Artykuł metodologiczny

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

DOI:

10.3791/56277

⸱

24 września 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest zoptymalizowana procedura oczyszczania i hodowli pBECs oraz ustanowienie in vitro modeli bariery krew-mózg (BBB) opartych na pBECs w monokulturze (MC), MC z pożywką kondycjonowaną przez astrocyty (ACM) i bezkontaktowej kokulturze (NCC) z astrocytami pochodzenia wieprzowego lub szczurzego. pBECs zostały wyizolowane i wyhodowane z fragmentów naczyń włosowatych z kory mózgowej świń domowych w wieku 5-6 miesięcy. Fragmenty te oczyszczono poprzez staranne usunięcie opon mózgowych, izolację i homogenizację istoty szarej, filtrację, trawienie enzymatyczne i odwirowanie. Aby jeszcze bardziej wyeliminować zanieczyszczające komórki, fragmenty naczyń włosowatych hodowano z pożywką zawierającą puromycynę. Gdy 60-95% zlewają się, pBEC wyrastające z fragmentów kapilarnych zostały przepuszczone do przepuszczalnych wkładów filtracyjnych membranowych i ustalone w modelach. W celu zwiększenia szczelności bariery i charakterystycznego dla BBB fenotypu pBEC, komórki potraktowano następującymi czynnikami różnicującymi: przepuszczalnym przez błonę 8-CPT-cAMP (tutaj w skrócie cAMP), hydrokortyzonem i inhibitorem fosfodiesterazy RO-20-1724 (RO). Zabieg przeprowadzano przez okres 9-11 dni, a przy ustalaniu modelu NCC astrocyty hodowano z 2-8 tygodniowym wyprzedzeniem. Przestrzeganie procedur opisanych w protokole pozwoliło na ustanowienie warstw śródbłonka o bardzo ograniczonej przepuszczalności parakomórkowej, przy czym model NCC wykazuje średni transśródbłonkowy opór elektryczny (TEER) wynoszący 1249 ± 80 Ω cm2 i przepuszczalność parakomórkową (P app) dla Lucyfera Yellow wynoszącą 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sec-1 (średnia ± SEM, n=55). Dalsza ocena tego fenotypu pBEC wykazała dobrą ekspresję białek ściśle połączeniowych klaudyny 5, ZO-1, okludyny i kateniny białka połączeniowego p120 adherenów. Przedstawiony model może być wykorzystany do szeregu badań nad barierą krew-mózg w zdrowiu i chorobie, a dzięki wysoce restrykcyjnej przepuszczalności parakomórkowej model ten nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktura komórkowa i funkcja bariery krew-mózg

Na styku układu krążenia i ośrodkowego układu nerwowego (OUN), BBB działa jako kluczowe miejsce regulacyjne dla homeostatycznej kontroli mikrośrodowiska OUN, co jest niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania i ochrony układu nerwowego. Miejscem bariery krew-mózg są komórki śródbłonka wyściełające światło naczynia krwionośnego. W naczyniach włosowatych mózgu komórki śródbłonka tworzą złożone ścisłe połączenia międzykomórkowe, a silnie spolaryzowane wzorce ekspresji poszczególnych transporterów napływu i odpływu zapewniają wysoce specyficzny transport molekularny między krwią a mózgiem 1. Składniki strukturalne kompleksów połączeń ścisłych obejmują białka z rodziny okludyny i klaudyny, białka zonula occludens (ZO), cingulinę i związane z nią cząsteczki adhezji złącznej (JAM). Klaudyna 5 jest szczególnie ważna w ograniczeniu połączeń przykomórkowych. Indukcja i utrzymanie tego charakterystycznego fenotypu śródbłonka BBB obejmuje dynamiczne interakcje z otaczającymi komórkami, w tym perycytami, astrocytami, neuronami i błonami podstawnymi, które wraz z komórkami śródbłonka mózgu tworzą jednostkę nerwowo-naczyniową (NVU)2,3. Mechanizmy związane z tymi interakcjami nie są jeszcze w pełni poznane, ale obejmują wymianę sygnałów chemicznych między komórkami, co pozwala na modulację przepuszczalności BBB w krótkim okresie i indukuje długoterminowe cechy BBB4. Astrocyty są szczególnie znane z tego, że przyczyniają się do fenotypu komórek śródbłonka mózgu i są źródłem czynników regulacyjnych, takich jak czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (wpływający na wewnątrzkomórkowy cAMP)5, podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów6, hydrokortyzon7 i transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β)8. Wpływ TGF-β był jednak przedmiotem dyskusji9.

Od In Vivo do In Vitro BBB

Badania in vivo nadal dostarczają cennych informacji na temat biologii BBB. Jednak modele hodowli komórkowych mogą dostarczyć dodatkowych informacji i stanowić użyteczne narzędzia do zrozumienia szczegółowych molekularnych i funkcjonalnych aspektów bariery krew-mózg zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Chociaż złożone interakcje między typami komórek i składnikami BBB są trudne do pełnego osiągnięcia w modelach in vitro, od czasu pierwszego oczyszczenia komórek śródbłonka mózgu i zastosowania ich w monokulturach zaszły takie przypadki10,11,12, szeroko zakrojony rozwój procedur oczyszczania i warunków wzrostu modeli hodowli komórkowych BBB, co skutkuje większym podobieństwem do bariery in vivo. Powszechnie stosowane modele BBB in vitro oparte są na pierwotnych komórkach pochodzących od gryzoni, świń i bydła oraz na unieśmiertelnionych liniach komórkowych. Każdy model ma inne zalety i wady. Do porównania i wyboru modelu wykorzystywane są markery walidacyjne, takie jak ekspresja enzymów BBB, transporterów, receptorów i białek strukturalnych, do tworzenia przeglądów aktualnie ustalonych modeli1.

