Method Article

Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów

DOI:

10.3791/56133

⸱

December 5th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physical Therapy, Marquette University, 2Medical College of Wisconsin, 3Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 4Graduate Programs of Nurse Anesthesia, Texas Wesleyan University, 5Office of Research, Medical College of Wisconsin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii telewizyjnej in vitro do oceny funkcji naczyń krwionośnych w izolowanych tętnicach oporowych mózgu (i innych naczyniach), a także opisuje techniki oceny perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływowej dopplerowskiej metrii (LDF) i gęstości mikronaczyń za pomocą fluorescencyjnie znakowanej lektyny Griffonia simplicifolia (GS1). Obecne metody badania izolowanych tętnic opornych przy ciśnieniach przezściennych spotykanych in vivo i przy braku wpływów komórek miąższowych stanowią kluczowe ogniwo między badaniami in vivo a informacjami uzyskanymi z podejść redukcjonistycznych molekularnych, które zapewniają ograniczony wgląd w reakcje integracyjne na poziomie całego zwierzęcia. LDF i techniki selektywnej identyfikacji tętniczek i naczyń włosowatych za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny GS1 zapewniają praktyczne rozwiązania, które umożliwiają badaczom poszerzenie wiedzy zdobytej podczas badań izolowanych tętnic oporowych. W artykule opisano zastosowanie tych technik w celu uzyskania podstawowej wiedzy na temat fizjologii i patologii naczyń krwionośnych u szczurów jako ogólnego modelu eksperymentalnego oraz w różnych wyspecjalizowanych genetycznie modyfikowanych "zaprojektowanych" szczepach szczurów, które mogą dostarczyć ważnych informacji na temat wpływu określonych genów na ważne fenotypy naczyniowe. Wykorzystanie tych cennych podejść eksperymentalnych w szczepach szczurów opracowanych przez selektywne strategie hodowlane i nowe technologie wytwarzania modeli nokautu genów u szczurów, rozszerzy rygor przesłanek naukowych opracowanych w modelach myszy z nokautem i rozszerzy tę wiedzę na bardziej odpowiedni model zwierzęcy, z dobrze poznanym tłem fizjologicznym i przydatnością do badań fizjologicznych ze względu na jego większy rozmiar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najwcześniejsze badania funkcji naczyń krwionośnych w tętnicach wykorzystywały tętnice przewodowe, a w wielu przypadkach aortę. Wytwarzanie siły w dużych tętnicach badano na ogół poprzez przymocowanie pierścieniowego odcinka tętnicy do przetwornika siły w kąpieli tkankowej; W przypadku aorty, przecinając spiralne paski naczynia w taki sposób, aby włókna mięśni gładkich były zorientowane w kierunku wzdłużnym między punktem przyczepu a przetwornikiem siły, aby zapewnić najlepsze oszacowanie siły generowanej przez skurcz mięśnia gładkiego wzdłuż jego osi podłużnej. Standardową techniką cięcia spiralnych pasków aorty było umieszczenie szklanego pręta w świetle naczynia, wykonanie nacięcia w ścianie naczynia pod pożądanym kątem i przytrzymanie końca odsłoniętej krawędzi ścianki naczynia podczas przedłużania cięcia, aby uzyskać cały spiralny pasek naczynia. W tym momencie śródbłonkowa strona naczynia była na ogół osuszana w celu usunięcia zanieczyszczeń przed przymocowaniem paska naczynia do przetwornika siły i zanurzeniem preparatu w natlenionej kąpieli tkankowej o kontrolowanej temperaturze. Ostatecznie podejście to doprowadziło do jednego z najsłynniejszych i najważniejszych odkryć w historii fizjologii autorstwa Furchgotta i Zawadskiego1, a mianowicie roli czynnika relaksacyjnego pochodzącego ze śródbłonka (EDRF), zidentyfikowanego następnie jako tlenek azotu, w regulacji funkcji naczyń krwionośnych. Kluczowym wydarzeniem, które doprowadziło do tego odkrycia, była sytuacja, w której badacze utrzymywali nienaruszony śródbłonek, unikając kontaktu śródbłonkowej strony tętnicy z obcymi powierzchniami i zauważyli, że pasek aorty nie wykazywał oczekiwanego skurczu do acetylocholiny (ACh), ale zamiast tego rozluźnił się w odpowiedzi na ACh. Opierając się na tej obserwacji, badacze opracowali preparat "kanapkowy", w którym przyłączyli segment aorty z nienaruszonym śródbłonkiem (ale niezdolny do wytworzenia siły skurczu) do standardowego spiralnego paska aorty i przekształcili skurcz wywołany przez ACh w relaksację.

Dwa główne osiągnięcia w tej dziedzinie, które są dziś szeroko stosowane, to opracowanie preparatów do pomiaru aktywnej siły skurczu w małych tętnicach oporowych2,3 (takich jak te w krezce jelitowej3) oraz preparaty tętnic oporowych kaniulowanych4,5,6. W jednym z najwcześniejszych doniesień Mulvany i Halpern3 opisali zastosowanie preparatu miografu drucianego do badania aktywnej siły skurczu w izolowanych tętnicach oporowych z krezki jelitowej szczurów z samoistnym nadciśnieniem tętniczym (SHR) i normotensyjnych kontrolnych WKY. Po opracowaniu systemu miografu drutowego, opracowano kaniulowane preparaty tętnic oporowych, aby umożliwić badania naczyń w warunkach zbliżonych do warunków in vivo4,5,6. Podczas gdy oba podejścia dostarczają cennych wyników, preparat tętnicy kaniulowanej ma dodatkowe zalety w postaci skuteczniejszego zachowania wewnętrznego aktywnego tonu w tętnicach; i umożliwiając badaczom badanie aktywnych reakcji miogennych na zmiany ciśnienia przezściennego i odpowiedzi naczyń na zmiany natężenia przepływu i naprężenia ścinającego śródbłonka (patrz recenzja Halperna i Kelleya6).

Głównym celem tego artykułu jest opisanie jak zastosować uświęconą tradycją technikę mikroskopii wideo przy użyciu izolowanych, kaniulowanych tętnic oporowych w celu uzyskania precyzyjnych informacji na temat mechanizmów, które regulują aktywny ton w tych kluczowych naczyniach, niezależnie od wpływów komórek nerwowych, humoralnych czy miąższowych. Te podstawowe informacje, wykorzystujące standardowy model szczura i przykłady z naszych badań nad nowymi genetycznie modyfikowanymi szczepami szczurów, dadzą czytelnikowi wyobrażenie o rodzajach spostrzeżeń dotyczących funkcji naczyń krwionośnych, które można uzyskać za pomocą podejść do mikroskopii telewizyjnej i które mogą być wykorzystane w badaniach obejmujących dowolną grupę kontrolną i eksperymentalną (grupy) wybrane przez badacza. w tym nowe, potężne eksperymentalne modele szczurów wytworzone przez selektywny chów wsobny i nowo opracowane techniki inżynierii genetycznej.

