Pronuclear (PN) wstrzykiwanie systemu CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) i systemu CRISPR-related protein-9 nucleazy (CRISPR/Cas9) jest wysoce efektywną metodą produkcji genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich. W niniejszym artykule opisujemy szczegółowy protokół wstrzykiwania PN do produkcji chomików z nokautem genów za pomocą systemu CRISPR/Cas9.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Produkcja genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich metodą wstrzyknięcia projądrowego kompleksu CRISPR/Cas9
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Technika iniekcji projądrowej (PN) została po raz pierwszy opracowana u myszy w celu wprowadzenia obcych materiałów genetycznych do przedjądrzy zarodków w stadium jednokomórkowym. Wprowadzony materiał genetyczny może integrować się z genomem embrionalnym i generować zwierzęta transgeniczne z obcą informacją genetyczną po przeniesieniu wstrzykniętych zarodków do matek zastępczych. Po sukcesie u myszy, wstrzykiwanie PN zostało z powodzeniem zastosowane u wielu innych gatunków zwierząt. Ostatnio iniekcja PN została z powodzeniem zastosowana do wprowadzenia odczynników o działaniu modyfikującym geny, takich jak system CRISPR/Cas9, w celu uzyskania specyficznych dla miejsca modyfikacji genetycznych u kilku gatunków zwierząt laboratoryjnych i gospodarskich. Oprócz opanowania specjalnego zestawu umiejętności mikroiniekcji w celu produkcji genetycznie modyfikowanych zwierząt za pomocą iniekcji PN, naukowcy muszą zrozumieć fizjologię reprodukcji i zachowanie gatunków docelowych, ponieważ każdy gatunek stanowi unikalne wyzwania. Na przykład zarodki złotego chomika syryjskiego mają wyjątkowe wymagania dotyczące obchodzenia się z zarodkami in vitro, tak że techniki wstrzykiwania PN nie były możliwe u tego gatunku aż do niedawnych przełomów dokonanych przez naszą grupę. Dzięki naszemu zmodyfikowanemu gatunkowo protokołowi wstrzykiwania PN udało nam się wyprodukować kilka chomików z nokautem genów (KO) i knockin (KI), które z powodzeniem wykorzystano do modelowania chorób ludzkich. Tutaj opisujemy procedurę wstrzykiwania PN w celu dostarczenia kompleksu CRISPR/Cas9 do zygot chomika, warunki obchodzenia się z zarodkiem, procedury transferu zarodków i hodowlę wymaganą do wytworzenia chomików modyfikowanych genetycznie.
Wprowadzenie
Złoty chomik syryjski (Mesocricetus auratus) jest jednym z najczęściej wykorzystywanych gryzoni do badań biomedycznych. Według Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, w 2015 r. w Stanach Zjednoczonych wykorzystano około 100 000 chomików, co stanowi 13% całkowitego wykorzystania zwierząt laboratoryjnych wśród gatunków objętych ustawą o dobrostanie zwierząt (http://www.aphis.usda.gov; dostęp 10 marca 2017 r.).
Chomik oferuje kilka zalet w porównaniu z innymi gryzoniami w badaniu wielu chorób ludzkich. Na przykład histopatologia gruczolakoraków przewodowych trzustki wywołanych N-nitrozobis(2-oksopropylo)aminą (BOP) u chomików jes....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Utah (protokół IACUC: 2484). Chomiki użyte w tym protokole to dorosłe (w wieku 6 - 10 tygodni) złote chomiki syryjskie szczepu LVG. Wszystkie chomiki są trzymane w wiwarium w centrum bioinnowacji na Uniwersytecie Stanowym Utah. Temperatura w pomieszczeniu jest ustawiona na 23 °C, wilgotność jest ustawiona na 40 - 50%, a cykl światła jest ustawiony na 14L:10D (jasny:ciemny). Jeśli to możliwe, manipulacja zarodkami i zabiegi chirurgiczne powinny być wykonywane technikami sterylnymi.
1. Przygotowanie rybonukleop....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wydajność opisanego protokołu w otrzymywaniu genetycznie zmodyfikowanych chomików zależy od wyników dwóch następujących krytycznych etapów: wskaźnika żywych urodzeń u samic biorców oraz liczby żywych młodych z zamierzonymi modyfikacjami genetycznymi. Wskaźnik żywych urodzeń jest bezpośrednim wynikiem jakości zarodków oraz umiejętności osoby wykonującej procedury wstrzykiwania do pronukleusa (PN) i transferu zarodków. Aby mieć pewność, że potencjał rozwojowy manipulowanych zarodków nie zos.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby lepiej wykorzystać potencjał złotych chomików syryjskich jako modeli chorób u ludzi, opracowaliśmy protokół wstrzykiwania PN do dostarczania kompleksu CRISPR/Cas9 w celu celowania w genom chomika. Protokół iniekcji PN optymalizuje kilka kluczowych zmiennych, w tym pożywkę do hodowli zarodków, temperaturę i długości fal światła13. Istnieje również kilka procedur obchodzenia się ze zwierzętami specyficznymi dla chomików, których należy przestrzegać, aby skutecznie przeprowadzić celowanie genowe .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
ZW ma udziały finansowe w Auratus Bio, LLC., firmie biotechnologicznej specjalizującej się w tworzeniu genetycznie modyfikowanych zwierząt do badań biomedycznych i zastosowań rolniczych.
Podziękowania
Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institutes of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the National Institutes of Health pod numerem grantu 1R41OD021979 (dla ZW) oraz przez grant badawczy z Next-Generation BioGreen 21 Program, Republika Korei, grant nr. PJ01107704 (do ZW) i grant nr. PJ01107703 (do IK). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health lub BioGreen 21. Dziękujemy dr Nikolasowi Roglowi za zredagowanie manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μ g/μ L (~6,1 μ M) |
| GeneArtTM Zestaw do syntezy precyzyjnej | Invitrogen | A29377 | Do syntezy sgRNA |
| Albumina z ludzkiej surowicy | Sigma | A1653 | Do podłoża uprawowego |
| Illuminator | Nikon NI-150 | Do transferu zarodków | |
| Inkubator | New Brunswick | Galaxy 14S | Do hodowli zarodków |
| Microforge | Narishige | PB-7 | Do wytwarzania igieł iniekcyjnych |
| Mikroskop | Nikon | ECLIPSE Ti-S Do | mikroiniekcji |
| Mikroskop | invitrogen | SMZ745T | Do transferu zarodków |
| Olej mineralny | Sigma | M1840 | Przechowywać w ciemności |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | Do superowulacji |
Bibliografia
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
