unikalnym mapowaniem695367413946436
liczba odczytów mapujących do wielu loci20406462925839
liczba poszczególnych miejsc procesowania końca 3'11074931710353

Tabela 1: Przykładowy wynik potoku analizy. Podsumowania odczytów uzyskanych na poszczególnych etapach.

Dyskusja

Mnogość czynników rdzeniowych i pomocniczych, które są zaangażowane w przetwarzanie końcowe pre-mRNA 3', znajduje odzwierciedlenie w odpowiednio złożonym krajobrazie poliadenylacji. Ponadto poliadenylacja reaguje również na zmiany w innych procesach, takich jak transkrypcja i splicing. Końcowe miejsca cięcia 3' w pre-mRNA są zwykle identyfikowane na podstawie charakterystycznych ogonów poli(A), które są dodawane do produktów cięcia 5'. Większość metod wykorzystuje startery oligo(dT) o zmiennej długości, które umożliwiają specyficzną konwersję mRNA zawierających poli(A) do cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. Częstym problemem tego podejścia jest wewnętrzne torowanie do sekwencji bogatych w A, co skutkuje sztucznymi miejscami cięcia. Zaproponowano dwie metody, które mają na celu obejście tego artefaktu na etapie przygotowania próbki. W metodzie 3P-seq 1 adaptery są specyficznie ligowane do końców ogonów poli(A) za pomocą oligo szyny, a następnie częściowe trawienie RNazy T1 i odwrotna transkrypcja z TTP w reakcji jako jedynym deoksynukleotydem. Powstałe heterodupleksy poli(A)-poli(dT) są następnie trawione za pomocą RNazy H, a pozostałe fragmenty RNA są izolowane, ligowane do adapterów i sekwencjonowane. Prostsza i bardziej elegancka metoda, 2P-seq, która wykorzystuje niestandardowy starter sekwencjonowania, pomijając pozostały odcinek oligo(dT) w reakcji sekwencjonowania, została opisana przez tych samych autorów 2. W pokrewnej metodzie, 3'READS 3, niezwykle długi starter składający się z 5 Us i 45 T, zawierający również biotynę, jest wyżarzany do rozdrobnionego RNA, a następnie poddawany rygorystycznym płukaniom w celu wyselekcjonowania cząsteczek RNA z ogonami poli(A) ponad 50 nukleotydów. Chociaż 3'READS drastycznie zmniejsza częstotliwość wewnętrznego gruntowania, nie eliminuje go całkowicie 3. Zaproponowano również protokoły bezpośredniego sekwencjonowania RNA, ale wynikowe odczyty są krótkie i mają wysoki poziom błędu, a podejście to nie było dalej rozwijane 18,19,20. Protokoły PolyA-Seq i skomercjalizowane Quant Seq łączą priming oparty na oligo(dT) z losowym etapem primingu do syntezy drugiej nici cDNA 20. Zastosowanie reakcji odwrotnej transkrypcji przełącznika matrycowego z odwrotną transkryptazą wirusa mysiej białaczki Moloneya (MMLV) prowadzi do wytworzenia cDNA z łącznikami w jednym kroku, a zatem w metodach PAS-Seq i SAPAS nie mogą pojawić się żadne dimery adapterowe 21,22.

Przedstawiona tutaj metoda A-seq2 wyróżnia się wykorzystaniem łupliwego nukleotydu (dU) w biotynylowanym starterze oligo(dT). Modyfikacja ta łączy w sobie użyteczność wzbogacania zhybrydyzowanych oligo(dT), poliadenylowanych celów z usunięciem większości sekwencji oligo (dT)25 z izolowanych fragmentów przed przygotowaniem bibliotek i zachowaniem trzech T, które wskazują na wcześniejszą obecność ogona poli(A). W przeciwieństwie do tego, metody, które wykorzystują RNazę H do usuwania poli(A) z cząsteczek RNA, losowo pozostawiają kilka As. Ponieważ w A-seq2 sekwencjonowanie odbywa się od końca 3' nici antysensownych, przewiduje się, że miejsca rozszczepienia będą zlokalizowane po odczytaniu motywu NNNNTTT na początku surowej sekwencji. Randomizowane tetramery służą nie tylko do umożliwienia wywoływania bazy, ale także do eliminacji artefaktów amplifikacji PCR. Można również pomieścić dłuższe moduły UMI. Możliwość wewnętrznego torowania pozostaje w A-seq2 i jest rozpatrywana obliczeniowo, najpierw poprzez odrzucenie końców 3' z zakodowaną genomowo, bogatą w A sekwencją dalszą, a następnie poprzez odrzucenie klastrów końcowych 3', które można wyjaśnić wewnętrznym torowaniem w samym sygnale poli(A) bogatym w A. Niedawna analiza miejsc poli(A) wywnioskowanych jednoznacznie przez dużą liczbę protokołów wskazuje, że miejsca, które są unikalne dla A-seq2, mają oczekiwaną dystrybucję nukleotydów i lokalizację w genach, podobnie jak inne protokoły sekwencjonowania końca 3'.