Dzięki precyzji metod mikroskopii telewizyjnej, pomiar zmian średnicy w preparatach tętnic kaniulowanych może dostarczyć bardzo cennych informacji na temat zależnych i niezależnych od śródbłonka mechanizmów relaksacji naczyniowej, jak również ważnych (i czasami nieoczekiwanych) zmian w mechanizmach kontroli naczyń występujących przy nadciśnieniu, diecie bogatej w sól i innych eksperymentalnych interwencjach. Ponadto pomiar zależności ciśnienie-średnica w izolowanych i kaniulowanych tętnicach oporowych, które są maksymalnie rozluźnione przez leczenie roztworem wolnym od Ca2+ lub farmakologicznym lekiem rozszerzającym naczynia krwionośne, pozwala badaczowi ocenić zmiany strukturalne w tętnicach spowodowane przebudową naczyń krwionośnych i obliczyć pasywne zależności naprężenie-odkształcenie7 Może to dostarczyć ważnych informacji na temat zmian w pasywnych właściwościach mechanicznych tętnic, które mogą wpływać na funkcję tętnic niezależnie (lub dodatkowo) od zmian w aktywnych mechanizmach kontroli. Ważne jest również, aby zauważyć, że informacje uzyskane z badań izolowanych tętnic opornych mogą być uzupełnione informacjami uzyskanymi przy użyciu LDF, praktycznej metody oceny perfuzji tkanek na poziomie całego zwierzęcia8,9,10, oraz informacjami uzyskanymi z oceny gęstości mikronaczyń za pomocą fluorescencyjnie znakowanej lektyny GS1, która specyficznie wiąże się z ugrupowaniami glikoproteinowymi w Błona podstawna małych tętniczek i naczyń włosowatych11,< klasa SUP = "XREF">12. Ta ostatnia metoda zapewnia bardzo dokładne oszacowanie gęstości mikronaczyń, które nie jest podatne na klasyczne trudności napotykane przy szacowaniu gęstości mikronaczyń poprzez zliczanie naczyń in vivo, na przykład brakujących nieperfundowanych naczyń, w których przepływ krwi jest zatrzymany z powodu aktywnego zamknięcia tętniczek. Stosowane razem, podejścia te mogą dostarczyć ważnych informacji na temat korelacji zmian funkcjonalnych w izolowanych tętnicach opornych ze zmianami w perfuzji tkanek na poziomie mikrokrążenia; Niektóre przykłady zastosowania tych cennych metod w połączeniu z technikami kaniulowania tętnic zostaną również przedstawione w niniejszym manuskrypcie.

Niniejszy artykuł skupia się na wykorzystaniu technik mikroskopii wideo do oceny zmian naczyniowych w tętnicach niekrewniaczych szczurów rasy Sprague-Dawley. Należy jednak zauważyć, że techniki te okazały się bardzo cenne w wyjaśnianiu zmian fenotypowych w wysoce wyspecjalizowanych genetycznie modyfikowanych szczepach szczurów stworzonych przez selektywną hodowlę lub edycję genów przy użyciu technik. W tym manuskrypcie podajemy przykłady tego, w jaki sposób techniki mikroskopii wideo dostarczyły ważnych informacji na temat funkcji naczyń krwionośnych w wielu cennych modelach szczurów, w tym w szczurze szczurze wrażliwym na sól Dahla (SS) - wsobnym szczepie szczurów, który jest najczęściej stosowanym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów wrażliwego na sól hypertensona18,19,20,21,22,23; oraz szczury konsomemiczne powstałe w wyniku selektywnej hodowli szczurów SS z niewrażliwym na sól szczepem szczura Brown Norway (BN). W panelach szczurów consomicznych każdy chromosom szczura rasy brązowej norweskiej został indywidualnie wprowadzony do klasy Dahl SS24,25,26 genetyczne. Wykorzystanie konsomalnych paneli szczurów dostarczyło cennych wskazówek dotyczących specyficznych chromosomów, które przyczyniają się do wrażliwości na sól ciśnienia krwi i innych fenotypów, w tym reaktywności naczyniowej24,25,26,27,28.

Selektywne strategie hodowlane wykorzystujące szczury SS i szczury konsomiczne posiadające indywidualne chromosomy BN umożliwiły również generowanie zawężonych szczepów kongenicznych z małymi segmentami pojedynczych chromosomów Brown Norway wprowadzonych do genetycznego tła Dahl SS22,29. Mogą one dostarczyć niezwykle cennych danych wejściowych na temat określonych genów lub wąskich regionów chromosomów, które mogą wpływać na kluczowe zmienne fizjologiczne, takie jak ciśnienie krwi, uszkodzenie nerek i reaktywność naczyń krwionośnych22,29. Kolejnym potężnym dodatkiem do zestawu narzędzi genetycznych szczurów jest opracowanie modeli nokautu genów szczurów wykorzystujących zaawansowane techniki edycji genów, w tym ZFN, nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALENS), a ostatnio CRISPR-Cas913,14,15,16,17. Pojawienie się tych potężnych technik, które umożliwiają wyeliminowanie genów u szczurów, jest niezwykle ważnym osiągnięciem, ponieważ dotychczasowe badania nad nokautem genów wykorzystywały (i nadal używają) myszy prawie wyłącznie. Kolejny komponent eksperymentalny w niniejszej pracy demonstruje wartość technik kaniulowanych tętnic i mikroskopii wideo do oceny fizjologicznych mechanizmów kontroli u szczurów z nokautem pozbawionych głównego przeciwutleniacza i ochronnego czynnika transkrypcyjnego komórek, czynnika jądrowego (2)-like-2 (NRF2) pochodzącego z erytroidu30,31, które zostały opracowane przy użyciu technologii TALEN w tle genetycznym Sprague-Dawley17. W eksperymentach tych wykorzystano techniki mikroskopii wideo in vitro, aby zapewnić funkcjonalną weryfikację utraty genu NRF2 i przetestować potencjalnie cenne podejście terapeutyczne oparte na bezpośredniej regulacji w górę obrony antyoksydacyjnej za pośrednictwem NRF2. NRF-2 ma istotne znaczenie terapeutyczne w zwalczaniu naczyniowego stresu oksydacyjnego u ludzi, w świetle rozczarowujących wyników badań klinicznych obejmujących bezpośrednie podawanie przeciwutleniaczy, takich jak witaminy C i E32.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Medical College of Wisconsin zatwierdził wszystkie protokoły opisane w tym artykule, a wszystkie procedury są zgodne z przepisami Biura ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych (OLAW) National Institutes of Health (NIH).

