Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56159

⸱

5 października 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje efektywny i wygodny proces analityczny pobierania próbek i jednoczesnego oznaczania wielu leków, doksorubicyny (DOX), mitomycyny C (MMC) i kardiotoksycznego metabolitu DOX, doksorubicyny (DOXol), w próbkach biologicznych z przedklinicznego modelu guza piersi traktowanego preparatami nanocząsteczkowymi synergicznego połączenia leków.

Streszczenie

Chemioterapia skojarzona jest często stosowana w klinice w leczeniu raka; jednak związane z nią działania niepożądane na normalną tkankę mogą ograniczyć jej korzyści terapeutyczne. Wykazano, że kombinacja leków oparta na nanocząsteczkach łagodzi problemy napotykane podczas terapii skojarzonej z bezpłatnymi lekami. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że połączenie dwóch leków przeciwnowotworowych, doksorubicyny (DOX) i mitomycyny C (MMC), wywołało efekt synergiczny zarówno przeciwko mysim, jak i ludzkim komórkom raka piersi in vitro. Hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe (DMPLN) z jednoczesnym obciążeniem DOX i MMC ominęły różne pompy transportera wypływu, które nadają oporność wielolekową, i wykazały zwiększoną skuteczność w modelach guzów piersi. W porównaniu z konwencjonalnymi formami roztworów, tak wyższą skuteczność DMPLN przypisano zsynchronizowanej farmakokinetyce DOX i MMC oraz zwiększonej wewnątrzkomórkowej biodostępności leku w komórkach nowotworowych, co umożliwił nanonośnik PLN.

Aby ocenić farmakokinetykę i biodystrybucję jednocześnie podawanych DOX i MMC zarówno w postaci wolnego roztworu, jak i nanocząstek, opracowano prostą i efektywną metodę analizy wielolekowej wykorzystującą wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) z odwróconymi fazami. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, które analizowały DOX lub MMC indywidualnie w osoczu, ta nowa metoda HPLC jest w stanie jednocześnie określić ilościowo DOX, MMC i główny kardiotoksyczny metabolit DOX, doksorubicynol (DOXol), w różnych matrycach biologicznych (np. Krew pełna, guz piersi i serce). Podwójna sonda fluorescencyjna i absorbująca promieniowanie ultrafioletowe, 4-metylolumbelliferon (4-MU), została użyta jako wzorzec wewnętrzny (IS) do jednoetapowego wykrywania wielu analiz leków o różnych długościach fal detekcji. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do określenia stężeń DOX i MMC dostarczanych zarówno przez nanocząstki, jak i roztwory w pełnej krwi i różnych tkankach w ortotopowym mysim modelu guza piersi. Przedstawiona metoda analityczna jest użytecznym narzędziem do analizy przedklinicznej dostarczania kombinacji leków na podstawie nanocząstek.

Wprowadzenie

Chemioterapia jest podstawową metodą leczenia wielu nowotworów, jednak często wiąże się z poważnymi działaniami niepożądanymi i ograniczoną skutecznością z powodu oporności na leki i innych czynników1,2,3. Aby poprawić wyniki chemioterapii, w klinice zastosowano schematy kombinacji leków w oparciu o takie czynniki, jak nienakładające się na siebie toksyczności, różne mechanizmy działania leków i niekrzyżowa oporność na leki4,5,6. W badaniach klinicznych często obserwowano lepszy wskaźnik odpowiedzi guza przy jednoczesnym podawaniu kombinacji leków w porównaniu ze schematem sekwencyjnego dostarczania leków7,8. Jednak ze względu na nieoptymalną biodystrybucję wolnych form leków, jednoczesne wstrzykiwanie wielu leków może powodować wyraźną normalną toksyczność tkankową, która przeważa nad efektem terapeutycznym9,10,11. Wykazano, że dostarczanie leków oparte na nanonośnikach zmienia farmakokinetykę i biodystrybucję leków w kapsułkach, zwiększając akumulację ukierunkowaną na nowotwór12,13,14. Jak omówiliśmy w naszych ostatnich artykułach, nanocząstki współładowane synergistycznymi kombinacjami leków wykazały zdolność do łagodzenia problemów napotykanych przez wolne kombinacje leków, ze względu na kontrolowane czasowe i przestrzenne jednoczesne dostarczanie wielu leków do tkanki nowotworowej, umożliwiając synergiczne działanie leków przeciwko komórkom nowotworowym4,15,16. W rezultacie, zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych, wykazano wyższą skuteczność terapeutyczną i niską toksyczność4,17,18.

Nasze poprzednie badania in vitro wykazały, że połączenie dwóch leków przeciwnowotworowych, doksorubicyny (DOX) i mitomycyny C (MMC), wywołało efekt synergiczny przeciwko kilku liniom komórek raka piersi, a ponadto, współładowanie DOX i MMC w hybrydowych nanocząstkach polimerowo-lipidowych (DMPLN) pokonało różne wielolekooporne pompy wypływu (np. glikoproteina P i białko odporne na raka piersi)19,20,21. In vivo DMPLN umożliwił przestrzenno-czasowe jednoczesne dostarczanie DOX i MMC do miejsc nowotworowych oraz zwiększył biodostępność leków w komórkach nowotworowych, na co wskazuje moderacja powstawania metabolitu DOX doksorubicynolu (DOXol)22. W rezultacie, DMPLN zwiększył apoptozę komórek nowotworowych, zahamowanie wzrostu guza i wydłużenie przeżycia gospodarza w porównaniu z kombinacją wolnych DOX i MMC lub liposomalnym preparatem DOX22,23,24,25.

