Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje ogólne podejście do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do uprawy mikrobiologicznej. Jest to możliwe dzięki iteracyjnemu procesowi pracy, łączącemu eksperymentalny projekt oparty na Krigingu i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, która jest wspierana przez robotykę laboratoryjną w celu zwiększenia niezawodności i szybkości przygotowywania pożywek do pracy z cieczami.

Streszczenie

Podstawową działalnością w biotechnologii przemysłowej wykorzystującej fabryki komórek do produkcji mikroorganizmów jest iteracyjny proces inżynierii szczepów i optymalizacji warunków bioprocesowych. Jednym z ważnych aspektów jest ulepszenie podłoża uprawowego, aby zapewnić optymalne środowisko do tworzenia się mikroorganizmów w produkcie będącym przedmiotem zainteresowania. Powszechnie przyjmuje się, że skład pożywki może znacząco wpłynąć na ogólną wydajność bioprocesu. Wiadomo, że optymalizacja pożywek poprawia produkcję białek rekombinowanych z układami mikrobiologicznymi, a zatem jest to satysfakcjonujący krok w rozwoju bioprocesów. Jednak bardzo często standardowe receptury pożywek są zaczerpnięte z literatury, ponieważ indywidualne projektowanie podłoża uprawowego jest żmudnym zadaniem, które wymaga technologii mikrobioreaktorów w celu zapewnienia wystarczającej przepustowości uprawy, szybkiej analizy produktu, a także wsparcia ze strony robotyki laboratoryjnej, aby zapewnić niezawodność na etapach obsługi cieczy. Ponadto zaawansowane metody matematyczne są niezbędne do racjonalnej analizy danych pomiarowych i efektywnego projektowania równoległych eksperymentów, takich jak osiągnięcie optymalnej zawartości informacji.

Ogólny charakter prezentowanego protokołu pozwala na łatwą adaptację do różnych urządzeń laboratoryjnych, innych gospodarzy ekspresji i docelowych białek będących przedmiotem zainteresowania, a także do dalszych parametrów bioprocesu. Co więcej, inne cele optymalizacyjne, takie jak tempo produkcji białka, określony plon lub jakość produktu, można wybrać tak, aby pasowały do zakresu innych badań optymalizacyjnych. Applied Kriging Toolbox (KriKit) jest ogólnym narzędziem do projektowania eksperymentów (DOE), które przyczynia się do poprawy holistycznej optymalizacji bioprocesów. Obsługuje również optymalizację wielozadaniową, co może być ważne w optymalizacji zarówno procesów poprzedzających, jak i następczych.

Wprowadzenie

Nowoczesna technologia rekombinowanych genów umożliwia szerokie zastosowanie enzymów technicznych do różnych zastosowań w przemyśle farmaceutycznym, żywieniu zwierząt, chemii organicznej i przetwórstwie spożywczym^1,2,3. Produkcja enzymów technicznych w ilościach hurtowych jest głównym tematem biotechnologii przemysłowej i zoptymalizowanej produkcji białek rekombinowanych, a potrzebna jest zarówno inżynieria szczepów, jak i bioprocesów. Do generowania efektywnie modyfikowanych szczepów produkcyjnych dostępne są różne biblioteki genetyczne, np. dla zrównoważonej ekspresji genów⁴ lub zwiększonej wydajności wydzielania⁵.

Corynebacterium glutamicum jest głównym producentem aminokwasów na skalę przemysłową^6,7 i stanowi atrakcyjną, niekonwencjonalną ekspresję do produkcji wydzielniczej rekombinowanych białek^8,9. Zarówno szlak wydzielniczy ogólny (Sec), jak i translokacja podwójnej argininy (Tat) są obecne w C. glutamicum i zostały z powodzeniem zastosowane do rekombinowanego wydzielania białek¹⁰. Bogate doświadczenie w inżynierii bioprocesowej dotyczącej produkcji aminokwasów na skalę przemysłową, a także zdolność do wydzielania białek w ilości g/L¹¹ oraz duża odporność na niejednorodności bioprocesów występujące w uprawach na dużą skalę^12,13, sprawiają, że C. glutamicum jest obiecującym organizmem platformowym do produkcji wydzielniczej białek heterologicznych na skalę przemysłową.

Optymalizacja podłoża odżywczego jest znana z poprawy produkcji białek rekombinowanych z systemami mikrobiologicznymi^14,15,16,17 i w związku z tym, dostosowanie składu podłoża jest satysfakcjonującym krokiem w rozwoju bioprocesów w odniesieniu do optymalnej produktywności^18,19,20,21. Intensywne badania nad zastosowaniem płytek mikromiareczkowych (MTP) do hodowli drobnoustrojów^22,23,24 utorowały drogę do opracowania i zaprojektowania MTP do hodowli mikroorganizmów^25,26 oraz rozwój systemów mikrobioreaktorów (MBR) opartych na MTP z monitorowaniem online i kontrolą środowiska^27,28. MBR umożliwiają znaczne zwiększenie wydajności upraw eksperymentalnych. Poza tym systemy MBR wywodzące się z innych typów bioreaktorów, np. kolumn bąbelkowych lub reaktorów zbiornikowych z mieszadłem, są dostępne do optymalizacji bioprocesów mikrobiologicznych^29,30,31,32.

Ogólnie, badania optymalizacyjne korzystają ze zwiększonej przepustowości eksperymentalnej, która staje się jeszcze bardziej potężna w połączeniu z metodologiami DOE, takimi jak ocena interakcji między zmiennymi projektowymi lub redukcja wielowymiarowych przestrzeni wyszukiwania. W związku z tym połączone zastosowanie systemów MBR, automatyzacji laboratorium i DOE okazało się potężną metodą w biotechnologii^{8,16,33,34,35}.

Prezentowany jest protokół do optymalizacji mediów, łączący najnowocześniejszą automatyzację laboratorium, technologię MBR z monitorowaniem procesów online oraz analizę danych / projektowanie eksperymentalne oparte na Krigingu. Metodologia Kriging jest zaimplementowana w MATLAB Toolbox ("KriKit"), który można pobrać i używać bezpłatnie³⁶. Jako przykład zastosowania pokazano maksymalizację produkcji wydzielniczego białka zielonej fluorescencji (GFP) z C. glutamicum poprzez optymalizację składu minimalnej pożywki CgXII. Miano GFP zostało wybrane jako cel optymalizacji, ponieważ można je łatwo określić ilościowo i jest szeroko stosowane jako białko modelowe do badań nad systemami MBR^37,38,39.

Przedstawiony framework jest podzielony na cztery kroki, które są zilustrowane na rysunku 1. Kroki są oznaczone ramkami ramek i odpowiadają sekcjom protokołu. Pierwszym krokiem (rys. 1A) jest zdefiniowanie celów projektu i określenie wymaganych metod. Połączenie metodologii DOE, technologii MBR i automatyzacji laboratoryjnej pozwala na zwiększenie przepustowości eksperymentalnej, która wymaga wydajnego przetwarzania danych. Drugi krok (rysunek 1B) ma na celu wykrycie wrażliwych zmiennych projektowych (tj. średnich komponentów) o dużym wpływie na cel optymalizacji. Prowadzi to do zmniejszenia liczby zmiennych projektowych będących przedmiotem zainteresowania. Trzeci krok (rysunek 1C) obejmuje iteracyjną optymalizację w celu bardziej szczegółowego zbadania relacji funkcjonalnej między pozostałymi zmiennymi projektowymi a celem zainteresowania. Korzystając z sukcesywnie rozszerzanego zbioru danych, stosuje się podejście Kriginga do przewidywania wyniku eksperymentu w niemierzonych lokalizacjach. Cykl iteracyjny zatrzymuje się, gdy tylko model Kriginga przewidzi optimum lub plateau z wystarczającą dokładnością. Wyniki są weryfikowane w czwartym kroku (rysunek 1D), rozpoczynając od dalszej analizy wrażliwości wokół zidentyfikowanego optimum. Jeśli początkowo okaże się, że niewrażliwe komponenty są niewrażliwe również w optymalnym regionie, rozsądnie jest założyć, że jest to prawdą podczas iteracyjnej procedury optymalizacji w trzecim kroku. Następnie zaleca się weryfikację wyników optymalizacji poprzez zastosowanie metod ortogonalnych, takich jak test aktywności lub SDS-Page.

