Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ogólna metoda wykrywania powstawania nitrozamidów w metabolizmie nitrozoamin in vitro przez cytochrom P450

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56312

⸱

25 września 2017

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Minnesota, 2Masonic Cancer Center, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

α-hydroksylacja rakotwórczych nitrozoamin przez cytochrom P450s jest akceptowanym szlakiem metabolicznym, który wytwarza produkty pośrednie uszkadzające DNA, które powodują mutacje. Jednak nowe dane wskazują, że może dojść do dalszego utleniania do nitrozamidów. Opisujemy ogólną metodę wykrywania nitrozamidów wytwarzanych w wyniku katalizowanego in vitro metabolizmem nitrozoamin katalizowanym cytochromem P450.

Streszczenie

N-nitrozoaminy to dobrze znana grupa środowiskowych czynników rakotwórczych, które wymagają utleniania cytochromu P450, aby wykazywać aktywność. Przyjęty mechanizm aktywacji metabolicznej polega na tworzeniu α-hydroksynitrozoamin, które spontanicznie rozkładają się do czynników alkilujących DNA. Nagromadzenie uszkodzeń DNA i wynikające z nich mutacje mogą ostatecznie prowadzić do raka. Nowe dowody wskazują, że α-hydroksynitrozoaminy mogą być dalej utleniane do nitrozoamidów przez cytochrom P450. Ponieważ nitrozamidy są na ogół bardziej stabilne niż α-hydroksynitrozoaminy i mogą również alkilować DNA, nitrozamidy mogą odgrywać rolę w kancerogenezie. W niniejszym raporcie opisujemy ogólny protokół oceny produkcji nitrozamidów w wyniku katalizowanego in vitro metabolizmu nitrozoamin katalizowanego cytochromem P450. Protokół ten wykorzystuje ogólne podejście do syntezy odpowiednich nitrozamidów i test metabolizmu cytochromu P450 in vitro przy użyciu chromatografii cieczowej, jonizacji nanosprayu, tandemowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości do wykrywania. W badaniu tym metoda wykryła N′-nitrozonorkotyninę jako drugorzędny metabolit N′-nitrosonornikotyny. Metoda charakteryzuje się wysoką czułością i selektywnością dzięki dokładnej detekcji masy. Zastosowanie tej metody do szerokiej gamy układów nitrozoamina-cytochrom P450 pomoże określić ogólność tej przemiany. Ponieważ cytochromy P450 są polimorficzne i różnią się aktywnością, lepsze zrozumienie powstawania nitrozamidów może pomóc w indywidualnej ocenie ryzyka zachorowania na raka.

Wprowadzenie

N-nitrozaminy stanowią szeroką klasę kancerogenów występujących w diecie, produktach tytoniowych oraz w środowisku ogólnym; mogą być one również tworzone endogennie w organizmie człowieka1. Przebadano ponad 300 związków N-nitrozowych, z czego >90% oceniono jako kancerogenne w modelach zwierzęcych2,3. Aby przejawić swoją kancerogenność, związki te muszą zostać najpierw aktywowane przez cytochromy P4501,2,3. Badania wykazują, że cytochromy P450 łatwo utleniają nitrozaminy do α-hydroksynitrozamin (Ryc. 1), które są związkami wysoce reaktywnymi o czasie połowicznego rozpadu wynoszącym ~5 s przed spontanicznym rozkładem do alkilodiazohydroksydów. Te ostatnie mogą alkilować DNA po utracie H2O i N2. Powstałe addukty DNA, jeśli nie zostaną naprawione, mogą powodować mutacje, które – jeśli wystąpią w krytycznych genach onkogennych lub supresorowych – prowadzą do rozwoju nowotworu1. Z tego powodu podjęto wiele wysiłków w celu pełnego zrozumienia szlaków metabolicznych, adduktów DNA oraz produktów metabolizmu wtórnego wynikających z utleniania kancerogennych nitrozamin przez cytochromy P450. Wiedza ta ma potencjalne zastosowanie w indywidualnej ocenie ryzyka raka4.