1. Przygotowanie roztworów i komora naczynia

  1. Przed przeprowadzeniem serii eksperymentów należy przygotować 2 l 20x stężonego roztworu soli składającego się z 278 g/L NaCl; 14 g/L KCl; 11,52 g/LMgSO4 .7H2O; i 9,4 g/l CaCl2 .2H2O. Przygotować również 2 l 20x stężonego roztworu buforowego składającego się z 80,8 g/lNaHCO3 i 0,4 g/l EDTA, oraz 2 l 20x stężonego roztworu podstawowego wolnego od Ca2+, składającego się z 281,6 g/l NaCl; 14 g/l KCl i 11,52 g/l MgSO4 .7H2O.
    UWAGA: Roztwory podstawowe 20X można przechowywać w lodówce do czasu użycia.
  2. W dniu eksperymentu przygotuj 2 l fizjologicznego roztworu soli (PSS) z 20x stężonych roztworów podstawowych w następujący sposób: dodaj 100 ml 20x bulionu soli do 1 800 ml wody dejonizowanej w 2 litrowej kolbie Erlenmeyera lub zlewce na zmotoryzowanej płytce mieszającej. Dodać 100 ml 20-krotnego bulionu buforowego, ciągle równoważąc roztwór mieszaniną gazów zawierającą 21%O2, 5% CO2, równowagę N2 i mieszając ją za pomocą mieszadła magnetycznego. Powoli dodawać 0,28 g NaH2PO4, monitorując pH; w razie potrzeby dostosować do pH 7,4, dodając krople 6 N HCl lub 6,5 N roztworu NaOH z pipety Pasteura. Po przygotowaniu PSS i dostosowaniu pH dodaj 1,98 g glukozy do PSS.
    UWAGA: Ważne jest, aby powoli dodawać NaH2PO4 na końcu, jednocześnie monitorując pH PSS, ponieważ dodanie NaH2PO4 do roztworu alkalicznego (pH >7,4) może spowodować wytrącenie się fosforanu wapnia, na co wskazuje pojawienie się mętnego roztworu lub białego osadu na dnie pojemnika.
    UWAGA: Ostateczny skład PSS to 119 mM/L NaCl; 4,7 mM/L KCl; 1,17 mM/L Mg>2SO4; 1,6 mM/L CaCl2; 1,18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L NaHCO3; 0,03 mM/L EDTA; i 5,5 mM/L glukozy. Chociaż skład PSS może się różnić w zależności od laboratorium, ta receptura jest wysoce odpowiednia do utrzymania napięcia naczyniowego, funkcji śródbłonka i odpowiedzi na czynniki wazoaktywne w izolowanych tętnicach oporowych.
  3. Aby określić maksymalną średnicę i ocenić aktywny ton w tętnicy poprzez wytworzenie maksymalnego rozszerzenia naczynia, przygotuj 500 ml PSS wolnego od Ca2+, dodając 25 ml 20X Ca2+ wolnej soli do 450 ml wody dejonizowanej, a następnie 25 ml 20-krotnego buforu w kolbie Erlenmeyera lub zlewce podobnej do kroku 1.2 powyżej. Dodać 0,07 g NaH2PO4 do roztworu, monitorując i dostosowując pH roztworu. Wolny od Ca2 + PSS dodaje się do zbiornika PSS i komory naczynia pod koniec eksperymentu, aby uniknąć wyczerpania wewnątrzkomórkowych zapasów Ca2 +, które mogłyby wpływać na odpowiedzi naczyń w normalnym PSS. Ponieważ roztwór wolny od Ca2+ jest dodawany na końcu eksperymentu, aby uzyskać maksymalne rozluźnienie tętnic, nie ma potrzeby dodawania glukozy do PSS.
    UWAGA: Po zakończeniu, ostateczny skład PSS wolnego od Ca2+ wynosi 120,6 mM/L NaCl; 4,7 mM/L KCl; 1,17 mM/L Mg2SO4; 1,18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L NaHCO3; 0 mM/L CaCl2; oraz 0,03 mM/L EDTA.
    UWAGA: W przypadku wielu badań wymagających maksymalnego rozszerzenia tętnicy, oprócz usunięcia Ca2+ z PSS, można dodać bloker wejścia wapnia, taki jak werapamil (1 μM) i/lub donor tlenku azotu, taki jak nitroprusydek sodu (10 μM).
  4. Utrzymuj PO2, PCO2 i pH PSS poprzez ciągłe równoważenie PSS wpływającego do komory naczynia w standardowej kąpieli narządowej używanej do badania izolowanych pierścieni aortalnych, mięśni gładkich jelit lub innych tkanek (Rysunek 1). Do połączenia zbiornika gazu z łaźnią organową należy użyć syntetycznego fluoropolimeru rurki tetrafluoroetylenowej, ponieważ ten typ rurki jest nieprzepuszczalny dla gazu, w przeciwieństwie do wielu innych form przewodów, np. lateksu.
  5. Umieść mały kamień napowietrzający połączony z mieszaniną gazów równoważących w komorze naczynia, aby pomóc w utrzymaniu składu gazu PSS.
    UWAGA: Reakcje zbiornika na zmiany PO2 można przetestować, równoważąc PSS w komorze naczynia i perfuzacie luminalnym z mieszaninami gazów zawierającymi różne procentyO2, np. 21% O2, 10% O2, 5% O2 i 0% O2, z 5% CO2 i równowagą N233,34,35. W przypadku większych tętnic o grubszych ścianach, gdzie dyfuzja tlenu do środka ściany naczynia może być ograniczeniem, można zastosować wyższy procent tlenu, np. 95%O2.
  6. Uważnie monitoruj temperaturę w komorze naczynia, ponieważ poszczególne komory mogą różnić się charakterystyką wymiany ciepła.
    UWAGA: Wiele komercyjnie przygotowanych komór naczyniowych używanych do badań kaniulowanych tętnic oporowych wykorzystuje pompę perystaltyczną do dostarczania natlenionego PSS ze zbiornika zrównoważonego gazem i zapewnia bardzo precyzyjną kontrolę temperatury kąpieli i natlenienia PSS.
  7. Umieść PSS w dużej (2 l) butelce Mariotte, z korkiem i centralną szklaną rurką, która służy jako zbiornik do ciągłego dostarczania PSS do kąpieli narządowej, która podgrzewa i równoważy gazem PSS wpływający do komory naczynia (Rysunek 1A).
  8. Umieścić otwór centralnej szklanej rurki w butelce Mariotte na tym samym poziomie, co górna część PSS w kąpieli organowej, aby utrzymać stałe ciśnienie hydrostatyczne w głowicy do dostarczania PSS do kąpieli organowej. Użyj rurki polietylenowej połączonej ze szklaną lub plastikową rurką w kształcie litery J, aby dostarczyć PSS z butelki Mariotte do kąpieli organowej.
  9. W przypadku perfuzji światła (Rysunek 1A), użyj rurki polietylenowej, aby podłączyć pipetę dopływającą do zbiornika PSS składającego się z plastikowej strzykawki o pojemności 60 cm3 podniesionej do pozycji, która utrzymuje pożądane ciśnienie dopływu (zwykle 80 mmHg w przypadku badań tętnic mózgowych szczurów), mierzone za pomocą przetwornika ciśnienia podłączonego do systemu za pomocą kurka.
  10. Podłączyć pipetę odpływową do rurki polietylenowej, aby umożliwić przepływ PSS przez naczynie w odpowiedzi na gradient ciśnienia, a następnie podłącz przewód odpływowy do zbiornika podobnego do zbiornika dopływowego. Użyj podobnego przyłącza kranu i przetwornika ciśnienia, aby zmierzyć ciśnienie wypływu.
    UWAGA: Procedury ustawiania ciśnienia poprzecznego i kontrolowania przepływu przez zbiornik są opisane w sekcji 2 poniżej.
  11. Pod koniec eksperymentu dokładnie przepłucz komorę, przewody tłoczne i systemy zbiorników wodą destylowaną. W częstych odstępach czasu wymieniaj przewody i przewody doprowadzające, czyść lub wymieniaj kurki w systemie i okresowo poddawaj szklane zbiorniki PSS myciu kwasem, aby zapobiec rozwojowi bakterii i innych mikroorganizmów, które powodują zanieczyszczenie i wpływają na reaktywność naczynia.