Ogólny charakter prezentowanego protokołu pozwala na łatwą adaptację do różnych urządzeń laboratoryjnych, innych gospodarzy ekspresji i wybranych białek docelowych, a także do dalszych zmiennych bioprocesowych, takich jak wartość pH czy temperatura uprawy. Ponadto inne cele optymalizacyjne, takie jak tempo produkcji białka, określony uzysk lub jakość produktu, można wybrać tak, aby pasowały do zakresu innych badań optymalizacyjnych.

Figure 1: Workflow badania optymalizacyjnego. Cztery ramki odpowiadają sekcjom protokołu: "Opracowanie badania i definicja metod" (sekcja 1), "Analiza wrażliwości" (sekcja 2), "Optymalizacja iteracyjna" (sekcja 3) i "Walidacja" (sekcja 4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Opracowanie badania i definicja metod (Rysunek 1: Część A)

UWAGA: Definicja celu optymalizacji: Czy potrzebny jest przebieg czasowy powstawania produktu, czy też istotny jest tylko ograniczony przedział czasowy lub nawet ustalony punkt czasowy? Weź również pod uwagę potencjalne problemy, takie jak stabilność, wysiłek związany z analityczną kwantyfikacją lub czas uprawy. Jako alternatywę dla końcowego miana białka można rozważyć inne cele, takie jak biomasa lub czas uprawy. Biomasa jest odzwierciedlana przez specyficzny dla biomasy plon produktu, podczas gdy czas uprawy jest odzwierciedlany przez plon czasoprzestrzenny. Celem może być również (minimalna) jakość produktu. W niektórych sytuacjach może być wymagana optymalizacja wielozadaniowa, jak omówiono w innym miejscu⁴⁰. W tym badaniu jako cel optymalizacji wybrano miano GFP po 17 godzinach uprawy. Fluorescencję GFP można śledzić online za pomocą sprzętu dostępnego w tym badaniu, co znacznie upraszcza określanie stężenia białka modelowego.
UWAGA: Definicja parametrów, które mają być optymalizowane: Pożywka CgXII składa się z 16 pojedynczych komponentów⁴¹, a zbadanie ich wszystkich w pełnym projekcie czynnikowym zaowocowałoby 2¹⁶ ≈ 65 000 eksperymentów. W związku z tym przestrzeń wyszukiwania musi być redukowana w sposób racjonalny i oparty na doświadczeniu. Dobór komponentów mediów branych pod uwagę pod kątem optymalizacji może być poparty dostępną wiedzą ekspercką lub danymi literaturowymi.