Analiza rzeczywistej ilości leków dostarczanych jednocześnie przez nanonośnik jest kluczowa dla projektowania skutecznych preparatów nanocząstek. Opracowano wiele metod analizy poziomu w osoczu pojedynczych dawek DOX lub MMC przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) samodzielnie lub w połączeniu ze spektrometrią mas (MS)26,27,28,29,30,31,32,33,34. Metody te są jednak często czasochłonne i niepraktyczne w przypadku terapii skojarzonej, ponieważ duża liczba próbek biologicznych musi być przygotowywana oddzielnie do analizy wielu leków (czasami zawierających metabolity leków). Oprócz silnego wiązania DOX i MMC z białkami osocza, czerwone krwinki mają również dużą zdolność do wiązania i koncentracji wielu leków przeciwnowotworowych35,36. W związku z tym analiza osocza pod kątem DOX lub MMC może zaciemnić rzeczywiste stężenia leków we krwi. Niniejsza praca (Rysunek 1) opisuje prostą i solidną metodę analizy wielu leków przy użyciu HPLC z odwróconą fazą do jednoczesnej ekstrakcji i ilościowego oznaczania DOX, MMC i metabolitu DOX doksorubicyny (DOXol) z pełnej krwi i różnych tkanek (np. nowotworów). Został on z powodzeniem zastosowany do określenia farmakokinetyki i biodystrybucji DOX i MMC, a także tworzenia DOXolu po podaniu leku za pośrednictwem wolnych roztworów lub form nanocząstek (tj. DMPLN i liposomalnego DOX) w ortotopowo wszczepionym mysim modelu guza piersi po wstrzyknięciu dożylnym (IV)22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami University Health Network w Ontario Cancer Institute i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Canadian Council on Animal Care.

1. Przygotowanie próbek biologicznych

  1. Pobierz krew pełną, główne organy oraz guz piersi w określonych punktach czasowych po dożylnym (i.v.) podaniu formulacji zawierających lek (np. DMPLN, liposomalny DOX)
    1. Wstrzyknij dożylnie przygotowaną formulację zawierającą lek myszy z przerzutami guza piersi.
    2. Uśpij mysz w wyznaczonych punktach czasowych (np. 15 min), podając wziewnie 2% izofluran w szczelnej komorze.
    3. Połóż znieczuloną mysz na plecach i umieść jej nos w adapterze nosowym, który stale dostarcza 2% izofluranu.
      UWAGA: Aby upewnić się, że mysz znajduje się w głębokiej narkozie, delikatnie uciśnij przednie kończyny myszy i sprawdź, czy nie występują żadne ruchy drgawkowe.
    4. Dokładnie oczyść okolice klatki piersiowej i brzucha za pomocą 70% etanolu, a następnie wykonaj terminalną procedurę nakłucia serca u głęboko znieczulonych myszy, używając heparynowanej strzykawki 1 mL i igły 23 G.
    5. Pobierz krew pełną do oznakowanej plastikowej probówki spryskanej heparynem sodu i delikatnie zakręć probówką, aby pobrana krew pełna miała kontakt z powłoką z heparyny na ściance probówki. Pobierz minimum 50 µL krwi pełnej. Próbki zawsze przechowuj w lodzie.
    6. Przytwierdź taśmą wszystkie cztery kończyny myszy, aby ją unieruchomić, a następnie otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową myszy za pomocą nożyczek i pęsety. Przesuń jelita na bok i odsuń wątrobę do góry, aby dostatecznie odsłonić żyłę wrotną. Przetnij żyłę wrotną w celu odprowadzenia krwi.
    7. Przepłucz cały organizm myszy 50 mL lodowatej 0,9% soli fizjologicznej poprzez serce, używając strzykawki 10 mL z igłą 25 G.
      UWAGA: Zegnij igłę pod kątem 90°, aby ułatwić wprowadzenie strzykawki do żyły wrotnej.
    8. Wypreparuj organy w następującej kolejności: serce, płuca, wątroba, śledziona, nerki. Następnie oddziel guz piersi od otaczających tkanek łącznych za pomocą nożyczek chirurgicznych w obrębie prawego podskórnego płata tłuszczowego piersi myszy. Wszystkie organy umieść indywidualnie w polipropylowych probówkach 1,5 mL i szybko zamroź w ciekłym azocie.
      ​UWAGA: Oddziel pęcherzyk żółciowy od wątroby.
    9. Przechowuj krew pełną w temperaturze 4 °C, a wypreparowane tkanki w zamrażarce -80 °C do czasu późniejszej analizy HPLC.
  2. Wyekstrahuj DOX, MMC i DOXol z matryc biologicznych.
    1. Szybko zważ wszystkie zamrożone wypreparowane tkanki i przenieś je do stożkowej probówki 13 mL z zaokrąglonym dnem. Aby uniknąć ewentualnego metabolizmu lub degradacji leku, próbki przechowuj w lodzie.
    2. Dodaj do probówki 1-5 mL lodowatego buforu do lizy komórek.
      UWAGA: Objętość stosowanego buforu zależy od masy tkanki, przyjmując stosunek tkanka-bufor 1 g: 5 mL (w/v); dla małych organów, takich jak serce i śledziona, stosunek ten wynosi 1 g: 2 mL.
    3. Używając elektrycznego homogenizatora ręcznego, homogenizuj próbki tkanek w lodzie, wykonując ruchy góra-dół przy prędkości 18 0 rpm.
      UWAGA: Pełna homogenizacja wymaga około 3 do 5 iteracji krótkiego procesu homogenizacji trwającego mniej niż 15 s, z chłodzeniem tkanki w lodzie pomiędzy każdym krótkim cyklem.
    4. Pomiędzy każdą próbką tkanki przemywaj 10 mm ząbkowaną sondę homogenizatora wodą destylowaną i dejonizowaną (DDI) H2O, 70% etanolem, a następnie ponownie DDI H2O, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej.
    5. Przenieś 50 µL homogenatu tkankowego lub krwi pełnej do polipropylowej probówki do mikrowirówki 1,5 mL i dodaj 5 µL wzorca wewnętrznego (I.S.) 4-metylumbelliferonu (4-MU) (200 ng/mL).
      UWAGA: Roztwór 4-MU został tutaj przygotowany w metanolu.
    6. Dodaj 250 µL lodowatego rozpuszczalnika do ekstrakcji do probówki zawierającej krew pełną lub homogenat tkankowy.
      UWAGA: Rozpuszczalnik do ekstrakcji składa się z 60% acetonitrylu (ACN) i 40% octanu amonu (5 mM) z pH skorygowanym do pH = 3,5 za pomocą 0,05% kwasu mrówkowego. Stosuj stosunek objętości próbka:rozpuszczalnik do ekstrakcji 1:5 (v/v).
    7. Mocno mieszaj mieszaninę w wirówce vortex przez 2 min, odwiruj przy sile 30 x g w temperaturze 4 oC przez 10 min i pobierz pipetą 20 µL supernatantu do innej, schłodzonej wcześniej, świeżej probówki do mikrowirówki.
    8. Odparuj supernatant w temperaturze 60 °C pod powolnym strumieniem gazowego azotu, chroniąc go przed światłem.
    9. Rekonstytuuj wysuszony osad w 10 µL lodowatego metanolu, mocno mieszaj w wirówce vortex przez 30 s i odwiruj przy 30 x g w temperaturze 4 °C przez kolejne 5 min.
    10. Przenieś supernatant do wkładu do fiolki HPLC i umieść fiolki z próbkami w tackach autosamplera do wstrzyknięcia.