2. Przygotowanie tętnicy kaniulowanej

  1. Znieczulij szczura Sprague-Dawley 5% izofluranem i utrzymuj znieczulenie za pomocą 1,5-2,5% tlenu klasy medycznej36. Alternatywnie należy podać wstrzyknięcie domięśniowe zawierające ketaminę (75,0 mg/kg), acepromazynę (2,5 mg/kg) i ksylazynę (10,0 mg/kg); dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (50-60 mg/kg); lub dowolną inną zatwierdzoną metodę znieczulenia, w zależności od protokołów i/lub preferencji badacza.
  2. Odetnij głowę szczura w głębokim znieczuleniu i usuń mózg w celu zbadania tętnic oporowych mózgu.
  3. Po usunięciu mózgu należy dokładnie wyizolować tętnicę środkowo-mózgową (MCA) (lub inne interesujące nas tętnice, np. tętnicę podstawną lub tętnicę mózgową tylną)37,38. Aby wyizolować MCA, umieść mózg na wznak na szklanej szalce Petriego wypełnionej lodowatym PSS (Ryc. 2).
  4. Użyj nożyczek Vannas i kleszczyków Dumont #5 z cienką końcówką, aby wyciąć MCA z mózgu. Oczyść resztki tkanki mózgowej z MCA za pomocą kleszczy i przenieś tętnicę do komory naczynia o kontrolowanej temperaturze zawierającej PSS, jak opisano wcześniej. 33,34 .
  5. Aby przenieść tętnicę do komory naczynia, delikatnie przytrzymaj wycięte naczynie za ACA lub tylny odcinek tętnicy łączącej i ostrożnie umieść go w komorze.
    UWAGA: Oprócz MCA, system naczyń kaniulowanych nadaje się do szerokiej gamy preparatów małych naczyń, w tym tętnic oporowych mięśni szkieletowych33,39,40, tętnice krezkowe oporowe38,41,42 oraz duże (pierwszego rzędu) tętniczki mięśnia Cremaster43, a także ludzkie tętniczki wieńcowe i tętniczki ludzkie uzyskane z podskórnej tkanki tłuszczowej podczas biopsji pośladkowej 44,45,46,47.
  6. Przymocuj tętnicę do mikropipety dopływowej, pociągając ją w kierunku podstawy pipety, aż końcówka wsunie się w światło MCA. Zabezpiecz tętnicę na pipecie dopływowej, zawiązując pętlę przygotowaną z pojedynczego włókna pasmowego uprzednio drażnionego z szwów 10-0 wokół tętnicy (Rysunek 1B). Przymocuj przeciwległy koniec MCA do pipety odpływowej, zaciskając drugą pętlę szwu wokół naczynia (Rysunek 1B).
    UWAGA: Umieść pętle do szwów na mikropipetach przed zamontowaniem naczynia i umieść je blisko ostatniego punktu mocowania, umożliwiając łatwe nasunięcie ich przez tętnicę i szybkie zabezpieczenie, gdy naczynie jest na swoim miejscu, co minimalizuje ryzyko zsunięcia się tętnicy z pipet.
    UWAGA: Mikropipety przygotowuje się z rurki kapilarnej ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 2 mm; średnica wewnętrzna 1 mm; długość 10 cm) za pomocą pionowego ściągacza do mikropipet. Przed podłączeniem tętnicy należy jak najdokładniej dopasować średnice końcówek mikropipet, aby zapobiec niedopasowaniu oporu dopływu i odpływu w systemie perfuzyjnym.
  7. Po bezpiecznym połączeniu tętnicy z mikropipetami użyj mikrometru podłączonego do uchwytu pipety dopływowej, aby rozciągnąć tętnicę do jej długości in situ.
  8. Zwiąż wszystkie boczne gałęzie pojedynczymi pasmami drażnionymi z szwów 10-0, aby utrzymać stałe ciśnienie w tętnicy.
  9. Sprawdź, czy nie ma nieszczelności, upewniając się, że ciśnienie śródświetlne (przezścienne) pozostaje stałe po tymczasowym zamknięciu pipety dopływowej. Zwiąż wszystkie gałęzie lub sprawdź, czy w naczyniu nie ma, jeśli ciśnienie spadnie. Przywróć perfuzję po sprawdzeniu, czy ciśnienie przezścienne pozostaje stałe.
    UWAGA: Kanilacja izolowanych tętnic oporowych wymaga zręczności manualnej i praktyki. Główne środki ostrożności, których należy przestrzegać, to unikanie pękania pipet i upewnienie się, że tętnica nie zsuwa się z pipet. Ważne jest, aby podczas całego zabiegu obchodzić się z izolowanymi tętnicami, ponieważ uraz naczynia może uszkodzić śródbłonek i/lub zakłócić normalne funkcjonowanie mięśni gładkich naczyń krwionośnych.
  10. Zmierz wewnętrzną średnicę tętnicy za pomocą zestawu do mikroskopii wideo (Rysunek 1A) składającego się z kamery wideo podłączonej do mikroskopu preparacyjnego i podłączonej do mikrometru wideo i monitora telewizyjnego (Rysunki 1B, 1C). Pozwala to obserwatorowi na ręczny pomiar średnic naczyń poprzez umieszczenie ruchomych linii odniesienia na wewnętrznej ścianie tętnicy oraz, w razie potrzeby, również na zewnętrznej ścianie tętnicy, w celu zmierzenia grubości ścianki naczynia.
    UWAGA: Niektóre mikrometry wideo oferują automatyczne śledzenie wymiarów naczynia.
    UWAGA: Skalibruj mikrometr wideo za pomocą mikroskopu stage mikrometr oraz przetworniki ciśnienia dopływu i odpływu za pomocą manometru rtęciowego (0 mmHg, 50 mmHg, 100 mmHg, 150 mmHg i 200 mmHg) między eksperymentami, aby zapewnić dokładne pomiary średnicy naczynia i ciśnienia śródświetlnego.
    UWAGA: Standardowe kontrolne ciśnienie przezścienne w eksperymentach MCA na szczurach wynosi 80 mmHg. Kalibracja dla wyższych i niższych poziomów ciśnienia zapewnia dokładność badań odpowiedzi miogennych na zmiany ciśnienia przezściennego i pasywnych krzywych ciśnienie-średnica w maksymalnie rozszerzonych tętnicach.
