Method Article

Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem

DOI:

10.3791/56159

⸱

October 5th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje efektywny i wygodny proces analityczny pobierania próbek i jednoczesnego oznaczania wielu leków, doksorubicyny (DOX), mitomycyny C (MMC) i kardiotoksycznego metabolitu DOX, doksorubicyny (DOXol), w próbkach biologicznych z przedklinicznego modelu guza piersi traktowanego preparatami nanocząsteczkowymi synergicznego połączenia leków.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemioterapia skojarzona jest często stosowana w klinice w leczeniu raka; jednak związane z nią działania niepożądane na normalną tkankę mogą ograniczyć jej korzyści terapeutyczne. Wykazano, że kombinacja leków oparta na nanocząsteczkach łagodzi problemy napotykane podczas terapii skojarzonej z bezpłatnymi lekami. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że połączenie dwóch leków przeciwnowotworowych, doksorubicyny (DOX) i mitomycyny C (MMC), wywołało efekt synergiczny zarówno przeciwko mysim, jak i ludzkim komórkom raka piersi in vitro. Hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe (DMPLN) z jednoczesnym obciążeniem DOX i MMC ominęły różne pompy transportera wypływu, które nadają oporność wielolekową, i wykazały zwiększoną skuteczność w modelach guzów piersi. W porównaniu z konwencjonalnymi formami roztworów, tak wyższą skuteczność DMPLN przypisano zsynchronizowanej farmakokinetyce DOX i MMC oraz zwiększonej wewnątrzkomórkowej biodostępności leku w komórkach nowotworowych, co umożliwił nanonośnik PLN.

Aby ocenić farmakokinetykę i biodystrybucję jednocześnie podawanych DOX i MMC zarówno w postaci wolnego roztworu, jak i nanocząstek, opracowano prostą i efektywną metodę analizy wielolekowej wykorzystującą wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) z odwróconymi fazami. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, które analizowały DOX lub MMC indywidualnie w osoczu, ta nowa metoda HPLC jest w stanie jednocześnie określić ilościowo DOX, MMC i główny kardiotoksyczny metabolit DOX, doksorubicynol (DOXol), w różnych matrycach biologicznych (np. Krew pełna, guz piersi i serce). Podwójna sonda fluorescencyjna i absorbująca promieniowanie ultrafioletowe, 4-metylolumbelliferon (4-MU), została użyta jako wzorzec wewnętrzny (IS) do jednoetapowego wykrywania wielu analiz leków o różnych długościach fal detekcji. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do określenia stężeń DOX i MMC dostarczanych zarówno przez nanocząstki, jak i roztwory w pełnej krwi i różnych tkankach w ortotopowym mysim modelu guza piersi. Przedstawiona metoda analityczna jest użytecznym narzędziem do analizy przedklinicznej dostarczania kombinacji leków na podstawie nanocząstek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemioterapia jest podstawową metodą leczenia wielu nowotworów, jednak często wiąże się z poważnymi działaniami niepożądanymi i ograniczoną skutecznością z powodu oporności na leki i innych czynników1,2,3. Aby poprawić wyniki chemioterapii, w klinice zastosowano schematy kombinacji leków w oparciu o takie czynniki, jak nienakładające się na siebie toksyczności, różne mechanizmy działania leków i niekrzyżowa oporność na leki4,5,6. W badaniach klinicznych często obserwowano lepszy wskaźnik odpowiedzi guza przy jednoczesnym podawaniu kombinacji leków w porównaniu ze schematem sekwencyjnego dostarczania leków7,8. Jednak ze względu na nieoptymalną biodystrybucję wolnych form leków, jednoczesne wstrzykiwanie wielu leków może powodować wyraźną normalną toksyczność tkankową, która przeważa nad efektem terapeutycznym9,10,11. Wykazano, że dostarczanie leków oparte na nanonośnikach zmienia farmakokinetykę i biodystrybucję leków w kapsułkach, zwiększając akumulację ukierunkowaną na nowotwór12,13,14. Jak omówiliśmy w naszych ostatnich artykułach, nanocząstki współładowane synergistycznymi kombinacjami leków wykazały zdolność do łagodzenia problemów napotykanych przez wolne kombinacje leków, ze względu na kontrolowane czasowe i przestrzenne jednoczesne dostarczanie wielu leków do tkanki nowotworowej, umożliwiając synergiczne działanie leków przeciwko komórkom nowotworowym4,15,16. W rezultacie, zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych, wykazano wyższą skuteczność terapeutyczną i niską toksyczność4,17,18.

Nasze poprzednie badania in vitro wykazały, że połączenie dwóch leków przeciwnowotworowych, doksorubicyny (DOX) i mitomycyny C (MMC), wywołało efekt synergiczny przeciwko kilku liniom komórek raka piersi, a ponadto, współładowanie DOX i MMC w hybrydowych nanocząstkach polimerowo-lipidowych (DMPLN) pokonało różne wielolekooporne pompy wypływu (np. glikoproteina P i białko odporne na raka piersi)19,20,21. In vivo DMPLN umożliwił przestrzenno-czasowe jednoczesne dostarczanie DOX i MMC do miejsc nowotworowych oraz zwiększył biodostępność leków w komórkach nowotworowych, na co wskazuje moderacja powstawania metabolitu DOX doksorubicynolu (DOXol)22. W rezultacie, DMPLN zwiększył apoptozę komórek nowotworowych, zahamowanie wzrostu guza i wydłużenie przeżycia gospodarza w porównaniu z kombinacją wolnych DOX i MMC lub liposomalnym preparatem DOX22,23,24,25.

