Zmiany w mikrobiomie jamy ustnej w dzieciństwie budzą coraz większe zainteresowanie. Porównanie różnych badań mikrobiomu ujawnia brak ustandaryzowanych protokołów pobierania próbek. Ograniczona przestrzeń sprawia, że pobieranie próbek dźwiękowych bruzd poddziąsłowych u dzieci jest wyzwaniem. Próbkowanie punktowe na papierze jest tutaj szczegółowo przedstawione jako metoda z wyboru dla tego obszaru.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie biofilmu w jamie ustnej do analizy mikrobiomu u zdrowych dzieci
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biofilm jamy ustnej i jego analiza molekularna stanowią podstawę do badania różnych badań stomatologicznych i pytań klinicznych. Wiedza na temat składu biofilmu prowadzi do lepszego zrozumienia mechanizmów próchnicotwórczych i okołopatogennych. Zmiany mikrobiologiczne zachodzące w jamie ustnej w dzieciństwie są interesujące z kilku powodów. Ewolucja mikrobioty jamy ustnej dziecka i zmiany w jej składzie muszą być dokładniej analizowane, aby zrozumieć i ewentualnie zapobiec wystąpieniu choroby. Jednocześnie potrzebna jest zaawansowana wiedza na temat naturalnego składu biofilmu w jamie ustnej. Wczesne stadia uzębienia stałego wolnego od próchnicy ze zdrowymi dziąsłami zapewniają szeroko nienaruszone środowisko poddziąsłowe, które może służyć jako punkt odniesienia in situ do badania cech zdrowia i chorób jamy ustnej. Analiza biofilmu jamy ustnej dzieci na różnych etapach życia jest zatem ważnym tematem w tej dziedzinie. Nowoczesne metody analizy molekularnej mogą dostarczyć wyczerpujących informacji na temat różnorodności bakteryjnej takich biofilmów. Aby umożliwić porównywanie danych dotyczących mikrobioty, ważne jest, aby ujednolicić każdy etap procedury generowania danych molekularnych. Procedura ta obejmuje pobieranie próbek klinicznych, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), przetwarzanie danych bioinformatycznych i interpretację taksonomiczną. Jednym z najbardziej krytycznych czynników jest tutaj pobieranie próbek biofilmu. Pobieranie próbek u dzieci jest jeszcze trudniejsze, w szczególności ze względu na ograniczoną przestrzeń w obszarach poddziąsłowych. W związku z tym skupiamy się na wykorzystaniu papierowych punktów do pobierania próbek poddziąsłowych. W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół pobierania próbek biofilmu z jamy ustnej bruzdy poddziąsłowej, błony śluzowej i śliny u dzieci.
Wprowadzenie
Biofilm jamy ustnej człowieka składa się głównie z komensalów i pożytecznych mikroorganizmów1,2,3. Występujące tu gatunki kolonizują wszystkie nisze, które oferuje jama ustna4,5,6. Skład biofilmu w tych niszach jest tak samo zróżnicowany jak siedliska. Na przykład ślina ma inny profil bakteryjny niż próbki płytki nazębnej. W próbkach płytki nazębnej zdrowych osób dorosłych względna liczebność Actinobacteria wynosi ponad 20%, podczas gdy w ślinie znajduje się mniej niż 7%. Z kolei Bacteroidetes i Firmicutes pojawiają się w znacznie większej liczbie w ślinie7. Dlatego ważne jest, aby pobierać próbki w różnych miejscach w jamie ustnej, aby uzyskać pełny obraz. Ponadto różne czynniki, takie jak różnice geograficzne i etniczne, wiek, płeć i wiele innych czynników, utrudniają określenie ogólnych zasad rozwoju biofilmu i wystąpienia choroby8,9. Przez wiele lat badania biofilmu periopatogennego i próchnicotwórczego były głównym problemem8,10,11,12,13.