Cel protokołu

Jedną z ważnych cech BBB jest szczelność bariery i wysoki TEER, jednak duża liczba dostępnych modeli nie odzwierciedla dobrze poziomów in vivo. Uwzględniając wkład rozwojowy i optymalizacyjny z kilku laboratoriów, celem niniejszego protokołu jest przedstawienie metody ustanawiania modelu BBB o wysokim TEER in vitro w oparciu o pierwotne pBEC w MC z ACM lub bez ACM lub w NCC z pierwotnymi astrocytami pochodzenia szczurzego lub wieprzowego. Zastosowane procedury i ustanowienie modelu obejmują wysiłki mające na celu wyeliminowanie zanieczyszczających komórek i poprawę różnicowania pBEC w fenotyp BBB. Prace te zaowocowały stworzeniem niezawodnych modeli o wysokim TEER o niskiej przepuszczalności parakomórkowej i dobrej ekspresji funkcjonalnej kluczowych białek połączeń ścisłych, transporterów i receptorów. Ponieważ jednak astrocyty są czynnikiem przyczyniającym się do fenotypu komórek śródbłonka mózgu, trzy różne warunki hodowli reprezentują trzy różne fenotypy komórek śródbłonka mózgu. Model NCC jest szczególnie przydatny do badań nad pewnymi wyspecjalizowanymi mechanizmami związanymi z odkrywaniem leków, badaniami transportu i transportem wewnątrzkomórkowym, a także do badania interakcji komórka-komórka, w których maksymalna ekspresja cech BBB jest korzystna.

Pochodzenie i historia protokołu

Opisany tutaj model pBEC jest w dużej mierze oparty na modelu świńskim opracowanym w Eisai Laboratories (Londyn) przez dr Louise Morgan i współpracowników, który jest oparty na udanym wcześniejszym modelu komórek śródbłonka mózgu bydlęcego13. Pierwotna metoda przygotowania komórek polegała na dwuetapowej filtracji przy użyciu siatek nylonowych do wyłapywania mikronaczyń, a następnie etapie subkulturacji w celu poprawy czystości. We wcześniejszym opracowaniu metody optymalny fenotyp BBB i szczelność bariery uzyskano poprzez wzrost w pożywce suplementowanej, w tym ACM. Dalsze modyfikacje metody zostały wprowadzone przez R. Skinnera w laboratorium prof. N. Rothwella w Manchesterze w Wielkiej Brytanii14,15. Metoda została przyjęta przez laboratorium Abbott, KCL London, gdzie Patabendige znacznie uprości przygotowanie, unikając użycia astrocytów lub ACM i eliminując puromycyną zanieczyszczające komórki, takie jak perycyty. Pierwsze prace potwierdziły, że model MC zachował kilka ważnych cech BBB in vivo, w tym skuteczne połączenia ścisłe, systemy transportu błonowego i transcytozę za pośrednictwem receptora16,17,18,19,20. Później S. Yusof ponownie przetestował kohodowlę astrocytów i stwierdził, że znacznie poprawiła TEER, więc jest to preferowany wariant obecnie używany w Abbott lab21. Model został teraz pomyślnie przeniesiony do laboratorium M. Nielsen w Aarhus, gdzie wprowadzono dalsze modyfikacje (ten protokół), w tym uproszczenie ekstrakcji istoty szarej, przy użyciu tylko jednego etapu filtracji siatkowej oraz pojedynczego etapu powlekania filtra łączącego kolagen i fibronektynę. Zastosowana procedura izolacji astrocytów świń (ten protokół) została oparta na protokołach opracowanych przez laboratorium T. Moos w Aalborgu, opisanych przez Thomsen et al22. TEER i inne właściwości modelu wygenerowanego w Londynie i Aarhus są podobne, co daje pewność poglądowi, że model jest łatwo przenoszony między laboratoriami i dobrze reaguje na uważną obserwację i racjonalizację etapów metody. Rzeczywiście, S. Yusof ustalił model MC w kraju tropikalnym (Malezja)23, co wymagało dalszego dostosowania do lokalnych warunków i źródeł tkankowych.

Zalety w porównaniu z alternatywnymi metodami i obecnie istniejącymi modelami

W porównaniu do komórek śródbłonka mózgu pochodzenia bydlęcego i gryzońskiego, pBECs mają tę zaletę, że mają niższy wskaźnik utraty fenotypu BBB in vivo po izolacji24. Co więcej, pBEC są zdolne do tworzenia stosunkowo szczelnych barier śródbłonkowych, nawet gdy są uprawiane w MC (800 Ω cm2)16 w porównaniu z powszechnie zgłaszanymi poziomami dla monowarstw linii komórkowych, takich jak bEND.5 i bEND.3 (50 Ω cm2)25,26,27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30 i cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32, oraz pierwotne komórki śródbłonka mózgu myszy (100-300 Ω cm2)33,34,35,36 i szczur (100-300 Ω cm2)37, 38. Wykazano jednak, że TEER jest zależny od procedur oczyszczania i hodowli. W większości przypadków dodanie ACM lub kohodowli z astrocytami wykazuje różnicujący wpływ na komórki śródbłonka i wzrost szczelności warstw śródbłonka1. Niemniej jednak, dzięki wysiłkom na rzecz optymalizacji warunków hodowli, tylko modele oparte na bydle wykazały wartości TEER porównywalne z modelami opartymi na świniach (średnie 800 Ω cm2 w MC, do 2500 Ω cm2 w kohodowli astrocytów)13,39,40,41,42,43,44,45. Ponieważ modele oparte na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu bydlęcego wykazały duże różnice, zarówno między laboratoriami, jak i w ich obrębie14,45,46,47,48, odtwarzalność może stanowić problem. W przedstawionym tutaj modelu pBEC laboratoria biorące udział w projekcie osiągnęły bardzo podobne wartości TEER i przepuszczalności parakomórkowej przy niskiej zmienności, zarówno w laboratoriach, jak i między nimi. W związku z tym inne laboratoria powinny być w stanie ustanowić solidny model o niskiej zmienności przy użyciu przedstawionej tutaj metody. Oprócz tworzenia ścisłych warstw śródbłonka, modele z pBEC zostały wcześniej zweryfikowane pod kątem ekspresji białek połączeń ścisłych, funkcjonalnych transporterów BBB, receptorów i enzymów oraz wykazały przydatność w szeregu badań15,16,17,19,20,22,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. Ponadto niepublikowane dane transkryptomiczne dotyczące kokultur pBEC pokazują oczekiwany profil transporterów i receptorów BBB (niepublikowane wyniki, Nielsen i wsp.).

