Produkcja genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich metodą wstrzyknięcia projądrowego kompleksu CRISPR/Cas9

Podsumowanie

Pronuclear (PN) wstrzykiwanie systemu CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) i systemu CRISPR-related protein-9 nucleazy (CRISPR/Cas9) jest wysoce efektywną metodą produkcji genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich. W niniejszym artykule opisujemy szczegółowy protokół wstrzykiwania PN do produkcji chomików z nokautem genów za pomocą systemu CRISPR/Cas9.

Streszczenie

Technika iniekcji projądrowej (PN) została po raz pierwszy opracowana u myszy w celu wprowadzenia obcych materiałów genetycznych do przedjądrzy zarodków w stadium jednokomórkowym. Wprowadzony materiał genetyczny może integrować się z genomem embrionalnym i generować zwierzęta transgeniczne z obcą informacją genetyczną po przeniesieniu wstrzykniętych zarodków do matek zastępczych. Po sukcesie u myszy, wstrzykiwanie PN zostało z powodzeniem zastosowane u wielu innych gatunków zwierząt. Ostatnio iniekcja PN została z powodzeniem zastosowana do wprowadzenia odczynników o działaniu modyfikującym geny, takich jak system CRISPR/Cas9, w celu uzyskania specyficznych dla miejsca modyfikacji genetycznych u kilku gatunków zwierząt laboratoryjnych i gospodarskich. Oprócz opanowania specjalnego zestawu umiejętności mikroiniekcji w celu produkcji genetycznie modyfikowanych zwierząt za pomocą iniekcji PN, naukowcy muszą zrozumieć fizjologię reprodukcji i zachowanie gatunków docelowych, ponieważ każdy gatunek stanowi unikalne wyzwania. Na przykład zarodki złotego chomika syryjskiego mają wyjątkowe wymagania dotyczące obchodzenia się z zarodkami in vitro, tak że techniki wstrzykiwania PN nie były możliwe u tego gatunku aż do niedawnych przełomów dokonanych przez naszą grupę. Dzięki naszemu zmodyfikowanemu gatunkowo protokołowi wstrzykiwania PN udało nam się wyprodukować kilka chomików z nokautem genów (KO) i knockin (KI), które z powodzeniem wykorzystano do modelowania chorób ludzkich. Tutaj opisujemy procedurę wstrzykiwania PN w celu dostarczenia kompleksu CRISPR/Cas9 do zygot chomika, warunki obchodzenia się z zarodkiem, procedury transferu zarodków i hodowlę wymaganą do wytworzenia chomików modyfikowanych genetycznie.

Wprowadzenie

Złoty chomik syryjski (Mesocricetus auratus) jest jednym z najczęściej wykorzystywanych gryzoni do badań biomedycznych. Według Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, w 2015 r. w Stanach Zjednoczonych wykorzystano około 100 000 chomików, co stanowi 13% całkowitego wykorzystania zwierząt laboratoryjnych wśród gatunków objętych ustawą o dobrostanie zwierząt (http://www.aphis.usda.gov; dostęp 10 marca 2017 r.).

Chomik oferuje kilka zalet w porównaniu z innymi gryzoniami w badaniu wielu chorób ludzkich. Na przykład histopatologia gruczolakoraków przewodowych trzustki wywołanych N-nitrozobis(2-oksopropylo)aminą (BOP) u chomików jest podobna do ludzkich guzów trzustki, podczas gdy leczenie BOP głównie indukuje guzy tarczycy u szczurów oraz nowotwory płuc i wątroby u myszy¹. Ponieważ chomiki są jedynymi małymi gryzoniami, które wspierają replikację adenowirusów, są one również modelem z wyboru do testowania wektorów onkolitycznych opartych na adenowirusach i leków przeciwadenowirusowych^2,3,4. Innym przykładem, w którym model chomika daje przewagę nad myszami i szczurami, jest badanie hiperlipidemii. Ludzie i chomiki wykazują duże podobieństwa w szlakach metabolicznych lipidów i oba gatunki są nosicielami genu kodującego białko przenoszące ester cholesterolu (CETP), który odgrywa kluczową rolę w metabolizmie lipidów, podczas gdy CETP jest nieobecny u myszy i szczurów⁵. Dodatkowo, u chomików rozwija się choroba krwotoczna, która jest bardziej reprezentatywna dla objawów u ludzi po ekspozycji na wirusa Ebola⁶. Chomiki są również modelami wybieranymi do badania miażdżycy⁷, raki jamy ustnej⁸ i miopatie zapalne⁹. Ostatnio wykazano również, że chomiki są bardzo podatne na zakażenie wirusem andyjskim i rozwijają chorobę podobną do zespołu płucnego hantawirusa, dostarczając jedyny model infekcji wirusem andyjskim u gryzoni¹⁰.