W ostatnich latach badania na zdrowych osobach zyskały na znaczeniu nie tylko dla szerszego zrozumienia choroby, ale także dla wdrożenia środków zapobiegawczych14. Nowe technologie i analizy molekularne pozwalają na dalsze wyjaśnianie procesu powstawania i funkcjonowania biofilmu w jamie ustnej15,16 i umożliwiają pełne profilowanie różnorodności mikrobiologicznej17,18. Oczekuje się, że doprowadzi to również do nowego zrozumienia zmian mikrobiologicznych podczas leczenia ortodontycznego19. Wpływ na rozwój biomateriałów ortodontycznych jest przewidywalny. Rozszerzona perspektywa rzuci nowe światło na powikłania leczenia ortodontycznego związane z biofilmem, takie jak demineralizacja szkliwa i choroby przyzębia12,20,21. Aby umożliwić porównywanie danych na całym świecie, niezbędna jest standaryzacja wszystkich etapów generowania danych. Drobne zmiany w procedurach laboratoryjnych mogą mieć duży wpływ na wyniki. Ponadto stosowanie różnych platform obliczeniowych w przetwarzaniu danych może prowadzić do powstania nieporównywalnych zbiorów danych. Wreszcie, wybór testów statystycznych i poprawek ma wpływ na wyniki. Jednak błąd systematyczny próbkowania może wystąpić już na długo przed rozpoczęciem jakichkolwiek prac laboratoryjnych lub obliczeń biologicznych. Niestandaryzowane metody doboru próby prowadzą do badania z natury stronniczego. Ze względu na niski lub umiarkowany poziom standaryzacji w odpowiednich badaniach, istnieje niewiele dowodów na związek między ortodoncją a mikrobiomami19. W związku z tym opracowanie ustandaryzowanych metod ułatwiłoby kwalifikowane porównywanie danych w terenie.
Ten artykuł przedstawia standardowe procedury pobierania próbek biofilmu z jamy ustnej. Protokół ma przyczynić się do generowania porównywalnych w skali globalnej zbiorów danych o sekwencjach mikrobiologicznych. Przedstawiono krok po kroku protokół pobierania próbek biofilmu w jamie ustnej u zdrowych dzieci. Jako metodę z wyboru papierowe punkty są wprowadzane atraumatycznie do zdrowej bruzdy poddziąsłowej. Aby ułatwić porównania siedlisk, próbki błony śluzowej policzków pobiera się zgodnie z tym samym protokołem. W tym artykule przedstawiono również próbkowanie równoległe i zbiorcze. Ponadto pokazano pobieranie próbek śliny. Zaprezentowano również prosty system transportu i przechowywania oznaczony kolorami, ułatwiający zarządzanie próbkami do dalszej obróbki. Wybór dalszych operacji dotyczących nośnika pamięci, analiz metagenomicznych i bioinformatyki zależy od pytań klinicznych stawianych przez różne dziedziny w badaniach jamy ustnej. W niniejszym manuskrypcie wybrano pobieranie próbek DNA pod kątem NGS jako przykład możliwego zastosowania w badaniach ortodontycznych.
Protokół
Protokół i kręcenie filmów zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersytetu Medycznego w Grazu (Votum 27-126ex14/15). Pisemna zgoda na publikację tego filmu została uzyskana od dziecka i jego rodzica.
1. Instrumenty i materiały
- Wytnij kalibrowane (ISO 015/02) i sterylne papierowe punkty, zwykle używane w leczeniu endodontycznym, na pierwszym znaku pierścienia w celu ujednolicenia ich długości (Rysunek 1).
- Zastosuj naświetlanie światłem UV o długości fali 260 nm przez 30 minut, aby uniknąć zanieczyszczenia punktów papierowych DNA i RNA (Rysunek 2).
- Probówki do przechowywania w temperaturze 120 °C i ciśnieniu 1,2 bar należy sterylizować w autoklawie przez 20 minut, a następnie naświetlać je promieniami UV lub stosować gotowe do użycia probówki napromieniowane promieniami gamma.
2. Przygotowanie tematów
Uwaga: Pisemna świadoma zgoda została uzyskana od dziecka i jego rodzica przed zapisaniem.
- Nałóż masło kakaowe na usta.
- Zamontuj retraktor policzka i języka, aby uzyskać pełny dostęp do obu łuków zębowych.
- Plamić płytkę nazębną z ujawnieniem płytki nazębnej.
- Wyjąć aparaturę do suchego pola.
- Przepłukać usta wodą, aż woda stanie się bezbarwna.
- Dokładnie umyj zęby szczoteczką elektryczną pod kątem 45 °. Stosuj tylko wodę, ale nie pastę do zębów, ponieważ zmieniłoby to biofilm w jamie ustnej.