Model BBB oparty na świniach ma dodatkową zaletę, ponieważ genom, anatomia, fizjologia i postęp choroby świni odzwierciedlają biologię człowieka w wyższym stopniu niż inne uznane modele60, które są korzystnymi cechami dla przemysłu farmaceutycznego. Ponieważ mózgi świń są powszechnym produktem ubocznym przemysłu mięsnego, stanowią one łatwo dostępne źródło komórek śródbłonka mózgu, minimalizując liczbę zwierząt potrzebnych do eksperymentów i zapewniając wysoką wydajność oczyszczania z jednego mózgu świni. Chociaż oczyszczanie i hodowla komórek pierwotnych jest nieco czasochłonna i wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie standaryzacji podczas tworzenia modelu, komórki pierwotne generują najbardziej wiarygodne modele BBB. Unieśmiertelnione linie komórkowe nie mogą być substytutem, ponieważ ważne właściwości, takie jak szczelność bariery, profile ekspresji transportera i regulacja mikrośrodowiska, nie odzwierciedlają wyników eksperymentu in vivo61,62. Modele in vitro zapewniają przewagę obrazowania żywych komórek o wyższej rozdzielczości, umożliwiając wizualizację procesów wewnątrzkomórkowych poprzez umożliwienie zbliżenia się do próbkowanych lub obserwowanych komórek, przy użyciu obiektywów o większym powiększeniu i lepszej jakości optycznej63. Inaczej jest w przypadku stosowania mikroskopii dwufotonowej u żywych zwierząt. Co więcej, modele in vitro zapewniają możliwość transfekcji komórek, umożliwiając wizualizację znakowanych białek i badanie ich transportu.

Zastosowania modelu

Funkcja BBB nie jest stała i może być dynamicznie modulowana zarówno w fizjologii, jak i patologii. W wielu chorobach neurologicznych, w tym chorobach neurodegeneracyjnych, zapalnych i zakaźnych, obserwuje się zakłócenie i zwiększoną przepuszczalność bariery krew-mózg64,65,66,67. W celu zmniejszenia i zapobieżenia postępowi choroby i późniejszym uszkodzeniom, identyfikacja i charakterystyka mechanizmów molekularnych leżących u podstaw modulacji BBB ma ogromne znaczenie. W tym kontekście przemysł farmaceutyczny bardzo poszukuje wiarygodnych modeli in vitro, które odgrywają również ważną rolę w przewidywaniu przepuszczalności krwi (BBB) leków do OUN. Każdy model in vitro służący jako ekran przepuszczalności powinien wyświetlać restrykcyjny szlak parakomórkowy, fizjologicznie realistyczną architekturę komórki i funkcjonalną ekspresję mechanizmów transportera68. Wykazany w poprzednich badaniach16,17,57, oraz przez przepuszczalność parakomórkową i ekspresję białek TJ i AJ tutaj, prezentowany model spełnia wszystkie te kryteria i nadaje się do szeregu badań BBB zarówno w normalnej fizjologii, jak i patologii. Do mocnych stron przedstawionej metody oczyszczania i hodowli należy połączenie prostoty i powtarzalności oraz możliwość uwzględnienia wpływu astrocytarnego z uzyskanym solidnym i wiarygodnym modelem BBB o wysokim współczynniku TEER in vitro. W tym celu wykazano, że astrocyty pochodzenia świńskiego i szczurzego zwiększają fenotyp BBB pBEC w podobny sposób22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózgi świń zostały uzyskane jako produkty uboczne duńskiego przemysłu spożywczego. Duńskie rzeźnie znajdują się pod ścisłym nadzorem i obserwacją duńskiego Ministerstwa Środowiska i Żywności.

Szczury używane do izolacji astrocytów były hodowane i trzymane grupowo w lokalnym obiekcie dla zwierząt w temperaturze otoczenia 22 °C-23 °C i w cyklu 12/12 godzin ciemności/światła pod nadzorem weterynarza i zgodnie z duńskimi przepisami dotyczącymi zwierząt laboratoryjnych. Szczury zostały poddane eutanazji przed uśmierceniem zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt (dyrektywa Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24 listopada 1986 r.; 86/609/EWG) i duńskimi wytycznymi. W tych eksperymentach nie przeprowadzono żadnych eksperymentów in vivo na zwierzętach lub ludziach.

UWAGA: Poniżej znajduje się główny protokół pBEC opisujący (Krok 1) oczyszczanie, (Krok 2) uprawę i (Krok 3) pomiary TEER. W celu utworzenia NCC z astrocytami przedstawiono alternatywny protcol (Krok 4) opisujący oczyszczanie i hodowlę astrocytów szczurów i świń.