Analiza rzeczywistej ilości leków dostarczanych jednocześnie przez nanonośnik jest kluczowa dla projektowania skutecznych preparatów nanocząstek. Opracowano wiele metod analizy poziomu w osoczu pojedynczych dawek DOX lub MMC przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) samodzielnie lub w połączeniu ze spektrometrią mas (MS)26,27,28,29,30,31,32,33,34. Metody te są jednak często czasochłonne i niepraktyczne w przypadku terapii skojarzonej, ponieważ duża liczba próbek biologicznych musi być przygotowywana oddzielnie do analizy wielu leków (czasami zawierających metabolity leków). Oprócz silnego wiązania DOX i MMC z białkami osocza, czerwone krwinki mają również dużą zdolność do wiązania i koncentracji wielu leków przeciwnowotworowych35,36. W związku z tym analiza osocza pod kątem DOX lub MMC może zaciemnić rzeczywiste stężenia leków we krwi. Niniejsza praca (Rysunek 1) opisuje prostą i solidną metodę analizy wielu leków przy użyciu HPLC z odwróconą fazą do jednoczesnej ekstrakcji i ilościowego oznaczania DOX, MMC i metabolitu DOX doksorubicyny (DOXol) z pełnej krwi i różnych tkanek (np. nowotworów). Został on z powodzeniem zastosowany do określenia farmakokinetyki i biodystrybucji DOX i MMC, a także tworzenia DOXolu po podaniu leku za pośrednictwem wolnych roztworów lub form nanocząstek (tj. DMPLN i liposomalnego DOX) w ortotopowo wszczepionym mysim modelu guza piersi po wstrzyknięciu dożylnym (IV)22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia w Ontario Cancer Institute i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Przygotowanie próbki biologicznej

  1. Pobrać krew pełną, główne narządy i guz piersi w określonych punktach czasowych po dożylnym (iv) podaniu preparatów zawierających leki (np. DMPLN, liposomalny DOX)
    1. Wstrzyknąć dożylnie myszy z guzem piersi przygotowany preparat zawierający lek.
    2. Znieczulić mysz w wyznaczonych punktach czasowych (np. 15 minut), podając wdychalny 2% izofluran w szczelnie zamkniętej komorze.
    3. Połóż znieczuloną mysz na grzbiecie i włóż jej nos przez końcówkę, która stale dostarcza 2% izofluranu.
      UWAGA: Aby upewnić się, że mysz zostanie poddana głębokiemu znieczuleniu, delikatnie ściśnij przednie kończyny myszy i poszukaj drgawek.
    4. Dokładnie oczyść okolice klatki piersiowej i brzucha za pomocą 70% etanolu, a następnie wykonaj końcową procedurę nakłucia serca na głęboko znieczulonych myszach za pomocą heparynizowanej strzykawki o pojemności 1 ml i igły 23 G.
    5. Zbierz pełną krew do znakowanej plastikowej probówki spryskanej heparyną sodową i delikatnie zakręć probówką, aby upewnić się, że zebrana krew pełna styka się z heparyną powlekaną ścianką probówki. Zbierz minimum 50 μl krwi pełnej. Próbki należy zawsze przechowywać na lodzie.
    6. Przyklej taśmą wszystkie cztery kończyny myszy, aby ją zabezpieczyć i otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową myszy za pomocą nożyczek i kleszczy. Przesuń jelita na bok i popchnij wątrobę do góry, aby wystarczająco odsłonić żyłę wrotną. Przeciąć żyłę wrotną w celu drenażu krwi.
    7. Przeprowadź perfuzję całego ciała myszy z 50 ml lodowatej soli fizjologicznej 0,9% przez serce za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 25 G.
      UWAGA: Zgiąć igłę pod kątem 90°, aby wprowadzić strzykawkę do żyły wrotnej.
    8. Wyciąć narządy w następującej kolejności: serce, płuca, wątroba, śledziona, nerki. Następnie oddziel guz piersi od otaczających go tkanek łącznych za pomocą nożyczek do nacinania prawej poduszeczki tłuszczowej sutka myszy. Zbierz wszystkie narządy pojedynczo do probówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml i szybko zamroź je w ciekłym azocie.
      UWAGA: Oddziel woreczek żółciowy od wątroby.
    9. Krew pełną należy przechowywać w temperaturze 4 °C, a wycięte tkanki w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu późniejszej analizy HPLC.
  2. Ekstrakcja DOX, MMC i DOXol z matryc biologicznych.
    1. Szybko zważ wszystkie zamrożone wypreparowane tkanki i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 13 ml z zaokrąglonym dnem. Aby uniknąć możliwego metabolizmu lub degradacji leku, próbki należy przechowywać na lodzie.
    2. Dodaj 1-5 ml lodowatego buforu do lizy komórek do probówki.
      UWAGA: Objętość buforu do użycia zależy od masy tkanki w oparciu o stosunek tkanki do bufora wynoszący 1 g: 5 ml (w/v); w przypadku małych narządów, takich jak serce i śledziona, stosunek wynosi 1 g: 2 ml.
    3. Użyj ruchu góra-dół, aby homogenizować próbki tkanek na lodzie z prędkością 18 000 obr./min za pomocą elektrycznego homogenizatora ręcznego.
      UWAGA: Zakończona homogenizacja wymaga około 3 do 5 iteracji krótkiego procesu homogenizacji trwającego mniej niż 15 s, a następnie chłodzenia tkanek nad lodem między każdą krótką homogenizacją.
    4. Umyć sondę generatora piłokształtnego o średnicy 10 mm homogenizatora destylowanym dejonizowanym (DDI)H2O, 70% etanolem, a następnie DDIH2Omiędzy każdą próbką tkanki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    5. Przenieść 50 μl homogenatu tkankowego lub krwi pełnej do probówki z mikrowirówką z polipropylenu o pojemności 1,5 ml i dodać 5 μl wzorca wewnętrznego (I.S.) 4-metyloubulliferonu (4-MU) (2000 ng/ml) do probówki.
      UWAGA: Roztwór 4-MU został przygotowany w metanolu tutaj.
    6. Dodać 250 μl lodowatego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do probówki zawierającej homogenat krwi pełnej lub tkanki.
      UWAGA: Rozpuszczalnik ekstrakcyjny składa się z 60% acetonitrylu (ACN) i 40% octanu amonu (5 mM) o pH dostosowanym do pH = 3,5 przy użyciu 0,05% kwasu mrówkowego. Użyć próbki w proporcji 1:5 (v/v): stosunek rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do objętości.
    7. Mieszaninę energicznie wirować przez 2 minuty, odwirować przy sile 3 000 x g w temperaturze 4 oC przez 10 minut i odpipetować 200 μl supernatantu do innej, wstępnie schłodzonej, świeżej probówki do mikrowirówki.
    8. Odparować supernatant w temperaturze 60 °C pod powolnym strumieniem azotu gazowego, z zachowaniem ochrony przed światłem.
    9. Rozpuścić wysuszoną pozostałość w 100 μl lodowatego metanolu, energicznie wirować przez 30 s i odwirować przy 3000 x g w temperaturze 4 °C przez kolejne 5 minut.
    10. Przenieść supernatant do wkładki do fiolki HPLC i umieścić fiolki z próbkami w tacce automatycznego podajnika próbek w celu wstrzyknięcia.