  11. Dostosuj wysokość zbiorników dopływu i odpływu, aby utrzymać żądane ciśnienie transmuralne na stałym poziomie. Podniesienie zbiornika dopływu o niewielką ilość (< 5 mmHg) i obniżenie zbiornika odpływu o tę samą wartość utrzymuje średnie ciśnienie przezścienne i tworzy przepływ perfuzyjny w naczyniu lumen6.
    UWAGA: Podniesienie zbiornika dopływowego i obniżenie zbiornika odpływowego o równe wartości utrzymuje to samo średnie ciśnienie rozdęcia przezściennego w tętnicy, ale generuje gradient ciśnienia hydrostatycznego, który powoduje przepływ i naprężenie ścinające w zbiorniku, umożliwiając badaczowi ocenę zależnych od śródbłonka reakcji na zmiany naprężenia ścinającego w obrębie światła w różnych grupach eksperymentalnych48.
  12. Aby ocenić reakcje miogenne i reakcje naczyń krwionośnych na bodźce rozszerzające naczynia krwionośne, upewnij się, że tętnica wykazuje odpowiedni poziom aktywnego tonu (około 40%) przed eksperymentem. Odrzuć wszystkie tętnice, którym brakuje czynnego tonu w spoczynku, z wyjątkiem naczyń, np. małych tętnic krezkowych, które normalnie nie wykazują aktywnego tonu spoczynkowego.
    UWAGA: W przypadku naczyń, które normalnie nie wykazują spontanicznego tonu, należy wstępnie zwęzić tętnice o równoważną ilość, stosując agonistę zwężającego naczynia krwionośne, takiego jak noradrenalina lub fenylefryna. Dobrym podejściem do wyboru dawki agonisty stosowanej do wstępnego zwężenia tętnicy jest zastosowanie dawki EC50 środka zwężającego naczynia krwionośne, np. noradrenaliny41,42. Jednak farmakologiczne środki zwężające naczynia krwionośne nie powinny być stosowane do tętnic, które wykazują spontaniczny aktywny ton w warunkach spoczynku.
  13. Zbadaj zależną od śródbłonka reaktywność kaniulowanej tętnicy oporowej, mierząc średnice naczyń podczas dodawania rosnących stężeń ACh (10-10 M-10-5 M) do komory naczynia. Zbadaj niezależną od śródbłonka wrażliwość mięśni gładkich naczyń krwionośnych na tlenek azotu, mierząc średnice naczyń podczas dodawania do komory naczynia rosnących stężeń (10-10 M–10-5 M) donora nitroprusydu sodu donora tlenku azotu.
    UWAGA: Wrażliwość na środki zwężające naczynia krwionośne i innych agonistów rozszerzających naczynia krwionośne można testować w podobny sposób, dodając rosnące stężenia agonisty do komory naczynia.
    UWAGA: Oprócz środków wazoaktywnych do kąpieli tkankowej i/lub perfuzatu świetlnego można dodawać różne leki, inhibitory i inne środki farmakologiczne. Zmiany w PO2 (jak również PCO2 i pH) mogą być selektywnie podawane po stronie śródbłonka lub po stronie pozaświetlnej tętnicy poprzez oddzielne zrównoważenie perfuzatu świetlnego kamieniem napowietrzającym połączonym ze skalibrowaną mieszaniną gazów inną niż mieszanina używana do równoważenia PSS w kąpieli tkankowej 33, 34,49. Reakcje miogenne na zmiany ciśnienia przezściennego można badać, zamykając pipetę odpływową i podnosząc (lub obniżając) wysokość zbiornika PSS podłączonego do pipety dopływowej49,50,51 w celu zwiększenia lub zmniejszenia ciśnienia śródświetlnego.
  14. Aby przetestować rolę śródbłonka w pośredniczeniu w reakcjach naczyń na określone bodźce, usuń śródbłonek naczyniowy i porównaj reakcje naczyń na te bodźce w obecności lub bez śródbłonka. Aby usunąć śródbłonek, ostrożnie odwiąż tętnicę od pipety odpływowej i powoli perfunduj światło tętnicy za pomocą bolusa powietrznego (0,5-1,0 ml). Po perfuzji powietrza przywróć perfuzję PSS, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe przed ponownym przywiązaniem naczynia do pipety odpływowej43.
    UWAGA: Po zabiegu denudacji śródbłonka ważne jest, aby sprawdzić, czy śródbłonek został usunięty, testując reakcje naczyniowe na agonistę (zwykle ACh), o którym wiadomo, że powoduje zależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń krwionośnych w tym typie naczynia. Jednak w niektórych stanach patologicznych uwalniane są zależne od śródbłonka środki zwężające naczynia krwionośne, w takim przypadku ważne jest, aby sprawdzić, czy odpowiedź zwężacza jest eliminowana po usunięciu śródbłonka.
  15. Pod koniec eksperymentu określ maksymalną średnicę tętnicy, dodając PSS wolny od Ca2+ do perfuzatu i superfuzatu. Obliczać aktywny ton spoczynkowy (%) jako((Dmax-D spoczynek)/Dmax) x 100, gdzie Dmax to maksymalna średnica w obecności roztworu wolnego od Ca2+, a Dspoczynek to spoczynkowa średnica kontrolna.
    UWAGA: Pomiary średnic maksymalnie rozluźnionych tętnic w różnych grupach eksperymentalnych są cenne w porównaniu aktywnego tonu spoczynkowego, przebudowy strukturalnej (tj. zmian grubości ścianki i średnicy światła) oraz pasywnych właściwości mechanicznych (zależności naprężenie-odkształcenie obliczone na podstawie średnic pasywnych przy różnych poziomach ciśnienia przezściennego).