1. Oczyszczanie naczyń włosowatych mózgu świni

  1. Zbierz 8-10 mózgów od 5-6 miesięcznych świń domowych (np. z pobliskiej rzeźni) i przetransportuj je na lodzie do laboratorium. Zalecamy rozpoczęcie następującej procedury oczyszczania w ciągu 2-3 godzin od uśmiercenia zwierzęcia.
  2. Umieść mózgi w sterylnej ławce przepływowej i delikatnie umyj je 1 litrem PBS w zlewce umieszczonej na lodzie.
  3. Ostrożnie usuwaj opony mózgowe z jednego mózgu na raz za pomocą kleszczy z cienką końcówką i przenieś mózgi wolne od opon mózgowych do innej zlewki o pojemności 1 l z PBS umieszczonym na lodzie. Wydłużenie czasu potrzebnego na usunięcie może skomplikować usunięcie. Przybliżony czas stosowany dla każdego mózgu powinien wynosić 10-15 minut.
  4. Za pomocą skalpela zeskrob istotę szarą z jednego mózgu na raz i przenieś wyizolowany materiał na szalki Petriego (8,8 cm2) zawierające 20 ml mieszanki składników odżywczych DMEM F-12 (DMEM/F-12) umieszczonej na lodzie. Wyizolować jak najwięcej istoty szarej bez wycofywania materiału istoty białej. W celu wstępnej fragmentacji przepuść materiał istoty szarej przez strzykawkę o pojemności 50 ml bez igły. Kontynuuj dla wszystkich mózgów i połącz zebrany materiał istoty szarej. Wydłużenie czasu potrzebnego na usunięcie może skomplikować usunięcie. Przybliżony czas stosowany dla każdego mózgu powinien wynosić 10-15 minut.
  5. Przenieś wyizolowany materiał istoty szarej do probówki rozdrabniacza ręcznego homogenizatora tkanek w stosunku 50/50 z pożywką DMEM/F-12. Homogenizuj materiał, wykonując 8 ruchów w górę iw dół luźnym tłuczkiem, a następnie 8 ruchów w górę iw dół ciasnym tłuczkiem. Kontynuuj, aż cały wyizolowany materiał zostanie zhomogenizowany, następnie przenieś homogenat do butelki o pojemności 500 ml i rozcieńcz DMEM/F-12 do około 450 ml całkowitej objętości.
  6. Przefiltruj homogenat za pomocą butelki z niebieską nakrętką o pojemności 500 ml z uchwytem filtra i siatką filtracyjną 140 μm, a następnie wyizoluj naczynia włosowate, przepuszczając tkankę przez filtr. Użyj jednego filtra na 50 ml homogenatu, a następnie umyj każdy filtr DMEM/F-12.
  7. Umieścić filtry kapilarne na szalkach Petriego z roztworem trawiącym trypsyny/EDTA (2,5 % trypsyny, 0,1 nM EDTA w PBS), kolagenazy CLS2 (2 000 U / ml) i DNazy 1 (3 400 U / ml) w DMEM/F-12. Użyj 1 szalki Petriego (8,8 cm2, 20 ml roztworu) na 3 oczka filtracyjne.
  8. Umieścić szalki Petriego w temperaturze 37 °C na 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min lub delikatnie mieszać je co 10 minut. Po 1 godzinie zmyć kapilary z filtrów zawiesiną z płytki Petriego za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  9. Podziel zawiesinę z 3 szalek na 2 probówki o pojemności 50 ml i zatrzymaj trawienie, dodając 10 ml DMEM/F-12 do każdej probówki o pojemności 50 ml.
  10. Odwirować zawiesiny komórkowe w temperaturze 250 x g, 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatanty i ponownie zawiesić każdą osadkę w 10 ml DMEM/F-12. Dodać kolejne 20 ml DMEM/F12 do każdej probówki. Powtórz ten krok wirówki dwukrotnie.
  11. Pozwól probówkom ostygnąć na lodzie przez 5 minut i przenieś roztwory do 2 nowych probówek o pojemności 50 ml.
  12. Odwirować zawiesiny komórkowe w temperaturze 250 x g, 4 °C przez 5 minut i ponownie zawiesić każdą osadkę w 8 - 10 ml (około 1 ml / mózg) roztworu do zamrażania składającego się z 10% DMSO w FBS.
  13. Przenieść zawiesinę komórkową do kriowialiów, używając 1 ml na kriowial. Średnio w wyniku oczyszczenia otrzymuje się 1 fiolkę na użyty mózg, co średnio zapewnia komórki śródbłonka na 12-16 wkładek. Umieścić fiolki w zamrażarce w temperaturze -80 °C na co najmniej 4 godziny, aż do nocy. Następnie przechowuj kriowiale w kriozbiorniku z ciekłym azotem.
    Uwaga: Ciekły azot ma bardzo niskie temperatury. Proszę nosić odpowiednią ochronę.