2. Oprzyrządowanie HPLC i parametry operacyjne

  1. Przygotowanie fazy mobilnej HPLC ze stałą odtwarzalnością
    1. Odmierzyć 500 mlH2Oklasy HPLC za pomocą cylindra miarowego.
    2. Odmierzyć 500 ml acetonitrylu klasy HPLC (ACN) za pomocą oddzielnego cylindra z podziałką.
    3. Ostrożnie dodać 0,5 ml kwasu trifluorooctowego (TFA) (UWAGA) do każdego z 500 mlH2Oi ACN, aby uzyskać fazę ruchomąH2Oi ACN zawierającą odpowiednio 0,1% TFA.
      UWAGA: TFA jest i toksyczny i powinien być obsługiwany pod laboratoryjnym wyciągiem. Wszystkie mieszaniny rozpuszczalników przygotowuje się w temperaturze pokojowej.
    4. Przefiltruj fazy ruchome przez nylonowy filtr membranowy o wielkości porów 0,45 μm i przenieś go do czystych butelek zbiornikowych HPLC.
  2. Konfiguracja oprzyrządowania HPLC do jednoczesnego wykrywania DOX, MMC i DOXol oraz I.S. 4-MU.
    1. Włącz pompę gradientową, odgazowywacz, automatyczny sampler, detektor fotodiodowy i detektor fluorescencji multi λ.
    2. Wprowadź warunki początkowe składu fazy ruchomej do 16,5% H2O (0,1% TFA) i 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).
    3. Ustaw detektor UV na dwa kanały, jeden na 310 nm dla 4-MU (I.S.), a drugi na 360 nm dla MMC.
    4. Ustaw detektor fluorescencji na dwa kanały, jeden na λex/λem =365/445 nm dla 4-MU, a drugi na λex/ λem=480 nm/560 nm odpowiednio dla DOX i DOXol.
    5. Ustawić izokratyczne natężenie przepływu na 1,0 ml/min.
    6. Zrównoważyć wstępnie zainstalowaną kolumnę C 18 z odwróconą fazą C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu ustalenia linii podstawowej.
  3. Oddzielne leki (DOX, MMC, DOXol i 4-MU) za pomocą gradientu fazy ruchomej.
    1. Wstrzyknąć 15 μl wyekstrahowanych i ponownie zagęszczonych próbek za pomocą automatycznego próbnika.
    2. Stopniowo zmieniaj początkowy stan fazy ruchomej (patrz krok protokołu 2.2.2) na 100% ACN (0,1% TFA) przez 18 minut za pomocą automatycznej pompy gradientowej.
      UWAGA: Podczas procesu separacji cztery kanały (dwa absorbujące promieniowanie UV i dwa fluorescencyjne) pojawiają się jednocześnie, z których każdy wyświetla jeden związek leczniczy (patrz krok protokołu 2.2.3 i 2.2.4).
    3. Utrzymuj 100% ACN (0,1% TFA) przez 1 minutę, a następnie powróć do początkowego stanu fazy ruchomej w ciągu 1 minuty.
    4. Ponownie kondycjonować kolumnę początkową fazą ruchomą przy natężeniu przepływu 1,5 ml/min przez 4 minuty do następnego wstrzyknięcia próbki.

