Tutaj opisujemy powszechną metodę wywoływania przewlekłego uszkodzenia wątroby u myszy poprzez karmienie dietą ubogą w cholinę i uzupełnioną etyoniną (CDE). Pokazujemy monitorowanie stanu zdrowia, perfuzję wątroby, izolację i konserwację. Sześciotygodniowy przebieg może informować o uszkodzeniu wątroby, patohistologii, zwłóknieniu, zapaleniu i odpowiedziach komórek progenitorowych wątroby.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model przewlekłego uszkodzenia wątroby z niedoborem choliny i etyoniną (CDE)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przewlekłe choroby wątroby, takie jak wirusowe zapalenie wątroby, alkoholowa choroba wątroby lub niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby, charakteryzują się ciągłym stanem zapalnym, postępującym niszczeniem i regeneracją miąższu wątroby, proliferacją komórek progenitorowych wątroby i zwłóknieniem. Końcowym etapem każdej przewlekłej choroby wątroby jest marskość wątroby, główny czynnik ryzyka rozwoju raka wątrobowokomórkowego. Do badania procesów regulujących inicjację, rozwój i postęp choroby w laboratoriach wykorzystuje się kilka modeli zwierzęcych. Tutaj opisujemy sześciotygodniowy przebieg mysiego modelu z niedoborem choliny i uzupełnionym etioniną (CDE), który obejmuje karmienie sześciotygodniowych samców myszy C57BL / 6J karmą z niedoborem choliny i 0,15% wodą pitną uzupełnioną DL-etioniną. Wyjaśniono monitorowanie stanu zdrowia zwierząt i typową krzywą utraty masy ciała. Protokół przedstawia dokładne badanie wątroby i pobrania krwi pod wpływem CDE przez nakłucie serca w celu przeprowadzenia kolejnych analiz surowicy. Następnie przedstawiono technikę perfuzji wątroby i pobieranie różnych płatów wątrobowych do standardowych ocen, w tym oceny histologiczne wątroby za pomocą hematoksyliny i eozyny lub barwienia czerwienią Sirius, immunofluorescencyjne wykrywanie populacji komórek wątroby, a także profilowanie transkryptomu mikrośrodowiska wątroby. Ten mysi model nadaje się do badania dynamiki komórek zapalnych, fibrogennych i progenitorowych wątroby indukowanej przewlekłą chorobą wątroby i może być wykorzystany do testowania potencjalnych środków terapeutycznych, które mogą modulować te procesy.
Wprowadzenie
Wątroba jest największym gruczołowym organem metabolicznym ciała i pełni wiele złożonych funkcji. Kluczowe role w wątrobie obejmują trawienie, metabolizm, detoksykację, magazynowanie niezbędnych składników odżywczych, produkcję składników białkowych osocza krwi i odporność, w której pośredniczą rezydujące makrofagi lub komórki Kupffera. Wątroba ma dużą zdolność do regeneracji nawet w przypadku utraty nawet 70-90% jej całkowitej masy. W przypadku ostrego uszkodzenia wątroby, takiego jak częściowe uszkodzenie hepatektomii lub zatrucie paracetamolem, pozostałe zdrowe hepatocyty namnażają się, aby naprawić uszkodzenia w wysoce skoordynowanym procesie1. Jednakże, gdy hepatocyty są przewlekle uszkodzone z powodu długotrwałej infekcji wirusowej, alkoholowej lub niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby, mikrośrodowisko zapalne wyzwala aktywację komórek gwiaździstych wątroby napędzających zwłóknienie i proliferację komórek progenitorowych wątroby (LPC) z potencjałem różnicowania się w cholangiocyty lub hepatocyty2,3,4,5. Dokładne pochodzenie, losy różnicowania LPC, ich wkład w regenerację wątroby i hepatokarcynogeneza były przedmiotem intensywnej dyskusji i najprawdopodobniej zależą od stopnia urazu i kontekstu2. Kolejność zdarzeń związanych z wczesną regeneracją jest również kontrowersyjnie dyskutowana, przy czym niektórzy badacze twierdzą, że aktywacja komórek gwiaździstych wątroby i przebudowa macierzy są niezbędne do wytworzenia niszy sprzyjającej LPC6, podczas gdy inni twierdzą, że ekspansja LPC i tak zwana reakcja przewodowa są wymagane do wywołania fibrogenezy7. Istnieje wiele modeli zwierzęcych do badania konkretnych aspektów urazów i regeneracji, w celu zrozumienia wszystkich podstawowych czynników regulujących postęp choroby i ostatecznie opracowania nowych strategii leczenia pacjentów8.