2. Uprawa pierwotnych pBEC (8-10 dni)

  1. Początkowa kultura (3-5 dni)
    Dzień 1
    1. Aby zoptymalizować warunki przyłączania pBEC, należy wykonać powlekanie kolby T75 poprzez dodanie roztworu z końcowymi stężeniami kolagenu IV (150 μg/ml) i fibronektyny (50 μg/ml) w ddH2O do kolby, upewniając się, że roztwór pokrywa całą powierzchnię. Użyć 10 ml na każdą kolbę T75. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 h.
      UWAGA: Powlekanie można wykonać tuż przed użyciem lub do tygodnia przed i przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C. Powłoka nie może wyschnąć, w przeciwnym razie nie będzie już tworzyć odpowiedniej powierzchni przylegania i wzrostu.
    2. Przygotuj 16 ml pożywki wzrostowej pBEC składającej się z DMEM/F-12 uzupełnionej 10% surowicą pochodzącą z osocza (PDS), penicyliną (100 U/ml), streptomycyną (100 μg/ml) i heparyną (15 U/ml). Uzupełnij pożywkę puromycyną (4 μg/ml), aby wybrać komórki śródbłonka. Należy pamiętać, że kuracja puromycyną może być stosowana maksymalnie przez 5 dni.
    3. Przygotować pożywkę podzielić na objętości 6 ml i 10 ml w dwóch probówkach po 15 ml.
    4. Przynieść fiolkę z naczyniami włosowatymi z ciekłego azotu (krok 1.13) i rozmrozić naczynia włosowate przy użyciu łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub przez dodanie 750 μl przygotowanej pożywki z 6 ml podwielokrotności. W przypadku rozmrażania przez dodanie pożywki należy ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby rozmrozić i homogenizować zawiesinę. Po rozmrożeniu przenieść zawiesinę komórkową do podwielokrotności pożywki o objętości 6 ml.
    5. Aby usunąć pożywkę zamrażającą, odwirować naczynia włosowate w temperaturze 250 x g, 4 °C przez 7 minut.
    6. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1-2 ml 10-mililitrowej porcji. Po ponownym zawieszeniu przenieść roztwór do podwielokrotności pożywki o objętości 10 ml.
    7. Przenieść zawiesinę kapilarną do powlekanej kolby T75 i delikatnie przechylić kolbę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na powierzchni. Umieścić kolbę T75 w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      Dzień 2
    8. Po całonocnej inkubacji przygotować 10 ml pożywki wzrostowej pBEC uzupełnionej puromycyną (4 μg/ml) dla jednej kolby T75 i przeprowadzić zmianę pożywki. Należy pamiętać, że wszystkie roztwory pożywki nakładane na komórki powinny być wstępnie podgrzane do temperatury 37 °C przed użyciem.
      UWAGA: Alternatywnie można przeprowadzić wymianę podłoża 4-6 godzin po posadzeniu, gdy kapilary powinny być przymocowane do powierzchni. Inkubuj komórki do osiągnięcia 60-95% konfluencji, zwykle 3-5 dni od rozmrożenia. Nie pozwól, aby komórki osiągnęły 100% zbieżności, aby uniknąć zahamowania kontaktu, które może zatrzymać dalszy wzrost komórek.
      Dzień 4-6
    9. Po osiągnięciu pożądanego zbiegu należy przemieścić komórki śródbłonka do przepuszczalnych wkładek błonowych (patrz punkt 2.2). Jeśli pożądana konfluencja nie zostanie osiągnięta w 4 dniu, przeprowadza się zmianę podłoża. Najpóźniej w 6 dniu komórki powinny zostać przeniesione do przepuszczalnych wkładek membranowych. Jeśli wymagana konfluencja nie zostanie osiągnięta do 6 dnia, komórki nie nadają się do użytku doświadczalnego.
      UWAGA: Przygotowanie astrocytów do NCC: Podczas tworzenia modelu kohodowli, 2-8 tygodniowe astrocyty w hodowli (patrz sekcja 4) powinny być przygotowane do modelu kohodowli, wykonując zmianę pożywki w dniu poprzedzającym pasaż komórek śródbłonka do wstawień. Dla każdej studzienki astrocytów przygotuj 1500 μl pożywki dla wzrostu astrocytów składającej się z DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% FBS, penicyliny (100 U/ml) i streptomycyny (100 μg/ml), a następnie wykonaj zmianę pożywki.
  2. Wzrost pBEC na przepuszczalnych wkładach membranowych (5 dni)
    Dzień 4-6
    1. Przygotuj przepuszczalne wkładki membranowe (płytka 12-dołkowa z wkładkami o powierzchni 1,12cm2, pory 0,4 μm) do wysiewu pBEC poprzez pokrycie kolagenem IV (500 μg/ml) i fibronektyną (100 μg/ml) w ddH2O. Użyj około 300 μl na każdą wkładkę i upewnij się, że roztwór pokrywa całą powierzchnię uprawy. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny.
    2. Przygotować 30 ml pożywki wzrostowej pBEC (skład pożywki, patrz sekcja 2.1.2) bez puromycyny.
    3. Odessać pożywkę z kultury pBEC do kolby T75 i delikatnie przemyć dwa razy 5 ml sterylnego PBS w temperaturze pokojowej.
    4. Trypsynizować komórki, dodając 2 ml roztworu trypsyny-EDTA (2,5% trypsyny, 0,1 nM EDTA w PBS) do T75 i umieścić kolbę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 5-7 minut.
    5. Aby odłączyć komórki śródbłonka mózgu, delikatnie postukaj w bok kolby T75 opuszkami palców, ostatecznie pozostawiając ocalałe i silniej przyczepiające się perycyty na powierzchni kolby. Wizualnie zbadaj oderwanie pod mikroskopem. Gdy zaobserwuje się 80% oderwania, przerwij trypsynizację, dodając 5 ml pożywki.
    6. Przenieść roztwór komórek do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 10 ml i odwirować komórki śródbłonka mózgu przez odwirowanie przy 250 x g, 4 °C przez 7 minut.
    7. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce o pojemności 1 ml. Po zawieszeniu dodać kolejne 2 ml pożywki, aby uzyskać całkowitą objętość do 3 ml
    8. Ręczne liczenie komórek za pomocą komory do zliczania komórek lub automatycznego systemu zliczania komórek. Przygotuj roztwór komórek o stężeniu 2,2 x 105 komórek/ml podłoża, co daje końcową gęstość wysiewu 1,1 x 105 komórek/wkładkę.
    9. Usunąć roztwór powlekający z przepuszczalnych wkładek membranowych i przenieść 500 μl zawiesiny komórek do każdej wkładki. Na jednej z wkładek dodaj tylko pożywkę i użyj tej wkładki jako kontroli "tylko filtr" dla pomiarów TEER.
    10. Ustal komórki śródbłonka w MC, MC z ACM lub w NCC z astrocytami w następujący sposób:
      1. Dla MC: Dodać 1500 μl pożywki wzrostowej pBEC/ACM na dołek 12-dołkowej płytki pod przepuszczalnymi wkładkami membranowymi. Umieścić przepuszczalne wkładki membranowe w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubować przez 2 dni.
      2. Dla NCC: Przenieś wkładki do studzienek z astrocytami odświeżonymi pożywką dla wzrostu astrocytów dzień wcześniej. Umieścić przepuszczalne wkładki membranowe w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubować przez 2 dni.
        UWAGA: Należy pamiętać o użyciu różnych typów nośników w dolnych studzienkach trzech modeli.
        Dzień 6-8
    11. W dniu 2 należy zmienić media na przepuszczalnych wkładach membranowych z pBEC. Przygotuj 500 μl pożywki wzrostowej pBEC na wkładkę i ostrożnie wykonaj zmianę, aby zminimalizować zakłócenie warstwy komórkowej. Inkubuj komórki przez dwa dni. Należy pamiętać, że wymiana mediów odbywa się tylko na wkładkach, a nie na studzienkach dennych.
  3. Stymulacja czynnikami różnicującymi (1-2 dni)
    Dzień 8-10
    1. Dla każdego z różnych modeli podłoża stymulacyjne należy przygotować w następujący sposób:
      1. Dla MC: Dla każdej wkładki i studzienki przygotuj 500 μl pożywki wzrostowej pBEC zawierającej cAMP (250 μM), hydrokortyzon (550 nM) i RO (17,5 μM).
        MC: Przygotuj dodatkowo 1500 μl pożywki wzrostowej pBEC zawierającej cAMP (250 μM), hydrokortyzon (550 nM) i RO (17,5 μM).
        MC z ACM: Rozmrozić 1500 μL ACM i uzupełnić go o cAMP (250 μM), hydrokortyzon (550 nM) i RO (17,5 μM).
      2. Dla NCC: Dla każdej wkładki należy przygotować 500 μl pożywki wzrostowej pBEC zawierającej cAMP (250 μM), hydrokortyzon (550 nM) i RO (17,5 μM). Dla każdej studzienki astrocytów przygotuj 1500 μl DMEM/F-12 uzupełnionego penicyliną (100 U/ml) i streptomycyną (100 μg/ml), heparyną (15 U/ml), cAMP (250 μM), hydrokortyzonem (550 nM) i RO (17,5 μM).
    2. Dla każdego z różnych modeli przeprowadź wymianę nośników w następujący sposób:
      1. Dla MC: Ostrożnie odessać pożywkę z dołków i wkładek i dodać pożywkę różnicującą do obu komór, używając 500 μl na każdą wkładkę i 1500 μl na każdą studzienkę. Należy pamiętać, że zakłócenia po obu stronach wkładki mogą wpływać na warstwę komórkową i zakłócać ją.
      2. Dla NCC: Ostrożnie odessać pożywkę z dołków i dodać 750 μl pożywki różnicującej do dołka. Ostrożnie odessać pożywkę z wkładek i dodać 500 μl pożywki różnicującej na wkładkę. Następnie dodaj pozostałe 750 μl pożywki różnicującej do każdego studzienki astrocytów.
    3. Dla wszystkich modeli: Umieścić komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubować z pożywką różnicującą do następnego dnia.
      UWAGA: Należy pamiętać, że w przypadku NCC z astrocytami, astrocyty są od tego momentu przechowywane w pożywce wolnej od surowicy.