Schemat reakcji chemicznej, wiązanie nitrosamin z DNA, enzym P450, nitrosamid, tworzenie adduktów DNA.
Rycina 1: Ogólny i proponowany metabolizm nitrosamin.
Nitrosaminy (1) są utleniane przez enzymy P450 do α-hydroksynitrosamin (2), które ulegają spontanicznemu rozkładowi do alkilodiazohydroksydów (3). Związki te mogą wiązać się z DNA, tworząc addukty DNA. Przypuszcza się, że 2 są dalej utleniane przez P450 do nitrosamidów 4. Te mogą bezpośrednio wiązać się z DNA, tworząc nowe addukty DNA, lub ulegać hydrolizie do 3, tworząc znane addukty DNA. R1 i R2 oznaczają dowolną grupę alkilową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Choć hipoteza α-hydroksynitrozamin jest mocno poparta obszernymi danymi, istnieje kilka niespójności; jedną z głównych jest krótki okres półtrwania α-hydroksynitrozamin5,6. Wiadomo, że związki te powstają w błonie siateczki śródplazmatycznej, a następnie alkilują DNA jądrowe. Biorąc pod uwagę ich czas życia wynoszący zaledwie kilka sekund, zastanawiające jest, w jaki sposób produkty pośrednie te przetrwają niezbędny transport przez cytozol. Jedna z hipotez zakłada, że część α-hydroksynitrozamin ulega procesywnemu utlenieniu do nitrosamidów7,8, które są w porównaniu z nimi dość stabilne9. Prawdopodobnie odbywa się to poprzez zatrzymanie α-hydroksynitrozamin w centrum aktywnym cytochromu P450. Precedensy dla tego rodzaju utleniania zaobserwowano w przypadku nikotyny10, alkoholi11 oraz prostych alkilonitrozamin12,13. Ponadto nitrosamidy są kancerogenami bezpośrednio działającymi2,3. Na podstawie ich reaktywności9 uważa się, że związki te tworzą addukty DNA identyczne z tymi powstającymi z α-hydroksynitrozamin, a także nowe, nieznane dotąd addukty DNA (Ryc. 1). Zatem hipoteza ta wyjaśnia nie tylko transport przez cytozol, ale również powstawanie produktów uszkodzeń DNA.

W niniejszej pracy opisano ogólny protokół oceny konwersji nitrozoamin do nitrozoamidów katalizowanej in vitro przez cytochrom P450. Jako przykład przedstawiono wcześniej opisaną konwersję N′-nitrozonornikotyny (NNN) do N′-nitrozonornikotyny (NNC) przez cytochrom P450 2A614. Zastosowanie tego protokołu do szerokiego zakresu systemów substrat-enzym pomoże określić znaczenie nitrozoamidów w ogólnym metabolizmie nitrozoamin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Materiały i ogólne procedury

  1. Zsyntetyzuj NNN zgodnie z wcześniejszym opisem15. Otrzymaj norkotyninę, bakulosomy P450 2A6, system regeneracji NADPH, 0,5-krotny bufor reakcyjny i wszystkie inne chemikalia lub rozpuszczalniki ze źródeł komercyjnych w klasie odczynnika.
  2. Rejestruj widma NMR na spektrometrze 500 MHz. Raportuj zmiany chemiczne w częściach na milion (ppm). Użyć pozostałych pików rozpuszczalnika jako wewnętrznych odniesień dla 1H-NMR (7,26 ppm CDCl3) i 13C-NMR (77,2 ppm CDCl3).
    UWAGA: Przy dzieleniu pików stosowano następujące skróty: s = singlet, d = dublet, dd = dublet dubletów, dt = dublet trójek, dq = dublet kwartetów, ddd = dublet dubletu dubletów i m = multiplet.
  3. Wykonaj spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS) dla wybranych związków na LTQ Orbitrap Velos i raportuj dane w m/z.
  4. Do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) należy użyć wstępnie pokrytych poligramem płytek TLC z żelu krzemionkowego (40 mm x 80 mm, grubość 0,2 mm) ze wskaźnikiem fluorescencyjnym 254 nm. Wizualizacja płytek TLC za pomocą naświetlania lampą UV.
  5. Przeprowadzić chromatografię błyskową na żelu krzemionkowym o oczkach 60 A, 70-150 przy użyciu szklanej kolumny o wymiarach 1,5 cm x 15 cm.