Model diety z niedoborem choliny i uzupełnieniem etioniny (CDE) został pierwotnie opracowany do stosowania u szczurów, a później zmodyfikowany do indukcji przewlekłego uszkodzenia wątroby u myszy9,10. Niedobór choliny w diecie powoduje upośledzone składanie i wydzielanie lipoprotein o bardzo niskiej gęstości. W połączeniu z hepatorakotwórczą DL-etioniną, schemat ten prowadzi do nadmiernego obciążenia wątroby tłuszczem, ciągłego stanu zapalnego, zwłóknienia okołowrotnego, odpowiedzi LPC i długotrwałego rozwoju raka wątrobowokomórkowego11,12. Jednak, co ważne, różne szczepy myszy wykazują charakterystyczne wzorce dynamiki odpowiedzi zapalnej, fibrogennej i LPC13. Protokół ten opisuje indukcję przewlekłego uszkodzenia wątroby u myszy C57BL / 6J, najczęściej stosowanego wsobnego szczepu myszy.
W badaniach nad przewlekłymi chorobami wątroby, typowe analizy obejmują oceny histologiczne za pomocą hematoksyliny i eozyny, a także barwienie Sirius Red w celu wizualizacji odkładania kolagenu, immunohistochemicznego lub immunofluorescencyjnego wykrywania populacji komórek wątroby oraz analizy transkryptomiczne mikrośrodowiska wątroby, które zarządza indukowanymi zmianami komórkowymi poprzez złożone sieci czynników wzrostu i cytokin14,15,16,17,18.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Eksperymenty na zwierzętach
Wszystkie badania na zwierzętach opisane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Curtin (numer zatwierdzenia: AEC_2014_28) przed rozpoczęciem eksperymentów i przeprowadzone zgodnie z australijskim kodeksem opieki i użytkowania zwierząt.
- zwierzęta
- Do eksperymentów użyj sześciotygodniowych samców myszy C57BL/6J.
- Projekt eksperymentalny
- Po przybyciu do obiektu dla zwierząt pozwól myszom zaaklimatyzować się przez cztery dni przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów.
- Myszy domowe na ściółce z plew pszennych, która została pozbawiona widocznych ziaren i łodyg, i trzymają myszy w 12-godzinnych cyklach dnia i nocy w indywidualnie wentylowanych klatkach. Zmieniaj pościel w trzecim i siódmym dniu, a następnie co tydzień.
- Zapewnij myszom ad libitum dostęp do diety ubogiej w cholinę i wody pitnej uzupełnionej o 0,15% DL-etioniny. Wodę uzupełnioną DL-etioniną należy przechowywać w temperaturze 4°C i wymieniać wodę pitną co drugi dzień, aby zapewnić świeżość i zachęcić do picia. Uzupełniaj karmę z niedoborem choliny co drugi dzień, całkowicie zmieniając karmę raz w tygodniu.
- Obserwuj myszy w spoczynku i podczas obsługi. Monitoruj standardowe oznaki zdrowia zwierząt, w tym ogólny wygląd, postawę, interakcje społeczne, pielęgnację, stan sierści i masę ciała.
- Waż myszy codziennie przez pierwsze dwa tygodnie eksperymentu, aby upewnić się, że wszystkie zwierzęta wykazujące więcej niż 20% utratę masy ciała zostaną poddane eutanazji, aby ograniczyć niepotrzebne cierpienie. Dzieje się tak zazwyczaj u mniej niż 5% zwierząt. Po dwóch tygodniach częstotliwość ważenia można zmniejszyć do trzech razy w tygodniu (np. poniedziałek, środa, piątek).
- Perfuzja i izolacja wątroby
- Znieczulenie myszy we wskazanych punktach czasowych (w tym badaniu jeden, dwa i sześć tygodni na diecie CDE) za pomocą ketaminy (100 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Przetestuj odruch wycofania pedału, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie.
- Zwilż futro 70% etanolem i wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej w ścianie brzucha aż do przepony za pomocą nożyczek Mayo. Klatkę piersiową można zdjąć, aby uzyskać łatwiejszy dostęp do serca.
- Zbierz krew przez powolne nakłucie serca za pomocą zwykłej igły ściennej o wymiarach 25 G x 1/2", aby uniknąć zapadnięcia się serca. Pozostawić krew do skrzepnięcia w probówce mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej, aby uzyskać próbki surowicy po odwirowaniu w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut. Później zmierz poziom aminotransferaz alaninowych w surowicy za pomocą standardowych procedur12.