2. Aparatura HPLC i parametry pracy

  1. Przygotowanie fazy ruchomej do HPLC z zachowaniem powtarzalności
    1. Odmierz 50 mL wody H2O klasy HPLC za pomocą cylindra miarowego.
    2. Odmierz 50 mL acetonitrylu (ACN) klasy HPLC za pomocą oddzielnego cylindra miarowego.
    3. Ostrożnie dodaj 0,5 mL kwasu triflorooctowego (TFA) (OSTROŻNIE) do każdego z 500 mL H2O oraz ACN, aby otrzymać fazę ruchomą H2O oraz ACN zawierającą odpowiednio 0,1% TFA.
      UWAGA: TFA jest substancją żrącą i toksyczną, dlatego należy z nią pracować pod dygestorium laboratoryjnym. Wszystkie mieszaniny rozpuszczalników przygotowuje się w temperaturze pokojowej.
    4. Przefiltruj fazy ruchome przez nylonowy filtr membranowy o rozmiarze porów 0,45 µm i przelej je do czystych butelek zbiorników HPLC.
  2. Konfiguracja aparatury HPLC do jednoczesnego detekcji DOX, MMC, DOXol oraz standardu wewnętrznego (I.S.) 4-MU.
    1. Włącz pompę gradientową, odgazowywacz, autosampler, detektor z matrycą fotodiod oraz wielodługościowy detektor fluorescencyjny λ.
    2. Wprowadź początkowe warunki składu fazy ruchomej: 16,5% H2O (0,1% TFA) i 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).
    3. Ustaw detektor UV na dwóch kanałach: jeden na 310 nm dla 4-MU (I.S.) i drugi na 360 nm dla MMC.
    4. Ustaw detektor fluorescencyjny na dwóch kanałach: jeden na λex/λem =365/45 nm dla 4-MU i drugi na λex/ λem=480 nm/560 nm odpowiednio dla DOX i DOXol.
    5. Ustaw izokratyczną prędkość przepływu na 1,0 mL/min.
    6. Równoważ wcześniej zainstalowaną kolumnę C18 w fazie odwróconej (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) w temperaturze pokojowej przez 10 min w celu ustalenia linii bazowej.
  3. Rozdział leków (DOX, MMC, DOXol i 4-MU) z wykorzystaniem warunków gradientowej fazy ruchomej.
    1. Wstrzyknij 15 µL wyekstrahowanych i zagęszczonych próbek za pomocą autosamplera.
    2. Stopniowo zmieniaj początkowe warunki fazy ruchomej (patrz punkt protokołu 2.2.2) do 10% ACN (0,1% TFA) w czasie 18 min przy użyciu automatycznej pompy gradientowej.
      UWAGA: Podczas procesu rozdziału jednocześnie pojawiają się cztery kanały (dwa absorbujące UV i dwa fluorescencyjne), przy czym każdy kanał wyświetla jeden związek leku (patrz punkty protokołu 2.2.3 i 2.2.4).
    3. Utrzymaj 10% ACN (0,1% TFA) przez 1 min, a następnie powróć do początkowych warunków fazy ruchomej w ciągu 1 min.
    4. Ponownie przygotuj kolumnę, stosując początkową fazę ruchomą przy prędkości przepływu 1,5 mL/min przez 4 min przed wstrzyknięciem kolejnej próbki.

