Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem

Chemioterapia jest podstawową metodą leczenia wielu nowotworów, jednak często wiąże się z poważnymi działaniami niepożądanymi i ograniczoną skutecznością z powodu oporności na leki i innych czynników1^,2,3. Aby poprawić wyniki chemioterapii, w klinice zastosowano schematy kombinacji leków w oparciu o takie czynniki, jak nienakładające się na siebie toksyczności, różne mechanizmy działania leków i niekrzyżowa oporność na leki^4,5,6. W badaniach klinicznych często obserwowano lepszy wskaźnik odpowiedzi guza przy jednoczesnym podawaniu kombinacji leków w porównaniu ze schematem sekwencyjnego dostarczania leków^7,8. Jednak ze względu na nieoptymalną biodystrybucję wolnych form leków, jednoczesne wstrzykiwanie wielu leków może powodować wyraźną normalną toksyczność tkankową, która przeważa nad efektem terapeutycznym^9,10,11. Wykazano, że dostarczanie leków oparte na nanonośnikach zmienia farmakokinetykę i biodystrybucję leków w kapsułkach, zwiększając akumulację ukierunkowaną na nowotwór^12,13,14. Jak omówiliśmy w naszych ostatnich artykułach, nanocząstki współładowane synergistycznymi kombinacjami leków wykazały zdolność do łagodzenia problemów napotykanych przez wolne kombinacje leków, ze względu na kontrolowane czasowe i przestrzenne jednoczesne dostarczanie wielu leków do tkanki nowotworowej, umożliwiając synergiczne działanie leków przeciwko komórkom nowotworowym^4,15,16. W rezultacie, zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych, wykazano wyższą skuteczność terapeutyczną i niską toksyczność^4,17,18.

Nasze poprzednie badania in vitro wykazały, że połączenie dwóch leków przeciwnowotworowych, doksorubicyny (DOX) i mitomycyny C (MMC), wywołało efekt synergiczny przeciwko kilku liniom komórek raka piersi, a ponadto, współładowanie DOX i MMC w hybrydowych nanocząstkach polimerowo-lipidowych (DMPLN) pokonało różne wielolekooporne pompy wypływu (np. glikoproteina P i białko odporne na raka piersi)^19,20,21. In vivo DMPLN umożliwił przestrzenno-czasowe jednoczesne dostarczanie DOX i MMC do miejsc nowotworowych oraz zwiększył biodostępność leków w komórkach nowotworowych, na co wskazuje moderacja powstawania metabolitu DOX doksorubicynolu (DOXol)²². W rezultacie, DMPLN zwiększył apoptozę komórek nowotworowych, zahamowanie wzrostu guza i wydłużenie przeżycia gospodarza w porównaniu z kombinacją wolnych DOX i MMC lub liposomalnym preparatem DOX^22,23,24,25.

Analiza rzeczywistej ilości leków dostarczanych jednocześnie przez nanonośnik jest kluczowa dla projektowania skutecznych preparatów nanocząstek. Opracowano wiele metod analizy poziomu w osoczu pojedynczych dawek DOX lub MMC przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) samodzielnie lub w połączeniu ze spektrometrią mas (MS)^{26,27,28,29,30,31,32,33,34}. Metody te są jednak często czasochłonne i niepraktyczne w przypadku terapii skojarzonej, ponieważ duża liczba próbek biologicznych musi być przygotowywana oddzielnie do analizy wielu leków (czasami zawierających metabolity leków). Oprócz silnego wiązania DOX i MMC z białkami osocza, czerwone krwinki mają również dużą zdolność do wiązania i koncentracji wielu leków przeciwnowotworowych^35,36. W związku z tym analiza osocza pod kątem DOX lub MMC może zaciemnić rzeczywiste stężenia leków we krwi. Niniejsza praca (Rysunek 1) opisuje prostą i solidną metodę analizy wielu leków przy użyciu HPLC z odwróconą fazą do jednoczesnej ekstrakcji i ilościowego oznaczania DOX, MMC i metabolitu DOX doksorubicyny (DOXol) z pełnej krwi i różnych tkanek (np. nowotworów). Został on z powodzeniem zastosowany do określenia farmakokinetyki i biodystrybucji DOX i MMC, a także tworzenia DOXolu po podaniu leku za pośrednictwem wolnych roztworów lub form nanocząstek (tj. DMPLN i liposomalnego DOX) w ortotopowo wszczepionym mysim modelu guza piersi po wstrzyknięciu dożylnym (IV)²².

