Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Summary

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Abstract

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nowotworowymi a komórkami kostnymi w mikrośrodowisku kości jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmu powstawania przerzutów do kości. Opracowaliśmy w pełni ludzki model przedkliniczny in vitro kohodowli komórek i monocytów raka piersi ulegających różnicowaniu w kierunku osteoklastów. Zoptymalizowaliśmy model osteoklastogenezy, zaczynając od próbki krwi obwodowej pobranej od zdrowych dawców. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) najpierw oddzielono przez wirowanie w gradimencie gęstości, wysiewano w dużej gęstości i indukowano do różnicowania przez dodanie dwóch czynników wzrostu (GF): aktywatora receptora liganda czynnika jądrowego κB (RANKL) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (MCSF). Komórki pozostawiono w hodowli na 14 dni, a następnie utrwalono i przeanalizowano za pomocą dalszej analizy. W osteolitycznych przerzutach do kości jednym ze skutków wniknięcia komórek nowotworowych do kości jest indukcja osteoklastogenezy. W związku z tym rzuciliśmy wyzwanie naszemu modelowi z kokulturami komórek raka piersi, aby zbadać zdolność różnicowania komórek rakowych w odniesieniu do GF. Prostym sposobem badania interakcji komórki rakowej z osteoklastami jest przeprowadzenie pośrednich kokultur opartych na użyciu kondycjonowanej pożywki pobranej z kultur komórek raka piersi i zmieszanej ze świeżą pożywką. Mieszanina ta jest następnie używana do indukowania różnicowania osteoklastów. Zoptymalizowaliśmy również metodę bezpośredniej kohodowli, w której komórki nowotworowe i monocyty ulegające różnicowaniu dzielą pożywkę i wymieniają wydzielane czynniki. Jest to znacząca poprawa w porównaniu z pierwotną metodą pośredniej hodowli, ponieważ naukowcy mogą obserwować wzajemne interakcje dwóch typów komórek i przeprowadzać dalsze analizy zarówno komórek nowotworowych, jak i osteoklastów. Metoda ta umożliwia badanie wpływu leków na mikrośrodowisko kości z przerzutami oraz na wysiewanie linii komórkowych innych niż te pochodzące z raka piersi. Model może być również wykorzystywany do badania innych chorób, takich jak osteoporoza czy inne choroby kości.

Introduction

Kość jest częstym miejscem przerzutów dla różnych typów nowotworów pierwotnych, takich jak rak prostaty, płuc i piersi, przy czym u 20 - 25% pacjentów występują przerzuty do kości w trakcie choroby^1,2,3. W szczególności 70% pacjentek z rakiem piersi nosi ślady przerzutów do kości w chwili śmierci⁴. Interakcja guza i komórek zrębu jest niezbędna do progresji raka zarówno w przypadku raka pierwotnego, jak i wtórnego. W mikrośrodowisku kostnym osteolityczne przerzuty do kości spowodowane rakiem piersi zależą od powstania patologicznego błędnego koła zachodzącego między komórkami rakowymi, komórkami kostnymi i mikrośrodowiskiem kości. Komórki rakowe zaburzają równowagę kostną, zwiększając resorpcję kości^5,6,7.

W normalnych i patologicznych warunkach, osteoklasty są komórkami odpowiedzialnymi za resorpcję kości, podczas gdy osteoblasty, deponując nową matrycę, są odpowiedzialne za tworzenie nowej kości⁸. Aktywność osteoklastów jest regulowana przez osteoblasty poprzez ekspresję RANKL, który wiąże się ze swoim receptorem RANK na powierzchni przedosteoklastowej, indukując fuzję przedosteoklastową, proces niezbędny do różnicowania się w dojrzałe osteoklasty. Indukcja osteoklastogenezy zwiększa resorpcję kości. Duża liczba badań in vivo znacznie poprawiła naszą wiedzę na temat powstawania przerzutów do kości^9,10,11. Komórki raka piersi z guza pierwotnego i w mikrośrodowisku kości zaburzają homeostazę kości, sprzyjając osteoklastogenezie i resorpcji kości⁸. W tym scenariuszu kluczowe znaczenie mają wszystkie interakcje molekularne zachodzące między komórkami nowotworowymi a osteoklastami. Jak już wspomniano, mechanizm powstawania przerzutów do kości został wyjaśniony w modelach in vivo myszy. Jednak oprócz konieczności zatwierdzania przez Komitet Etyki wszystkich doświadczeń in vivo na zwierzętach, istnieje kilka innych wad przeprowadzania doświadczeń in vivo, w tym wysokie koszty i czasochłonne metody. Kilku autorów połączyło przedkliniczne modele osteoklastogenezy in vivo i in vitro przy użyciu mysiej linii preosteoklastów o nazwie RAW246.7^9,10,11. Wady tego modelu wynikają z faktu, że komórki są już zaangażowane w stanie się preosteoklastami i nie są pochodzenia ludzkiego. Z tych powodów badania translacyjne mogą przynieść ogromne korzyści z dostępności w pełni ludzkich modeli przedklinicznych in vitro do badania interakcji między komórkami raka kości.