Aby zaspokoić niezaspokojone zapotrzebowanie na nowe genetyczne modele zwierzęce do badania chorób ludzkich, gdzie nie jest dostępny wiarygodny model małego gryzonia, ostatnio udało nam się zastosować system CRISPR/Cas9 u chomików i wyprodukowaliśmy kilka linii genetycznie modyfikowanych chomików¹¹. Zygoty chomików są bardzo wrażliwe na środowisko środowiskowe, tak że protokoły wstrzykiwania PN opracowane u innych gatunków są nieodpowiednie. W związku z tym opracowaliśmy protokół wstrzykiwania PN dla chomika, który uwzględnia specjalne wymagania dotyczące obchodzenia się z zarodkami chomików in vitro. W tym miejscu opisujemy szczegółową procedurę iniekcji PN przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i towarzyszące jej etapy, od przygotowania pojedynczego prowadzącego RNA (sgRNA) do transferu wstrzykniętych zarodków do biorczyń.

Protokół

Procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Utah (protokół IACUC: 2484). Chomiki użyte w tym protokole to dorosłe (w wieku 6 - 10 tygodni) złote chomiki syryjskie szczepu LVG. Wszystkie chomiki są trzymane w wiwarium w centrum bioinnowacji na Uniwersytecie Stanowym Utah. Temperatura w pomieszczeniu jest ustawiona na 23 °C, wilgotność jest ustawiona na 40 - 50%, a cykl światła jest ustawiony na 14L:10D (jasny:ciemny). Jeśli to możliwe, manipulacja zarodkami i zabiegi chirurgiczne powinny być wykonywane technikami sterylnymi.

1. Przygotowanie rybonukleoprotein sgRNA i Cas9/sgRNA (RNP)

1. Zsyntetyzować sgRNA zgodnie z procedurami transkrypcji in vitro opisanymi w podręczniku zestawu do syntezy (Tabela materiałów, Suplement 1).
2. Aby złożyć rybonukleoproteiny, wymieszaj 2 μg Cas9 z 1 μg sgRNA i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 - 15 min. Do wstrzykiwania PN należy przygotować roztwór roboczy o stężeniu 100 ng/μL Cas9 i 50 ng/μL sgRNA z 10 mM buforem TE (bez RNazy, tabela materiałów).

2. Przygotowanie do wazektomii

UWAGA: Wazektomia jest wykonywana u samców chomików w wieku 6 - 8 tygodni. Zabieg należy wykonać 10-14 dni przed pierwszym kryciem. Bezpłodność potwierdzają nieudane ciąże z krycia z płodnymi samicami. Samce po wazektomii mogą być zwykle używane przez rok, zanim staną się mniej aktywne seksualnie.