1. Zdecyduj, które stężenia składników pożywki nie powinny być zmieniane. W celu optymalizacji podłoża CgXII wybrano następujące komponenty do naprawy:
   1. Stężenie glukozy ustala się na poziomie 10 g/l. Ta optymalizacja jest trywialna, ponieważ więcej glukozy daje więcej biomasy wydzielającej GFP. Celem było ujawnienie nieintuicyjnych efektów medium.
   2. Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS) utrwala się na poziomie 42 g/l. Zapewnia to wystarczającą pojemność buforową podczas uprawy okresowej i nie jest metabolizowane.
      UWAGA: Dodanie MOPS w tym końcowym stężeniu zapewnia wartość początkową pH 7, nawet przy różnych objętościach dodanych innych roztworów podstawowych, które nie mają pH 7. Jednakże, aby wykluczyć jakiekolwiek odchylenia w początkowych wartościach pH, pH powinno być sprawdzane dla kompozycji pożywek, w których wszystkie roztwory podstawowe są dodawane w ich maksymalnych i minimalnych objętościach.
   3. KH₂PO₄ i K₂HPO₄ są ustalone na poziomie 1 g/L każdy. Zapewniają one również zdolność buforową i służą jako źródło fosforanów.
   4. Mocznik ustala się na poziomie 5 g/l. Służy jako podstawowe źródło azotu i środek stabilizujący pH, wystarczający, aby zapobiec ograniczeniu azotu.
   5. Biotyna jest utrwalona na poziomie 0,2 mg/L. C. glutamicum ATCC13032 jest auksotrofem biotyny.
   6. Kwas protokatechowy (PCA) jest wiązany na poziomie 30 mg/l. Służy jako środek chelatujący żelazo.
   7. Izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) utrwala się na poziomie 100 μM. Indukuje ekspresję genu gfp.
2. Wybierz wysokie i niskie stężenia składników pożywki do wstępnych badań przesiewowych czułości. W tym przypadku wybrano komponenty z trzech typowych grup komponentów mediów. Badane niskie i wysokie stężenia dla każdego składnika to:
   1. Standardowe źródło azotu: (NH₄)₂SO₄ (8-32 g/L); zmienność źródła azotu została uznana za obiecującą dla optymalizacji sygnału GFP specyficznego dla biomasy⁸.
   2. Pierwiastki śladowe: FeSO₄ ∙ 7 H₂O (4-16 mg/L), MnSO₄ ∙ H₂O (4-16 mg/L), ZnSO₄ ∙ 7 H₂O (0,4-1,6 mg/L), CuSO₄ ∙ 5 H₂O (125-501 μg/L), NiCl₂ ∙ 6 H₂O (8-32 μg/L) i CoCl₂ ∙ 6 H₂O (52-208 μg/L). Skład pierwiastków śladowych jest dziedziczony po pierwszej publikacji CgXII medium⁴¹. Ponadto jako pierwiastki śladowe włączono Na₂MoO₄ ∙ H₂O (26-104 μg/L) i H₃BO₃ (20-80 μg/L), ponieważ są one używane w opublikowanym wariancie CgXII medium⁴².
   3. Makroelementy: MgSO₄ ∙ 7 H₂O (0,2-0,4 g/L), CaCl₂ ∙ 2 H₂O (5,3-21,2 mg/L). Znaleziono je wśród innych dwuwartościowych kationów w celu zwiększenia produkcji wydzielniczej GFP w innym badaniu¹⁴, w którym zastosowano szczep R C. glutamicum z innym tłem podłoża i peptydem sygnałowym Tat CgR0949.
3. Przygotowanie materiałów i procedury definicji
   UWAGA: Zaleca się zdefiniowanie i utrwalenie metod eksperymentalnych na poziomie szczegółowym. Ta standaryzacja zapewnia, że różne wyniki można prześledzić wstecz do wewnętrznej zmienności biologicznej lub różnych składów pożywki.
   UWAGA: Roztwory podstawowe dla pożywki: Przygotuj indywidualne roztwory podstawowe dla wszystkich badanych składników pożywki. Przygotować wysoce skoncentrowane zapasy, aby umożliwić rozcieńczenie różnych objętości dla wszystkich składników. Oznacza to, że po połączeniu wszystkich roztworów podstawowych w ich największej objętości zgodnie z planem projektowym, nie może ona przekroczyć końcowej objętości uprawy, por. punkt "Generowanie listy pipetowania roztworów podstawowych średnia", krok 1.3.3. Jeżeli dodanie roztworu o wysokim stężeniu powoduje bardzo małą objętość dodawania, np. < 1/100 końcowej objętości uprawy, należy odpowiednio rozcieńczyć roztwór podstawowy. Na przykład w tym badaniu uznano, że objętość pipetowania mniejsza niż 10 μl jest niewykonalna. Zazwyczaj roztwory pierwiastków śladowych są zagęszczane nawet 1000-krotnie w stosunku do końcowego stężenia wzorcowego w pożywce. Korzystne jest zagęszczenie składników pożywki jako wielokrotności (X-krotnie) w odniesieniu do stężeń w recepturze referencyjnej. W ten sposób unika się niewykonalnego pipetowania objętości ułamków dziesiętnych. Szczegółowe receptury dla wszystkich roztworów podstawowych pożywki CgXII znajdują się w dokumencie dodatkowym.
   1. Bank komórek roboczych (WCB)
      Uwaga: W każdym eksperymencie wzrostu używana jest jedna podwielokrotność WCB. Jeśli potrzeba więcej porcji, należy użyć 100 ml pożywki do infuzji mózgu i serca (BHI) w 1000 ml kolbach do wytrząsania z przegrodami lub zaszczepić kilka kolb do wytrząsania, które są łączone przed dodaniem roztworu glicerolu.
      1. Przygotować pojedyncze kolonie rekombinowanego szczepu ekspresyjnego C. glutamicum pCGPhoD^Bs-GFP43 na płytkach agarowych (37 g/L proszku BHI, 20 g/L agar, 25 mg/L kanamycyny). Materiał galwaniczny może pochodzić ze świeżej przemiany lub z kriokonserwowanej podwielokrotności. Inkubować w temperaturze 30 °C aż do pojawienia się pojedynczych kolonii; Trwa to zwykle od jednego do dwóch dni.
      2. Zaszczepić kulturę w kolbie wytrząsającej (50 ml pożywki BHI z 25 mg/l kanamycyny, 500 ml kolby z przegrodami, 250 obr./min, średnica wytrząsania 25 mm, 30 °C) materiałem kolonijnym i inkubować przez noc (około 16 godzin).
      3. Połączyć jedną objętość otrzymanej zawiesiny komórek z jedną objętością 500 g/l sterylnego roztworu glicerolu i rozprowadzić w 2 ml podwielokrotności w sterylnych fiolkach do krioprezerwacji. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
   2. Protokół uprawy MBR
      Uwaga: W przypadku systemu MBR BioLector w tym badaniu, światło rozproszone (biomasa) i fluorescencja GFP są pomiarami intensywności, które wymagają przypisania określonej wartości wzmocnienia. Im wyższe wzmocnienie, tym wyżej wzmacniany jest sygnał optyczny; Z tego też powodu światło rozproszone i fluorescencja są mierzone w dowolnych jednostkach (a.u.). Określ odpowiednie wartości wzmocnienia do wykrywania biomasy i GFP we wstępnych eksperymentach, wraz z odpowiednią częstotliwością wytrząsania i objętością napełniania, aby uniknąć ograniczenia tlenu przy wyższych stężeniach biomasy na późniejszych etapach procesu. Zastosowane warunki uprawy ("Flowerplates", czyli 48-dołkowe MTP w kształcie kwiatów, częstotliwość wytrząsania 1 200 obr./min, objętość napełnienia 1 000 μl, 10 g/l glukozy jako główne źródło węgla) zapewniły nieograniczone uprawy tlenowe. Aby uzyskać informacje na temat maksymalnych szybkości transferu tlenu wynikających z innych kombinacji objętości napełniania i częstotliwości wytrząsania w 48-dołkowych MTP w kształcie kwiatów, dostępne są karty katalogowe dostawcy. Mogą również wystąpić wady wzrostu poszczególnych kultur z powodu małej ilości substratów wtórnych (np. azotu, pierwiastków śladowych). W związku z tym należy sprawdzić stężenie biomasy pod koniec uprawy. W tym badaniu nie zaobserwowano takich efektów wzrostu.
      1. Zdefiniuj protokół uprawy dla systemu MBR ("BioLector") w następujący sposób:
      2. Zestaw filtrów 1: Biomasa, zysk 14. Zestaw filtrów 2: pH, wzmocnienie jest ustawione. Zestaw filtrów 3: pO2, wzmocnienie jest ustawione. 4: GFP, wzmocnienie 80.
      3. Częstotliwość wytrząsania: 1 200 obr./min.
      4. Temperatura: 30 °C.
      5. Czas cyklu: 15 min.
      6. Czas eksperymentu: ręczny (uprawa nie zostanie automatycznie zatrzymana).
   3. Generowanie listy pipetowania roztworów średnio-podstawowych
      Uwaga: Prawie każdy system robota do obsługi cieczy jest w stanie odczytać operacje pipetowania z plików zewnętrznych. Zasadniczo minimalna ilość potrzebnych informacji to objętość transferu i położenie źródła odczynnika, a także miejsce przeznaczenia każdego z nich, reprezentowane przez pozycję sprzętu laboratoryjnego na pokładzie robota i określoną wnękę w sprzęcie laboratoryjnym. Należy jednak wziąć pod uwagę różne składnie dla różnych systemów obsługi cieczy. Rysunek 2 pokazuje przykładową strukturę plików dla systemu pipetowania zastosowanego w tym badaniu.
      1. Do każdej studzienki uprawowej pipetuje się cztery rodzaje roztworów podstawowych:
         1. Roztwory podstawowe składników pożywki, które są zróżnicowane ("Zapasy wariantowe").
         2. Woda w celu skompensowania różnych skumulowanych objętości powyższych stad.
         3. Roztwór podstawowy ("Rest Stock") zawierający wszystkie składniki, które są stałe. Ten roztwór podstawowy może być skomponowany z zapasów zawierających różne składniki, które są np. przechowywane w różnych temperaturach lub sterylizowane różnymi metodami.
         4. Inokulum, które należy dodać jako ostatni składnik i umieścić na stole roboczym tuż przed dodaniem, aby uniknąć osiadania komórek.
      2. Dla każdego dołka uprawowego obliczyć objętości do przeniesienia dla wszystkich składników pożywki zgodnie z:
         
         Wolumen, który należy dodać dla niektórych akcji wariantowych, może wynosić zero, tj. gdy ten konkretny składnik zostanie pominięty.
      3. Zrewiduj wszystkie obliczone woluminy V_i pod kątem odpowiednich numerów. Przyrosty objętości pipetowania w krokach co dawkowanie nie powinny być zbyt małe. W razie potrzeby należy dostosować stężenia zapasów zmiennych. Na przykład minimalna objętość pipetowania została zdefiniowana jako 10 μl, a minimalna wielkość pipetowania została zdefiniowana jako 5 μl. Ogólnie rzecz biorąc, objętości te powinny być definiowane na podstawie eksperymentalnie określonej precyzji i dokładności dla używanej stacji obsługi cieczy^15,44.
      4. Obliczyć objętość zapasów resztkowych zawierających stałe składniki dla wszystkich studzienek w następujący sposób:
         
         gdzie używany jest maksymalny skumulowany wolumen zapasów wariantów . W związku z tym należy obliczyć wymagane stężenia składników stałych w zapasach w następujący sposób:
         
         Odpowiednio przygotuj pozostały zapas.
      5. Dla każdej studni uprawowej oblicz objętość wody do dodania w następujący sposób:
         