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia w Ontario Cancer Institute i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Przygotowanie próbki biologicznej

1. Pobrać krew pełną, główne narządy i guz piersi w określonych punktach czasowych po dożylnym (iv) podaniu preparatów zawierających leki (np. DMPLN, liposomalny DOX)
   1. Wstrzyknąć dożylnie myszy z guzem piersi przygotowany preparat zawierający lek.
   2. Znieczulić mysz w wyznaczonych punktach czasowych (np. 15 minut), podając wdychalny 2% izofluran w szczelnie zamkniętej komorze.
   3. Połóż znieczuloną mysz na grzbiecie i włóż jej nos przez końcówkę, która stale dostarcza 2% izofluranu.
      UWAGA: Aby upewnić się, że mysz zostanie poddana głębokiemu znieczuleniu, delikatnie ściśnij przednie kończyny myszy i poszukaj drgawek.
   4. Dokładnie oczyść okolice klatki piersiowej i brzucha za pomocą 70% etanolu, a następnie wykonaj końcową procedurę nakłucia serca na głęboko znieczulonych myszach za pomocą heparynizowanej strzykawki o pojemności 1 ml i igły 23 G.
   5. Zbierz pełną krew do znakowanej plastikowej probówki spryskanej heparyną sodową i delikatnie zakręć probówką, aby upewnić się, że zebrana krew pełna styka się z heparyną powlekaną ścianką probówki. Zbierz minimum 50 μl krwi pełnej. Próbki należy zawsze przechowywać na lodzie.
   6. Przyklej taśmą wszystkie cztery kończyny myszy, aby ją zabezpieczyć i otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową myszy za pomocą nożyczek i kleszczy. Przesuń jelita na bok i popchnij wątrobę do góry, aby wystarczająco odsłonić żyłę wrotną. Przeciąć żyłę wrotną w celu drenażu krwi.
   7. Przeprowadź perfuzję całego ciała myszy z 50 ml lodowatej soli fizjologicznej 0,9% przez serce za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 25 G.
      UWAGA: Zgiąć igłę pod kątem 90°, aby wprowadzić strzykawkę do żyły wrotnej.
   8. Wyciąć narządy w następującej kolejności: serce, płuca, wątroba, śledziona, nerki. Następnie oddziel guz piersi od otaczających go tkanek łącznych za pomocą nożyczek do nacinania prawej poduszeczki tłuszczowej sutka myszy. Zbierz wszystkie narządy pojedynczo do probówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml i szybko zamroź je w ciekłym azocie.
      UWAGA: Oddziel woreczek żółciowy od wątroby.
   9. Krew pełną należy przechowywać w temperaturze 4 °C, a wycięte tkanki w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu późniejszej analizy HPLC.
2. Ekstrakcja DOX, MMC i DOXol z matryc biologicznych.
   1. Szybko zważ wszystkie zamrożone wypreparowane tkanki i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 13 ml z zaokrąglonym dnem. Aby uniknąć możliwego metabolizmu lub degradacji leku, próbki należy przechowywać na lodzie.
   2. Dodaj 1-5 ml lodowatego buforu do lizy komórek do probówki.
      UWAGA: Objętość buforu do użycia zależy od masy tkanki w oparciu o stosunek tkanki do bufora wynoszący 1 g: 5 ml (w/v); w przypadku małych narządów, takich jak serce i śledziona, stosunek wynosi 1 g: 2 ml.
   3. Użyj ruchu góra-dół, aby homogenizować próbki tkanek na lodzie z prędkością 18 000 obr./min za pomocą elektrycznego homogenizatora ręcznego.
      UWAGA: Zakończona homogenizacja wymaga około 3 do 5 iteracji krótkiego procesu homogenizacji trwającego mniej niż 15 s, a następnie chłodzenia tkanek nad lodem między każdą krótką homogenizacją.
   4. Umyć sondę generatora piłokształtnego o średnicy 10 mm homogenizatora destylowanym dejonizowanym (DDI)_H2O, 70% etanolem, a następnie DDI_H2Omiędzy każdą próbką tkanki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
   5. Przenieść 50 μl homogenatu tkankowego lub krwi pełnej do probówki z mikrowirówką z polipropylenu o pojemności 1,5 ml i dodać 5 μl wzorca wewnętrznego (I.S.) 4-metyloubulliferonu (4-MU) (2000 ng/ml) do probówki.
      UWAGA: Roztwór 4-MU został przygotowany w metanolu tutaj.
   6. Dodać 250 μl lodowatego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do probówki zawierającej homogenat krwi pełnej lub tkanki.
      UWAGA: Rozpuszczalnik ekstrakcyjny składa się z 60% acetonitrylu (ACN) i 40% octanu amonu (5 mM) o pH dostosowanym do pH = 3,5 przy użyciu 0,05% kwasu mrówkowego. Użyć próbki w proporcji 1:5 (v/v): stosunek rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do objętości.
   7. Mieszaninę energicznie wirować przez 2 minuty, odwirować przy sile 3 000 x g w temperaturze 4 ^oC przez 10 minut i odpipetować 200 μl supernatantu do innej, wstępnie schłodzonej, świeżej probówki do mikrowirówki.
   8. Odparować supernatant w temperaturze 60 °C pod powolnym strumieniem azotu gazowego, z zachowaniem ochrony przed światłem.
   9. Rozpuścić wysuszoną pozostałość w 100 μl lodowatego metanolu, energicznie wirować przez 30 s i odwirować przy 3000 x g w temperaturze 4 °C przez kolejne 5 minut.
   10. Przenieść supernatant do wkładki do fiolki HPLC i umieścić fiolki z próbkami w tacce automatycznego podajnika próbek w celu wstrzyknięcia.