- Ponownie zamontuj urządzenie do suchego pola, w tym osłonę języka, aby usta były otwarte i suche.
- Oczyść i osusz zęby wskazujące sterylnymi wacikami, aby uniknąć wchłaniania płynu naddziąsłowego podczas pobierania próbek z papieru.
3. Pobieranie próbek biofilmu
- Punktowe pobieranie próbek bruzdy poddziąsłowej w formie papierowej
- Chwyć papierowe punkty sterylną pęsetą dentystyczną.
- Punkty papieru należy wkładać stycznie do określonej długości 4 mm. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nabłonka skrzyżowania (Ryc. 3).
- Usuń punkty papieru po 20 sekundach.
- Zbierz papierowe punkty bezpośrednio do przygotowanych probówek: umieść papierową końcówkę bezpośrednio w sterylnej i wolnej od DNA fiolce i przytnij ją na trzecim znaku na znormalizowaną długość 4 mm (Rysunek 4).
- Jeśli jest to wskazane w protokole badania, umieść dwa punkty papieru równolegle i jednocześnie w tym samym miejscu (Rysunek 5A).
- Alternatywnie, zbierz punkty papierowe z kilku miejsc, jeśli protokół badania wymaga "zbiorczych próbek" (Rysunek 5B).
- Usunąć aparat do suchego pola do pobierania próbek błony śluzowej i śliny.
- Punktowe pobieranie próbek z papieru śluzówkowego
- Przyłóż papierowe punkty do fałdu przedsionkowego górnej części policzka (Ryc. 6).
- Zamknij policzek i krótko go masuj.
- Otwórz policzek i usuń papierowe punkty po 20 sekundach.
- Wytnij papierowe punkty przy trzecim znaku i umieść je w sterylnej probówce, jak wskazano do pobierania próbek poddziąsłowych.
- Pobieranie próbek śliny
- Pozwól dziecku wypluć niestymulowaną ślinę do wysterylizowanego naczynia zbiorczego (Rysunek 7).
4. Transfer i przechowywanie
- Zbierz punkty papierowe jako pojedyncze, zbiorcze lub równoległe próbki, w zależności od projektu badania (Rysunek 8).
- Zastosuj system przechowywania oznaczony kolorami, aby ułatwić dalsze zarządzanie próbkami (Rysunek 9).
- Na koniec przechowuj próbki w temperaturze -80 °C w oczekiwaniu na analizę mikrobiomu.
Wyniki
W niniejszej publikacji pobieranie próbek DNA do NGS jest zaprezentowane jako przykład możliwego zastosowania w badaniach ortodontycznych. Bakteryjne DNA jest ekstrahowane bezpośrednio z próbek pobranych za pomocą papierowych punktów. DNA to może być następnie wykorzystane w badaniach nad składem mikrobiologicznym w celu odpowiedzi na pytania kliniczne lub badawcze (zgodnie z podsumowaniem na Rysunku 10).
Nowoczesne metody analizy molekularnej, takie jak metoda NGS 454-pyrosekwencjonowania, dają wgląd w pełny skład mikrobioty próbki. DNA tysięcy bakterii jest identyfikowane jednocześnie na różnych poziomach filogenetycznych na podstawie różnic w sekwencji 16s rRNA. Konieczne jest opracowanie platform bioinformatycznych jako narzędzi do strukturyzowania w klastry informacji uzyskanych z dużych zbiorów danych. Następnie do zbiorów danych mikrobioty można zastosować analizę statystyczną.
Ogólną względną liczebność określonych gatunków bakterii można analizować, podobnie jak zmiany w mikrobiocie wynikające ze zmieniających się warunków siedliska. Wykresy słupkowe (Rycina 11) oraz mapy ciepła (Rysunek 12) przedstawia skład bakterii poddziasłowych na poziomie typu lub rzędu. Różnych osobników i metod leczenia można porównać za pomocą statystyki opisowej i indukcyjnej. Rycina 13 przedstawia porównanie histogramów dwóch metod pobierania próbek papierowymi punktami poddziasłowymi na różnych poziomach taksonomicznych. Tabela 1 wykazuje zmianę składu biofilmu podczas in vitro badanie porównujące dwa punkty czasowe (T1 i T3). Istotność statystyczną zmian obliczono za pomocą testu znaków Wilcoxona z następującą korekcją Bonferroniego na podstawie danych z pirosekwencjonowania 454.