3. Pomiary TEER

  1. Następnego dnia po stymulacji komórek pożywką różnicującą należy przygotować system komory do pomiaru oporu tkanek do pomiarów TEER poprzez przepłukanie komory dwa razy ddH2O, jeden raz 70% EtOH przez 5 min i jeszcze 2 razyddH2O.
  2. Dodaj 4 ml DMEM/F-12 do komory pomiaru oporu tkanek, podłącz ją do systemu i kalibruj przez około 30 minut zgodnie z następującymi ustawieniami: R = 0, Test R = 1000, Tryb = R.
  3. Wykonaj pomiary TEER, ostrożnie umieszczając wkładki w komorze pomiaru oporu tkanek. Dla każdej wkładki należy wykonać pomiary w trzech egzemplarzach i obliczyć średnią Ω cm2,
    UWAGA: W przypadku modelu kokultury oczekuje się, że wartości TEER osiągną >500 Ω cm2. Jeżeli odpowiedni poziom TEER nie zostanie osiągnięty w pierwszym dniu pomiaru TEER, należy dodać nowe współczynniki różnicujące (cAMP (250 μM), hydrokortyzon (550 nM) i RO (17,5 μM)) i ponownie zmierzyć TEER następnego dnia. Po osiągnięciu odpowiednich poziomów model powinien być gotowy do planowanego eksperymentu. Należy pamiętać, że komórki powinny odpoczywać przez co najmniej 3 godziny przed wykonaniem eksperymentu, aby zregenerować się po pomiarach TEER. Po stymulacji wartości TEER na ogół pozostają akceptowalne przez 24-48 godzin po stymulacji.
    UWAGA: Alternatywna i szybsza metoda wykorzystująca sztywną parę elektrod STX-100C również rejestruje wysoki TEER w tym modelu81. Elastyczna para elektrod STX2 daje mniej wiarygodne odczyty.