2. Oprzyrządowanie HPLC i parametry operacyjne

1. Przygotowanie fazy mobilnej HPLC ze stałą odtwarzalnością
   1. Odmierzyć 500 ml_H2Oklasy HPLC za pomocą cylindra miarowego.
   2. Odmierzyć 500 ml acetonitrylu klasy HPLC (ACN) za pomocą oddzielnego cylindra z podziałką.
   3. Ostrożnie dodać 0,5 ml kwasu trifluorooctowego (TFA) (UWAGA) do każdego z 500 ml_H2Oi ACN, aby uzyskać fazę ruchomą_H2Oi ACN zawierającą odpowiednio 0,1% TFA.
      UWAGA: TFA jest i toksyczny i powinien być obsługiwany pod laboratoryjnym wyciągiem. Wszystkie mieszaniny rozpuszczalników przygotowuje się w temperaturze pokojowej.
   4. Przefiltruj fazy ruchome przez nylonowy filtr membranowy o wielkości porów 0,45 μm i przenieś go do czystych butelek zbiornikowych HPLC.
2. Konfiguracja oprzyrządowania HPLC do jednoczesnego wykrywania DOX, MMC i DOXol oraz I.S. 4-MU.
   1. Włącz pompę gradientową, odgazowywacz, automatyczny sampler, detektor fotodiodowy i detektor fluorescencji multi λ.
   2. Wprowadź warunki początkowe składu fazy ruchomej do 16,5% H₂O (0,1% TFA) i 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).
   3. Ustaw detektor UV na dwa kanały, jeden na 310 nm dla 4-MU (I.S.), a drugi na 360 nm dla MMC.
   4. Ustaw detektor fluorescencji na dwa kanały, jeden na λ_ex/λ_em =365/445 nm dla 4-MU, a drugi na λ_ex/ λ_em=480 nm/560 nm odpowiednio dla DOX i DOXol.
   5. Ustawić izokratyczne natężenie przepływu na 1,0 ml/min.
   6. Zrównoważyć wstępnie zainstalowaną kolumnę C 18 z odwróconą fazą C₁₈ (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu ustalenia linii podstawowej.
3. Oddzielne leki (DOX, MMC, DOXol i 4-MU) za pomocą gradientu fazy ruchomej.
   1. Wstrzyknąć 15 μl wyekstrahowanych i ponownie zagęszczonych próbek za pomocą automatycznego próbnika.
   2. Stopniowo zmieniaj początkowy stan fazy ruchomej (patrz krok protokołu 2.2.2) na 100% ACN (0,1% TFA) przez 18 minut za pomocą automatycznej pompy gradientowej.
      UWAGA: Podczas procesu separacji cztery kanały (dwa absorbujące promieniowanie UV i dwa fluorescencyjne) pojawiają się jednocześnie, z których każdy wyświetla jeden związek leczniczy (patrz krok protokołu 2.2.3 i 2.2.4).
   3. Utrzymuj 100% ACN (0,1% TFA) przez 1 minutę, a następnie powróć do początkowego stanu fazy ruchomej w ciągu 1 minuty.
   4. Ponownie kondycjonować kolumnę początkową fazą ruchomą przy natężeniu przepływu 1,5 ml/min przez 4 minuty do następnego wstrzyknięcia próbki.