Wreszcie analiza głównych współrzędnych (PCoA) umożliwia bezpośrednie porównanie 3D na poziomie jednostek taksonomicznych (OTU) zidentyfikowanych w różnych próbkach. Wykresy PCoA na Rysunku 14 przedstawiają różnice wewnątrzosobnicze i międzyosobnicze mikrobiomu poddziasłowego w serii przypadków pięciu dzieci. Rysunek 15 przedstawia wyniki ortodontycznego badania przypadku i grupy kontrolnej: kropki od różowych do czerwonych to przypadki, a kropki od jasnych do ciemnoniebieskich to grupa kontrolna; wszystkie próbki pobierano wielokrotnie w okresie czterech miesięcy. Wyraźne grupowanie przypadków po interwencji ortodontycznej (czerwone kropki) reprezentuje zmianę w mikrobiomie. Niebieskie kropki, reprezentujące grupę kontrolną, są rozmieszczone równomiernie.
Rysunek 1: Przygotowanie papierowych punktów o ustandaryzowanej długości. Sterylne, skalibrowane papierowe punkty są odcinane przy pierwszym znaku pierścienia w celu ustandaryzowania ich długości. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek 2: Sterylizacja i usuwanie DNA z papierowych końcówek. Standaryzowane papierowe końcówki są sterylizowane i naświetlane promieniami UV w komorze sterylnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Wprowadzanie papierowych punktów poddziąsłowych. Sterylne skalibrowane papierowe punkty są wprowadzane stycznie do kieszonki dziąsłowej aż do znacznika pierścienia 4 mm na 20 s.
Rysunek 4: Odcinanie papierowego punktu do probówki. Bezpośrednio po pobraniu próbek, papierowe punkty są odcinane na poziomie trzeciej oznaczonej obręczy (4 mm) do sterylnej probówki 1,5 mL wolnej od DNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Próbkowanie zbiorcze i równoległe. Dwa papierowe punkty są wprowadzane jednocześnie do bruzdy poddziąsłowej jednego zęba (A) lub kilka papierowych punktów do bruzd poddziąsłowych kilku zębów (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Pobieranie próbek śluzówki. Sterylne, kalibrowane papierowe punkty są umieszczane w śluzówce fałdu przedsionkowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 7: Pobieranie śliny. Niepobudzana ślina jest wypluwana do sterylnego zlewka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 8: Schemat pobierania próbek. Próbki mogą być pobierane jako pojedyncze (lewa strona, po jednym zębie), zbiorcze (kilka lub wszystkie paski w jednej probówce) lub równoległe (niebieskie paski, dwa papierowe punktowe w jednym zębie). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 9: Przechowywanie kodowane kolorami. Odnośny kod kolorystyczny dla arkuszy i fiolek ułatwia dalszą obsługę próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 10: Analiza biofilmu poddziasnowego. Schematyczne przedstawienie pobierania próbek biofilmu klinicznego (A), ekstrakcji DNA (B) oraz różnych technologii NGS (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 11: Wykres słupkowy. Przedstawia względną obfitość bakterii na poziomie typu, analizowaną za pomocą 454-pirosekwencjonowania. Obraz zmodyfikowany z pracy Santigli et al.22 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 12: Mapa ciepła. Przedstawia względną liczność rzędów bakterii analizowanych za pomocą pirosekwencjonowania 454. Ciemnoczerwony kolor oznacza wysoką względną liczność (> 10%). Ciemnoniebieski kolor oznacza bardzo niską lub brak względnej liczności danego rzędu bakterii. Obraz zmodyfikowany na podstawie pracy Santigli et al.22 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 13: Histogram. Porównanie dwóch trybów pobierania prób za pomocą papierowych punktów pomiarowych (tryby A i B) na różnych poziomach taksonomicznych. Dane wygenerowane za pomocą pirosekwencjonowania 