3. Walidacja HPLC

  1. Przygotować standardy robocze DOX, MMC i DOXol oraz 4-MU (standard wewnętrzny).
    1. Odważ oddzielnie 1 mg proszku leków DOX i MMC (OSTROŻNIE) oraz 4-MU na świeżej, małej papierowej szalce wagowej (3 x 3 cale)2).
      Uwaga: Wszystkie leki przeciwnowotworowe są uznawane za zagrożenie dla zdrowia, które w przypadku inhalacji lub połknięcia mogą wywołać ostrą toksyczność oraz mutagenność komórek linii zarodkowej. Należy z nimi obchodzić się ostrożnie, stosując rękawiczki i maski.
    2. Przenieś odważone DOX, MMC oraz 4-MU do nowej, oddzielnej polipropylenowej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodać 1 ml metanolu i krótko wymieszać wstrząsarce typu vortex, aby uzyskać stężenie DOX i MMC wynoszące 1 mg/ml.
    4. Do probówki zawierającej wcześniej odważony 1 mg DOXol (ostrożnie) dodać 1 ml metanolu i krótko wymieszać w wirówce typu vortex, aby uzyskać stężenie DOXol wynoszące 1 mg/ml.
      UWAGA: DOXol jest kardiotoksycznym metabolitem i należy z nim obchodzić się ostrożnie.
    5. Pipeta 20 µL przygotowanych roztworów zapasowych DOX, MMC, DOXol i 4-MU do nowej, oddzielnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml z polipropylenu i dodać 980 µL metanolu w celu otrzymania standardu roboczego o stężeniu 20 µg/mL każdego leku.
    6. Rozcieńczyć 20 µg/mL DOX, MMC i DOXol przy użyciu metanolu w celu otrzymania standardów roboczych o stężeniu 50 ng - 20 µg /mL dla DOX, MMC i DOXol oraz 200 ng/mL dla I.S. 4-MU.
    7. Zakryć zakrętkę probówki z roztworami roboczymi wąskim paskiem folii parafinowej, aby zapobiec odparowaniu metanolu, owinąć całą probówkę folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na bezpośrednie światło, i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Określenie liniowości, precyzji i dokładności DOX, MMC oraz DOXol w macierzach biologicznych (t. j. całokrwiste oraz homogenat guza).
    1. Jednoczesne wzbogacenie próbek 5 µL roztworów wzorców roboczych DOX i DOXol (50 ng/ml - 20 µg/mL), MMC (1 0 ng/ml - 16 µg/mL), oraz 4-MU (2 µg/mL) do 50 µL ślepej pełnej krwi lub homogenatu tkankowego w polipropylenowych probówkach do mikrocentryfugi w celu uzyskania standardowej krzywej kalibracyjnej w zakresie od 5 do 200 ng/mL dla związków leku oraz 20 ng/mL dla 4-MU (standardu wewnętrznego).
    2. Przeprowadź analizę ekstrakcji leku opisaną w protokole 1.2.
    3. Do oceny precyzji i dokładności wewnątrz- i między-dniowej należy zastosować niskie, średnie i wysokie stężenia DOX i DOXol (50, 50 i 20 ng/ml) oraz MMC (10, 100 i 20 ng/ml).
      UWAGA: Świeże roztwory standardów o określonych stężeniach należy przygotować w dniu przeprowadzenia analizy.
  3. Analiza próbek
    1. Wstrzyknąć 15 µL próbki za pomocą autosamplera.
    2. Stopniowo zmieniaj fazę ruchomą w czasie od 0 do 18 min, zwiększając w tym przedziale zawartość ACN.
    3. Po 18 min utrzymaj warunki fazy ruchomej przez 1 min.
    4. Powróć do warunków początkowych w ciągu następnych 2 min, a następnie ponownie wyrównoważ układ przez 4 min przed kolejnym wstrzyknięciem.
    5. Po każdym przebiegu próbki należy zwrócić uwagę, że piki związków leków wraz z ich czasami retencji są przedstawione w następującej kolejności: MMC, DOXol, 4-MU (S.W.) i DOX.
    6. Zintegruj pole powierzchni pod krzywą (AUC) dla związków leków, korzystając z oprogramowania do HPLC.
    7. Obliczyć stosunek AUC pomiędzy poszczególnym związkiem leku a wzorcem wewnętrznym (I.S.) (Równanie 1) i wykorzystać krzywe wzorcowe przygotowane zgodnie z tymi samymi procedurami ekstrakcji, aby oznaczyć stężenia leków DOX, MMC i DOXol w formulacji DMPLN.
      Równanie stosunku powierzchni piku AUC_leku/AUC_IS; formuła chemii analitycznej do analizy danych.
    8. Oblicz procent odzysku leku (Równanie 2), porównując stężenia leku po rekonstytucji przy użyciu metanolu z ekstraktów wzbogaconych próbek biologicznych do stężenia standardowego („czystego”) roztworu leku w metanolu.