4. PRZYGOTOWANIE ASTROCYTÓW DO BEZKONTAKTOWEJ KOHODOWLI: Metoda alternatywna

  1. Oczyszczanie astrocytów
    1. Dla każdego użytego mózgu szczura pokryć 2 kolby T75, dodając 10 ml poli-L-lizyny (5 μg/ml) w ddH2O do każdej kolby T75. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Izolację astrocytów można przeprowadzić w następujący sposób:
      1. Astrocyty szczurów:
        1. Odetnij głowy 2 1-2 dniowym szczurom przy użyciu zatwierdzonej metody.
        2. Odetnij skórę od czaszki, zaczynając od szyi w kierunku nosa, i przetnij kość z nacięciem strzałkowym.
        3. Otwórz czaszkę zakrzywionymi kleszczami, wyjmij mózg i umieść go w probówce o pojemności 15 ml (probówka 1) z 11 ml DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% FBS i siarczanem gentamycyny (125 μg/ml).
        4. Ostrożnie usuń opony mózgowe za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i zawieś materiał mózgowy za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
      2. Astrocyty świń:
        1. Zdobądź 1 mózg od 5-6-miesięcznej świni domowej.
        2. Ostrożnie usuń opony mózgowe z mózgu za pomocą kleszczy i/lub rąk z cienką końcówką.
        3. Zbierz 4 g istoty szarej z mózgu i umieść jej kawałki w 1-2 ml DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% FBS i siarczanem gentamycyny (125 μg/ml) na szalce Petriego. Jeśli kawałki są duże, zmiel je skalpelami lub kleszczami.
        4. Zawiesić wyizolowany materiał za pomocą pipety o pojemności 1 ml, przenieść go do probówki o pojemności 15 ml (probówka 1) i napełnić DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełnionym 10% FBS i siarczanem gentamycyny (125 μg/ml) do całkowitej objętości 11 ml.
        5. Kontynuuj homogenizację wyizolowanego materiału za pomocą długiej igły przymocowanej do strzykawki o pojemności 10 ml i zawieś 3 razy w górę iw dół. Poczekaj, aż duże kawałki osiądą na dnie probówki, a następnie zbierz 7 ml pożywki z górnej części probówki (probówka 1).
        6. Przefiltruj zawiesinę komórek o pojemności 7 ml przez filtr nylonowy 40 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml (probówka 2).
        7. Dodaj 7 ml pożywki do probówki 1 z mózgiem. Kontynuować homogenizację i filtrację od etapów 4.1.2.2.5-6 do momentu, gdy objętość przefiltrowanej zawiesiny komórek w probówce 2 osiągnie około 35 ml.
    3. Usunąć roztwór powlekający z kolb T75 [krok 4.1.1]. Można zastosować szybkie mycie 5 ml PBS po inkubacji z poli-L-lizyną, aby upewnić się, że komórki nie zostaną uszkodzone przez żadne toksyczne działanie roztworu powlekającego.
    4. Podzielić i wysiać wyizolowany roztwór astrocytów równo między kolby T75. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3-5 dni.
  2. Hodowla astrocytów i przygotowanie NCC z komórkami śródbłonka (3 tygodnie)
    1. Kultura początkowa
      1. Po 3 - 5 dniach inkubacji wykonaj zmianę pożywki, ostrożnie odsysając pożywkę i dodając 10 ml DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% FBS i siarczanem gentamycyny (125 μg/ml).
        UWAGA: Po pierwszej zmianie podłoża podłoże należy wymieniać co 5 dni. Przez pierwsze 2 tygodnie wstrząsnąć kolbami i dokładnie umyć komórki PBS podczas zmiany pożywki. Pomaga to w usuwaniu zanieczyszczającego mikrogleju.
      2. Po 3 tygodniach hodowli trypsynować komórki, dodając 2 ml roztworu trypsyny-EDTA na dno każdej kolby T75 i inkubować je w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5-7 minut.
      3. Zatrzymać trypsynizację przez dodanie 5 ml pożywki, przenieść roztwór komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować astrocyty w temperaturze 250 x g, 4 °C przez 7 minut.
      4. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w roztworze zamrażającym składającym się z 10 % DMSO w FBS.
      5. Policz liczbę komórek i przygotuj roztwór komórek 4,0 x 106 komórek/ml. Zamrozić komórki w kriowialach, dodając 1 ml na fiolkę.
    2. Wzrost w studzienkach dennych systemu wkładów membranowych z przepuszczalną membraną (2 - 12 tygodni)
      1. Przygotuj 12-dołkowe płytki do wzrostu astrocytów, dodając 1 ml poli-L-lizyny (5 μg/ml) w ddH2O do każdej studzienki. Umieścić płytki w temperaturze 37 °C na 2 godziny.
      2. Na każdą 12-dołkową płytkę przygotuj 25 ml pożywki do wzrostu astrocytów (DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% FBS i penicyliną (100 U/ml) oraz streptomycyną (100 μg/ml)).
      3. Przynieś fiolkę astrocytów z ciekłego azotu i rozmroź komórki, dodając 750 μl pożywki DMEM o niskiej zawartości glukozy. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby rozmrozić i homogenizować zawiesinę. Po rozmrożeniu przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i dodać pożywkę do całkowitej objętości 7 ml.
        Ostrzeżenie: Ciekły azot ma bardzo niską temperaturę, dlatego należy nosić środki ochrony osobistej, takie jak rękawice.
      4. Aby usunąć pożywkę zamrażającą, odwirować naczynia włosowate w temperaturze 250 x g, 4 °C przez 7 minut.
      5. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce.
      6. Usunąć powłokę z dołków 12-dołkowych płytek i przenieść zawiesinę komórek do studzienek, używając 1 ml na studzienkę. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
      7. Odświeżaj pożywkę co trzeci dzień i hoduj komórki przez co najmniej 2 tygodnie przed użyciem komórek do kohodowli z komórkami śródbłonka. Komórki można wykorzystać do kohodowli do 12 tygodni po rozmrożeniu, przy czym optymalny wiek to 2-8 tygodni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Założenie BBB Modeli In Vitro