454. Obraz zmodyfikowany z Santigli et al.22 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 14: Wykres 2D PCoA. Seria przypadków (n=5) wykazująca różnice wewnątrz- i międzyosobnicze w wyniku zastosowania dwóch metod pobierania próbek poddziasłowinowych (jeden kolor odpowiada jednemu badanemu). Dane wygenerowane za pomocą pirosekwencjonowania 454. Obraz zmodyfikowany z Santigli et al.22 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 15: Klatka z animacji wykresu 3D PCoA. Przedstawia zmiany mikrobiomu poddziąsłowego w ortodontycznym badaniu przypadków i kontroli (n = 16; w każdej grupie 3 punkty czasowe; przypadki: od różowego do czerwonego, kontrola: od jasnoniebieskiego do ciemnoniebieskiego). Dane wygenerowane za pomocą pirosekwencjonowania 454. Niepublikowane dane z grupy roboczej Santigli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Takson: Bacteriae | Punkt czasowy 1 [%] | Punkt czasowy 3 [%] | Test znaków Wilcoxona | ||||||
| Typ/Rodzaj | 25. | Mediana | 75. | 25. | Mediana | 75. | wartość p | skorygowana wartość p | |
| Inne | |||||||||
| Inne | 0.70 | 1.07 | 1.28 | 1.32 | 1.63 | 1.93 | .000 | .005 | |
| Actinobacteria | |||||||||
| Actinomyces | 0.00 | 0.04 | 0.13 | 0.06 | 0.30 | 0.97 | .001 | .021 | |
| Rothia | 0.00 | 0.00 | 0.05 | 0.00 | 0.13 | 0.32 | .001 | .009 | |
| Bacteroidetes | |||||||||
| Prevotella | 0.00 | 0.01 | 0.22 | 0.15 | 1.02 | 2.44 | .000 | .006 | |
| Firmicutes | |||||||||
| Inne (Bacilli) | 0.00 | 0.01 | 0.06 | 0.00 | 0.04 | 0.10 | .706 | 1.000 | |
| Gronkowiec | 0.00 | 0.01 | 0.12 | 0.00 | 0.07 | 0.17 | .548 | 1.000 | |
| (Gemellaceae) | 0.00 | 0.00 | 0.07 | 0.12 | 0.77 | 1.24 | .005 | .091 | |
| (Lactobacillales) | 0.00 | 0.00 | 0.04 | 0.00 | 0.12 | 1.50 | .004 | .073 | |
| Granulicatella | 0.09 | 0.23 | 0.37 | 0.64 | 1.59 | 2.28 | .000 | .003 | |
| Lactobacillus | 0.00 | 0.00 | 0.18 | 0.00 | 0.00 | 0.04 | .700 | 1.000 | |
| Inne (Streptococcaceae) | 0.00 | 0.04 | 0.13 | 0.00 | 0.10 | 0.19 | .768 | 1.000 | |
| (Streptococcaceae) | 0.04 | 0.10 | 0.23 | 0.12 | 0.37 | 0.69 | .005 | .083 | |
| Streptococcus | 53.42 | 61.96 | 88.38 | 48.44 | 60.83 | 73.97 | .055 | .930 | |
| Inne (Lachnospiraceae) | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.00 | 0.00 | 0.11 | .003 | .058 | |
| Dialister | 0.00 | 0.00 | 0.04 | 0.00 | 0.00 | 0.04 | .240 | 1.000 | |
| Veillonella | 3.43 | 27.15 | 42.78 | 6.69 | 13.38 | 27.05 | .157 | 1.000 | |
| Proteobacteria | |||||||||
| Haemophilus | 0.00 | 0.00 | 0.03 | 0.31 | 0.84 | 2.38 | .000 | .008 | |
| #wartość p testu znaków Wilcoxona skorygowana poprawką Bonferroniego | |||||||||
| A p | |||||||||
Tabela 1: Analiza statystyczna. Różnice w mikrobiomie jamy ustnej zdrowych dzieci w dwóch punktach czasowych. Dane wygenerowane za pomocą pirosekwencjonowania 454. Obraz zmodyfikowany na podstawie Klug et al.23
Dyskusja
Bakterie znajdują się we wszystkich miejscach w jamie ustnej 24,25,26. Wiele badań koncentrowało się na wykorzystaniu śliny jako pożywki do pobierania próbek do mapowania kolonizacji jamy ustnej, ponieważ można ją łatwo pobrać przez plucie 27,28,29,30,31,32. Jednak biofilm śliny nie odzwierciedla składu biofilmu poddziąsłowego. W związku z tym zastosowanie innych metod pobierania próbek ma kluczowe znaczenie dla stworzenia pełnego obrazu i wywoła nowe dyskusje w badaniach stomatologicznych. W kilku artykułach porównano użycie kiret i papierowych punktów do poddziąsłowego pobierania próbek od osób chorych na przyzębie 8,33,34. Nie wiadomo jednak, czy żadna grupa badawcza skupiłaby się na zastosowaniu standardowych urządzeń do pobierania próbek dla różnych grup wiekowych, zwłaszcza dla dzieciw wieku 19 lat.