Krytycznym krokiem w A-seq2 jest selekcja poliadenylowanego RNA i usunięcie rybosomalnego RNA i różnych małych RNA. Najłatwiej jest to osiągnąć za pomocą zestawu do izolacji mRNA z kulkami magnetycznymi oligo (dT)25 . Zasadniczo całkowite RNA wyizolowane roztworami zawierającymi fenol daje również wysokiej jakości RNA, które można dalej poddawać selekcji za pomocą zestawu do izolacji mRNA lub agarozy oligo(dT). Etapem, który można zmieniać w A-seq2, jest leczenie hydrolizą alkaliczną, którą można skrócić lub wydłużyć w celu uzyskania fragmentów RNA o różnych rozmiarach. Kluczowe jest również to, że dodawanie 3'dATP do końców 3' fragmentów RNA przez polimerazę poli(A) jest wydajne. W opisanym tutaj protokole zabieg ten stosuje się do wszystkich fragmentów RNA, aby uniknąć konkategoryzacji podczas reakcji ligacji. Na koniec zauważamy, że chociaż ligaza RNA 1 jest zwykle używana jako ligaza RNA, skutecznie liguje również jednoniciowe DNA, tak jak zrobiliśmy to tutaj, aby podwiązać adapter do końca 5' cząsteczek cDNA.

