Method Article

Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem

DOI:

10.3791/56159

⸱

October 5th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje efektywny i wygodny proces analityczny pobierania próbek i jednoczesnego oznaczania wielu leków, doksorubicyny (DOX), mitomycyny C (MMC) i kardiotoksycznego metabolitu DOX, doksorubicyny (DOXol), w próbkach biologicznych z przedklinicznego modelu guza piersi traktowanego preparatami nanocząsteczkowymi synergicznego połączenia leków.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemioterapia skojarzona jest często stosowana w klinice w leczeniu raka; jednak związane z nią działania niepożądane na normalną tkankę mogą ograniczyć jej korzyści terapeutyczne. Wykazano, że kombinacja leków oparta na nanocząsteczkach łagodzi problemy napotykane podczas terapii skojarzonej z bezpłatnymi lekami. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że połączenie dwóch leków przeciwnowotworowych, doksorubicyny (DOX) i mitomycyny C (MMC), wywołało efekt synergiczny zarówno przeciwko mysim, jak i ludzkim komórkom raka piersi in vitro. Hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe (DMPLN) z jednoczesnym obciążeniem DOX i MMC ominęły różne pompy transportera wypływu, które nadają oporność wielolekową, i wykazały zwiększoną skuteczność w modelach guzów piersi. W porównaniu z konwencjonalnymi formami roztworów, tak wyższą skuteczność DMPLN przypisano zsynchronizowanej farmakokinetyce DOX i MMC oraz zwiększonej wewnątrzkomórkowej biodostępności leku w komórkach nowotworowych, co umożliwił nanonośnik PLN.

Aby ocenić farmakokinetykę i biodystrybucję jednocześnie podawanych DOX i MMC zarówno w postaci wolnego roztworu, jak i nanocząstek, opracowano prostą i efektywną metodę analizy wielolekowej wykorzystującą wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) z odwróconymi fazami. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, które analizowały DOX lub MMC indywidualnie w osoczu, ta nowa metoda HPLC jest w stanie jednocześnie określić ilościowo DOX, MMC i główny kardiotoksyczny metabolit DOX, doksorubicynol (DOXol), w różnych matrycach biologicznych (np. Krew pełna, guz piersi i serce). Podwójna sonda fluorescencyjna i absorbująca promieniowanie ultrafioletowe, 4-metylolumbelliferon (4-MU), została użyta jako wzorzec wewnętrzny (IS) do jednoetapowego wykrywania wielu analiz leków o różnych długościach fal detekcji. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do określenia stężeń DOX i MMC dostarczanych zarówno przez nanocząstki, jak i roztwory w pełnej krwi i różnych tkankach w ortotopowym mysim modelu guza piersi. Przedstawiona metoda analityczna jest użytecznym narzędziem do analizy przedklinicznej dostarczania kombinacji leków na podstawie nanocząstek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemioterapia jest podstawową metodą leczenia wielu nowotworów, jednak często wiąże się z poważnymi działaniami niepożądanymi i ograniczoną skutecznością z powodu oporności na leki i innych czynników1,2,3. Aby poprawić wyniki chemioterapii, w klinice zastosowano schematy kombinacji leków w oparciu o takie czynniki, jak nienakładające się na siebie toksyczności, różne mechanizmy działania leków i niekrzyżowa oporność na leki4,5,6. W badaniach klinicznych często obserwowano lepszy wska....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia w Ontario Cancer Institute i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Przygotowanie próbki biologicznej