1. Znieczulenie mężczyzn poprzez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny w dawce 40 mg/kg (ketamina) i 10 mg/kg (ksylazyna). Potwierdź znieczulenie przez brak odruchu pedałowania (szczypanie palców
).
2. Połóż uspokojonego chomika w pozycji leżącej grzbietowej na suchej bibułce. Przepłucz brzuch trzema seriami zabiegów antyseptycznych, naprzemiennie stosując roztwory peelingu chirurgicznego między 70% alkoholem a jodowidonem.
3. Wykonaj pionowe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi, zaczynając od 1,5 cm czaszki do napletka, rozciągając się na 1 cm z każdej strony od linii środkowej (Ryc. 1a). Naciąć skórę, tkankę podskórną i linię białą, aby uzyskać dostęp do przestrzeni otrzewnej (Ryc. 1b).
4. Wywieraj delikatny nacisk na ogonową stronę moszny, aby wypchnąć jądra i tkankę tłuszczową. Chwyć delikatnie nasieniowody kleszczami i ostrożnie oddziel naczynie krwionośne od naczynia krwionośnego za pomocą drugiego zestawu kleszczy (Rysunek 1c).
5. Przytrzymaj nasieniowody kleszczami, aby utworzyć pętlę. Podgrzej końcówkę innego kleszczyka w płomieniu, aż stanie się czerwona, a następnie użyj jej do usunięcia pętli nasieniowodów. Włóż tkankę tłuszczową i jądra z powrotem do brzucha. Usuń nasieniowody po przeciwnej stronie, wykonując te same procedury.
6. Najpierw zszyj mięśnie, a następnie zszyj skórę. Umieść zwierzę na ciepłej podkładce w klatce na 30 minut, aż zwierzę wyzdrowieje. Obserwuj zwierzę, dopóki nie wznowi normalnej aktywności.

3. Harmonogram przygotowań chomika dawcy/biorcy

1. Monitoruj i rejestruj cykle rujowe.
   UWAGA: Samice chomików mają stabilny 4-dniowy cykl rujowy, który utrzymuje się natychmiast po porodzie. Samice w pierwszym dniu rui można rozpoznać po nieprzezroczystej, żółtawej i lepkiej wydzielinie z pochwy (Ryc. 2a). Samice w 4 dniu rui można zidentyfikować po przezroczystym, lepkim śluzie (Ryc. 2b).
2. W przypadku superowulacji chomika-dawcy należy przeprowadzić superowulację dojrzałych płciowo samic (>6 tygodni) w pierwszym dniu cyklu rujowego poprzez wstrzyknięcie IP gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG; rozpuszczonej w PBS jako 50 j.m./ml) (Tabela 1) między 9 a 12 AM.
   UWAGA: PMSG służy do wywoływania superowulacji, ale nie do synchronizacji cyklu rujowego.
3. 80 - 84 h po wstrzyknięciu PMSG (dzień 4, 18 - 20) umieść samice w klatkach z samcami do krycia. Ponieważ krycia chomików nie skutkują zatyczkami kopulacyjnymi, zapewnij udane krycia, obserwując krycia.
4. Przygotuj samice w ciąży rzekomej, kryjąc dojrzałe płciowo samice w 4 dniu rui z samcami po wazektomii. Harmonogram przygotowania samic dawczyni i biorczyni przedstawiono w tabeli 2.
   UWAGA: Jako biorczycy mogą być również wykorzystywane prawdziwe ciężarne samice, tj. samice o kolorze sierści odróżnialnym od koloru złotego zmatowione tym samym kolorem płodnych samców. Szczenięta pochodzące z transferu zarodków można zidentyfikować na podstawie koloru sierści. Potencjalną zaletą wykorzystania prawdziwych ciężarnych samic jest to, że endogennie wyprodukowane zarodki zapewniłyby udaną ciążę i pomogłyby w zagnieżdżeniu się zarodków, którym wstrzyknięto PN; Potencjalną wadą wykorzystywania prawdziwych ciężarnych samic jako biorców jest to, że zarodki, którym wstrzyknięto PN, muszą konkurować o implantację z zarodkami wytwarzanymi endogennie.