3. Ocena reakcji przepływu krwi w mózgu za pomocą LDF

  1. Znieczulij zwierzę 5% izofluranem i zabezpiecz szczura w aparacie stereotaktycznym9,10.
  2. Utrzymuj zwierzę w stałym znieczuleniu, monitorując częstotliwość oddychania, końcowy oddech CO2 i głębokość znieczulenia za pomocą szczypania palców u stóp36.
  3. Ostrożnie rozrzedzić czaszkę do przezierności za pomocą wiertła dentystycznego o niskiej prędkości i oleju mineralnego, aby zapewnić sprzężenie optyczne10. Zachowaj ostrożność, aby nie wytwarzać nadmiernego ciepła i nie przeniknąć do kości.
    UWAGA: Ścieńczenie czaszki pozwala światłu laserowemu dotrzeć do leżącej pod spodem tkanki i odbić się z powrotem do sondy w celu zmierzenia przesunięcia dopplerowskiego, którego wielkość zależy od liczby poruszających się cząstek (tj. czerwonych krwinek) i ich prędkości.
  4. Zamocuj sondę LDF w mikromanipulatorze i umieść ją bezpośrednio nad cienkim obszarem czaszki. Podczas eksperymentu bardzo ważne jest, aby zapobiec ruchowi sondy LDF lub samego preparatu, ponieważ LDF jest przeznaczony do pomiaru przepływu w jednym ograniczonym obszarze tkanki i jest niezwykle wrażliwy na artefakty ruchu.
    UWAGA: Każdy ruch sondy w kierunku odchylenia od jej początkowej pozycji zapewni oszacowanie przepływu krwi w innym obszarze tkanki, co wyklucza porównania. Chociaż LDF nie zapewnia bezwzględnych wartości przepływu i nie nadaje się do porównania między osobami, jest to doskonały sposób na nieinwazyjną ocenę zmian w perfuzji tkanek w odpowiedzi na interwencje eksperymentalne u poszczególnych osób; i względne zmiany sygnału LDF z wartości kontrolnych można uśrednić i porównać ze zmianami sygnału LDF z kontroli w innych grupach eksperymentalnych.
    UWAGA: LDF jest wygodnym podejściem do uzyskania wglądu w czynniki regulujące przepływ krwi na poziomie całego łożyska naczyniowego w różnych grupach eksperymentalnych8,9,10. Ocena perfuzji tkanek za pomocą LDF zapewnia praktyczne podejście do asymilacji wiedzy uzyskanej z badań izolowanych naczyń w perspektywie całego złoża. Z wyjątkiem regionalnych różnic w mechanizmach kontroli naczyniowej między tętnicami oporowymi a mikrokrążeniem, pomiary uzyskane za pomocą LDF zapewniają dobre wskazanie kontroli przepływu krwi w tkankach, która jest ogólnie zgodna z wynikami uzyskanymi za pomocą preparatów do tętnic kaniulowanych.

4. Ocena gęstości mikronaczyń mięśni szkieletowych za pomocą lektyny GS1

  1. Usuń mięsień cremaster od samca szczura, rozcinając mosznę standardowymi cienkimi nożyczkami chirurgicznymi, a następnie używając kleszczy Dumont #5, aby chwycić mięsień.
    UWAGA: Cienkie mięśnie (np. mięsień cremaster, a także mięśnie prostownika długiego palca i piszczelowe przednie, które występują zarówno u samców, jak i samic szczurów) idealnie nadają się do stosowania jako całe wierzchowce do badań lektyny, chociaż sekcje histologiczne mogą być używane do grubszych tkanek.
  2. Usuń mięsień cremaster z jądra za pomocą jednego cięcia. Umieść go w lodowatym PSS i przypnij do szalki Petriego z silikonową wyściółką elastomerową na dolnej wewnętrznej powierzchni. Delikatnie zetrzyj tkankę łączną za pomocą kleszczy Dumont #5.
  3. Przepłukać próbki mięśni 2 ml buforowanego PSS, a następnie zanurzyć je w lektynie GS1 znakowanej rodaminą (20 μg/ml PSS) na 50 minut w 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej z 2 ml / basenik, która jest owinięta folią aluminiową w celu wykluczenia światła.
  4. Wyjmij tkanki z roztworu lektyny, przepłucz je trzykrotnie w PSS z 5-minutową inkubacją "mycia" na kołysku i zamontuj je na szkiełkach mikroskopowych. Upewnij się, że inkubujesz tkanki w ciemności i przechowujesz szkiełka w ciemności, aby zapobiec utracie fluorescencji.
    UWAGA: Jeśli szkiełka nie mogą być użyte od razu, można je przechowywać w lodówce bez utraty fluorescencji. W przypadku dłuższego przechowywania szkiełka można przechowywać w zamrażarce, aby zapobiec zniszczeniu11.
  5. Oceń gęstość mikronaczyń, zliczając liczbę przecięć oznaczonych mikronaczyń z wygenerowanymi komputerowo liniami siatki nałożonymi na image52 lub z przezroczystą nakładką siatki nałożoną na monitor używany do oglądania slajdów.
    UWAGA: Podejścia lektynowe GS1 zostały wykorzystane do zademonstrowania: rozrzedzenie mikronaczyniowe wywołane solą53, ochronny efekt zapobiegania indukowanej solą supresji angiotensyny II w przywracaniu gęstości mikronaczyń u zwierząt karmionych solą17,53,54; rola NRF2 pośredniczącego w ochronnym działaniu infuzji angiotensyny II w niskiej dawce w celu zapobiegania rozrzedzeniu mikronaczyń u szczurów karmionych solą17; a także ocena roli angiotensyny II w utrzymaniu odpowiedzi angiogennej na przewlekłą stymulację mięśni u szczurów karmionych solą54,55. Jedną z zalet techniki lektyny GS1 jest to, że można ją wykorzystać do oceny gęstości mikronaczyń u tych samych zwierząt, które są używane do badań kaniulowanych tętnic oporowych lub LDF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia in vitro tętnic oporowych kaniulowanych pozwala na badanie czynników wpływających na aktywny ton w małych tętnicach oporowych (i większych tętniczkach) przy normalnych ciśnieniach transmuralnych in vivo i przy braku wpływów komórek miąższowych. Oprócz oceny reaktywności naczyń na różne bodźce rozszerzające naczynia krwionośne i zwężające naczynia krwionośne oraz reakcje miogenne na przezścienne podwyższenie ciśnienia w normalnym PSS, PSS wolny od Ca2 +

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak zauważono we wstępie, artykuł ten opisuje zastosowanie mikroskopii telewizyjnej i izolowanych podejść do tętnic oporowych do oceny funkcji naczyń krwionośnych nie tylko w standardowych modelach szczurzych (jak zastosowano w filmie), ale także w wysoce wyspecjalizowanych genetycznie modyfikowanych szczepach szczurów, które pokazują nowatorskie i potężne spostrzeżenia, które można uzyskać przy użyciu tych podejść. Zastosowanie tych potężnych technik do oceny czynnego tonu i biernych właściwości mechanicznych małych tęt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy wyrażają szczere podziękowania dla Katie Fink i Lynn Dondlinger za ich nieocenioną pomoc w przygotowaniu tego manuskryptu.