3. Walidacja HPLC

1. Przygotowanie standardów pracy DOX, MMC i DOXol oraz 4-MU (I.S.).
   1. Zważyć oddzielnie 1 mg proszku leku DOX i MMC (UWAGA) i 4-MU na świeżym, małym papierze wagowym (3 x 3 cale²).
      Uwaga: Wszystkie leki przeciwnowotworowe są uważane za zagrożenie dla zdrowia, które może powodować ostrą toksyczność i mutagenność komórek rozrodczych przy inhalacji lub spożyciu. Należy obchodzić się z nimi ostrożnie, w rękawiczkach i maskach.
   2. Przenieś zważone DOX, MMC i 4-MU do nowej, pojedynczej probówki do mikrowirówek z polipropylenu o pojemności 1,5 ml.
   3. Dodać 1 ml metanolu i krótko odwirować, aby uzyskać stężenie 1 mg/ml DOX i MMC.
   4. Dodać 1 ml metanolu do fiolki zawierającej wstępnie zważone 1 mg DOXolu (UWAGA) i krótko przetrząsnąć, aby uzyskać stężenie 1 mg/ml DOXol.
      UWAGA: DOXol jest metabolitem kardiotoksycznym i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
   5. Odpipetować 20 μl przygotowanych roztworów podstawowych DOX, MMC, DOXol i 4-MU do nowej, oddzielnej probówki mikrowirówkowej z polipropylenu o pojemności 1,5 ml i dodać 980 μl metanolu, aby uzyskać wzorc roboczy 20 μg/ml każdego leku.
   6. Rozcieńczyć 20 μg/ml DOX, MMC i DOXol za pomocą metanolu, aby uzyskać wzorce robocze 50 ng - 20 μg / ml dla DOX, MMC i DOXol oraz 2000 ng/ml dla I.S. 4-MU.
   7. Uszczelnij nakrętkę probówki z roztworami roboczymi wąskim kawałkiem folii parafinowej, aby zapobiec parowaniu metanolu, owiń całą probówkę folią aluminiową, aby uniknąć wystawienia na bezpośrednie działanie światła i przechowuj w temperaturze -20 °C.
2. Określ liniowość, precyzję i dokładność DOX, MMC i DOXol w matrycach biologicznych (tj. homogenacie krwi pełnej i guza).
   1. Jednocześnie należy dodać 5 μl roboczych wzorców DOX i DOXol (50 ng/ml - 20 μg/mL), MMC (1,000 ng/ml - 16 μg/mL) i 4-MU (2 μg/mL) do 50 μl ślepej krwi pełnej lub homogenatu tkankowego w mikroprobówkach wirówkowych z polipropylenu, aby uzyskać standardową krzywą stężenia w zakresie od 5 - 2000 ng/ml dla związków leków i 200 ng/ml dla 4-MU (I.S.).
   2. Wykonać test ekstrakcji narkotyku opisany w Protokole 1.2.
   3. Używaj niskich, średnich i wysokich stężeń DOX i DOXol (50, 500 i 2 000 ng/ml) oraz MMC (100, 1000, 2 000 ng/ml), aby uzyskać precyzję i dokładność w ciągu dnia i między nimi.
      UWAGA: Przygotować świeże stężenia wzorcowe w dniu analizy.
3. Analiza próbek
   1. Wstrzyknąć 15 μl próbki za pomocą automatycznego próbnika.
   2. Stopniowo zmieniaj fazę ruchomą w ciągu 0 do 18 minut, zwiększając skład ACN w tym czasie.
   3. Po 18 minutach utrzymaj stan fazy ruchomej przez 1 minutę.
   4. Powrócić do stanu początkowego w ciągu następnych 2 minut, a następnie ponownie wyrównać stan równowagi przez 4 minuty przed następnym wstrzyknięciem.
   5. Po każdej próbce należy zauważyć, że piki związków leczniczych wraz z ich czasem retencji są pokazane w następujący sposób: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) i DOX.
   6. Zintegrować powierzchnię piku pod krzywą (AUC) związków leków za pomocą oprogramowania HPLC.
   7. Obliczyć stosunek AUC między pojedynczym związkiem leku a I.S. (równanie 1) i użyć krzywych wzorcowych przygotowanych w ramach tych samych procedur ekstrakcji do określenia stężeń DOX, MMC i DOXol w postaci DMPLN.
      