2. Przygotowanie pozytywnej kontroli nitrozamidowej (N′-nitrozonorkotynina, NNC)

  1. Wysuszyć przez noc w piekarniku (16 h, ~140 °C) kolbę okrągłodenną o pojemności 25 ml zawierającą mieszadło magnetyczne. Rano schłodzić kolbę pod strumieniemN2, używając bełkotki olejowej, aby utrzymać natężenie przepływuN2 poniżej jednego pęcherzyka na sekundę.
    UWAGA: Po schłodzeniu nie są wymagane żadne środki ostrożności, aby utrzymać kolbę w temperaturze poniżejN2.
  2. Do schłodzonej kolby dodać norkotyninę (31,8 mg, 0,196 mmol), bezwodnik octowy (5 ml) i kwas octowy (1 ml). Mieszaninę tę mieszać w sposób ciągły, schładzając do temperatury 0 °C w łaźni wodno-lodowej.
    ostrożność: Bezwodnik octowy i kwas octowy są.
  3. Dodać NaNO2 (33,3 mg, 0,483 mmol) w jednej porcji i ciągle mieszać mieszaninę przez 2,5 godziny. Monitorować postęp reakcji za pomocą TLC (100% EtOAc, Rf = 0,19, patrz krok 1.4).
    UWAGA: W tym czasie mieszanina będzie stawać się coraz bardziej żółta z okazjonalnym bulgotaniem.
  4. Ugasić reakcję, wlewając mieszaninę do lodowategoH2O(18 ml). Natychmiast wyekstrahować roztwór wodny z 18 ml CH2Cl2 w lejku separatorowym o pojemności 100 ml. Ekstrahować warstwę wodną co najmniej 2 razy za pomocą CH2Cl2 (9 ml każdy).
  5. Suszyć zebrane substancje organiczne w ciągu ~100 mgMgSO4 przez 2 minuty. Przefiltrować i zagęścić roztwór przez odparowanie obrotowe, aby uzyskać surowy, żółty olej. Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 30 °C podczas parowania, aby usunąć pozostałości kwasu octowego.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu wstrzymać, jeśli związek zostanie rozpuszczony w CH2Cl2, a roztwór będzie przechowywany w ciemności w temperaturze 2 - 8 °C.
  6. Oczyść surowy związek za pomocą chromatografii kolumnowej (patrz krok 1.5) używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej i 100% EtOAc jako eluentu16.
    ostrożność: Z NNC i pokrewnymi nitrozamidami należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ zakłada się, że są one substancjami rakotwórczymi dla ludzi.
  7. Rozpuść czysty związek w CDCl3 i użyj NMR (patrz krok 1.2), aby potwierdzić strukturę i określić molowość tego roztworu17. Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze 2 - 8 °C, aż będzie potrzebny.
    UWAGA: Roztwór ten będzie stosowany jako kontrola pozytywna w teście in vitro (etap 3.5). Widma NMR i przesunięcia chemiczne są dostępne w informacjach uzupełniających.
  8. Za pomocą czystego roztworu NNC potwierdzić dokładną masę macierzystą i oznaczyć masy jonów produktu przez bezpośrednią infuzję na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS) zgodnie z parametrami opisanymi w krokach 1.3 i 4.3.
    UWAGA: Masy produktu zostaną wykorzystane do wykrycia tego związku w teście metabolizmu in vitro (krok 4.3).