      Wzór obliczania odzysku leku, \( \text{Równanie: Odzysk leku \%} = \frac{\text{Stosunek powierzchni piku}_{ekstrahowanego}}{\text{Stosunek powierzchni piku}_{czystego}} \times 10 \).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dwa leki przeciwnowotworowe, DOX i MMC, a także metabolit DOX, DOXol, zostały jednocześnie wykryte bez żadnych interferencji biologicznych w tych samych warunkach gradientowej HPLC, stosując 4-MU jako standard wewnętrzny (I.S.) zarówno dla detektora fluorescencyjnego, jak i UV. DOX, MMC, DOXol i 4-MU zostały od siebie wyraźnie oddzielone, a czasy retencji wyniosły odpowiednio: 5,7 min dla MMC, 10,4 min dla DOXol, 10,9 min dla 4-MU oraz 1,1 min dla DOX (Rysunek 2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W porównaniu z innymi metodami chromatograficznymi, które umożliwiają wykrywanie pojedynczego gatunku leku na raz, obecny protokół HPLC jest w stanie jednocześnie oznaczać ilościowo trzy związki leków (DOX, MMC i DOXol) w tej samej matrycy biologicznej bez konieczności zmiany fazy ruchomej. Ta metoda przygotowania i analizy została z powodzeniem zastosowana do określenia farmakokinetyki i biodystrybucji dwóch systemów dostarczania leków opartych na nanocząstkach (tj. liposomalnych DOX i DMPLN)2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych i konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują za dotację na sprzęt od Kanadyjskiej Rady Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC) dla HPLC, dotację operacyjną od Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR) i Kanadyjskiego Sojuszu Badań nad Rakiem Piersi (CBCR) dla X.Y. Wu oraz stypendium Uniwersytetu w Toronto dla R.X. Zhanga i T. Zhanga.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Doksorubicyna Polymed Theraeutics111023Lek przeciwnowotworowy
Mitomycyna CPolymed Theraeutics060814Lek przeciwnowotworowy
Doksorubicynol (DOXol)Toronto Research ChemicalsD558020Metabolit
soli sodowej DOX 4-metylumbliferonu Sigma-AldrichM1508Wzorzec wewnętrzny
Kwas mirystynowySigma-Aldrich544-63-8   Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe
Polioksyetylen (100) StearateSpectrumM1402Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe
Polioksyetylen (40) StearynianSigma-AldrichP3440Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe
Pluronic F68 (PF68)BASF Corp.9003-11-6Materiały do hybrydowych nanocząstek polilipidowych
Ultradźwięki (UP100H)Hielscher, Technologia ultradźwiękowaNAPrzygotowanie nanocząstek
Kąpiel wodna (ISOTEMP 3016HS)Fisher ScientificNAPrzygotowanie nanocząstek
Doksorubicyna liposomalna  (Caelyx)JanssenZakupiony w aptece Princess MargaretHospital Klinicznie zatwierdzona formuła nanocząstek 
Metanol klasy HPLCCaledon Chemicals6701-7-40HPLC kompozycja fazy ruchomej
Klasa H2OCaledon Chemicals8801-7-40HPLC kompozycja fazy ruchomej
Acetonitryl klasy HPLC Caledon Chemicals1401-7-40HPLC kompozycja fazy ruchomej
Kwas trifluorooctowySigma-Aldrich302031HPLC skład fazy ruchomej
0,45 μ m Bibuła filtracyjna z membraną nylonowąWhatmanWHA7404004HPLC Przygotowanie fazy mobilnej
1cc Plastikowe strzykawkiBecton, Dickinson and Company2606-309659Wtrysk leczniczy
5cc Plastikowe strzykawkiBecton, Dickinson and Company2608-309646Kolekcje tkanek
Igły 30G 1/2Becton, Dickinson and Company305106Leczenie iniekcyjne
Igły 25G 5/8Becton, Dickinson and Company305122Kolekcje tkanek
Sterylne 0,9% soli fizjologicznejUniwersytet w Toronto Marka House1011Perfuzja tkanek
13 ml Rurka stożkowa z zaokrąglonym dnem SARSTEDT62.515.006Prolyprolen, homogenizacja tkankowa
Alpha Minimum Essential Medium (MEM) Gibco12571063Pożywka komórkowa
1 x Bufor fosforanowy Sól fizjologicznaGibco10010023Homogenizacja tkanek
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 MLHomogenizacja tkanek
Kwas mrówkowyCaledon Chemicals1/5/3840Dostosuj pH dla rozpuszczalnika ekstrakcyjnego
Plastikowe rurki spryskane heparyną sodowąBecton, Dickinson i spółka367878Analityczna waga do pobierania krwi
 Sartorius 
CPA225D pH-metry NA Fisher Scientific13-637-671accumet BASIC
Vortex MixterFisher Scientific02-215-365Wirowanie próbek z żądaną prędkością
1,5 ml  Rurka do mikrowirówekFisherbrand2043-05408129Homogenizator prolyprolenu
Model 1000Fisher Scientific08-451-672Wirówka do homogenizacji tkanek
5702REppendorf5702RPrzygotowanie do ekstrakcji
Podgrzewany system parownikaGlas-ColNARekonstytucja próbki
HPLC Fiolki z gwintemśrubowym DIKMA5320Wtrysk próbki HPLC
Zakrętki HPLC z białym silikonem PTFE SeptaDIKMA5325HPLC wtrysk próbki HPLC
Wkładka polipropylenowa HPLC   Agilent Technologies5182-0549Maksymalna głośność 250 μ l, wstrzyknięcie próbki HPLC
Xbridge C18 KolumnaWaters Corporation186003117Analiza leków
Pompa gradientowa Waters CorporationW600Analiza narkotyków
Auto-samplerWaters CorporationW2707Analiza narkotyków
Detektor matrycy fotodiodowej Waters CorporationW2998Analiza narkotyków
Detektor fluorescencji Multi &lambda Waters CorporationW2475Analiza leków
EMPOWER 2Waters CorporationNAOprogramowanie do analizy danych
NaukowiecMicromathNAAnaliza farmakokinelogiczna
Samice myszy Balb/cLaboratory001026In vivo
EMT6 / WT Komórki raka piersidostarczone przez dr Iana Tannocka; Ontario Cancer InstituteNAIn vivo
Jackson