Zoptymalizowaliśmy metodę osteoklastogenezy in vitro, zaczynając od próbek ludzkiej krwi obwodowej^12,13. Osteoklasty pochodzą z monocytów, które są obecne, choć w niewielkim stopniu, w próbkach krwi obwodowej. Komórki jednojądrzaste są najpierw oddzielane od erytrocytów i granulocytów obecnych we krwi pełnej za pomocą gradientu gęstości Ficollu; Są one następnie selekcjonowane ze względu na ich zdolność do przylegania do podłoża z tworzywa sztucznego, w przeciwieństwie do limfocytów. Po wysianiu komórki są hodowane przez 14 dni. MCSF i RANKL to GF wymagane przez monocyty do różnicowania się najpierw w makrofagi, a następnie w osteoklasty^14,15. MCSF jest potrzebny przez cały czas trwania testu, podczas gdy RANKL służy do indukowania procesu różnicowania w późnych stadiach osteoklastogenezy. We wczesnej fazie różnicowania MCSF pomaga monocytom namnażać się i przetrwać^14,15. Podczas drugiej części osteoklastogenezy komórki łączą się ze sobą i dojrzewają jako osteoklasty, wykazując charakterystyczny rozkład aktyny F w pierścieniach i wyrażając specyficzne markery, takie jak kwasowa fosfataza odporna na winian (TRAP) i receptor kalcytoniny (CTR)^14,15. Nasza metoda polega na dodawaniu MCSF do hodowli monocytów przez pierwsze 7 dni eksperymentu oraz kombinacji MCSF i RANKL od 7 do 14 dni. Pod koniec eksperymentu osteoklastogeneza jest analizowana poprzez liczenie zróżnicowanych komórek, jak opisano poniżej.

Hodowle monocytów indukowane do różnicowania przez GF stanowią podstawę naszego modelu przedklinicznego. Zoptymalizowaliśmy system kohodowli bez GF, aby lepiej zrozumieć osteoklastogenną moc komórek raka piersi. Najpierw opracowaliśmy model pośrednich kokultur, dodając pożywkę (80% α -Minimal Essential Medium (α-MEM) i 20% kondycjonowaną pożywkę pobraną z hodowli komórek raka piersi, które w około 90% zrażały się z komórkami przechodzącymi różnicowanie¹². Kondycjonowaną pożywkę (nie pobraną w warunkach deprywacji surowicy) pobrano po 24 godzinach i zmieszano ze świeżą pożywką w proporcji 1:4. Kondycjonowane podłoże indukowało istotne różnicowanie osteoklastów w stosunku do kontroli ujemnej. Ponieważ jednak informacje na temat wzajemnych oddziaływań między komórkami nowotworowymi a komórkami kostnymi są tracone podczas stosowania pośrednich kultur, ulepszyliśmy nasz system, przeprowadzając bezpośrednie kokultury. Umieściliśmy komórki rakowe we wstawkach 0,4 μM i umieściliśmy je w studzienkach, w których poszczepiono komórki jednojądrzaste. Korzystając z tej metody, komórki dzielą to samo podłoże i wymieniają wydzielane białka. W ten sposób stworzyliśmy w pełni ludzki przedkliniczny model osteoklastogenezy indukowanej przez komórki nowotworowe¹³.