3. Walidacja HPLC

  1. Przygotowanie standardów pracy DOX, MMC i DOXol oraz 4-MU (I.S.).
    1. Zważyć oddzielnie 1 mg proszku leku DOX i MMC (UWAGA) i 4-MU na świeżym, małym papierze wagowym (3 x 3 cale2).
      Uwaga: Wszystkie leki przeciwnowotworowe są uważane za zagrożenie dla zdrowia, które może powodować ostrą toksyczność i mutagenność komórek rozrodczych przy inhalacji lub spożyciu. Należy obchodzić się z nimi ostrożnie, w rękawiczkach i maskach.
    2. Przenieś zważone DOX, MMC i 4-MU do nowej, pojedynczej probówki do mikrowirówek z polipropylenu o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodać 1 ml metanolu i krótko odwirować, aby uzyskać stężenie 1 mg/ml DOX i MMC.
    4. Dodać 1 ml metanolu do fiolki zawierającej wstępnie zważone 1 mg DOXolu (UWAGA) i krótko przetrząsnąć, aby uzyskać stężenie 1 mg/ml DOXol.
      UWAGA: DOXol jest metabolitem kardiotoksycznym i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
    5. Odpipetować 20 μl przygotowanych roztworów podstawowych DOX, MMC, DOXol i 4-MU do nowej, oddzielnej probówki mikrowirówkowej z polipropylenu o pojemności 1,5 ml i dodać 980 μl metanolu, aby uzyskać wzorc roboczy 20 μg/ml każdego leku.
    6. Rozcieńczyć 20 μg/ml DOX, MMC i DOXol za pomocą metanolu, aby uzyskać wzorce robocze 50 ng - 20 μg / ml dla DOX, MMC i DOXol oraz 2000 ng/ml dla I.S. 4-MU.
    7. Uszczelnij nakrętkę probówki z roztworami roboczymi wąskim kawałkiem folii parafinowej, aby zapobiec parowaniu metanolu, owiń całą probówkę folią aluminiową, aby uniknąć wystawienia na bezpośrednie działanie światła i przechowuj w temperaturze -20 °C.
  2. Określ liniowość, precyzję i dokładność DOX, MMC i DOXol w matrycach biologicznych (tj. homogenacie krwi pełnej i guza).
    1. Jednocześnie należy dodać 5 μl roboczych wzorców DOX i DOXol (50 ng/ml - 20 μg/mL), MMC (1,000 ng/ml - 16 μg/mL) i 4-MU (2 μg/mL) do 50 μl ślepej krwi pełnej lub homogenatu tkankowego w mikroprobówkach wirówkowych z polipropylenu, aby uzyskać standardową krzywą stężenia w zakresie od 5 - 2000 ng/ml dla związków leków i 200 ng/ml dla 4-MU (I.S.).
    2. Wykonać test ekstrakcji narkotyku opisany w Protokole 1.2.
    3. Używaj niskich, średnich i wysokich stężeń DOX i DOXol (50, 500 i 2 000 ng/ml) oraz MMC (100, 1000, 2 000 ng/ml), aby uzyskać precyzję i dokładność w ciągu dnia i między nimi.
      UWAGA: Przygotować świeże stężenia wzorcowe w dniu analizy.
  3. Analiza próbek
    1. Wstrzyknąć 15 μl próbki za pomocą automatycznego próbnika.
    2. Stopniowo zmieniaj fazę ruchomą w ciągu 0 do 18 minut, zwiększając skład ACN w tym czasie.
    3. Po 18 minutach utrzymaj stan fazy ruchomej przez 1 minutę.
    4. Powrócić do stanu początkowego w ciągu następnych 2 minut, a następnie ponownie wyrównać stan równowagi przez 4 minuty przed następnym wstrzyknięciem.
    5. Po każdej próbce należy zauważyć, że piki związków leczniczych wraz z ich czasem retencji są pokazane w następujący sposób: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) i DOX.
    6. Zintegrować powierzchnię piku pod krzywą (AUC) związków leków za pomocą oprogramowania HPLC.
    7. Obliczyć stosunek AUC między pojedynczym związkiem leku a I.S. (równanie 1) i użyć krzywych wzorcowych przygotowanych w ramach tych samych procedur ekstrakcji do określenia stężeń DOX, MMC i DOXol w postaci DMPLN.
      figure-protocol-1
    8. Obliczyć procent odzysku leku (równanie 2), porównując stężenia leku odtworzonego przy użyciu metanolu z ekstraktów wzbogaconych próbek biologicznych z stężeniami wzorcowego ("czystego") roztworu leku w metanolu.
      figure-protocol-2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwa leki przeciwnowotworowe, DOX i MMC, a także metabolit DOX, DOXol, zostały wykryte jednocześnie bez żadnej ingerencji biologicznej w tych samych warunkach gradientowych HPLC przy użyciu 4-MU jako I.S. zarówno dla detektorów fluorescencji, jak i UV. DOX, MMC, DOXol i 4-MU były od siebie dobrze oddzielone, a czasy retencji wynosiły 5,7 minuty dla MMC, 10,4 minuty dla DOXol, 10,9 minuty dla 4-MU i 11,1 minuty dla DOX (Rysunek 2). Każdy lek w pełnej krwi i różnych tkank...