Wsparcie grantowe: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; oraz #R01-HL128242.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Szczep SS RatMedical College of WisconsinSS/JHsd/McwiSkontaktuj się z dr Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic RatMedical College of WisconsinSS-Chr 5BN/McwiSkontaktuj się z Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic RatMedical College of WisconsinSS-Chr 13BNSzczep /McwiSkontaktuj się z dr Aronem Geurtsem (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic RatMedical College of WisconsinSS. Szczep BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/McwiSkontaktuj się z dr Aronem Geurtsem (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic RatMedical College of WisconsinSS. Szczep BN-(D13rat77-D13rat105/McwiSkontaktuj się z dr Aronem Geurtsem (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic RatMedical College of WisconsinSS. Szczep BN-(D13rat124-D13rat101/McwiSkontaktuj się z dr Aronem Geurtsem (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type MiotMedical College of WisconsinSD-NFE212em1McwiSkontaktuj się z Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0,4% NaCl)-AIN-76ADyets, Inc.
Wysoka zawartość soli dla szczurów (4% NaCl)-AIN-76A Barwniki, Inc.
Zacisk wideo KoloradoColorado Video, Inc.Kamera wideo model 308
Mikroskop HitachiKPM1AN
Olympus Life ScienceCKX41
Monitor telewizyjnyPrzetworniki ciśnienia PanasonicWVBM1410
Stoelting56360
Wyświetlacz ciśnienia krwiStoelting50115
Kaniulowana komora tętniczaOprzyrządowanie systemów żywychCH-1Komora jednozbiornikowa do ogólnego użytku
Regulator temperatury do jednokomorowegooprzyrządowania systemów żywychTC-09S Rura
dyspersyjna gazu, miniaturowa, prostaoprzyrządowanie systemów żywychGD-MSZapewnia napowietrzanie w kąpieli naczynia
Natleniacz wymiany gazowej, Oprzyrządowanie miniaturowychsystemów żywychOXUmożliwia wymianę gazową z perfuzatem
przepływomierz laserowo-dopplerowskiPerimedPeriFlux 5000 LDPM
GS1, LectinVector LabsRL-1102
szklane rurki kapilarne do mikropipet,Fredrich Haer Co.27-33-12 mm ODX1 mm ID
Pionowy ściągacz do pipetDavid Kopf InstrumentyModel 700C
Nylonowy materiał szwowy (10/0)-3-PLYAshaway Line i Twine Manufacturing Co.114-ANM-10Pojedyncze pasma 3-warstwowego nylonowego szwu wysuszone do stosowania na naczyniach
Dumont #5 Kleszcze-InoxFine Science Tools11254-20
Vannas NożyczkiNarzędzia do nauki15003-08
ProtandimProtandimNRF2 Inducer: Skontaktuj się z dr Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Bioodczynniki Fisherachlorku soduBP358-212
Wodorowęglan soduFisher ChemicalS233-3
Dekstroza (d-glukoza) bezwodnaFisher ChemicalD16-500
Siarczan magnezu (MgSO4-7H2O)Sigma AldrichM1880-500 g
Chlorek wapnia (CaCl2-2 H2O)SigmaC5080-500G
Fosforan sodu jednozasadowy (NaH2PO4)SigmaS0751-500G
Chlorek potasu (KCl)Fisher ChemicalP217-500G
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna (EDTA)SigmaED255-500G
113755113756, , , , z