Bibliografia

  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 219-234 (2006).
  3. Kong, A. -N. T. Inflammation, Oxidative Stress, and Cancer: Dietary Approaches for Cancer Prevention. Kong, A. .N. .T. ., , CRC Press. Florida, USA. (2013).
  4. Zhang, R. X., Wong, H. L., Xue, H. Y., Eoh, J. Y., Wu, X. Y. Nanomedicine of Synergistic Drug Combinations for Cancer Therapy - Strategies and Perspectives. J Control Release. 240, 489-503 (2016).
  5. Webster, R. M. Combination Therapies in Oncology. Nat. Rev. Drug. Discov. 15 (2), 81-82 (2016).
  6. Waterhouse, D. N., Gelmon, K. A., Klasa, R., Chi, K., Huntsman, D., Ramsay, E., Wasan, E., Edwards, L., Tucker, C., Zastre, J., Wang, Y. Z., Yapp, D., Dragowska, W., Dunn, S., Dedhar, S., Bally, M. B. Development and Assessment of Conventional and Targeted Drug Combinations for Use in the Treatment of Aggressive Breast Cancers. Curr Cancer Drug Targets. 6 (6), 455-489 (2006).
  7. Cancello, G., Bagnardi, V., Sangalli, C., Montagna, E., Dellapasqua, S., Sporchia, A., Iorfida, M., Viale, G., Barberis, M., Veronesi, P., Luini, A., Intra, M., Goldhirsch, A., Colleoni, M. Phase Ii Study with Epirubicin, Cisplatin, and Infusional Fluorouracil Followed by Weekly Paclitaxel with Metronomic Cyclophosphamide as a Preoperative Treatment of Triple-Negative Breast Cancer. Clin Breast Cancer. 15 (4), 259-265 (2015).
  8. Masuda, N., Higaki, K., Takano, T., Matsunami, N., Morimoto, T., Ohtani, S., Mizutani, M., Miyamoto, T., Kuroi, K., Ohno, S., Morita, S., Toi, M. A Phase Ii Study of Metronomic Paclitaxel/Cyclophosphamide/Capecitabine Followed by 5-Fluorouracil/Epirubicin/Cyclophosphamide as Preoperative Chemotherapy for Triple-Negative or Low Hormone Receptor Expressing/Her2-Negative Primary Breast Cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 74 (2), 229-238 (2014).
  9. Carrick, S., Parker, S., Thornton, C. E., Ghersi, D., Simes, J., Wilcken, N. Single Agent Versus Combination Chemotherapy for Metastatic Breast Cancer. Cochrane Database Syst Rev. 15 (2), 003372(2009).
  10. Cardoso, F., Bedard, P. L., Winer, E. P., Pagani, O., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L. J., Kyriakides, S., Costa, A., Cufer, T., Albain, K. S., Force, E. -M. T. International Guidelines for Management of Metastatic Breast Cancer: Combination Vs Sequential Single-Agent Chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 101 (17), 1174-1181 (2009).
  11. Alba, E., Martin, M., Ramos, M., Adrover, E., Balil, A., Jara, C., Barnadas, A., Fernandez-Aramburo, A., Sanchez-Rovira, P., Amenedo, M., Casado, A. Multicenter Randomized Trial Comparing Sequential with Concomitant Administration of Doxorubicin and Docetaxel as First-Line Treatment of Metastatic Breast Cancer: A Spanish Breast Cancer Research Group (Geicam-9903) Phase Iii. J Clinn Oncol. 22 (13), 2587-2593 (2004).
  12. Sadat, S. M., Saeidnia, S., Nazarali, A. J., Haddadi, A. Nano-Pharmaceutical Formulations for Targeted Drug Delivery against Her2 in Breast Cancer. Curr. Cancer Drug Targets. 15 (1), 71-86 (2015).
  13. Devadasu, V. R., Wadsworth, R. M., Ravi Kumar, M. N. V. Tissue Localization of Nanoparticles Is Altered Due to Hypoxia Resulting in Poor Efficacy of Curcumin Nanoparticles in Pulmonary Hypertension. Eur. J. Pharm. Biopharm. 80 (3), 578-584 (2012).
  14. Li, S. D., Huang, L. Pharmacokinetics and Biodistribution of Nanoparticles. Mol. Pharm. 5 (4), 496-504 (2008).
  15. Zhang, R. X., Ahmed, T., Li, L. Y., Li, J., Abbasi, A. Z., Wu, X. Y. Design of Nanocarriers for Nanoscale Drug Delivery to Enhance Cancer Treatment Using Hybrid Polymer and Lipid Building Blocks. Nanoscale. 9 (4), 1334-1355 (2017).
  16. Wang, X., Li, S., Shi, Y., Chuan, X., Li, J., Zhong, T., Zhang, H., Dai, W., He, B., Zhang, Q. The Development of Site-Specific Drug Delivery Nanocarriers Based on Receptor Mediation. J. Control. Release. 193, 139-153 (2014).