- Przesuń żołądek i jelito cienkie na bok i odsłoń żyłę wrotną. Przeciąć serce za pomocą nożyczek Mayo, aby umożliwić wydostanie się płynów i perfuzję wątroby sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (pH = 7,4) poprzez kaniulowanie żyły wrotnej za pomocą zwykłej igły ściennej 27 G x 1/2 ". Równomiernie zblanszowana wątroba wskazuje na udaną perfuzję wszystkich płatów wątrobowych.
- Ostrożnie odłącz wątrobę i umieść ją na szalce Petriego za pomocą kleszczy i nożyczek Mayo. Usuń nadmiar, tkankę inną niż wątroba i woreczek żółciowy.
- Konserwacja wątroby
- Po zarejestrowaniu całkowitej masy wątroby pokrój jeden mały płat na kilka małych kawałków o powierzchni kilku milimetrów kwadratowych, przenieś je do sterylnych probówek i zamroź w ciekłym azocie w celu późniejszej ekstrakcji RNA i białka, zgodnie ze standardowymi protokołami. Zamroź te fragmenty tkanek tak szybko, jak to możliwe po pobraniu narządu, aby uniknąć degradacji tkanek.
- Zbierz jeden płat w 10% neutralnej buforowanej formalinie do późniejszego przetworzenia i zatopienia parafiny, zgodnie ze standardowymi protokołami.
- Umieść jeden płat w formie wypełnionej żywicą zatapiającą Cryomatrix o optymalnej temperaturze cięcia i zamroź ją w ciekłym azocie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W ciągu sześciotygodniowego okresu przewlekłego uszkodzenia wątroby indukowanego CDE, parametry oceniano w dniach 7. (faza indukcji), 14. i 21. (faza ustalania) oraz 42. (faza utrzymywania). W porównaniu z myszami kontrolnymi, myszy traktowane CDE utraciły do 20% początkowej masy ciała w początkowej fazie adaptacji, a następnie wykazywały tendencję do odzyskiwania masy ciała w fazach ustalania i utrzymywania. (Rysunek 1)Masa ciała była odwrot...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przewlekła choroba wątroby jest często cichą chorobą, w której większość pacjentów przebiega bezobjawowo i jest jednym z głównych czynników przyczyniających się do zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Przewlekły alkoholizm i zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C są głównymi przyczynami. Przewlekłe uszkodzenie wątroby charakteryzuje się zapaleniem wątroby, zwłóknieniem, a w ciężkich przypadkach marskością wątroby, rakiem i ostatecznie niewydolnością wątroby. Obecnie nie ma dostępnego lekarstwa i chociaż ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) Australii (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Autorzy pragną podziękować pracownikom Curtin Health Innovation Research Institute za pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sześciotygodniowy samiec myszy C57BL/6J | Centrum Zasobów Zwierzęcych Australii Zachodniej, Murdoch, WA, Australia | Nie dotyczy | |
| 10 kg plew pszennych krojonych na parze | Pasze specjalistyczne, Glen Forrest, WA, Australia | Nie dotyczy | |
| Woda do nawadniania Butelka 1000ml (Baxter) | Dom Chirurgiczny, Perth, WA, Australia | ||
| Dieta uboga w cholinę, modyfikowana (granulki) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Wzgórze Zamkowe, Nowa Południowa Walia, Australia | E5139-25G | |
| Wtrysk ketamilu | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, Nowa Południowa Walia, Australia | Nie dotyczy | |
| Ilum, Xylazil-20 do wstrzykiwań | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, Nowa Południowa Walia, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Zwykła igła ścienna | Terumo Australia Pty Limited, Nowa Południowa Walia, Australia | NN-2713R | |
| Strzykawki Terumo 1ml i 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, Nowa Południowa Walia, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Związek Tissue-Tek OCT | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutralna buforowana formalina | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Etanol absolutny anaLaR normalnypur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | Prowadnice Superfrost Plus 20821.33 | |
| Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | |||
| Dako Protein Block, bez surowicy | Dako Australia Pty Limited, Północne Sydney, Nowa Południowa Walia, Australia | X090930-2 | |
| Rozcieńczalnik przeciwciał Dako | Dako Australia Pty Limited, Północne Sydney, Nowa Południowa Walia, Australia | s0809 | |
| szczur anty-CD45 | eBioscience, San Diego, Kalifornia, Stany Zjednoczone | M0701 | Rozcieńczenie 1:200 |
| królik anty-panCK | Dako Australia Pty Limited, Północne Sydney, Nowa Południowa Walia, Australia | Z0622 | Rozcieńczenie 1/300 |
| Kozia anty-królik (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 rozcieńczenie |
| Kozia anty-szczurza IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | Rozcieńczenie 1/500 |
| Odczynnik przeciwblakowy ProLong Gold z DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, Stany Zjednoczone | AB150681  |
Bibliografia
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration - mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39(2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