Ten system jest niezwykle wszechstronny i może być używany do różnych celów badawczych, np. w badaniach farmakologicznych badających rolę leków w przerzutach do kości. Nasz model umożliwia badanie skuteczności i mechanizmów działania terapii ukierunkowanych na kości i/lub leków przeciwnowotworowych w mikrośrodowisku kości w obecności komórek nowotworowych¹³. Zaprojektowanie eksperymentów z odpowiednimi kontrolami, tj. komórkami nowotworowymi i osteoklastami hodowanymi indywidualnie, ułatwia zrozumienie wpływu kokultury na aktywność leku. Podejście to staje się jeszcze bardziej interesujące, gdy badany lek celuje zarówno w komórki nowotworowe, jak i osteoklasty, np. everolimus¹⁶. Model ten może być również wykorzystany do identyfikacji nowych szlaków interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami kostnymi.

Protocol

Ludzkie osteoklasty zostały odróżnione od PBMC zdrowych dawców, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Protokół badania został zatwierdzony przez lokalną Komisję Etyczną, zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku.

1. Różnicowanie osteoklastów

UWAGA: Zbieraj krew obwodową lub kożuchy od zdrowych ludzkich dawców w EDTA. Nie należy stosować mniej niż 20 ml krwi obwodowej. Płaszcze kożuchowe są preferowane, ponieważ mają większą obfitość komórek jednojądrzastych. Wykonaj wszystkie poniższe czynności w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.

1. Rozcieńczyć krew pełną EDTA w stosunku 1:1 solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Ponownie zawieś dobrze.
2. Nałożyć warstwę na pożywkę do separacji limfocytów (PBS krwi: pożywka do separacji limfocytów, 2:1) w probówkach o pojemności 50 ml.
   1. Odpipetować 30 ml krwi rozcieńczonej w PBS do probówki o pojemności 50 ml.
   2. Delikatnie umieść 15 ml pożywki do separacji limfocytów na dnie probówki o pojemności 50 ml.
3. Wirować przy 757 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (bez hamulców).
4. Pobieranie komórek jednojądrzastych:
   1. Zebrać białą warstwę komórek jednojądrzastych za pomocą pipety o pojemności 5 ml bez mieszania i umieścić ją w nowej probówce o pojemności 50 ml.
   2. Rozcieńczyć zebrane PBMC w 20 ml PBS.
5. Mycie PBMC:
   1. Wirować przy 225 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki. Powtórz raz.
6. Liza RBC:
   UWAGA: Jeśli osad komórkowy jest czerwony, potraktuj komórki roztworem buforowym do lizy czerwonych krwinek (patrz Tabela materiałów).
   1. Umieść probówkę o pojemności 50 ml na lodzie.
   2. Dodać 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek.
   3. Odczekaj 3 - 5 minut, aby zakończyć lizę erytrocytów. Czas różni się w zależności od stopnia zanieczyszczenia erytrocytów.
   4. Zatrzymaj reakcję, dodając 20 ml PBS.
   5. Wirować przy 225 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki.
      UWAGA: Opcjonalnie: Jeśli przeprowadzana jest liza RBC, umyj PBMC zgodnie z poniższym opisem.
7. Mycie PBMC:
   1. Dodać 20 ml PBS i wirować przy 225 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki.
8. Ponownie zawiesić komórki w pełnym α-MEM (uzupełnionym 1% glutaminą (początkowe stężenie 100X) i 10% płodową surowicą bydlęcą).
9. Policz komórki za pomocą komory Neubauera.
   1. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:100 w lodowatym kwasie octowym i użyć 10 μl rozcieńczenia do zliczenia komórek.
   2. Policz co najmniej dwa razy i oblicz średnią powtórzeń, aby uzyskać całkowitą średnią liczbę zebranych komórek.
10. Komórki płytkowe:
    1. Komórki płytkowe w stężeniu 750 000 PBMC na cm².
    2. Przechowywać posiane komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2.
       UWAGA: Zaprojektuj eksperyment tak, aby obejmował kontrole negatywne, czyli komórki, które są traktowane normalnym kompletnym α-MEM bez MCSF lub RANKL GFs. Pamiętaj, aby wykonać każdy warunek w co najmniej 3 powtórzeniach technicznych. Wykonać co najmniej 3 kontrpróby biologiczne.
11. Zmień pożywkę uzupełnioną GFs:
    1. Odczekaj około 3 godziny po wysianiu komórek, a następnie usuń pożywkę pipetą (200 - 1,000 μL), aby usunąć resztki, nieprzyłączone komórki i erytrocyty.
       UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas zmiany podłoża, aby uniknąć oderwania komórek.
    2. Dodać nowy kompletny α-MEM uzupełniony 20 ng / ml MCSF (500 μl / basenik).
       UWAGA: Podczas kohodowli z komórkami rakowymi, wysiewaj komórki rakowe dzień po wysiewie PBMC.
12. Zmieniaj pożywkę co 2 - 3 dni (α-MEM uzupełniony o 20 ng/ml MCSF):
    1. Wyrzucić pożywkę za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl.
    2. Dodać nową świeżą pożywkę za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl.
13. 6-7 dni po wysianiu komórek dodaj 20 ng / ml RANKL, aby uzupełnić α-MEM + MCSF.
14. Zmieniaj pożywkę (pełne α-MEM+MCSF+RANKL) co 2-3 dni:
    1. Wyrzucić pożywkę za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl.
    2. Dodać nową pożywkę za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl. Zatrzymaj indukcję różnicowania 14 dni po wysianiu komórek.
    3. Wyrzuć podłoże i przemyj dwukrotnie PBS.
15. Napraw komórki za pomocą paraformaldehydu:
    1. Pozostaw komórki do wyschnięcia.
    2. Dodać 4% paraformaldehydu (patrz Tabela Materiałów).
    3. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
16. Wyrzuć paraformaldehyd i przemyj dwukrotnie 500 μl PBS.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny; Prosimy o noszenie rękawiczek, maski i okularów.
17. Pozostaw komórki do wyschnięcia.
18. Barwienie TRAP należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
19. Policz komórki podobne do osteoklastów ręcznie pod mikroskopem przy powiększeniu 10X; NA 0.30.
    UWAGA: Komórki podobne do osteoklastów definiuje się jako komórki polikarionowe TRAP+ z co najmniej 4 jądrami.