   8. Obliczyć procent odzysku leku (równanie 2), porównując stężenia leku odtworzonego przy użyciu metanolu z ekstraktów wzbogaconych próbek biologicznych z stężeniami wzorcowego ("czystego") roztworu leku w metanolu.
      

Dwa leki przeciwnowotworowe, DOX i MMC, a także metabolit DOX, DOXol, zostały wykryte jednocześnie bez żadnej ingerencji biologicznej w tych samych warunkach gradientowych HPLC przy użyciu 4-MU jako I.S. zarówno dla detektorów fluorescencji, jak i UV. DOX, MMC, DOXol i 4-MU były od siebie dobrze oddzielone, a czasy retencji wynosiły 5,7 minuty dla MMC, 10,4 minuty dla DOXol, 10,9 minuty dla 4-MU i 11,1 minuty dla DOX (Rysunek 2). Każdy lek w pełnej krwi i różnych tkankach wykazywał liniowość stężeń ze współczynnikami korelacji (R2) w zakresie od 0,98 do 1,00 (Rysunek 3 i Tabela 1). Dolna granica oznaczalności (LLOQ) DOX, DOXol i MMC wynosiła odpowiednio 10 ng/ml, 10 ng/ml i 100 ng/ml we krwi pełnej oraz 25 ng/mL, 25 ng/ml i 200 ng/ml w różnych tkankach (tabela 1). Opracowana metoda HPLC wykazała mniej niż 15% różnicę pod względem precyzji i dokładności w ciągu dnia i między dobami dla DOX, MMC i DOXol w pełnej krwi i różnych matrycach biologicznych (np. sercu, płucach, wątrobie, śledzionie i nerkach), co wskazuje na doskonałą odtwarzalność (tabele 2 i 3). Ponad 85% DOX i MMC zostało odzyskanych z krwi pełnej po ekstrakcji (Tabela 4).

Procedury analizy wielolekowej wykorzystujące jednoetapową deproteinizację za pomocą zakwaszonego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego, a następnie zastosowanie wielokanałowej metody HPLC, zostały pomyślnie zastosowane do określenia farmakokinetyki i biodystrybucji długo krążących lub opartych na pegylowanych nanocząsteczkach dostarczania leków zarówno DOX samodzielnie, jak i w połączeniu z MMC w ortotopowym mysim modelu guza piersi (Rysunki 4 i 5). Rysunek 4 pokazuje co najmniej 6-krotnie wyższe stężenia leków we krwi dostarczanych przez nanocząsteczki (tj. liposomalne DOX i DMPLN) niż równoważne wolne roztwory leków (tj. wolne DOX lub wolne DOX-MMC) (Rysunek 4). Ze względu na przedłużone krążenie ogólnoustrojowe, nanocząstki były w stanie wykorzystać zwiększoną przepuszczalność i retencję guza, co spowodowało zwiększoną akumulację DOX i MMC w guzie piersi (Ryc. 5A)37. Tymczasem ilościowo określone tworzenie metabolitu DOX DOXol w guzach piersi w ciągu 24 godzin wskazuje na różnicę w biodostępności leków dla różnych preparatów leków (Ryc. 5B).