  1. Pobrać krew pełną, główne narządy i guz piersi w określonych punktach czasowych po dożylnym (iv) podaniu preparatów zawierających leki (np. DMPLN, liposomalny DOX)
    1. Wstrzyknąć dożylnie myszy z guzem piersi przygotowany preparat zawierający lek.
    2. Znieczulić mysz w wyznaczonych punktach czasowych (np. 1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwa leki przeciwnowotworowe, DOX i MMC, a także metabolit DOX, DOXol, zostały wykryte jednocześnie bez żadnej ingerencji biologicznej w tych samych warunkach gradientowych HPLC przy użyciu 4-MU jako I.S. zarówno dla detektorów fluorescencji, jak i UV. DOX, MMC, DOXol i 4-MU były od siebie dobrze oddzielone, a czasy retencji wynosiły 5,7 minuty dla MMC, 10,4 minuty dla DOXol, 10,9 minuty dla 4-MU i 11,1 minuty dla DOX (Rysunek 2). Każdy lek w pełnej krwi i różnych tkank.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu z innymi metodami chromatograficznymi, które umożliwiają wykrywanie pojedynczego gatunku leku na raz, obecny protokół HPLC jest w stanie jednocześnie oznaczać ilościowo trzy związki leków (DOX, MMC i DOXol) w tej samej matrycy biologicznej bez konieczności zmiany fazy ruchomej. Ta metoda przygotowania i analizy została z powodzeniem zastosowana do określenia farmakokinetyki i biodystrybucji dwóch systemów dostarczania leków opartych na nanocząstkach (tj. liposomalnych DOX i DMPLN)2.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych i konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za dotację na sprzęt od Kanadyjskiej Rady Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC) dla HPLC, dotację operacyjną od Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR) i Kanadyjskiego Sojuszu Badań nad Rakiem Piersi (CBCR) dla X.Y. Wu oraz stypendium Uniwersytetu w Toronto dla R.X. Zhanga i T. Zhanga.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Doksorubicyna Polymed Theraeutics111023Lek przeciwnowotworowy
Mitomycyna CPolymed Theraeutics060814Lek przeciwnowotworowy
Doksorubicynol (DOXol)Toronto Research ChemicalsD558020Metabolit
soli sodowej DOX 4-metylumbliferonu Sigma-AldrichM1508Wzorzec wewnętrzny
Kwas mirystynowySigma-Aldrich544-63-8   Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe
Polioksyetylen (100) StearateSpectrumM1402Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe
Polioksyetylen (40) StearynianSigma-AldrichP3440Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe
Pluronic F68 (PF68)BASF Corp.9003-11-6Materiały do hybrydowych nanocząstek polilipidowych
Ultradźwięki (UP100H)Hielscher, Technologia ultradźwiękowaNAPrzygotowanie nanocząstek
Kąpiel wodna (ISOTEMP 3016HS)Fisher ScientificNAPrzygotowanie nanocząstek
Doksorubicyna liposomalna  (Caelyx)JanssenZakupiony w aptece Princess MargaretHospital Klinicznie zatwierdzona formuła nanocząstek 
Metanol klasy HPLCCaledon Chemicals6701-7-40HPLC kompozycja fazy ruchomej
Klasa H2OCaledon Chemicals8801-7-40HPLC kompozycja fazy ruchomej
Acetonitryl klasy HPLC Caledon Chemicals1401-7-40HPLC kompozycja fazy ruchomej
Kwas trifluorooctowySigma-Aldrich302031HPLC skład fazy ruchomej
0,45 μ m Bibuła filtracyjna z membraną nylonowąWhatmanWHA7404004HPLC Przygotowanie fazy mobilnej
1cc Plastikowe strzykawkiBecton, Dickinson and Company2606-309659Wtrysk leczniczy
5cc Plastikowe strzykawkiBecton, Dickinson and Company2608-309646Kolekcje tkanek
Igły 30G 1/2Becton, Dickinson and Company305106Leczenie iniekcyjne
Igły 25G 5/8Becton, Dickinson and Company305122Kolekcje tkanek
Sterylne 0,9% soli fizjologicznejUniwersytet w Toronto Marka House1011Perfuzja tkanek
13 ml Rurka stożkowa z zaokrąglonym dnem SARSTEDT62.515.006Prolyprolen, homogenizacja tkankowa
Alpha Minimum Essential Medium (MEM) Gibco12571063Pożywka komórkowa
1 x Bufor fosforanowy Sól fizjologicznaGibco10010023Homogenizacja tkanek
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 MLHomogenizacja tkanek
Kwas mrówkowyCaledon Chemicals1/5/3840Dostosuj pH dla rozpuszczalnika ekstrakcyjnego
Plastikowe rurki spryskane heparyną sodowąBecton, Dickinson i spółka367878Analityczna waga do pobierania krwi
 Sartorius 
CPA225D pH-metry NA Fisher Scientific13-637-671accumet BASIC
Vortex MixterFisher Scientific02-215-365Wirowanie próbek z żądaną prędkością
1,5 ml  Rurka do mikrowirówekFisherbrand2043-05408129Homogenizator prolyprolenu
Model 1000Fisher Scientific08-451-672Wirówka do homogenizacji tkanek
5702REppendorf5702RPrzygotowanie do ekstrakcji
Podgrzewany system parownikaGlas-ColNARekonstytucja próbki
HPLC Fiolki z gwintemśrubowym DIKMA5320Wtrysk próbki HPLC
Zakrętki HPLC z białym silikonem PTFE SeptaDIKMA5325HPLC wtrysk próbki HPLC
Wkładka polipropylenowa HPLC   Agilent Technologies5182-0549Maksymalna głośność 250 μ l, wstrzyknięcie próbki HPLC
Xbridge C18 KolumnaWaters Corporation186003117Analiza leków
Pompa gradientowa Waters CorporationW600Analiza narkotyków
Auto-samplerWaters CorporationW2707Analiza narkotyków
Detektor matrycy fotodiodowej Waters CorporationW2998Analiza narkotyków
Detektor fluorescencji Multi &lambda Waters CorporationW2475Analiza leków
EMPOWER 2Waters CorporationNAOprogramowanie do analizy danych
NaukowiecMicromathNAAnaliza farmakokinelogiczna
Samice myszy Balb/cLaboratory001026In vivo
EMT6 / WT Komórki raka piersidostarczone przez dr Iana Tannocka; Ontario Cancer InstituteNAIn vivo
Jackson

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Doxorubicin Mitomycin CHPLC QuantitationDrug Combination AnalysisNanoparticle Drug DeliveryReverse Phase HPLCBiological Matrix ExtractionInternal Standard MethodSimultaneous Drug DetectionPharmacokinetics StudyTumor Tissue Analysis

Related Articles