2. Hodowle komórek nowotworowych

UWAGA: Eksperymenty mogą być przeprowadzane na różnych typach linii komórkowych gruczolakoraka piersi, takich jak SCP2¹⁷, osteotropowa linia komórkowa wywodząca się z potrójnie ujemnej linii komórkowej ludzkiego raka piersi (MDA-MB-231), oraz linia komórkowa MCF7 z dodatnim receptorem hormonalnym.

1. Hodować komórki jako monowarstwę w kolbach o długości^{75 cm 2}.
   1. Wysiej 1 000 000 komórek rakowych w kolbie^{o średnicy 75 cm2}.
   2. Przechowywać komórki w temperaturze 37 °C w kompletnym pożywce α-MEM uzupełnionej 1% glutaminą i 10% płodową surowicą bydlęcą w atmosferze 5%_CO2
   .
2. Odłącz komórki przy zbieganiu około 90%:
   1. Wyrzuć pożywkę, przemyj PBS i dodaj 2 - 3 ml trypsyny 1X do PBS.
   2. Inkubować komórki przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C.
   3. Zebrać oderwane komórki z kolby o długości 75^cm2 za pomocą pipety o pojemności 10 ml, dodając 8 ml kompletnej pożywki w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej.
   4. Wirować przy 225 x g przez 5 min.
3. Umyj komórki rakowe:
   1. Dodać 10 ml PBS.
   2. Wirować przy 600 x g przez 5 min.
4. Policz komórki rakowe za pomocą komory Neubauera.
   1. Policz komórki rakowe co najmniej dwa razy i oblicz średnią powtórzeń, aby uzyskać całkowitą średnią liczbę zebranych komórek.