3. Przykład inkubacji in vitro nitrozoaminy-P450

  1. Wyjmij bakulosomy P450 2A6, system regeneracji Vivid-NADPH i 10 mM roztworu podstawowego NADP+ z zamrażarki w temperaturze -80 °C i pozwól im rozmrozić się na lodzie. Po rozmrożeniu rozcieńczyć bakulosomy i system regeneracji NADPH odpowiednio 1:10 i 1:50 w pojedynczej probówce o pojemności 1 ml z 0,5-krotnym buforem reakcyjnym. Podobnie, dodaj 3 μl roztworu podstawowego NADP+ do 97 μl 0,5-krotnego buforu reakcyjnego.
    UWAGA: NADP+ jest wrażliwy na światło. Chroń ten roztwór, owijając jego pojemnik folią aluminiową. Roztwory enzymatyczne są wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania; Ogranicz to do nie więcej niż 2 cykli. Przygotuj podwielokrotności w razie potrzeby dla przyszłych eksperymentów.
  2. Do każdej inkubacji dodać 50 μl roztworu enzymatycznego (zawierającego 5 pmol P450) do 1 ml probówki zawierającej 40 μl 4 μM roztworu NNN wykonanego z buforem reakcyjnym. Tę nową mieszaninę należy wstępnie inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, a następnie dodać 10 μl rozcieńczonego roztworu NADP+. Inkubować cały system przez 1 - 30 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Stosowanie 5-minutowych odstępów czasu inkubacji (np. 5, 10, 15 minut itp.) zapewni wystarczający przebieg czasu tworzenia nitrozamidu.
  3. Po pożądanym czasie inkubacji schładzać, dodając najpierw 10 μl 3,0 N ZnSO4, a następnie 10 μl 3,0 N Ba(OH)2. Odwiruj ten roztwór, a utworzy się biały osad. Odwirować próbkę o masie 8000 x g przez 4 minuty w celu osadu.
    UWAGA: Procedura nie może być przerywana na tym etapie, ponieważ powstałe nitrozamidy mają ograniczoną stabilność w roztworach wodnych. Długie przerwy mogą skutkować wynikami fałszywie ujemnymi.
  4. Natychmiast odpipetować supernatant i przeanalizować 2 μl metodą chromatografii cieczowej z dodatnią tandemową spektrometrią mas z jonizacją w wysokiej rozdzielczości (LC-NSI+-HRMS/MS, kroki 4.1 - 4.3).
  5. W przypadku inkubacji kontroli dodatniej odparować podwielokrotność zawierającą 100 fmol zsyntetyzowanego roztworu NNC do probówki o pojemności 1 ml pod strumieniemN2. Do tej fiolki dodać pełny układ enzymatyczny z kroku 3.2 i postępować zgodnie z opisem dla kroków 3.3 - 3.4.
  6. W przypadku inkubacji kontroli ujemnej należy przeprowadzić doświadczenie zgodnie z opisem (kroki 3.2 - 3.4), z wyjątkiem zastąpienia 50 μl roztworu enzymu buforem reakcyjnym 0,5x.

4. Przykładowe parametry do wykrywania nitrozamidów przez LC-NSI+-HRMS/MS

  1. W przypadku komponentu LC zastosuj następujący wieloetapowy gradient w kroku 4.2 do systemu UPLC za pomocą komercyjnej, ręcznie pakowanej 18 C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, 15 μm kryza kolumny kapilarnej.
  2. Używając 5 mM NH4OAc jako rozpuszczalnika A i MeCN jako rozpuszczalnika B, załadować próbkę do kolumny, pracując z prędkością 5% B przy 1 μl/min od 0 do 5 minut, a następnie zmniejszając natężenie przepływu do 0,3 μL/min. Następnie uruchom nachylenie od 5 do 20% B w ciągu 4 minut, a następnie rampę do 55% B w ciągu 10 minut, a następnie ponownie zrównoważ do 5% B.
  3. Wykonaj LC-NSI+-HRMS/MS na LTQ Orbitrap. Monitoruj NNC zarówno przez pełne skanowanie, jak i fragmentację MS2. Wykonaj pełne skanowanie w rozdzielczości 60 000 i wyodrębnij dokładną masę macierzystą (192.07670) z tolerancją masy 5 ppm. Użyj fragmentacji MS2 do wyizolowania jonów macierzystych (2,0 amu) i fragmentacji przez dysocjację wywołaną zderzeniem (CID) o energii zderzenia 25 eV, rozdzielczości 15 000 i czasie skanowania 30 ms. Wyodrębnić dokładne masy jonów poproduktowych NNC (m/z 192 m/z 134.04739 i 162.07874) z tolerancją masową 5 ppm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W oparciu o prace White et al.19, norcotyninę poddano nitrosowaniu do NNC w sposób czysty i z wysoką wydajnością (80 - 92%), aby uzyskać standard do eksperymentu in vitro. Dowody strukturalne potwierdzające przebieg reakcji uzyskano z analiz spektroskopowych, w tym 1H-NMR, 13C-NMR, COSY i HSQC (Informacje uzupełniające), a także z HRMS, która potwierdziła masę jonu rodzica [M + H]+ z dokładnością do 5 ppm względem ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyjaśnienie metabolizmu nitrozoamin jest kluczowym elementem zrozumienia ich rakotwórczości. Ponieważ zaangażowany cytochrom P450 i inne enzymy metaboliczne są polimorficzne, dalsze zastosowanie tej wiedzy może potencjalnie zidentyfikować osoby wysokiego ryzyka 1,4. Nowe dane wskazują, że możliwe jest dalsze utlenianie α-hydroksynitrozoamin, przypuszczalnych głównych metabolitów nitrozoamin biorących udział w wiązaniu DNA, do nitrozamidów; Nie zostało to jednak s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant nr. CA-81301 z National Cancer Institute. Dziękujemy Bobowi Carlsonowi za pomoc redakcyjną, dr Peterowi Villalta i Xun Mingowi za pomoc w zakresie spektrometrii mas w Analytical Biochemistry Shared Resource of the Masonic Cancer Center oraz dr Adamowi T. Zarthowi i dr Annie K. Michel za ich cenne dyskusje i wkład. Wspólny zasób biochemii analitycznej jest częściowo wspierany przez grant wsparcia National Cancer Institute Cancer Center CA-77598