4. Izolacja zygoty

1. Przygotuj pożywkę hodowlaną (HECM-9; receptura jest opisana w Suplemencie 2), jak opisano wcześniej w McKiernan i Bavister¹².
2. Na dzień przed wstrzyknięciem PN należy przygotować naczynia do obchodzenia się z zygotą (25 μl/kroplę) i kroplę do wstrzykiwań PN (100 μl) w pokrywie naczynia o średnicy 35 mm z HECM-9. Następnie przykryj średnie krople olejem mineralnym. Zrównoważyć pożywkę w inkubatorze przez noc w następujących warunkach: 37,5 °C, 10% CO₂, 5% O_2, 85% N₂ i 100% wilgotności.
3. W dniu przewidzianym do wstrzyknięcia PN należy przygotować naczynia do płukania zarodków (1 miska/chomik dawcy) z HECM-9 i przechowywać wszystkie szalki w inkubatorze do czasu użycia.
4. Eutanazja chomików z superowulacją za pomocą CO₂.
5. Izolacja jajowodu
   1. Umieść uśpioną samicę chomika w pozycji leżącej grzbietowej na serwety chirurgicznej lub bibułce i przygotuj brzuch za pomocą sprayu 70% etanolu.
   2. Mocno przytrzymaj skórę i warstwę mięśni brzucha na linii środkowej i wykonaj nacięcie. Naciąć otrzewną, aby odsłonić narządy jamy brzusznej.
   3. Chwyć jeden z rogów macicy cienkimi kleszczami i wycofaj tkankę z brzucha. Oddziel macicę od mezometrium i tkanki tłuszczowej. Wykonaj nacięcie między jajowódem a jajnikiem i drugie cięcie przylegające do połączenia jajowodu i macicy (obejmują niewielką część macicy). Umieść oba jajowody w tym samym naczyniu do spłukiwania.
6. Spłucz i zbierz zygoty
   1. Pod mikroskopem preparacyjnym chwyć bok rogu macicy kleszczami Dumonta #5 i włóż igłę domowej roboty (Rysunek 3) do światła jajowodu od końca lejka i przepłucz jajowód 300 - 400 μl pożywki HECM-9.
   2. Natychmiast zebrać zygoty i umyć je dwukrotnie pożywką HECM-9 w naczyniu manipulacyjnym. Na tym etapie rozwoju wszystkie zygoty powinny zostać ogołocone z komórek wzgórka.
   3. Umieść zygoty w inkubatorze (37,5 °C, 10% CO₂, 5% O_2, 85% N₂ i 100% wilgotności) natychmiast po pobraniu, aby zminimalizować ekspozycję na światło.

5. Wtrysk PN

1. Rozmrozić Cas9/sgRNA RNP na lodzie i utrzymywać kompleks na lodzie podczas całego procesu wstrzykiwania PN.
2. Załadować igły iniekcyjne roztworem Cas9/sgRNA RNP bezpośrednio przed eksperymentami iniekcyjnymi. Umieścić tylny koniec igieł do wstrzykiwań w probówce zawierającej roztwór Cas9/sgRNA RNP i pozwolić, aby roztwór Cas9/sgRNA RNP wypełnił igłę poprzez działanie kapilarne.
3. Przygotować naczynie do wstrzykiwań i igły. Napełnij pipetę z uchwytem olejem mineralnym z dokładnością do ~3 mm od zgięcia igły uchwytu. Umieścić uchwyt w mikrowstrzykiwaczu tak, aby końcówka igły była ustawiona poziomo do dna naczynia i napełnić końcówkę igły pożywką przez odsysanie. Ustawić igłę do wstrzykiwań pod kątem 10 - 15° w kierunku przeciwnym do uchwytu.
4. Wtrysk PN
   1. Zidentyfikuj zygotę i zastosuj drobne ssanie za pomocą igły uchwytu. Idealnie, męskie i żeńskie przedjądrze znajdują się w tym samym zakresie ogniskowych i są ustawione równolegle do uchwytu.
   2. Przebić przez strefę i przedjądrze męskie (pozycja godziny 3) za pomocą igły do wstrzykiwań.
   3. Po pęcznieniu przedjądrza należy szybko wyjąć igłę, aby zapobiec przyleganiu jądra do igły i uniknąć uszkodzenia przedjądrza.