  17. Batist, G., Gelmon, K. A., Chi, K. N., Miller, W. H., Chia, S. K., Mayer, L. D., Swenson, C. E., Janoff, A. S., Louie, A. C. Safety, Pharmacokinetics, and Efficacy of Cpx-1 Liposome Injection in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res. 15 (2), 692-700 (2009).
  18. Mayer, L. D., Harasym, T. O., Tardi, P. G., Harasym, N. L., Shew, C. R., Johnstone, S. A., Ramsay, E. C., Bally, M. B., Janoff, A. S. Ratiometric Dosing of Anticancer Drug Combinations: Controlling Drug Ratios after Systemic Administration Regulates Therapeutic Activity in Tumor-Bearing Mice. Mol. Cancer Ther. 5 (7), 1854-1863 (2006).
  19. Prasad, P., Cheng, J., Shuhendler, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Nanoparticle Formulation Overcomes Multiple Types of Membrane Efflux Pumps in Human Breast Cancer Cells. Drug Deliv Transl Res. 2 (2), 95-105 (2012).
  20. Shuhendler, A. J., Cheung, R. Y., Manias, J., Connor, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Doxorubicin-Mitomycin C Co-Encapsulated Nanoparticle Formulation Exhibits Anti-Cancer Synergy in Multidrug Resistant Human Breast Cancer Cells. Breast Cancer Res Treat. 119 (2), 255-269 (2010).
  21. Shuhendler, A. J., O'Brien, P. J., Rauth, A. M., Wu, X. Y. On the Synergistic Effect of Doxorubicin and Mitomycin C against Breast Cancer Cells. Drug Metabol. Drug Interact. 22 (4), 201-233 (2007).
  22. Zhang, R. X., Cai, P., Zhang, T., Chen, K., Li, J., Cheng, J., Pang, K. S., Adissu, H. A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Synchronize Pharmacokinetics of Co-Encapsulated Doxorubicin-Mitomycin C and Enable Their Spatiotemporal Co-Delivery and Local Bioavailability in Breast Tumor. Nanomedicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
  23. Zhang, T., Prasad, P., Cai, P., He, C., Shan, D., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Dual-Targeted Hybrid Nanoparticles of Synergistic Drugs for Treating Lung Metastases of Triple Negative Breast Cancer in Mice. Acta Pharmacol Sin. , 1-13 (2017).
  24. Shuhendler, A. J., Prasad, P., Zhang, R. X., Amini, M. A., Sun, M., Liu, P. P., Bristow, R. G., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Synergistic Nanoparticulate Drug Combination Overcomes Multidrug Resistance, Increases Efficacy, and Reduces Cardiotoxicity in a Nonimmunocompromised Breast Tumor Model. Mol Pharm. 11 (8), 2659-2674 (2014).
  25. Prasad, P., Shuhendler, A., Cai, P., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Doxorubicin and Mitomycin C Co-Loaded Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Inhibit Growth of Sensitive and Multidrug Resistant Human Mammary Tumor Xenografts. Cancer Lett. 334 (2), 263-273 (2013).
  26. Rafiei, P., Michel, D., Haddadi, A. Application of a Rapid Esi-Ms/Ms Method for Quantitative Analysis of Docetaxel in Polymeric Matrices of Plga and Plga-Peg Nanoparticles through Direct Injection to Mass Spectrometer. Am. J. Anal. Chem. 6 (2), 164-175 (2015).
  27. Daeihamed, M., Haeri, A., Dadashzadeh, S. A Simple and Sensitive Hplc Method for Fluorescence Quantitation of Doxorubicin in Micro-Volume Plasma: Applications to Pharmacokinetic Studies in Rats. Iran. J. Pharm. Res. 14, Suppl 33-42 (2015).
  28. Alhareth, K., Vauthier, C., Gueutin, C., Ponchel, G., Moussa, F. Hplc Quantification of Doxorubicin in Plasma and Tissues of Rats Treated with Doxorubicin Loaded Poly(Alkylcyanoacrylate) Nanoparticles. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 887-888, 128-132 (2012).
  29. Al-Abd, A. M., Kim, N. H., Song, S. C., Lee, S. J., Kuh, H. J. A Simple Hplc Method for Doxorubicin in Plasma and Tissues of Nude Mice. Arch Pharm Res. 32 (4), 605-611 (2009).
  30. Loadman, P. M., Calabrese, C. R. Separation Methods for Anthraquinone Related Anti-Cancer Drugs. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 764 (1-2), 193-206 (2001).