3. Bezpośrednie kokultury komórek nowotworowych i monocytów ulegających różnicowaniu w kierunku osteoklastów

1. Wysiewaj komórki rakowe na wkładkach (średnica porów 0,4 μm):
   1. Wysiewaj komórki rakowe w stężeniu 4,000 komórek na cm².
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
      UWAGA: Wysiej komórki rakowe dzień po wysiewie PBMC do eksperymentu z kokulturą w wstawkach 0,4 μm.
2. Odczekaj 24 godziny, aby komórki się przylgnęły.
3. Umieścić wysiewaną kulturę insertową na kulturach jednojądrzastych, aby rozpocząć kokulturę (patrz sekcja 1.10 protokołu).
4. Zmieniaj nośnik co 2-3 dni za pomocą pełnej pamięci α-MEM.
   1. Wyrzucić pożywkę za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl.
   2. Dodać 500 μl świeżej pożywki.
      UWAGA: Głównym celem kohodowli jest zrozumienie osteoklastogennej mocy komórek nowotworowych, dlatego GF nie są dodawane do α-MEM. W każdym eksperymencie z kokulturą należy uwzględnić kontrole ujemne (patrz uwaga w kroku 1.10 protokołu) oraz kontrole pozytywne osteoklastów różnicowanych przez RANKL i MCSF (brak komórek rakowych). Komórki rakowe wysiane we wstawkach, które nie są umieszczone nad komórkami jednojądrzastymi, są używane jako negatywna kontrola kokultury.
5. Zatrzymaj kokulturę i użyj komórek rakowych do dalszej analizy:
   1. 13 dni po wysiewie PBMC i 12 dni po wysianiu komórek rakowych umieść wkładkę na nowej płytce.
   2. Zatrzymanie hodowli komórek nowotworowych, na podstawie której mają być wykonywane dalsze analizy (patrz Dyskusja).
6. W dniu 14 zatrzymaj różnicowanie osteoklastów i utrwal komórki, jak opisano w kroku 1.15.
7. Barwienie metodą TRAP należy wykonać natychmiast lub w ciągu 14 - 30 dni.
   UWAGA: Barwienie opcjonalne: Aby potwierdzić, że komórki polikarionowe TRAP+ są osteoklastami, naukowcy mogą wykonać dodatkowe barwienie w celu wykrycia CTR, markera specyficznego dla osteoklastów. Wykrywanie pierścieni F-aktyny to kolejny test barwienia specyficzny dla osteoklastów^12,13,14.

Results

Zoptymalizowano metodę łatwego odróżniania osteoklastów od ludzkich monocytów krwi obwodowej. Hodowla monocytów została wyhodowana z komórkami nowotworowymi, potwierdzając (zgodnie z opisem w literaturze¹⁸), że komórki rakowe są zdolne do podtrzymania osteoklastogenezy w przerzutach do kości. Osteoklasty zróżnicowane od komórek rakowych i GF są pokazane na Rysunek 1. Komórka podobna do osteoklastów to komórka z 4 lub więcej jądrami i jest dodatn...

Discussion

Przedkliniczne modele in vitro badające mechanizmy przesłuchów między komórkami nowotworowymi a komórkami kostnymi są potrzebne do zidentyfikowania mechanizmów przerzutów do kości, które można wykorzystać do tworzenia nowych strategii terapeutycznych. Opracowaliśmy w pełni ludzki model osteoklastogenezy in vitro z ludzkiej krwi obwodowej (ryc. 3). W trakcie optymalizacji metodyki zidentyfikowano i usunięto szereg punktów krytycznych. Pierwsza z nich dotyczyła ilości komórek...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
&alfa; MEM	Euroclone	BE12-169F
Glutamina	Life-technologies	ECB3000D
Płodowa surowica bydlęca	Technologie życia	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	Należy przestrzegać wskazówek dotyczących przechowywania
hRANKL	Peprotech	310-01	Należy przestrzegać wskazówek dotyczących przechowywania
Fosfataza kwasowa, Zestaw leukocytów (TRAP) Sigma	Aldrich	387 A
	Biowest	L0560-100
Bufor lizujący czerwone krwinki	SIgma	11814389001 ROCHE
Trypsin	EuroClone	Chzt. ECB3052D
Paraformaldehyd 4% roztwór wodny, klasa EM	Mikroskopia elektronowa Nauki	157-4-100
MDA-MB-231 linia komórkowa	ATCC	CRM-HTB-267
MCF7	ATCC	HTB-22
Transwell	Corning	3470-Clear	Te wkładki są przeznaczone do płytek 24-dołkowych; 6,5 mm, 0,4 μ M; wielkość porów