Tak więc A-seq2 jest wydajnym i łatwym do wdrożenia protokołem do identyfikacji końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'. Przyszłe rozwiązania mogą obejmować dalsze zmniejszanie złożoności protokołu i ilości wymaganego materiału. Powiązany zestaw narzędzi do obliczeniowej analizy danych umożliwia ponadto jednorodne przetwarzanie odczytów sekwencjonowania końca 3' uzyskanych za pomocą szerokiej gamy protokołów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Pani Béatrice Dimitriades za pomoc w hodowli komórek. Prace te były wspierane przez granty Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki #31003A_170216 i 51NF40_141735 (NCCR RNA & Disease).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
Agaroza, ultra czystyInvitrogen16500-500
2100 BioanalyzerAgilentG2940CA
Trifosforan kordycepiny (3' dATP)SIGMAC9137
DNA fiolki o niskim poziomie wiązania, 1,5 mlEppendorf22431021
Dulbecco’ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSIGMAD8637
Dynabeads mRNA-DIRECT KitAmbionAM61012
GR-Green barwnikExcellgenEG-1071zastosowanie rozcieńczenia 1:10 000
HiSeq 2500 lub NextSeq 500 sekwencery nowej generacjiIlluminazapytaj dostawcę
KAPA HiFi Hotstart Mieszanka polimerazy DNAKAPA/RocheKK2602
Woda wolna od nukleazAmbionAM9937
Polimeraza poli(A), drożdżeThermo Fisher Scientific74225Z25KU
Polimeraza poli(A), E.coliNew England BiolabsM0276L
Kinaza polinukleotydowaThermo Fisher ScientificEK0032
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAEX IIQiagen20021
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704
Ligaza RNA 1, wysokie stężenieNew England BiolabsM0437Mzawiera zestaw do czyszczenia RNA PEG-8000
RNeasy MinEluteQiagen74204
RNase HNew England BiolabsM0279
RNasin Plus, inhibitor rybonukleazyPromegaN2618
Indeks górny IV odwrotna transkryptazaThermo Fisher Scientiific18090050
Turbo DNaseAmbionAM2238
UŻYTKOWNIK mieszanka enzymówNew England BiolabsM5505
Dyna-Mag-2 stojak magnetycznyThermo Fisher Scientific12321D
Thermomixer CEppendorf5382000015Podgrzewany mikser z podgrzewaną pokrywą
Kolumny MicroSpinGE-Healthcare27-5325-01
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Buffers
Alkaliczny bufor do hydrolizy, 1,5 xWymieszaj 1 część 0,1 M Na2CO3 i 9 części 0,1 M NaHCO3. Dodaj EDTA do 1 mM. Dostosuj pH do 9,2. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
5x bufor poli(A) polimerazyThermo Fisher Scientiific100 mM Tris-HCl, pH 7,0, 3 mM MnCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mg/ml acetylowany BSA, 50% glicerol
Bufor wiążący biotynę20 mM Tris­ Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,1% NP­ 40
bufor10 mM Tris­ Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,02% NP­ 40
NazwaFirmaNumer katalogowySequence
Oligonukleotydy według zestawów do przygotowywania małych próbek RNA Illumina TruSeq, do sekwencerów GA-IIx i Hiseq2000/2500Microsynth
revRA3 (RNA)Mikrosyntezator5' aminowy & nieśmiały; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&nieśmiały; 3'
revDA5Microsynth5' amino&nieśmiały; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3'
Bio-dU-dT25, RT starterMicrosynth5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3' (V = G, A lub C)
Starter PCR do przodu, RP1Microsynth Microsynth5' AATGATACGGGGCGGACCACCGAGA TCTACACGTGTGTTCTCTACAG
TCCGA 3'PCR
starter reverse, RPI1, kod kreskowy pogrubioną czcionkąMicrosynth5' CAAGCAGAAGGGCATACGAG
ATCGTGATGTGACTGGAGTTCCT
TGGCACCCGAGAATTCCA 3'
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>Oligonukleotydy według zestawów do przygotowywania próbek Illumina TruSeq HT-Small RNA, dla sekwencerów HiSeq2000/2500 i NextSeq500
HT-rev3A (DNA/RNA)Mikrosyntezator5'-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
CTCTTCCrGrAUrC-3'HT-rev5A
Mikrosyntezator5' amino-ACACTCTCTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCTNNNN
3'Bio-dU-dT25, RT starterMicrosynth3'PCR
startery do przodu (D501-506)Microsynth lub Illumina5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA
CGACGCTCTCTCCCCGATCT -3'PCR
startery odwrotne (D701-D712)Microsynth lub Illumina5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3'Dokumentacja
multipleksowania Illumina:Illuminahttps://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf
TEN 5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN

Bibliografia

  1. Jan, C. H., Friedman, R. C., Ruby, J. G., Bartel, D. P. Formation, regulation and evolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs. Nature. 469 (7328), 97-101 (2011).
  2. Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. 3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts. Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).
  3. Hoque, M., Ji, Z., et al. Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing. Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).
  4. Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length. Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).
  5. Gruber, A. R., Martin, G., et al. Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells. Nat. Commun. 5, 5465(2014).
  6. Kivioja, T., Vähärautio, A., et al. Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).
  7. Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation. Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).
  8. Lingner, J., Keller, W. 3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).
  9. Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
  10. Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  11. Analytics, C. Anaconda Software Distribution. , Available from: https://continuum.io (2016).
  12. Lab, H. FASTX-Toolkit - Hannon Lab. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html (2017).
  13. Dobin, A., Davis, C. A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  14. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  15. Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  16. Robinson, J. T., Thorvaldsdóttir, H., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Ozsolak, F., Platt, A. R., et al. Direct RNA sequencing. Nature. 461 (7265), 814-818 (2009).
  19. Yao, C., Biesinger, J., et al. Transcriptome-wide analyses of CstF64-RNA interactions in global regulation of mRNA alternative polyadenylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (46), 18773-18778 (2012).
  20. Lin, Y., Li, Z., et al. An in-depth map of polyadenylation sites in cancer. Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).
  21. Shepard, P. J., Choi, E. -A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq. RNA. 17 (4), 761-772 (2011).
  22. Fu, Y., Sun, Y., et al. Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing. Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Protokół A-seq2przetwarzanie końca 3' mRNAmapowanie miejsc poliadenylacjimagnetyczne kulki z oligod(T)hydroliza alkalicznamieszanina główna ligazy RNAodwrotna transkrypcjakulki z streptawidynąpilotażowe PCR
3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.