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NorkotyninaAKoS GmbH (Steinen, Niemcy)CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969
Kwas octowySigma-Aldrich695092
Bezwodnik octowySigma-Aldrich242845
Octan amonuSigma-Aldrich431311
Wodorotlenek baruSigma-Aldrich 433373
D-ChloroformSigma-Aldrich151823
HPLC AcetonitrylSigma-Aldrich34998
Siarczan magnezuSigma-AldrichM7506
Chlorek metylenuSigma-Aldrich34856
Azotyn soduSigma-Aldrich237213
ViVid CYP2A6 Zestaw do niebieskiego przesiewaniaTechnologiesPV6140
SiarczanSigma-Aldrich221376
probówki 0,5 mlFisherAB0533
100 ml kolba okrągłodennaSigma-AldrichZ510424
125 ml Kolba ErlenmeyeraSigma-AldrichCLS4980125
125 ml Lejek separacyjnySigma-AldrichZ261017
25 ml okrągły dolna kolbaSigma-AldrichZ278262
500 MHz Spektrometr NMRWirówka Bruker
Allegra X-22RBeckman-Coulter
LCChromTechCTC– 0957– BOND
LTQ Orbitrap VelosThermo Scientific
Mieszadło magnetyczneRurka NMR Sigma-AldrichZ127035
PipetySigma-AldrichZ274682
P1000, P200 i P10Parownik obrotowy Eppendorf
Thermo Scientific
Kąpiel wodna z wytrząsaniemFisherFSSWB15
Płytka mieszającaSigma-AldrichCLS6795420
Kolumna PicoFritNowy obiektywPF3607515N5
Luna C18, 5 umPhenomenex535913-1
Life Fiolki System RSLCnano UPLC Sigma-Ald Z691410 rich

Bibliografia

  1. Rom, W. N., Markowitz, S. Environmental and Occupational Medicine. , 4th ed, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 1226-1239 (2007).
  2. Preussmann, R., Stewart, B. W. Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. Searle, C. E. 2, 2nd ed, American Chemical Society. 643-828 (1984).
  3. Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R. Chemical Carcinogens. ACS monograph 173. Searle, C. E. , American Chemical Society. 491-625 (1976).
  4. Zhu, A. Z., et al. Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation. Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).
  5. Mesić, M., Revis, C., Fishbein, J. C. Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions. J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).
  6. Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation. Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).
  7. Guttenplan, J. B. Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and à-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine. Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).
  8. Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens. Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).
  9. Chow, Y. L. ACS Symposium Series. 101, American Chemical Society. 13-37 (1979).
  10. von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. E. CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5'(1')iminium ion. J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).
  11. Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde. J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).
  12. Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1. Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).
  13. Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps. J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).
  14. Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines. Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).
  15. Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays. Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).
  16. Clark, A. G., Wong, S. T. A rapid chromatographic technique for the detection of dye-binding. Anal Biochem. 89 (2), 317-323 (1978).
  17. Pauli, G. F., et al. Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay. J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).
  18. van der Heeft, E., et al. A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules. Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).
  19. White, E. H. The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation. J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).
  20. Patten, C., et al. Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes. Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).
  21. Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine. Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).
  22. Hecht, S. S. Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines. Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).
  23. von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13. Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metabolizm nitrozoaminutlenianie cytochromem P450chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią maswysokorozdzielcza tandemowa spektrometria massynteza wzorców nitrozoamintest in vitroinkubacja enzymatycznaprzerywanie reakcjidetekcja dokładnej masy
Ogólna metoda wykrywania powstawania nitrozamidów w metabolizmie nitrozoamin in vitro przez cytochrom P450
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.