Rysunek 1: Ilustracja procesów analizy do jednoczesnego oznaczania DOX i MMC dostarczanych przez nanocząstki in vivo. (A) Przygotowanie DMPLN przy użyciu jednoetapowej metody ultrasonizacji, po której następuje proces samoorganizacji; (B) Pobieranie próbek biologicznych z ortotopowego mysiego modelu guza piersi; (C) Ekstrakcja narkotyków z matryc biologicznych i rekonstytucja leków; (D) Gradientowa HPLC do rozdzielania DOX, MMC i DOXol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Porównanie chromatogramów czystej krwi pełnej i mieszanin leków we krwi. Porównanie chromatogramów ślepej próby pełnej i mieszanin leków we krwi przy użyciu HPLC sprzężonego z detektorami UV i fluorescencji przy (A) UV 360 nm dla MMC; b) UV 310 nm dla I.S. 4-MU; C) fluorescencja przy λex/em = 480/560 nm dla DOX i DOXol; (D) Fluorescencja przy λex/em = 365/445 nm dla I.S. 4-MU. AU to jednostka absorbancji, a EU to jednostka fluorescencji. Stężenia wstrzykiwanych MMC, DOX i DOXol oraz ich I.S. 4-MU wynosiły odpowiednio 100 ng/mL, 50 ng/mL, 50 ng/ml i 200 ng/ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentacja standardowych krzywych dla MMC, DOX i DOXol w krwi pełnej. Zakresy stężeń wynosiły od 100 ng/ml do 2000 ng/ml dla MMC (A), od 5 ng/ml do 2000 ng/ml dla niskiego stężenia DOX (B) i od 5 ng/ml do 50 ng/ml dla DOXolu (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zastosowanie systemu analizy wielu leków, wykorzystującego metodę wielokanałowej i gradientowej HPLC, do badania farmakokinetyki długo krążących leków opartych na nanocząsteczkach. (A) Profile stężenia DOX w czasie i krwi w monoterapii z zastosowaniem wolnych roztworów leków (free DOX) lub preparatu liposomalnego (patrz tabela materiałów); (B) Profile czasowo-krwionośne DOX i MMC jako wolnej kombinacji leków (free DOX-MMC) lub DMPLN. Krew pełną pobierano w różnych punktach czasowych do 24 godzin po pojedynczym wstrzyknięciu dożylnym myszom z ortotopowym mysim guzem piersi. Wszystkie myszy leczono DOX w dawce 9,2 mg/kg samodzielnie lub w skojarzeniu z 2,9 mg/kg MMC. Ponieważ LLOD MMC wynosił 100 ng / ml przy użyciu detektora UV sprzężonego z HPLC, stężenie MMC po 6 godzinach po wstrzyknięciu określono za pomocą spektrometrii mas. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie Zhang et al. Nanomedycyna za zgodą22. Wszystkie punkty danych są przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe (SD) przy n = 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Zastosowanie analizy wielu leków przy użyciu metody gradientowej HPLC do badania biodystrybucji guza w systemie dostarczania leków opartym na nanocząsteczkach. (A) Całkowite stężenia DOX i MMC wolnego DOX-MMC lub DMPLN w nowotworach piersi; (B) Całkowite tworzenie metabolitu DOXol w guzach piersi leczonych mono- lub skojarzoną chemioterapią DEX. Wszystkie myszy leczono DOX w dawce 9,2 mg/kg samodzielnie lub w skojarzeniu z 2,9 mg/kg MMC. Ponieważ wolny DOX-MMC miał niską akumulację guza, która była poza LLOD MMC przy użyciu detektora UV sprzężonego z HPLC, stężenie MMC w wolnym DOX-MMC określono za pomocą spektrometrii mas. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie Zhang et al. Nanomedycyna za zgodą22. Wszystkie punkty danych są przedstawione jako średnia ± SD przy n = 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Liniowość i LLOQ DOX, MMC i DOXol w różnych matrycach biologicznych. Dane reprezentują średnią ± SD dla n = 3.

Tabela 2: Precyzja i dokładność w ciągu i między dniami DOX, MMC i DOXol w pełnej krwi myszy (n = 3).

Tabela 3: Precyzja i dokładność w ciągu doby i między dobami DOX, MMC i DOXol w nowotworach piersi (n = 3).

Tabela 4: Procent odzysku DOX i MMC w próbkach krwi pełnej po ekstrakcji (n = 3). Dane reprezentują średnią ± SD dla n = 3.

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych i konfliktów interesów.