      6. Dla każdej studni uprawowej wymień wszystkie objętości, które mają zostać dodane, w następującej kolejności dodawania: V_H2O, V_RestStock, V_i, V_Inok. Sformatuj listę pipetowania zgodnie ze specyfikacją stacji obsługi cieczy, jak pokazano w przykładzie na Rysunek 2.
4. Uprawa nasion, automatyczne przygotowanie pożywki i rozpoczęcie głównej hodowli
   1. Utwórz protokół dla robota do obsługi cieczy. Zobacz Rysunek 3 i Rysunek 4 dla przykładowego protokołu dla systemu "Janus", zaimplementowanego w odpowiednim oprogramowaniu "WinPREP". W protokole należy uwzględnić następujące aspekty:
      1. Należy zapewnić wystarczający czas pracy sterylnej obudowy przed przygotowaniem podłoża.
      2. Należy dokładnie dokładnie wyczyścić i umyć wszystkie końcówki do pipetowania i rurki.
      3. Wybierz odpowiednie pojemniki na sprzęt laboratoryjny do roztworów podstawowych. W tym przypadku płytki głębinowe z 12 kolumnami nadają się do przechowywania zapasów Variation Stocks, ponieważ wszystkie osiem końcówek pipetujących może zanurzać się w kolumnach studzienkowych w układzie równoległym. To znacznie przyspiesza przygotowanie podłoża. Jeśli jako zbiorniki używane są probówki z odczynnikiem o pojemności 15 ml lub 50 ml, tylko jedna końcówka pipetująca może być w nich zanurzona jednocześnie. W przypadku innych zapasów, takich jak woda i zapasy reszty, stosuje się koryta o pojemności 100 ml, ponieważ te roztwory podstawowe wymagają łącznie większych objętości.
      4. Dla każdego roztworu podstawowego należy zapewnić wystarczającą objętość całkowitą, aby skompensować objętość odpadów, przesunięcia wysokości pipetowania itp.
      5. Wprowadzić monit użytkownika przed etapem inokulacji, upewniając się, że ten krok jest wykonywany bezpośrednio przed procedurą hodowli nasion.
   2. Przygotować wszystkie roztwory podstawowe w sterylny sposób i przechowywać do czasu użycia w odpowiednich pojemnikach, np. sterylnych probówkach o pojemności 15 ml i 50 ml.
   3. Wysterylizować płytki z głęboką studzienką do przechowywania roztworu podstawowego na stole roboczym, np. przecierając 70% etanolem, a następnie susząc w okapie z przepływem laminarnym.
   4. Rozpocznij hodowlę nasion od zaszczepienia 50 ml pożywki BHI zawierającej 25 mg/l kanamycyny jedną porcją z WCB. Przed uprawą MBR należy przygotować świeże, żywotne inokulum z wykładniczo rosnących kultur nasion w wystarczającej ilości.
   5. Umieść wszystkie niezbędne przybory laboratoryjne na stole roboczym robota i wlej roztwory podstawowe do odpowiednich naczyń laboratoryjnych.
   6. Uruchom zrobotyzowany przepływ pracy w celu przygotowania pożywki, tak aby ostatni etap (inokulacja) został osiągnięty na czas z rozpoczęciem hodowli nasion. Całkowity czas pracy zrobotyzowanego przepływu pracy musi zostać wcześniej oceniony. W tym przypadku całkowity czas pracy wynosił około 1,5 godziny.
   7. Pobrać próbkę kultury siewnej po około 2 godzinach, a następnie co godzinę, w celu monitorowania wzrostu za pomocą gęstości optycznej (OD₆₀₀). Po około 5 godzinach kultura osiąga 3-4 OD₆₀₀ i służy do zaszczepiania głównych kultur.
   8. Umieść kulturę nasion na stole roboczym do obsługi cieczy i kontynuuj protokół przygotowania podłoża. Hodowla fok MTP po zaszczepieniu.
   9. Umieść zapieczętowany MTP uprawowy w urządzeniu BioLector i rozpocznij wstępnie zdefiniowany protokół uprawy.
   10. Pozostałe roztwory podstawowe, w razie potrzeby zgodnie z przepisami bezpieczeństwa biologicznego, należy usunąć i wysiać kulturę z roboczego stołu roboczego. Wyczyść sprzęt laboratoryjny wielokrotnego użytku i rozpocznij protokół odkażania płynów.
5. Kwantyfikacja produktu i wstępne przetwarzanie surowych danych do analizy
   1. Zatrzymaj główną kulturę po 17 godzinach pracy.
   2. Przenieś dane pomiarowe z urządzenia BioLector MBR do podłączonego komputera za pomocą pakietu oprogramowania BioLection zgodnie z instrukcją obsługi producenta.
   3. Użyj funkcji "Zarządzanie danymi → przekształcanie danych" w pakiecie oprogramowania "BioLection", który jest dołączony do systemu MBR, aby przekonwertować plik surowych danych na łatwo dostępny format arkusza kalkulacyjnego. Skopiuj dane sygnału GFP dla wszystkich studni uprawowych z kolumny znacznika czasu najbliższej 17 godzin. Zidentyfikuj sygnały GFP z referencyjnych studni uprawowych i średnią. Znormalizuj cały pozostały sygnał GFP przez średni sygnał odniesienia.
   4. Określić ilościowo miano GFP przy użyciu dodatkowych metod (jeśli jest to wymagane)
      1. Przenieść zawiesiny komórkowe ze wszystkich dołków hodowlanych do wstępnie znakowanych probówek reakcyjnych i otrzymać bezkomórkowy supernatant po odwirowaniu przez 10 minut z maksymalną prędkością za pomocą wirówki stołowej.
      2. Przenieść 200 μl każdego bezkomórkowego supernatantu do czarnego 96-dołkowego MTP z przezroczystym dnem i odczytać fluorescencję specyficzną dla GFP przy 488/520 nm za pomocą odpowiedniego czytnika mikropłytek. Znormalizować sygnał GFP ze wszystkich studzienek średnim sygnałem z upraw referencyjnych, jak w kroku 1.5.3.
         UWAGA: Bezwzględne sygnały fluorescencji GFP nie mogą być porównywane dla różnych urządzeń pomiarowych. Dlatego 5 szczepów referencyjnych ze wszystkich głównych upraw służy jako wzorzec wewnętrzny. Poprawa miana GFP może być wyrażona w odniesieniu do wzorca wewnętrznego. Pozwala to na porównanie wyników z różnych eksperymentów i różnych metod kwantyfikacji GFP (patrz dwa następne kroki).
      3. Oznaczyć zawartość białka w bezkomórkowych supernatantach za pomocą standardowych protokołów, np. testu Bradforda lub testu BCA. W połączeniu z wynikami z kroku 2 możliwe jest oznaczenie miana GFP specyficznego dla białka.
         UWAGA: Po pomiarze fluorescencji należy użyć próbki bezpośrednio z tej mikropłytki. Stosowanie pipet wielokanałowych znacznie ułatwia niezbędne etapy obsługi cieczy.
      4. Wykonaj wizualizację strony SDS supernatantów bezkomórkowych zgodnie ze standardowymi protokołami, aby sprawdzić, czy większość wzrostu zawartości białka jest spowodowana zwiększonym wydzielaniem GFP.
         UWAGA: SDS-Page jest bardziej pracochłonne niż wcześniej wymienione metody, zwłaszcza przy dużym obciążeniu próbki. Do celów weryfikacji często wystarcza uruchomienie SDS stron z bezkomórkowymi supernatantami z pożywki referencyjnej i końcowej zoptymalizowanej pożywki upraw¹⁵.

2. Analiza wrażliwości (Rysunek 1: Część B)

UWAGA: Celem tej części jest zidentyfikowanie ważnych czynników, które mają znaczący wpływ na cel.