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu z innymi metodami chromatograficznymi, które umożliwiają wykrywanie pojedynczego gatunku leku na raz, obecny protokół HPLC jest w stanie jednocześnie oznaczać ilościowo trzy związki leków (DOX, MMC i DOXol) w tej samej matrycy biologicznej bez konieczności zmiany fazy ruchomej. Ta metoda przygotowania i analizy została z powodzeniem zastosowana do określenia farmakokinetyki i biodystrybucji dwóch systemów dostarczania leków opartych na nanocząstkach (tj. liposomalnych DOX i DMPLN)2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych i konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za dotację na sprzęt od Kanadyjskiej Rady Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC) dla HPLC, dotację operacyjną od Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR) i Kanadyjskiego Sojuszu Badań nad Rakiem Piersi (CBCR) dla X.Y. Wu oraz stypendium Uniwersytetu w Toronto dla R.X. Zhanga i T. Zhanga.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Doksorubicyna Polymed Theraeutics111023Lek przeciwnowotworowy
Mitomycyna CPolymed Theraeutics060814Lek przeciwnowotworowy
Doksorubicynol (DOXol)Toronto Research ChemicalsD558020Metabolit
soli sodowej DOX 4-metylumbliferonu Sigma-AldrichM1508Wzorzec wewnętrzny
Kwas mirystynowySigma-Aldrich544-63-8   Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe
Polioksyetylen (100) StearateSpectrumM1402Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe
Polioksyetylen (40) StearynianSigma-AldrichP3440Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe
Pluronic F68 (PF68)BASF Corp.9003-11-6Materiały do hybrydowych nanocząstek polilipidowych
Ultradźwięki (UP100H)Hielscher, Technologia ultradźwiękowaNAPrzygotowanie nanocząstek
Kąpiel wodna (ISOTEMP 3016HS)Fisher ScientificNAPrzygotowanie nanocząstek
Doksorubicyna liposomalna  (Caelyx)JanssenZakupiony w aptece Princess MargaretHospital Klinicznie zatwierdzona formuła nanocząstek 
Metanol klasy HPLCCaledon Chemicals6701-7-40HPLC kompozycja fazy ruchomej
Klasa H2OCaledon Chemicals8801-7-40HPLC kompozycja fazy ruchomej
Acetonitryl klasy HPLC Caledon Chemicals1401-7-40HPLC kompozycja fazy ruchomej
Kwas trifluorooctowySigma-Aldrich302031HPLC skład fazy ruchomej
0,45 μ m Bibuła filtracyjna z membraną nylonowąWhatmanWHA7404004HPLC Przygotowanie fazy mobilnej
1cc Plastikowe strzykawkiBecton, Dickinson and Company2606-309659Wtrysk leczniczy
5cc Plastikowe strzykawkiBecton, Dickinson and Company2608-309646Kolekcje tkanek
Igły 30G 1/2Becton, Dickinson and Company305106Leczenie iniekcyjne
Igły 25G 5/8Becton, Dickinson and Company305122Kolekcje tkanek
Sterylne 0,9% soli fizjologicznejUniwersytet w Toronto Marka House1011Perfuzja tkanek
13 ml Rurka stożkowa z zaokrąglonym dnem SARSTEDT62.515.006Prolyprolen, homogenizacja tkankowa
Alpha Minimum Essential Medium (MEM) Gibco12571063Pożywka komórkowa
1 x Bufor fosforanowy Sól fizjologicznaGibco10010023Homogenizacja tkanek
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 MLHomogenizacja tkanek
Kwas mrówkowyCaledon Chemicals1/5/3840Dostosuj pH dla rozpuszczalnika ekstrakcyjnego
Plastikowe rurki spryskane heparyną sodowąBecton, Dickinson i spółka367878Analityczna waga do pobierania krwi
 Sartorius 
CPA225D pH-metry NA Fisher Scientific13-637-671accumet BASIC
Vortex MixterFisher Scientific02-215-365Wirowanie próbek z żądaną prędkością
1,5 ml  Rurka do mikrowirówekFisherbrand2043-05408129Homogenizator prolyprolenu
Model 1000Fisher Scientific08-451-672Wirówka do homogenizacji tkanek
5702REppendorf5702RPrzygotowanie do ekstrakcji
Podgrzewany system parownikaGlas-ColNARekonstytucja próbki
HPLC Fiolki z gwintemśrubowym DIKMA5320Wtrysk próbki HPLC
Zakrętki HPLC z białym silikonem PTFE SeptaDIKMA5325HPLC wtrysk próbki HPLC
Wkładka polipropylenowa HPLC   Agilent Technologies5182-0549Maksymalna głośność 250 μ l, wstrzyknięcie próbki HPLC
Xbridge C18 KolumnaWaters Corporation186003117Analiza leków
Pompa gradientowa Waters CorporationW600Analiza narkotyków
Auto-samplerWaters CorporationW2707Analiza narkotyków
Detektor matrycy fotodiodowej Waters CorporationW2998Analiza narkotyków
Detektor fluorescencji Multi &lambda Waters CorporationW2475Analiza leków
EMPOWER 2Waters CorporationNAOprogramowanie do analizy danych
NaukowiecMicromathNAAnaliza farmakokinelogiczna
Samice myszy Balb/cLaboratory001026In vivo
EMT6 / WT Komórki raka piersidostarczone przez dr Iana Tannocka; Ontario Cancer InstituteNAIn vivo
Jackson