W przedstawionej, zoptymalizowanej metodzie, hodowla pBECs i stworzenie systemu przepuszczalnych wkładów błonowych z MC lub bez ACM lub NCC z astrocytami (Rysunek 1) prowadzono przez okres 9-11 dni (Rysunek 2). W celu selekcji komórek śródbłonka, początkową hodowlę oczyszczonych fragmentów naczyń włosowatych połączono z leczeniem puromycyną przez maksyma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie i proliferacja pBEC

Podczas procedury oczyszczania krytyczne etapy obejmują szybkie i skuteczne usunięcie opon mózgowych oraz oddzielenie istoty białej i szarej, co jest ważne dla wydajności i czystości oczyszczania oraz dla prawidłowego ustalenia modelu. Dla przedstawionego modelu BBB in vitro z wykorzystaniem pBEC udoskonaliliśmy i uprościliśmy procedurę oczyszczania opartą na mechanicznej homogenizacji wyizolowanej istoty szarej, filtracji selektywnej pod kątem izolacji m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Elisabeth Helenie Bruun, Sarah Christine Christensen i Nielsowi M. Kristiansensenowi za pomoc techniczną oraz grant Fundacji Lundbeck o numerze R155-2013-14113.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FibronektynaSigma-AldrichF1141
Kolagen IVSigma-AldrichC5533
Poli-L-lizynaSigma-AldrichP1524
DMEM/F-12LonzaBE12-719F
DMEM/Niski poziom glukozySigma-AldrichD6046
Penicylina/StreptomycynaGibco Invitrogen15140
Surowica pochodząca z osocza (PDS)First Link UK Ltd.60-00-89
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco Invitrogen10-270-106
Trypsyna/EDTAGibco Invitrogen15090-046
HeparynaSigma-AldrichH3393
PuromycynaSigma-AldrichP8833
HydrokortyzonSigma-AldrichH4001
8-CPT-cAMPBiologC010
RO 20-1724Sigma-AldrichB8279
Siarczan gentamycynyLonza17-518Z
DMSOSigma-Aldrich34896
PBSSigma-AldrichD8537
EtOHVWR20,824,296Wymieszaj 70% roztwór z 96
DNAzy EtOH 1Sigma-AldrichD4513
Kolagenaza CLS2Sigma-AldrichC6885
ddH2OWykonane z kolb Elga System
T75Thermo Scientific156499
Wkładki Costar Transwell (wkładki membranowe przepuszczalne dla komórek)CostarCLS340112-dołkowa płytka, średnica 12 mm, 0,4 μ m Membrana poliwęglanowa
15 ml probówki wirówkoweCellstar188271
50 ml Probówki wirówkoweCellstar227261
PetriegoThermo Scientific150350
Fiolki kriogeniczneThermo Scientific377224
butelka 500 mlThermo Scientific159910/159920
SkalpeleSwann-MortenREF0211Typ 24
Homogenizator tkankowySigmaD9188
140 μ m filtryMERCKNY4H04700
40 μ m filtryCorning431750
EndOhmWorld Precision InstrumentsENDOHM-12Komora EndOhm do kubków hodowlanych 12 mm
System elektrod EVOM2 System pomiarowyTEER World Precision Instruments300523+STX100Csztywną parą elektrod STX-100C
Długa igłaSigmaPodłącz do strzykawki
Kleszczyki zakrzywione z cienką końcówkąKLS Martin12-409-12-07
Kleszcze z szeroką końcówkąVWR82027-390
Uchwyt filtraMERCK MiliporeSwinnex-47
Strzykawka 50 mlBraun4617509F
10 ml PrzeciwciałoTerumoSSt20ESI
Abcamab317211:100
Anty-p120 Przeciwciało kateninyLaboratoria transdukcji BD6101331:200
Przeciwciało anty-ZO-1Invitrogen61-73001:200
Przeciwciało anty-Claudin 5Sigma-AldrichSAB45029811:100
IgG przeciwko osiołkowi przeciw królikowi skoniugowane z mąką Alexa 568Thermo ScientificA100421:500
IgG przeciwko myszom osła skoniugowane z mąką Alexa 488Thermo ScientificA212021:500
SacharozaPerkin ElmerNEC100X250UC0,15&mikro; l/ml końcowy składnik roboczy
Lucifer YellowSigmaL014410 µ g/ml końcowe stężenie robocze
% System komór ze antyokludynowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE - 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D'Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854(2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765(2015).
  23. Liew, K. -F., Hanapi, N. A., Chan, K. -L., Yusof, S. R., Lee, C. -Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233(2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352(2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction 'opening': signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, Suppl 1. S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278(2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli,, et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood--brain barrier. AIDS. 15 (4), London, England. 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -Y., Zhu, H. -M., Wu, J. -H., Wen, H., Liu, C. -J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, Clifton, N.J. 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40(2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093(2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja fragment w naczy w osowatektrawienie enzymatyczneselekcja puromycynwk adki z przepuszczaln membranczynniki r nicowaniatransendotelialna oporno elektrycznaprzepuszczalno parakom rkowabezkontaktowa kokultura

Powiązane artykuły