1. Wybierz początkowy zakres stężeń składników pożywki. Skład podłoża referencyjnego powinien mieścić się w wybranych zakresach stężeń.
2. Wybierz odpowiedni DOE. Takie projekty można znaleźć w literaturze, np. w NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methods (dostępnym pod adresem www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). Wybrany projekt zależy od liczby interesujących nas komponentów mediów (tutaj 11) i liczby przeprowadzonych eksperymentów (tutaj 32). W podanym przykładzie wybrano projekt "2_IV^11-6", który daje wynik 32 eksperymentów i pozwala oszacować wpływ zwiększenia stężenia jednego z jedenastu składników na interesujący nas cel. Mówiąc dokładniej, główne efekty nie są mylone z interakcjami czynnikowymi parami. Można je pomylić z interakcjami wyższego rzędu, które jednak najprawdopodobniej nie są znaczące.
3. Pozostałe studzienki (tutaj 16) należy wykorzystać do przeprowadzenia wielu powtórzeń z podłożem referencyjnym w celu oceny odtwarzalności procesu. Powtórzenia powinny być równomiernie rozłożone na płytce, aby odkryć efekty pozycyjne. Do normalizacji wykorzystuje się średnią wartość zmierzonego produktu z doświadczeń referencyjnych. Oznacza to, że każdy zmierzony wynik analizy wrażliwości jest dzielony przez średnią wartość wyjścia odniesienia.
4. Oblicz główne i, jeśli to możliwe, efekty kombinatoryczne za pomocą odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Klasyczny projekt eksperymentu opiera się na przybliżeniu wielomianowym⁴⁵. Na przykład funkcja mvregress w MATLAB może być użyta do oszacowania współczynników wielomianowych. Funkcja mvregress jest częścią zestawu narzędzi statystyk i uczenia maszynowego.
5. Zidentyfikuj istotny wpływ różnych składników mediów na obiektyw za pomocą testu t. W tym przykładzie NH₄⁺ ma znaczący negatywny wpływ, a Ca²⁺ i Mg²⁺ wykazują najsilniejsze pozytywne efekty (Rysunek 5). Ponieważ sygnał GFP został znormalizowany, współczynniki reprezentują średnią względną zmianę sygnału GFP przy zwiększaniu stężenia danego składnika od jego wartości środkowej, , do wartości maksymalnej.
6. Stałe komponenty bez istotnego efektu osiągają swoją wartość odniesienia podczas optymalizacji.

3. Optymalizacja iteracyjna (Rysunek 1: Część C)

UWAGA:Narzędzie MATLAB KriKit zostało użyte do interpretacji i analizy danych statystycznych³⁶. KriKit pozwala użytkownikowi na skonstruowanie modelu Kriging opartego na danych. Ten model Kriginga przewiduje funkcjonalną relację między komponentami mediów a celem. Dostarcza również informacji na temat niepewności prognozy. Wysoka niepewność wskazuje na zaszumione dane i/lub niewystarczającą gęstość danych.

1. DOE
   UWAGA: Nowe eksperymenty są projektowane iteracyjnie na podstawie wyników poprzedniego przebiegu.
   1. W pierwszej iteracji zaprojektuj nowe eksperymenty w celu szczegółowego zbadania zidentyfikowanych komponentów mediów będących przedmiotem zainteresowania. Wyniki doświadczalne z sekcji 2 nie mogą być przeniesione do optymalizacji iteracyjnej (sekcja 3), ponieważ stężenia składników niemających istotnego wpływu są obecnie ustalane na odpowiednim poziomie wartości odniesienia. W związku z tym eksperymenty z analizy wrażliwości i optymalizacji iteracyjnej nie są porównywalne.
   2. W przeciwnym razie postępuj zgodnie ze schematem zilustrowanym na Rysunek 1, ramka "Optymalizacja iteracyjna". Jeśli potencjalne optimum mieści się w zdefiniowanym zakresie stężeń, nowe eksperymenty są projektowane przy użyciu oczekiwanego ulepszenia^40,46. Projekt eksperymentalny oparty na oczekiwanej poprawie jest zintegrowany z zestawem narzędzi KriKit. Jeśli optimum leży na granicy, rozszerz zakres stężeń.
2. Przeprowadzić doświadczenia w zaprojektowanych punktach pobierania próbek zgodnie z metodami doświadczalnymi określonymi w sekcji 2.
3. analiza statystyczna
   1. Skonstruuj model krigingu, korzystając z połączonych danych ze wszystkich iteracji, w tym bieżącej.
   2. Zbadaj wyniki modelu poprzez wizualizację przy użyciu kompleksowych narzędzi KriKit (interpolacja 2/3D, analiza filmu, wykres przesiewowy itp.).
4. Jeśli optymalny obszar został oszacowany z wystarczającą dokładnością, zatrzymaj optymalizację. Jeśli nie, przejdź do kroku 3.1.
   UWAGA: Rysunek 6 ilustruje iteracyjną optymalizację dla badania testowego. Zakres stężeń był sukcesywnie rozszerzany, aż do osiągnięcia plateau (iteracja 1-6). Siódma iteracja została wykorzystana do bardziej szczegółowego zbadania granic.

4. Weryfikacja wyników (Rysunek 1: Część D)

UWAGA: Po zakończeniu iteracyjnej optymalizacji, początkowe założenia muszą zostać sprawdzone pod kątem poprawności.

1. Powtórz analizę wrażliwości (sekcja 2) w celu uzyskania optymalnego składu podłoża. Oznacza to, że stężenia składników, które są badane w Rysunek 1 (część C) są ustalone na ich optymalne wartości. Stężenia innych składników są zróżnicowane w zależności od odpowiedniego DOE.
   UWAGA: Podobne wyniki w obu badaniach przesiewowych wskazują, że poziomy stężeń badanych składników nie wpływają na działanie pozostałych składników. Jeżeli badanie przesiewowe wykaże znaczące różnice w stosunku do wyników z części B, do puli badanych składników należy dodać składniki o zmienionym działaniu i powtórzyć część C.
2. W przypadku pomiaru pośredniego (np. fluorescencja jako wskaźnik stężenia produktu) należy zastosować ortogonalne podejścia pomiarowe (np. test aktywności, kwantyfikacja białka Bradforda lub BCA, strona SDS), aby potwierdzić zmianę celu będącego przedmiotem zainteresowania, porównując wyniki z pożywki referencyjnej i zoptymalizowanej pożywki¹⁵.

Wyniki

Wprowadzony protokół został zastosowany w celu maksymalizacji miana wydzielanego GFP. W szczególności jako cel optymalizacyjny wybrano miano GFP po 17 godzinach uprawy. Wykrywanie fluorescencji GFP w trybie online umożliwiło proste określenie ilościowe produktu. Jednak normalizacja sygnału GFP za pomocą danych z uprawy referencyjnej jest niezbędna do zapewnienia odtwarzalności i porównywalności wyników. Wstępna selekcja komponentów mediów została przeprowadzona w sposób racjonalny, jak opisano w punkcie 1. Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z instrukcjami zawartymi w rozdziale 1: parametry procedur mokrego laboratorium zostały określone dla całego badania, zapewniając spójność i powtarzalność wyników.

Jak opisano w sekcji 2, przeprowadzono wstępne badanie przesiewowe w celu zidentyfikowania istotnych elementów wykazujących znaczący wpływ na cel optymalizacji dla dalszego, bardziej szczegółowego badania. System MBR oparty na MTP pozwala na równoległe przeprowadzenie 48 eksperymentów. Biorąc pod uwagę maksymalną możliwą liczbę równoległych eksperymentów na jednym MTP (48) oraz całkowitą liczbę składników mediów (11) sprawia, że konstrukcja frakcyjna 2_IV^11-6 jest odpowiednim wyborem. Ten projekt eksperymentalny składa się z 32 eksperymentów i pozwala na oszacowanie głównego efektu dla każdego z badanych składników pożywki. Pozostałe studnie uprawowe (16) wykorzystano do wielokrotnych powtórzeń doświadczeń z podłożem referencyjnym w celu oceny odtwarzalności i efektów pozycyjnych. Oznacza to, że każdy eksperyment jest przeprowadzany raz (bez powtórzeń), z wyjątkiem eksperymentu referencyjnego (pięć powtórzeń).