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 219-234 (2006).
  3. Kong, A. -N. T. Inflammation, Oxidative Stress, and Cancer: Dietary Approaches for Cancer Prevention. Kong, A. .N. .T. ., , CRC Press. Florida, USA. (2013).
  4. Zhang, R. X., Wong, H. L., Xue, H. Y., Eoh, J. Y., Wu, X. Y. Nanomedicine of Synergistic Drug Combinations for Cancer Therapy - Strategies and Perspectives. J Control Release. 240, 489-503 (2016).
  5. Webster, R. M. Combination Therapies in Oncology. Nat. Rev. Drug. Discov. 15 (2), 81-82 (2016).
  6. Waterhouse, D. N., Gelmon, K. A., Klasa, R., Chi, K., Huntsman, D., Ramsay, E., Wasan, E., Edwards, L., Tucker, C., Zastre, J., Wang, Y. Z., Yapp, D., Dragowska, W., Dunn, S., Dedhar, S., Bally, M. B. Development and Assessment of Conventional and Targeted Drug Combinations for Use in the Treatment of Aggressive Breast Cancers. Curr Cancer Drug Targets. 6 (6), 455-489 (2006).
  7. Cancello, G., Bagnardi, V., Sangalli, C., Montagna, E., Dellapasqua, S., Sporchia, A., Iorfida, M., Viale, G., Barberis, M., Veronesi, P., Luini, A., Intra, M., Goldhirsch, A., Colleoni, M. Phase Ii Study with Epirubicin, Cisplatin, and Infusional Fluorouracil Followed by Weekly Paclitaxel with Metronomic Cyclophosphamide as a Preoperative Treatment of Triple-Negative Breast Cancer. Clin Breast Cancer. 15 (4), 259-265 (2015).
  8. Masuda, N., Higaki, K., Takano, T., Matsunami, N., Morimoto, T., Ohtani, S., Mizutani, M., Miyamoto, T., Kuroi, K., Ohno, S., Morita, S., Toi, M. A Phase Ii Study of Metronomic Paclitaxel/Cyclophosphamide/Capecitabine Followed by 5-Fluorouracil/Epirubicin/Cyclophosphamide as Preoperative Chemotherapy for Triple-Negative or Low Hormone Receptor Expressing/Her2-Negative Primary Breast Cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 74 (2), 229-238 (2014).
  9. Carrick, S., Parker, S., Thornton, C. E., Ghersi, D., Simes, J., Wilcken, N. Single Agent Versus Combination Chemotherapy for Metastatic Breast Cancer. Cochrane Database Syst Rev. 15 (2), 003372(2009).
  10. Cardoso, F., Bedard, P. L., Winer, E. P., Pagani, O., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L. J., Kyriakides, S., Costa, A., Cufer, T., Albain, K. S., Force, E. -M. T. International Guidelines for Management of Metastatic Breast Cancer: Combination Vs Sequential Single-Agent Chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 101 (17), 1174-1181 (2009).
  11. Alba, E., Martin, M., Ramos, M., Adrover, E., Balil, A., Jara, C., Barnadas, A., Fernandez-Aramburo, A., Sanchez-Rovira, P., Amenedo, M., Casado, A. Multicenter Randomized Trial Comparing Sequential with Concomitant Administration of Doxorubicin and Docetaxel as First-Line Treatment of Metastatic Breast Cancer: A Spanish Breast Cancer Research Group (Geicam-9903) Phase Iii. J Clinn Oncol. 22 (13), 2587-2593 (2004).
  12. Sadat, S. M., Saeidnia, S., Nazarali, A. J., Haddadi, A. Nano-Pharmaceutical Formulations for Targeted Drug Delivery against Her2 in Breast Cancer. Curr. Cancer Drug Targets. 15 (1), 71-86 (2015).
  13. Devadasu, V. R., Wadsworth, R. M., Ravi Kumar, M. N. V. Tissue Localization of Nanoparticles Is Altered Due to Hypoxia Resulting in Poor Efficacy of Curcumin Nanoparticles in Pulmonary Hypertension. Eur. J. Pharm. Biopharm. 80 (3), 578-584 (2012).
  14. Li, S. D., Huang, L. Pharmacokinetics and Biodistribution of Nanoparticles. Mol. Pharm. 5 (4), 496-504 (2008).
  15. Zhang, R. X., Ahmed, T., Li, L. Y., Li, J., Abbasi, A. Z., Wu, X. Y. Design of Nanocarriers for Nanoscale Drug Delivery to Enhance Cancer Treatment Using Hybrid Polymer and Lipid Building Blocks. Nanoscale. 9 (4), 1334-1355 (2017).
  16. Wang, X., Li, S., Shi, Y., Chuan, X., Li, J., Zhong, T., Zhang, H., Dai, W., He, B., Zhang, Q. The Development of Site-Specific Drug Delivery Nanocarriers Based on Receptor Mediation. J. Control. Release. 193, 139-153 (2014).