6. Przeniesienie zygot do chomików w ciąży rzekomej

1. Znieczulij chomika w rzekomej ciąży (w taki sam sposób, jak opisano w sekcji wazektomii powyżej) i połóż go na serwety chirurgicznej lub suchej bibułce w pozycji brzusznej.
2. Nałóż smary do oczu zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu oczu i przykryj głowę szmatką lub papierem, aby chronić oczy przed światłem. Przygotuj boczną część ciała, goląc obszar skóry o wymiarach około 4 cm x 4 cm z każdej strony ciała, a następnie nakładając 3 razy peelingi powidonowo-jodowe i 3 razy peelingi etanolowe 70%. Wykonaj 2 cm pionowe nacięcie 2 cm ogonowo do ostatniego żebra (jak pokazano na Rysunki 4a, 4b) po każdej stronie grzbietu zwierzęcia.
3. Chwyć poduszeczkę tłuszczową kleszczami i delikatnie pociągnij, aż jajowód i macica będą widoczne. Zacisnąć poduszeczkę tłuszczową za pomocą hemostatyku i odbić poduszeczkę tłuszczową grzbietowo nad kręgosłupem (Rysunek 4c). Ustaw układ rozrodczy w taki sposób, aby jajowód mógł być penetrowany igłą o rozmiarze 30 w celu transferu zarodków (Rysunek 4d).
4. Umyj wstrzyknięte zygoty za pomocą HECM-9 w nowym naczyniu. Użyj nowej szklanej pipety (średnica: ~150 - 200 μm), aby załadować 10 - 15 zygot. Ułóż zygoty jako łańcuch pereł, a następnie kilka pęcherzyków powietrza. Włóż pipetę do otwartej rurki z penetracją z kroku 6.3 i delikatnie dmuchnij w pipetę, aby przenieść zygoty do jajowodu. Kontynuuj, aż pierwszy pęcherzyk powietrza zostanie uwolniony do przewodu jajowodowego (Rysunek 4e).
5. Uwolnij poduszkę tłuszczową i zwróć tkankę do brzucha. Przenieś w przybliżeniu taką samą liczbę (10 - 15) wstrzykniętych zarodków do innego przewodu jajowodowego za pomocą tych samych procesów.
6. Zszyj mięśnie i skórę w 2 warstwach. Buprenorfina-HCL (0,5 mg/kg) należy podawać podskórnie jako analgezję pooperacyjną. Umieść chomika z powrotem w klatce i umieść klatkę na ciepłej podkładce w celu odzyskania zdrowia. Umieść klatkę z powrotem w pomieszczeniu dla zwierząt, gdy zwierzę w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia. Pooperacyjne leki przeciwbólowe podaje się ponownie sześć godzin później.

Wyniki

Wydajność opisanego protokołu w otrzymywaniu genetycznie zmodyfikowanych chomików zależy od wyników dwóch następujących krytycznych etapów: wskaźnika żywych urodzeń u samic biorców oraz liczby żywych młodych z zamierzonymi modyfikacjami genetycznymi. Wskaźnik żywych urodzeń jest bezpośrednim wynikiem jakości zarodków oraz umiejętności osoby wykonującej procedury iniekcji do pronukleusa (PN) i transferu zarodków. Aby mieć pewność, że potencjał rozwojowy manipulowanych zarodków nie zostanie...

Dyskusja

Aby lepiej wykorzystać potencjał złotych chomików syryjskich jako modeli chorób u ludzi, opracowaliśmy protokół wstrzykiwania PN do dostarczania kompleksu CRISPR/Cas9 w celu celowania w genom chomika. Protokół iniekcji PN optymalizuje kilka kluczowych zmiennych, w tym pożywkę do hodowli zarodków, temperaturę i długości fal światła¹³. Istnieje również kilka procedur obchodzenia się ze zwierzętami specyficznymi dla chomików, których należy przestrzegać, aby skutecznie przeprowadzić celowanie genowe ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cas9	Invitrogen	B25640	1 μ g/μ L (~6,1 μ M)
GeneArtTM Zestaw do syntezy precyzyjnej	Invitrogen	A29377	Do syntezy sgRNA
Albumina z ludzkiej surowicy	Sigma	A1653	Do podłoża uprawowego
Illuminator		Nikon NI-150	Do transferu zarodków
Inkubator	New Brunswick	Galaxy 14S	Do hodowli zarodków
Microforge	Narishige	PB-7	Do wytwarzania igieł iniekcyjnych
Mikroskop	Nikon	ECLIPSE Ti-S Do	mikroiniekcji
Mikroskop	invitrogen	SMZ745T	Do transferu zarodków
Olej mineralny	Sigma	M1840	Przechowywać w ciemności
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	Do superowulacji