Tabela 1 podsumowuje wyniki analizy przesiewowej. W rozważanym zakresie stężeń zróżnicowanie większości składników pożywki nie wykazało zauważalnego wpływu na obiektyw. Składnik NH₄⁺ wykazuje silne negatywne działanie, podczas gdy Ca²⁺ i Mg²⁺ wykazują najsilniejszą pozytywną tendencję. Wpływ^Mg2+ nie jest znaczący dla obecnego zakresu stężeń, ale może być istotny dla szerszego zakresu stężeń. W związku z tym zdecydowano o pominięciu NH₄⁺ w pożywce i zbadaniu wpływu^Ca2+ i^Mg2+ w dalszych eksperymentach.

Sekcja 3 opisuje procedurę iteracyjnej optymalizacji, która jest używana do maksymalizacji sygnału fluorescencji GFP przy jednoczesnej różnicowaniu stężeń Ca²⁺ i Mg²⁺. W iteracji 1 przetestowano hipotezę, że NH₄⁺ można pominąć. Zakres stężeń dla^Ca2+ i^Mg2+ przyjęto z analizy przesiewowej. Minimalne stężenie NH₄⁺ ustalono na zero, a maksymalne stężenie przyjęto z eksperymentu przesiewowego. W kolejnych eksperymentach stężenia składników rozprowadzono na siatce 3 x 3 x 3 w określonym zakresie stężeń, w wyniku czego przeprowadzono 27 eksperymentów. Podczas wszystkich upraw włączono pięć powtórzeń podłoża referencyjnego, które posłużyły jako wzorzec wewnętrzny i zapewniły, że nie wystąpią żadne efekty pozycyjne w stosunku do MTP. Dla pozostałych 16 dołków stężenia NH₄⁺, Ca²⁺ i Mg²⁺ zostały losowo rozmieszczone w podanych zakresach.

Rysunek 5A przedstawia wyniki pierwszych iteracji. Etykiety osi odnoszą się do stężeń składników stosowanych w oryginalnym podłożu odniesienia, oznaczonych przez x Ref. Niebieskie powierzchnie reprezentują interpolacje Krigingu, które zostały obliczone za pomocą oprogramowania KriKit. Każda powierzchnia jest powiązana ze względnym poziomem stężenia dla NH₄⁺ (ciemnoniebieski: 0 x Ref, w kratkę: 1 x Ref, jasnoniebieski: 2 x Ref). Ta wizualna reprezentacja pokazuje, że korzystne jest pominięcie NH₄⁺. Powierzchnie interpolacji wykazują również pozytywne działanie zarówno Mg²⁺, jak i Ca²⁺, ponieważ wszystkie płaszczyzny wznoszą się wraz ze wzrostem stężeń.

Na podstawie wyników iteracji 1 zdecydowano o rozszerzeniu zakresu stężeń Ca²⁺ i Mg²⁺ poprzez podwojenie maksymalnych stężeń i przesunięcie okna projektu eksperymentalnego do prawego górnego rogu, zobacz Rysunek 5B. Wewnątrz tego zakresu stężenia zostały rozłożone na siatce 6 x 6. Zapewnia to równomierne rozprowadzenie w całym zakresie stężeń, co prowadzi do optymalnych wyników interpolacji Kriging. Rysunek 5B pokazuje wykres interpolacji Kriginga oparty na połączonych danych zmierzonych w obu iteracjach (czerwone kropki i żółte kwadraty). Zarówno w przypadku^Ca2+, jak i^Mg2+ pozytywny efekt zwiększenia ich stężeń utrzymuje się. W związku z tym procedurę powtórzono poprzez podwojenie maksymalnego stężenia, a tym samym okno projektu eksperymentalnego zostało przesunięte w celu zbadania granic prawego górnego rogu.

Rysunek 6A przedstawia przegląd pozostałej procedury optymalizacji. Analiza zebranych danych zestawionych do iteracji 3 wykazała ograniczenie pozytywnego działania Mg²⁺, tj. zidentyfikowano optymalny zakres stężeń Mg²⁺. W związku z tym zdecydowano się na dalsze rozszerzenie zakresu stężeń tylko dla Ca²⁺ (iteracja 4). Procedurę tę powtórzono dwukrotnie (iteracja 5 i 6), aż do stwierdzenia nasycenia sygnału GFP. To nasycenie tłumaczy się wytrącaniem się soli Ca dla zastosowanych stężeń Ca²⁺, które nie są dostępne dla komórek.

Ponieważ wyniki eksperymentów są zawsze zakłócane przez szum, wynikająca z tego interpolacja Kriginga wydaje się nieregularna, a oględziny mogą prowadzić do fałszywych wniosków. Jednak optymalny zakres stężeń składników mediów dla nasyconego sygnału GFP można niezawodnie zidentyfikować za pomocą statystycznego testu z, który jest również zaimplementowany w KriKit. Test z wykorzystuje bezpośrednio wewnętrzne informacje statystyczne dostarczone przez metodę Kriginga, tj. wartości predykcyjne i niepewności przewidywania. Rysunek 6B pokazuje zidentyfikowany płaskowyż, określony i zwizualizowany za pomocą zestawu narzędzi KriKit. Zestaw narzędzi KriKit jest dostępny bezpłatnie³⁶ i zawiera szczegółowy samouczek, który wyjaśnia, jak korzystać z jego funkcji.

Jeśli zostaną znalezione więcej niż dwa istotne komponenty, wizualizacja 3D osiąga swój limit. KriKit zapewnia kilka innych możliwych metod reprezentacji wizualnej, takich jak filmy lub "fabuła pokazowa". Jeśli potencjalne optimum mieści się w zdefiniowanym zakresie stężeń, nowe eksperymenty są automatycznie projektowane przy użyciu oczekiwanego ulepszenia^40,46. Projekt eksperymentalny oparty na oczekiwanej poprawie jest zintegrowany z zestawem narzędzi KriKit. Bardziej szczegółowe informacje można znaleźć w dokumentacji oprogramowania.

Po procedurze iteracyjnej przeprowadzono weryfikację wyników, jak opisano w części D. Sprawdzono słuszność wstępnych założeń poprzez wykonanie dodatkowej analizy wrażliwości z wykorzystaniem optymalnego składu podłoża. Oznacza to, że wszystkie początkowe składniki pożywek były zróżnicowane, ale Ca²⁺ i Mg²⁺ zostały ustawione na optymalne poziomy stężenia. W tym badaniu wybrano optymalne stężenia = 32 x Ref i = 6,8 x Ref. W tabeli 2 przedstawiono wyniki badań przesiewowych w zakresie walidacji. Podobnie jak w przypadku wstępnego badania przesiewowego wrażliwości (por. tabela 1), NH₄⁺ nadal ma znaczący negatywny wpływ, a pozostałe efekty są nadal znikome.

Ze względu na łatwy dostęp, sygnał fluorescencji GFP z zawiesiny hodowlanej został wykorzystany do ilościowego określenia miana zewnątrzkomórkowego GFP podczas wszystkich eksperymentów. Ze względów weryfikacyjnych fluorescencję GFP poddano walidacji w porównaniu z innymi pomiarami. Ponieważ GFP jest wydzielany przez szlak Tat, sygnał fluorescencyjny nie może rozróżniać wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego GFP. W ten sposób uprawy były rozmnażane przy użyciu podłoża referencyjnego i zoptymalizowanego podłoża. Oprócz pomiaru fluorescencji z supernatantów do hodowli bezkomórkowej, zawartość białka określono ilościowo za pomocą testu Bradforda, a (pół)jakościową poprawę GFP zwizualizowano za pomocą SDS-Page¹⁵. Wszystkie uzyskane sygnały pomiarowe zostały w przybliżeniu podwojone dla upraw ze zoptymalizowanym podłożem w porównaniu z podłożem referencyjnym i potwierdziły około 100% poprawę wydajności wydzielania zoptymalizowanej pożywki. W związku z tym fluorescencję swoistą GFP zawiesiny uprawowej można uznać za odpowiednią metrykę dla celu optymalizacji, tj. zewnątrzkomórkowego miana GFP.