  17. Batist, G., Gelmon, K. A., Chi, K. N., Miller, W. H., Chia, S. K., Mayer, L. D., Swenson, C. E., Janoff, A. S., Louie, A. C. Safety, Pharmacokinetics, and Efficacy of Cpx-1 Liposome Injection in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res. 15 (2), 692-700 (2009).
  18. Mayer, L. D., Harasym, T. O., Tardi, P. G., Harasym, N. L., Shew, C. R., Johnstone, S. A., Ramsay, E. C., Bally, M. B., Janoff, A. S. Ratiometric Dosing of Anticancer Drug Combinations: Controlling Drug Ratios after Systemic Administration Regulates Therapeutic Activity in Tumor-Bearing Mice. Mol. Cancer Ther. 5 (7), 1854-1863 (2006).
  19. Prasad, P., Cheng, J., Shuhendler, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Nanoparticle Formulation Overcomes Multiple Types of Membrane Efflux Pumps in Human Breast Cancer Cells. Drug Deliv Transl Res. 2 (2), 95-105 (2012).
  20. Shuhendler, A. J., Cheung, R. Y., Manias, J., Connor, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Doxorubicin-Mitomycin C Co-Encapsulated Nanoparticle Formulation Exhibits Anti-Cancer Synergy in Multidrug Resistant Human Breast Cancer Cells. Breast Cancer Res Treat. 119 (2), 255-269 (2010).
  21. Shuhendler, A. J., O'Brien, P. J., Rauth, A. M., Wu, X. Y. On the Synergistic Effect of Doxorubicin and Mitomycin C against Breast Cancer Cells. Drug Metabol. Drug Interact. 22 (4), 201-233 (2007).
  22. Zhang, R. X., Cai, P., Zhang, T., Chen, K., Li, J., Cheng, J., Pang, K. S., Adissu, H. A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Synchronize Pharmacokinetics of Co-Encapsulated Doxorubicin-Mitomycin C and Enable Their Spatiotemporal Co-Delivery and Local Bioavailability in Breast Tumor. Nanomedicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
  23. Zhang, T., Prasad, P., Cai, P., He, C., Shan, D., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Dual-Targeted Hybrid Nanoparticles of Synergistic Drugs for Treating Lung Metastases of Triple Negative Breast Cancer in Mice. Acta Pharmacol Sin. , 1-13 (2017).
  24. Shuhendler, A. J., Prasad, P., Zhang, R. X., Amini, M. A., Sun, M., Liu, P. P., Bristow, R. G., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Synergistic Nanoparticulate Drug Combination Overcomes Multidrug Resistance, Increases Efficacy, and Reduces Cardiotoxicity in a Nonimmunocompromised Breast Tumor Model. Mol Pharm. 11 (8), 2659-2674 (2014).
  25. Prasad, P., Shuhendler, A., Cai, P., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Doxorubicin and Mitomycin C Co-Loaded Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Inhibit Growth of Sensitive and Multidrug Resistant Human Mammary Tumor Xenografts. Cancer Lett. 334 (2), 263-273 (2013).
  26. Rafiei, P., Michel, D., Haddadi, A. Application of a Rapid Esi-Ms/Ms Method for Quantitative Analysis of Docetaxel in Polymeric Matrices of Plga and Plga-Peg Nanoparticles through Direct Injection to Mass Spectrometer. Am. J. Anal. Chem. 6 (2), 164-175 (2015).
  27. Daeihamed, M., Haeri, A., Dadashzadeh, S. A Simple and Sensitive Hplc Method for Fluorescence Quantitation of Doxorubicin in Micro-Volume Plasma: Applications to Pharmacokinetic Studies in Rats. Iran. J. Pharm. Res. 14, Suppl 33-42 (2015).
  28. Alhareth, K., Vauthier, C., Gueutin, C., Ponchel, G., Moussa, F. Hplc Quantification of Doxorubicin in Plasma and Tissues of Rats Treated with Doxorubicin Loaded Poly(Alkylcyanoacrylate) Nanoparticles. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 887-888, 128-132 (2012).
  29. Al-Abd, A. M., Kim, N. H., Song, S. C., Lee, S. J., Kuh, H. J. A Simple Hplc Method for Doxorubicin in Plasma and Tissues of Nude Mice. Arch Pharm Res. 32 (4), 605-611 (2009).
  30. Loadman, P. M., Calabrese, C. R. Separation Methods for Anthraquinone Related Anti-Cancer Drugs. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 764 (1-2), 193-206 (2001).