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  2. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circ. Res. 41, 19-26 (1977).
  4. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  5. Osol, G., Halpern, W. Myogenic properties of cerebral blood vessels from normotensive and hypertensive rats. Am. J. Physiol. 249, H914-H921 (1985).
  6. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  7. Feihl, F., Liaudet, L., Waeber, B. The macrocirculation and microcirculation of hypertension. Curr Hypertens Rep. 11, 182-189 (2009).
  8. Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. J Appl Physiol. 61, 666-672 (1985).
  9. Hudetz, A. G., Roman, R. J., Harder, D. R. Spontaneous flow oscillations in the cerebral cortex during acute changes in mean arterial pressure. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 491-499 (1992).
  10. Hudetz, A. G., Smith, J. J., Lee, J. G., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Modification of cerebral laser-Doppler flow oscillations by halothane, PCO2, and nitric oxide synthase blockade. Am J Physiol. 269, H114-H120 (1995).
  11. Hansen-Smith, F. M., Watson, L., Lu, D. Y., Goldstein, I. Griffonia simplicifolia I: fluorescent tracer for microcirculatory vessels in nonperfused thin muscles and sectioned muscle. Microvasc Res. 36, 199-215 (1988).
  12. Greene, A. S., Lombard, J. H., Cowley, A. W., Hansen-Smith, F. M. Microvessel changes in hypertension measured by Griffonia simplicifolia I lectin. Hypertension. 15, 779-783 (1990).
  13. Aitman, T., Dhillon, P., Geurts, A. M. A RATional choice for translational research? Dis Model Mech. 9, 1069-1072 (2016).
  14. Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433(2009).
  15. Geurts, A. M., et al. Generation of gene-specific mutated rats using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol. 597, 211-225 (2010).
  16. Geurts, A. M., Moreno, C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat genome. Clin Sci (Lond). 119, 303-311 (2010).
  17. Priestley, J. R., Kautenburg, K. E., Casati, M. C., Endres, B. T., Geurts, A. M., Lombard, J. H. The NRF2 knockout rat: a new animal model to study endothelial dysfunction, oxidant stress, and microvascular rarefaction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310, H478-H487 (2016).
  18. Cowley, A. W., et al. Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat. Hypertension. 37, 456-461 (2001).
  19. Rapp, J. P. Dahl salt-susceptible and salt-resistant rats. A review. Hypertension. 4, 753-763 (1982).
  20. Rapp, J. P., Wang, S. M., Dene, H. A genetic polymorphism in the renin gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243, 542-544 (1989).
  21. Manning, R. D. Jr, Meng, S., Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179, 243-250 (2003).
  22. Moreno, C., et al. Multiple blood pressure loci on rat chromosome 13 attenuate development of hypertension in the Dahl S hypertensive rat. Physiol Genomics. 31, 228-235 (2007).
  23. Tobian, L., Lange, J., Iwai, J., Hiller, K., Johnson, M. A., Goossens, P. Prevention with thiazide of NaCl-induced hypertension in Dahl "S" rats. Evidence for a Na-retaining humoral agent in "S" rats. Hypertension. 1, 316-323 (1979).
  24. Mattson, D. L., et al. Chromosome substitution reveals the genetic basis of Dahl salt-sensitive hypertension and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F837-F842 (2008).
  25. Kunert, M. P., et al. Consomic strategies to localize genomic regions related to vascular reactivity in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 26, 218-225 (2006).
  26. Cowley, A. W., Liang, M., Roman, R. J., Greene, A. S., Jacob, H. J. Consomic rat model systems for physiological genomics. Acta Physiol Scand. 181, 585-592 (2004).
  27. Kunert, M. P., Dwinell, M. R., Lombard, J. H. Vascular responses in aortic rings of a consomic rat panel derived from the Fawn Hooded Hypertensive strain. Physiol Genomics. 42A, 244-258 (2010).
  28. Liang, M., et al. Renal medullary genes in salt-sensitive hypertension: a chromosomal substitution and cDNA microarray study. Physiol Genomics. 8, 139-149 (2002).
  29. Durand, M. J., Moreno, C., Greene, A. S., Lombard, J. H. Impaired relaxation of cerebral arteries in the absence of elevated salt intake in normotensive congenic rats carrying the Dahl salt-sensitive renin gene. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1865-H1874 (2010).
  30. Hybertson, B. M., Gao, B., Bose, S. K., McCord, J. M. Oxidative stress in health and disease: the therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 32, 234-246 (2011).
  31. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236, 313-322 (1997).
  32. Myung, S. K., et al. Efficacy of vitamin and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ. 346, f10(2013).
  33. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduced PO2. Am J Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  34. Fredricks, K. T., Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Role of endothelium and arterial K+ channels in mediating hypoxic dilation of middle cerebral arteries. Am J Physiol. 267, H580-H586 (1994).
  35. Frisbee, J. C., Maier, K. G., Falck, J. R., Roman, R. J., Lombard, J. H. Integration of hypoxic dilation signaling pathways for skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 283, R309-R319 (2002).
  36. Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J Vis Exp. (103), (2015).
  37. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. J Physiol. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  38. Brayden, J. E., Halpern, W., Brann, L. R. Biochemical and mechanical properties of resistance arteries from normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 5, 17-25 (1983).
  39. Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, H500-H506 (2000).
  40. Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, H2196-H2202 (2001).
  41. Wang, J., Roman, R. J., Falck, J. R., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Effects of high-salt diet on CYP450-4A omega-hydroxylase expression and active tone in mesenteric resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, H1557-H1565 (2005).
  42. Raffai, G., et al. Modulation by cytochrome P450-4A omega-hydroxylase enzymes of adrenergic vasoconstriction and response to reduced PO2 in mesenteric resistance arteries of Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 17, 525-535 (2010).
  43. Mishra, R. C., Wulff, H., Hill, M. A., Braun, A. P. Inhibition of Myogenic Tone in Rat Cremaster and Cerebral Arteries by SKA-31, an Activator of Endothelial KCa2.3 and KCa3.1 Channels. J Cardiovasc Pharmacol. 66, 118-127 (2015).
  44. Freed, J. K., Beyer, A. M., LoGiudice, J. A., Hockenberry, J. C., Gutterman, D. D. Ceramide changes the mediator of flow-induced vasodilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in the human microcirculation. Circ Res. 115, 525-532 (2014).
  45. Beyer, A. M., Durand, M. J., Hockenberry, J., Gamblin, T. C., Phillips, S. A., Gutterman, D. D. An acute rise in intraluminal pressure shifts the mediator of flow-mediated dilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in human arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1587-H1593 (2014).
  46. Durand, M. J., et al. Vascular actions of angiotensin 1-7 in the human microcirculation: novel role for telomerase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36, 1254-1262 (2016).
  47. Beyer, A. M., et al. Transition in the mechanism of flow-mediated dilation with aging and development of coronary artery disease. Basic Res Cardiol. 112, 5(2017).
  48. Muller, J. M., Chilian, W. M., Davis, M. J. Integrin signaling transduces shear stress--dependent vasodilation of coronary arterioles. Circ Res. 80, 320-326 (1997).
  49. Liu, Y., Harder, D. R., Lombard, J. H. Interaction of myogenic mechanisms and hypoxic dilation in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2276-H2281 (2002).
  50. Potocnik, S. J., et al. Endothelium-dependent vasodilation in myogenically active mouse skeletal muscle arterioles: role of EDH and K+ channels. Microcirculation. 16, 377-390 (2009).
  51. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circ Res. 55, 197-202 (1984).
  52. Greene, A. S., Rieder, M. J. Measurement of vascular density. Methods Mol. Med. 51, 489-496 (2001).
  53. Hernandez, I., Cowley, A. W., Lombard, J. H., Greene, A. S. Salt intake and angiotensin II alter microvessel density in the cremaster muscle of normal rats. Am J Physiol. 263, H664-H667 (1992).
  54. Resende, M. M., Amaral, S. L., Moreno, C., Greene, A. S. Congenic strains reveal the effect of the renin gene on skeletal muscle angiogenesis induced by electrical stimulation. Physiol Genomics. 33, 33-40 (2008).
  55. Petersen, M. C., Munzenmaier, D. H., Greene, A. S. Angiotensin II infusion restores stimulated angiogenesis in the skeletal muscle of rats on a high-salt diet. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, H114-H120 (2006).
  56. Frisbee, J. C., Weber, D. S., Liu, Y., DeBruin, J. A., Lombard, J. H. Altered structure and mechanics of skeletal muscle arteries with high-salt diet and reduced renal mass hypertension. Microvasc Res. 59, 323-328 (2000).
  57. Drenjancevic-Peric, I., Lombard, J. H. Introgression of chromosome 13 in Dahl salt-sensitive genetic background restores cerebral vascular relaxation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H957-H962 (2004).
  58. Drenjancevic-Peric, I., Phillips, S. A., Falck, J. R., Lombard, J. H. Restoration of normal vascular relaxation mechanisms in cerebral arteries by chromosomal substitution in consomic SS.13BN rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H188-H195 (2005).
  59. Lukaszewicz, K. M., Paudyal, M. P., Falck, J. R., Lombard, J. H. Role of vascular reactive oxygen species in regulating cytochrome P450-4A enzyme expression in Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 23, 540-548 (2016).
  60. Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284, H1124-H1133 (2003).
  61. Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvasc Res. 89, 134-145 (2013).
  62. Velmurugan, K., Alam, J., McCord, J. M., Pugazhenthi, S. Synergistic induction of heme oxygenase-1 by the components of the antioxidant supplement Protandim. Free Radic Biol Med. 46, 430-440 (2009).
  63. Widlansky, M. E., Gokce, N., Keaney, J. F., Vita, J. A. The clinical implications of endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 42, 1149-1160 (2003).
  64. Lukaszewicz, K. M., Falck, J. R., Manthati, V. L., Lombard, J. H. Introgression of Brown Norway CYP4A genes on to the Dahl salt-sensitive background restores vascular function in SS-5BN consomic rats. Clin Sci (Lond). 124, 333-342 (2013).
  65. Lukaszewicz, K. M., Lombard, J. H. Role of the CYP4A/20-HETE pathway in vascular dysfunction of the Dahl salt-sensitive rat. Clin Sci (Lond). 124, 695-700 (2013).
  66. Roman, R. J. P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev. 82, 131-185 (2002).
  67. Roman, R. J., Maier, K. G., Sun, C. W., Harder, D. R., Alonso-Galicia, M. Renal and cardiovascular actions of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid and epoxyeicosatrienoic acids. Clin Exp Pharmacol. 27, 855-865 (2000).
  68. Roman, R. J., Alonso-Galicia, M. P-450 eicosanoids: A novel signaling pathway regulating renal function. News Physiol Sci. 14, 238-242 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Isolated Resistance ArteriesVideo MicroscopyVascular Control MechanismsCerebral Resistance ArteriesLaser Doppler FlowmetryFluorescent Lectin LabelingTissue Perfusion AnalysisMicrovessel Density AssessmentVasoactive Stimuli TestingEndothelial Function Evaluation

Related Articles