Rysunek 2: Zrzut ekranu z listy pipetowania objętościowego do analizy czułości. Wpisy w pierwszej kolumnie przypisują niepowtarzalny identyfikator do wszystkich woluminów wiersza; ten identyfikator jest numerem studni MTP docelowej uprawy MTP na stole roboczym do obsługi cieczy, por. Rysunek 4C. Pozostałe kolumny kodują objętości dla różnych roztworów ("Sln-01" do "Sln-15"), które mają być pipetowane. Łączna objętość jednego rzędu odpowiada końcowej objętości uprawy odpowiedniej studni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zrzut ekranu z oprogramowania do kontroli obsługi cieczy "WinPREP". Po lewej: Polecenia uporządkowane według wierszy, w tym polecenie transferu dla każdego roztworu podstawowego, który ma być pipetowany. Przed ostatnim poleceniem dodania inokulum, wstawiany jest monit użytkownika, aby upewnić się, że kultura nasion zostanie umieszczona na stole w odpowiednim czasie. Po prawej: Schemat stołu roboczego, w tym źródłowy sprzęt laboratoryjny dla Variation Stocks (dwie płytki z głębokimi studniami z 12 studzienkami przypominającymi kolumny), koryto na odczynniki dla Rest Stock, wody i inokulum oraz MTP do uprawy docelowej do przygotowania pożywki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Kompilacja szczegółowych zrzutów ekranu do konfiguracji pipetowania roztworu podstawowego. (A) Nieopakowane polecenie do pipetowania materiału Fe. Źródłowe oprogramowanie laboratoryjne i studzienka źródłowa są oznaczone na stole roboczym ramką odczytu i czerwoną kolumną odpowiedniej płytki studni głębinowej. Docelowy sprzęt laboratoryjny i studnie docelowe w środku są oznaczone niebieską ramką wokół i niebieskimi studniami docelowego MTP uprawy. (B) Szczegółowy przykładowy widok przypisania objętości pipetowania dla tego etapu (roztwór podstawowy Fe). Liczba odbiorców jest odczytywana z listy pipetowania, która składa się z 48 wierszy. Objętości dozowania dla wszystkich dołków docelowych dla roztworu podstawowego Fe znajdują się w kolumnie 4 wykazu pipetowania. Zwróć uwagę, że pierwsza kolumna na liście pipetowania zawiera identyfikatory, a nie woluminy do przeniesienia, patrz Rysunek 2. (C) Szczegółowe informacje na temat numeracji studni docelowych. Objętości zapisane w wierszu #1 odpowiedniej listy pipetowania zostaną odpipetowane do studni oznaczonej jako #1 i tak dalej. Studnie #01, #08, #41 i #48 odpowiadają studzienkom A01, A08, F01 i F08 pod względem kodowania alfanumerycznego, które jest również drukowane w samym MTP uprawy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Szczegółowe wyniki z pierwszej iteracji. (A) Interpolacja Kriginga na podstawie danych eksperymentalnych iteracji 1. Czerwone kropki wskazują zestaw danych. Dla porównania, wszystkie trzy powierzchnie interpolacji są nałożone na jeden wykres (ciemnoniebieski: 0 x Ref, w kratkę: 1 x Ref, jasnoniebieski: 2 x Ref). Alternatywną reprezentację wyników można znaleźć w innym miejscu¹⁵. (B) Interpolacja krigingowa na podstawie eksperymentów przeprowadzonych w iteracji 1 (czerwone kropki) i iteracji 2 (żółte kwadraty). Część danych przedstawionych na tym rysunku została wcześniej opublikowana¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przedstawienie iteracyjnie zebranych wyników optymalizacji. (A) Końcowe przewidywanie modelu Kriging. (B) Statystyczna identyfikacja optymalnego obszaru (kolor czerwony) na podstawie statystycznego testu z, który jest dostarczany przez KriKit. Ramki wskazują kolejne etapy iteracyjnego projektowania i wykonywania eksperymentów. Część danych przedstawionych na tym rysunku została wcześniej opublikowana¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

składnik Znormalizowana wartość średnia współczynnika Fe²⁺ -0,08 pkt. Mn²⁺ -0,05 pkt. Zn²⁺ -0,21 pkt. Cu²⁺ -0,21 pkt. NH₄⁺ -2,04 ZŁ Ni²⁺ -0,11 pkt. Stężenie^CO2+ -0,10 pkt. MoO₄^2- 0,03 pkt. BO₃^3- 0,06 Ok.²⁺ godz. 1.00 Mg²⁺ 0,45 pkt.

Tabela 1: Wyniki analizy wrażliwości. Wartości współczynników reprezentujące średni efekt przy zwiększaniu stężenia danego składnika podłoża od jego wartości środkowej do wartości maksymalnej. W przypadku optymalnych projektów eksperymentalnych, które znajdują się w literaturze standardowej i są tutaj stosowane, odchylenie standardowe reprezentuje bezpośrednio zmienność doświadczalną wynikającą z replikacji doświadczenia referencyjnego. Wartości współczynników zostały znormalizowane przez wartość maksymalną (0,0422 dla składnika Ca²⁺). Odchylenie standardowe współczynnika znormalizowanego i bezwzględnego wynosi odpowiednio 0,54 i 0,0226.

składnik Znormalizowana wartość średnia współczynnika Fe²⁺ -1.00 Mn²⁺ godz. 1.00 Zn²⁺ -3,48 pkt. Cu²⁺ -0,52 pkt. NH₄⁺ -15,95 pkt. Ni²⁺ 0,69 pkt. Stężenie^CO2+ -0,51 pkt. MoO₄^2- -0,45 pkt. BO₃^3- -1,11 pkt.

Tabela 2: Wyniki końcowej analizy wrażliwości. Wartości współczynników reprezentujące średni efekt przy zwiększaniu stężenia danego składnika podłoża od jego wartości środkowej do wartości maksymalnej. Ponieważ zastosowano optymalny projekt eksperymentalny, odchylenie standardowe zależy tylko od zmienności eksperymentalnej przy użyciu zoptymalizowanego składu pożywki. Zmienność doświadczalna nieznacznie wzrosła w porównaniu ze zmiennością przy użyciu pożywki referencyjnej. Wartości współczynników znormalizowano przez wartość maksymalną (0,0106 dla składowej Mn²⁺). Odchylenie standardowe współczynnika znormalizowanego i bezwzględnego wynosi odpowiednio 3,63 i 0,0385.

Dyskusja

Ogólny charakter przedstawionego protokołu pozwala na różne adaptacje, np. do badania innych gospodarzy ekspresji drobnoustrojów 9,47,48,49,50,51 lub do optymalizacji innych właściwości białka docelowego, takich jak wzór glikozylacji lub wiązania dwusiarczkowe. Konieczne może być również dostosowanie protokołu do dostępnego sprzętu laboratoryjnego. Integracja systemu MBR pozwala na zwiększenie przepustowości eksperymentalnej, co pozwala na dużą oszczędność czasu. Jednak przy zastępowaniu w pełni oprzyrządowanych i sterowalnych bioreaktorów systemami MBR, należy wziąć pod uwagę skalowalność wyników 8,37,52,53. Zastosowanie metodologii DOE i modelowania matematycznego pomaga zmaksymalizować zawartość informacyjną danych pomiarowych w odniesieniu do badanego celu⁵⁴ poprzez efektywne planowanie eksperymentalne i interpretację danych w oparciu o model¹⁵.