  31. Zhang, Z. D., Guetens, G., De Boeck, G., Van Cauwenberghe, K., Maes, R. A., Ardiet, C., van Oosterom, A. T., Highley, M., de Bruijn, E. A., Tjaden, U. R. Simultaneous Determination of the Peptide-Mitomycin Kw-2149 and Its Metabolites in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 739 (2), 281-289 (2000).
  32. Alvarez-Cedron, L., Sayalero, M. L., Lanao, J. M. High-Performance Liquid Chromatographic Validated Assay of Doxorubicin in Rat Plasma and Tissues. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 721 (2), 271-278 (1999).
  33. Paroni, R., Arcelloni, C., De Vecchi, E., Fermo, I., Mauri, D., Colombo, R. Plasma Mitomycin C Concentrations Determined by Hplc Coupled to Solid-Phase Extraction. Clin. Chem. 43 (4), 615-618 (1997).
  34. Song, D., Au, J. L. Direct Injection Isocratic High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Mitomycin C in Plasma. J Chromatogr B Biomed Appl. 676 (1), 165-168 (1996).
  35. Schrijvers, D. Role of Red Blood Cells in Pharmacokinetics of Chemotherapeutic Agents. Clin. Pharmacokinet. 42 (9), 779-791 (2003).
  36. Colombo, T., Broggini, M., Garattini, S., Donelli, M. G. Differential Adriamycin Distribution to Blood Components. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 6 (2), 115-122 (1981).
  37. Maeda, H., Nakamura, H., Fang, J. The Epr Effect for Macromolecular Drug Delivery to Solid Tumors: Improvement of Tumor Uptake, Lowering of Systemic Toxicity, and Distinct Tumor Imaging in Vivo. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (1), 71-79 (2013).
  38. Gustafson, D. L., Rastatter, J. C., Colombo, T., Long, M. E. Doxorubicin Pharmacokinetics: Macromolecule Binding, Metabolism, and Excretion in the Context of a Physiologic Model. J. Pharm. Sci. 91 (6), 1488-1501 (2002).
  39. Gabizon, A., Shiota, R., Papahadjopoulos, D. Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Doxorubicin Encapsulated in Stable Liposomes with Long Circulation Times. J. Natl. Cancer Inst. 81 (19), 1484-1488 (1989).
  40. Motlagh, N. S., Parvin, P., Ghasemi, F., Atyabi, F. Fluorescence Properties of Several Chemotherapy Drugs: Doxorubicin, Paclitaxel and Bleomycin. Biomed Opt Express. 7 (6), 2400-2406 (2016).
  41. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a Molecular Nanotheranostic Agent: Effect of Doxorubicin Encapsulation in Micelles or Nanoemulsions on the Ultrasound-Mediated Intracellular Delivery and Nuclear Trafficking. Mol Pharm. 7 (6), 1959-1973 (2010).
  42. Cielecka-Piontek, J., Jelińska, A., Zając, M., Sobczak, M., Bartold, A., Oszczapowicz, I. A Comparison of the Stability of Doxorubicin and Daunorubicin in Solid State. J. Pharm. Biomed Anal. 50 (4), 576-579 (2009).
  43. Gilbert, C. M., McGeary, R. P., Filippich, L. J., Norris, R. L. G., Charles, B. G. Simultaneous Liquid Chromatographic Determination of Doxorubicin and Its Major Metabolite Doxorubicinol in Parrot Plasma. J. chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life sci. 826 (1-2), 273-276 (2005).
  44. Liu, Z. S., Li, Y. M., Jiang, S. X., Chen, L. R. Direct Injection Analysis of Mitomycin C in Biological Fluids by Multidemension High Performance Liquid Chromatography with a Micellar Mobile Phase. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 19 (8), 1255-1265 (1996).
  45. Zhou, Y., He, C., Chen, K., Ni, J., Cai, Y., Guo, X., Wu, X. Y. A New Method for Evaluating Actual Drug Release Kinetics of Nanoparticles inside Dialysis Devices Via Numerical Deconvolution. J. Control. Release. 243, 11-20 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

DoksorubicynaMitomycyna Coznaczanie metodą HPLCanaliza kombinacji lekówdostarczanie leków za pomocą nanocząsteczekHPLC w odwróconej fazieekstrakcja z matrycy biologicznejmetoda wzorca wewnętrznegojednoczesna detekcja lekówbadanie farmakokinetyczneanaliza tkanki nowotworowej
Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.