  31. Zhang, Z. D., Guetens, G., De Boeck, G., Van Cauwenberghe, K., Maes, R. A., Ardiet, C., van Oosterom, A. T., Highley, M., de Bruijn, E. A., Tjaden, U. R. Simultaneous Determination of the Peptide-Mitomycin Kw-2149 and Its Metabolites in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 739 (2), 281-289 (2000).
  32. Alvarez-Cedron, L., Sayalero, M. L., Lanao, J. M. High-Performance Liquid Chromatographic Validated Assay of Doxorubicin in Rat Plasma and Tissues. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 721 (2), 271-278 (1999).
  33. Paroni, R., Arcelloni, C., De Vecchi, E., Fermo, I., Mauri, D., Colombo, R. Plasma Mitomycin C Concentrations Determined by Hplc Coupled to Solid-Phase Extraction. Clin. Chem. 43 (4), 615-618 (1997).
  34. Song, D., Au, J. L. Direct Injection Isocratic High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Mitomycin C in Plasma. J Chromatogr B Biomed Appl. 676 (1), 165-168 (1996).
  35. Schrijvers, D. Role of Red Blood Cells in Pharmacokinetics of Chemotherapeutic Agents. Clin. Pharmacokinet. 42 (9), 779-791 (2003).
  36. Colombo, T., Broggini, M., Garattini, S., Donelli, M. G. Differential Adriamycin Distribution to Blood Components. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 6 (2), 115-122 (1981).
  37. Maeda, H., Nakamura, H., Fang, J. The Epr Effect for Macromolecular Drug Delivery to Solid Tumors: Improvement of Tumor Uptake, Lowering of Systemic Toxicity, and Distinct Tumor Imaging in Vivo. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (1), 71-79 (2013).
  38. Gustafson, D. L., Rastatter, J. C., Colombo, T., Long, M. E. Doxorubicin Pharmacokinetics: Macromolecule Binding, Metabolism, and Excretion in the Context of a Physiologic Model. J. Pharm. Sci. 91 (6), 1488-1501 (2002).
  39. Gabizon, A., Shiota, R., Papahadjopoulos, D. Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Doxorubicin Encapsulated in Stable Liposomes with Long Circulation Times. J. Natl. Cancer Inst. 81 (19), 1484-1488 (1989).
  40. Motlagh, N. S., Parvin, P., Ghasemi, F., Atyabi, F. Fluorescence Properties of Several Chemotherapy Drugs: Doxorubicin, Paclitaxel and Bleomycin. Biomed Opt Express. 7 (6), 2400-2406 (2016).
  41. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a Molecular Nanotheranostic Agent: Effect of Doxorubicin Encapsulation in Micelles or Nanoemulsions on the Ultrasound-Mediated Intracellular Delivery and Nuclear Trafficking. Mol Pharm. 7 (6), 1959-1973 (2010).
  42. Cielecka-Piontek, J., Jelińska, A., Zając, M., Sobczak, M., Bartold, A., Oszczapowicz, I. A Comparison of the Stability of Doxorubicin and Daunorubicin in Solid State. J. Pharm. Biomed Anal. 50 (4), 576-579 (2009).
  43. Gilbert, C. M., McGeary, R. P., Filippich, L. J., Norris, R. L. G., Charles, B. G. Simultaneous Liquid Chromatographic Determination of Doxorubicin and Its Major Metabolite Doxorubicinol in Parrot Plasma. J. chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life sci. 826 (1-2), 273-276 (2005).
  44. Liu, Z. S., Li, Y. M., Jiang, S. X., Chen, L. R. Direct Injection Analysis of Mitomycin C in Biological Fluids by Multidemension High Performance Liquid Chromatography with a Micellar Mobile Phase. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 19 (8), 1255-1265 (1996).
  45. Zhou, Y., He, C., Chen, K., Ni, J., Cai, Y., Guo, X., Wu, X. Y. A New Method for Evaluating Actual Drug Release Kinetics of Nanoparticles inside Dialysis Devices Via Numerical Deconvolution. J. Control. Release. 243, 11-20 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Doxorubicin Mitomycin CHPLC QuantitationDrug Combination AnalysisNanoparticle Drug DeliveryReverse Phase HPLCBiological Matrix ExtractionInternal Standard MethodSimultaneous Drug DetectionPharmacokinetics StudyTumor Tissue Analysis

Related Articles