Modyfikacje metody
Oprócz wielofunkcyjnych i rozbudowywalnych zrobotyzowanych systemów obsługi cieczy, takich jak ten zastosowany w tym badaniu, należy wspomnieć, że na rynku dostępnych jest kilka mniejszych systemów obsługi cieczy, które są w stanie wykonać to zadanie i można je umieścić wewnątrz stołów roboczych z przepływem laminarnym. Jeśli nie jest dostępny automatyczny system pipetowania, różne składy pożywek zgodnie z planem DOE można również uzyskać za pomocą pipetowania ręcznego za pomocą pipet jedno- i/lub wielokanałowych. Ponieważ ręczne przygotowanie jest bardziej podatne na błędy i będzie wymagało bardzo skoncentrowanej pracy przez dość długi czas, zaleca się przygotowanie mniejszej liczby różnych kompozycji mediów.

W zależności od możliwości zastosowanego systemu MBR, odpowiedni protokół uprawy będzie się różnił. Na przykład, jeśli nie jest dostępny pomiar powstawania biomasy online, może to być wystarczające do zmierzenia stężenia biomasy po zakończeniu eksperymentu wzrostu. W połączeniu z monitorowaniem online pH i tlenu rozpuszczonego, które jest realizowane w kilku systemach MBR, można bezpiecznie określić nasycenie wzrostu. Zasadniczo eksperymenty wzrostowe można przeprowadzać w samych MTP umieszczonych w inkubatorach z wytrząsaniem, bez użycia systemu MBR. W takim przypadku należy zapewnić odpowiednie warunki uprawy: (1) Upraw o ograniczonej zawartości tlenu można uniknąć, stosując MTP o odpowiedniej geometrii, w połączeniu z odpowiednią częstotliwością wytrząsania i średnicą wytrząsania, np. kwadratowe płytki głębinowe 96 lub 24 pracujące odpowiednio z prędkością 1 000 obr./min przy rzucie 3 mm lub przy prędkości 250 obr./min przy wyrzucie 25 mm. Co ważne, im niższe możliwe do osiągnięcia maksymalne prędkości transferu tlenu, tym niższe powinno być stężenie głównego źródła węgla. Jak wspomniano powyżej, w tym badaniu zastosowanie glukozy 10 g/l było odpowiednie, aby zapobiec ograniczeniu tlenu w stosowanych warunkach uprawy; (2) Pobieranie próbek z kultur MTP w celu ilościowego określenia biomasy i produktu powinno być ograniczone do minimum. Za każdym razem, gdy MTP jest usuwany z inkubatora wytrząsającego, transfer tlenu natychmiast się rozpada, co może skutkować niekorzystnymi warunkami uprawy; (3) Zdaniem autorów, stosowanie czytników MTP jako urządzeń do uprawy nie jest zalecane, ponieważ urządzenia te nie zostały opracowane w tym celu. Na przykład mechanika wytrząsania została opracowana z myślą o sporadycznym mieszaniu mikropłytek po dodaniu odczynnika, a zatem często brakuje jej wytrzymałości na długie serie ciągłego wytrząsania trwającego przez kilka dni. Co więcej, w tych czytnikach nie można zrealizować wystarczającego poboru mocy potrzebnej do hodowli mikroorganizmów. Integracja odczytów gęstości optycznej w krótkich odstępach czasu wymaga zatrzymania ruchu wytrząsającego, co skutkuje powtarzającymi się okresami ograniczenia tlenu. Co więcej, parowanie w takich systemach przez długie okresy uprawy zniekształci wyniki. Więcej szczegółów na zaskakująco złożony temat wykorzystania MTP do hodowli mikroorganizmów odsyła czytelnika do cytowanej literatury 22,23,24,25,26 i zawartych w niej odniesień.

Dalsze rozważania
Aby przyspieszyć iteracyjne kroki optymalizacji, zaleca się staranny wybór metody analitycznej do oznaczania ilościowego produktu. Szybkie i proste metody powinny być preferowane kosztem precyzji i dokładności, ponieważ iteracyjna strategia projektowania eksperymentalnego toleruje niedokładność eksperymentalną. Jednak ostateczne wyniki muszą zostać zweryfikowane pod kątem wystarczająco precyzyjnych i dokładnych metod oznaczania ilościowego produktu, które mogą być bardziej skomplikowane. Ogólnie rzecz biorąc, staranna ocena i podejmowanie decyzji dotyczących procedur badania wymaga wysiłku na początku badania, ale opłaca się w dłuższej perspektywie, po ustaleniu rutynowych metod.

Zdecydowanie zaleca się zdefiniowanie eksperymentu referencyjnego, który jest porównywany ze wszystkimi eksperymentami podczas optymalizacji. Oznacza to, że zastosowane stężenia składników medium oraz zmierzona wydajność są normalizowane poprzez podzielenie przez wartości odniesienia. W ten sposób każda zastosowana i zmierzona wartość może być interpretowana jako x-krotność wartości odniesienia. Aby uwzględnić różnice między płytkami, na każdej z nich przeprowadza się pięć doświadczeń referencyjnych. Do normalizacji wykorzystuje się średnią wartość zmierzonego wyniku.

Na ogół nie można zagwarantować, że opracowane podłoże jest również optymalne dla innych szczepów. Jednak ulepszona pożywka najprawdopodobniej będzie również odpowiednia do hodowli szczepów ekspresyjnych o niewielkich różnicach genetycznych, np. podczas wytwarzania wariantów enzymów z podstawieniami pojedynczych aminokwasów uzyskanych z badań mutagenezy (chociaż nawet mutacje jednopunktowe zostały opisane jako wpływające na metabolizm komórkowy i ekspresję heterologiczną^55,56). W tym przypadku przedstawiony protokół może być pierwszym krokiem, a następnie protokołami do wysokoprzepustowych badań przesiewowych ekspresji⁵⁷. Jeżeli protokół jest stosowany do opracowywania pożywki, a następnie zwiększania skali do upraw wsadowych z paszą, zoptymalizowane podłoże powinno zostać zweryfikowane pod kątem odpowiednich warunków bioprocesu, ponieważ kampanie przesiewowe klonów w mikroskali zidentyfikowały różne najlepsze wyniki dla różnych strategii żywienia i podłoży uprawowych^52,58. Co więcej, wprowadzony KriKit³⁶ może ogólnie przyczynić się do lepszej całościowej optymalizacji bioprocesów. Dopiero niedawno możliwości narzędzia zostały rozszerzone o obsługę optymalizacji wielocelowej⁴⁰, co może być ważne dla optymalizacji zarówno procesów poprzedzających, jak i późniejszych^59,60.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BioLector	m2p-labs	G-BL-100
Flowerplate	m2p-labs	MTP-48-BOH	Do uprawy w urządzeniu BioLector
Folia uszczelniająca	m2p-labs	F-GP-10	Sterylne uszczelnienie do Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jü lich	n/a	Swobodnie dostępny, wymagana instalacja MATLAB
Robot pipetujący Janus	Perkin Elmer	n/a	Obejmuje instalację oprogramowania "WinPrep"
12-kolumnowa mikropłytka głębinowa	E& K Scientific	EK-2034	Pojemnik na średnie roztwory podstawowe
96-dołkowe mikropłytki, przezroczyste, F-bottom	Greiner	655101	Do oznaczania białek Bradforda
i mikro; przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki, ciało czarne, przezroczyste dno F	Greiner	655087	Do pomiaru fluorescencji w supernatantach bezkomórkowych
Badania pipet  plus pipety wielokanałowe	Eppendorf	n/a	Ułatwia ręczną obsługę cieczy dzięki mikropłytkom
TruPAG  Prefabrykaty żelowe	Sigma	PCG2002	Do analizy SDS-Page bezkomórkowych supernantantów
Odczynnik Bradford	Sigma	B6916
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	n/a	n/a	Przenosi plazmid pEKEx2 z fuzją genu GFP i peptydu sygnałowego PhoD z B.subtilis jako insertu ekspresji. Plazmid zapewnia oporność na kanamycynę. Opisane i opublikowane przez Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633– 42 (2007)