W tym filmie przedstawiono pobieranie próbek biofilmu z jamy ustnej w trzech siedliskach jamy ustnej u zdrowych dzieci.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:
Celem pracy jest opracowanie protokołu klinicznego pobierania biofilmu poddziąsłowego u dzieci zdrowych. Wybrana metoda odnosi się do zdrowych bruzd poddziąsłowych, w których ograniczona przestrzeń sprawia, że pobieranie próbek jest szczególnie trudne. W tym filmie metoda została zastosowana do wczesnego uzębienia stałego. Może być również stosowany do uzębienia mieszanego lub dojrzałego, a także u dzieci i/lub dorosłych. Nasza metoda pobierania próbek pozwala na modyfikacje, takie jak próbki pojedyncze lub zbiorcze. Ten ostatni czynnik może stać się kluczowym czynnikiem w analizach molekularnych ze względu na niewielką ilość DNA, którą można pobrać ze zdrowej bruzdy poddziąsłowej. Wybór zębów indeksujących może być modyfikowany na żądanie; W szczególności inny ząb może zostać pobrany jako alternatywa, gdy nabłonek jest uszkodzony i krwawi, co sprawia, że papierowy punkt jest bezużyteczny. Równoległe pobieranie próbek przy użyciu dwóch punktów papierowych jednocześnie w jednym miejscu pozwala na uzyskanie powtórzeń próbek w jednym kroku, a także skraca czas spędzony przez dzieci na krześle.
Przy niewielkich modyfikacjach można pobrać próbki z chorych kieszonek przyzębnych. W tym przypadku punkty papierowe będą musiały zostać włożone na całą długość kieszeni, która może sięgać do 10 mm. Długość i stożek punktów papierowych, a także głębokość wsunięcia muszą być dostosowane do interesującego nas środowiska wewnątrzustnego, ale zawsze powinny być ustandaryzowane pod względem materiału i wymiarów. Próbki można również pobierać z błony śluzowej za pomocą papierowych punktów. Identyczne protokoły pozwalają na porównanie różnych siedlisk jamy ustnej i różnych materiałów dentystycznych. Przygotowanie pacjenta i przechowywanie próbki można przeprowadzić zgodnie z opisem w tym filmie. W przypadku badań nad metatranskryptomem RNA można pobrać za pomocą tej samej metody. Dlatego po pobraniu próbek punkty papieru należy umieścić bezpośrednio w roztworze stabilizującym RNA.
Ograniczenia techniki:
Niezależnie od modyfikacji, opisana przez nas metoda klinicznego pobierania próbek ogranicza się do dźwiękowej bruzdy poddziąsłowej. Inne miejsca pobierania próbek, takie jak na przykład kieszonki chore na przyzębie, nie były częścią naszego projektu badania. Ponieważ konieczne jest pobieranie próbek na pełnej głębokości takich kieszeni, punkty papierowe mogą nie być wystarczająco duże, aby pobrać próbki w wystarczającym stopniu. Jeśli celem eksperymentalnym jest porównanie danych pobranych z zdrowych bruzd poddziąsłowych i kieszonek chorych przyzębie, ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z nieodłącznego odchylenia, które jest związane z różnymi klinicznymi metodami pobierania próbek. W związku z tym nie zaleca się porównywania takich danych.
Ograniczeniem przedstawionej tutaj metody jest pobieranie próbek bez późniejszego stosowania monoazydu propidy. Dodanie tego czynnika bezpośrednio po pobraniu próbki pozwala na specyficzną analizę tylko żywych komórek w analizowanym biofilmie. Opisana tutaj metoda pobierania próbek odzwierciedla liczbę żywych i martwych komórek. W przypadku badań nad ciężkim zapaleniem przyzębia papierowe punkty prawdopodobnie będą musiały zostać zastąpione łyżeczkami, ponieważ tworzenie się biofilmu w głębokich kieszeniach jest silne. W takich przypadkach punktowe pobieranie próbek z papieru może nie odzwierciedlać całego spektrum drobnoustrojów, ponieważ ich powierzchnia może zostać zbyt szybko nasycona.
Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod:
Proponowany manuskrypt jest pierwszym tego rodzaju, który standaryzuje pobieranie próbek poddziąsłowych w zdrowej bruździe za pomocą papierowych punktów. Inne sprawozdania odnosiły się do stosowania metalowych kiret 35,36 lub papierowych punktów 37,38,39, ale nie opisywały procesów zachodzących przed pobraniem próbki, takich jak kontrola płytki nazębnej, czyszczenie zębów, izolacja zębów i suszenie, a także procesy, które wynikają z nieodpowiednich specyfikacji dotyczących techniki pobierania próbek i ram czasowych.
W dwóch poprzednich artykułach wykazaliśmy, że użycie punktów papierowych jest powtarzalną metodą pobierania biofilmu poddziąsłowego u dzieci 22,40. Ze względu na swoją konstrukcję kirety są zbyt duże dla płytkiej bruzdy o ograniczonej przestrzeni i zbyt ostre dla delikatnego nabłonka połączeniowego. Bardzo ważne jest, aby uzyskać dostęp do bruzdy poddziąsłowej bez uszkodzenia nabłonka. W ten sposób unika się stronniczości wynikającej z krwawienia. Dlatego w tym obszarze preferowane jest stosowanie cienkich i delikatnych punktów papierowych. Punkty papierowe służą do monitorowania zmian w składzie biofilmu podczas leczenia ortodontycznego21,41. Są na tyle smukłe i elastyczne, że mieszczą się pomiędzy elementami stałych aparatów ortodontycznych. Jest to główna zaleta w porównaniu z innymi metodami pobierania próbek, takimi jak kirety. Pobieranie próbek atraumatycznych jest uproszczone i możliwe jest pobieranie próbek z niewielkich ilości DNA.
Przyszłe aplikacje:
W tym filmie pokazaliśmy metodę na niechorobowym, wczesnym, stałym uzębieniu. Może być również stosowany do uzębienia mieszanego lub dojrzałego. Przy pewnych adaptacjach możliwe jest pobieranie próbek miejsc dotkniętych chorobami przyzębia, takich jak zęby lub implanty i inne nisze spowodowane materiałami dentystycznymi, postępując zgodnie z tym samym protokołem. Badania nad próchnicą mogą skorzystać z tego ustandaryzowanego protokołu, w szczególności badania nad próchnicą korzeni. Najważniejszym wykładem z naszego filmu o próbkowaniu jest standaryzacja protokołów, aby dane były porównywalne, bez względu na to, jakie i w jaki sposób próbki są mierzone. Przyszłe demonstracje wideo mogą poszerzyć zakres badań klinicznych w ogóle.
Biofilm jamy ustnej uzyskany, jak pokazano na filmie, jest używany w klinikach i do badań naukowych. To podejście in vivo stanowi dobre uzupełnienie technik molekularnych in vitro , takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ i konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa15. Metody NGS, takie jak pokazane tutaj pirosekwencjonowanie, zastosowane do pobranego biofilmu, pozwalają na analizę całej mikrobioty. Obliczanie względnej liczebności niektórych gatunków bakterii może być wykorzystane do wspomagania leczenia lub do porównywania różnych pacjentów lub różnych metod leczenia. Wraz ze znormalizowanym protokołem sekwencjonowania i przepływem pracy analizy sekwencji, które opisaliśmy wcześniej40, ta metoda próbkowania umożliwia analizę sekwencji aż do poziomu rodzaju. Dalsze badania "meta", takie jak badania metatranskryptomiczne lub metabolomiczne, są możliwe w oparciu o protokół pobierania próbek przedstawiony w tym filmie.
Kroki krytyczne:
Unikanie zanieczyszczenia jest kluczowym krokiem: sterylne narzędzia muszą być stosowane w niesterylnym środowisku in vivo . Przeniesienie z ust na ławkę musi być wykonane szybko i bezpiecznie przez doświadczonego egzaminatora, aby czas siedzenia na krześle przez uczestników badania był jak najkrótszy. Najbardziej krytycznym krokiem w protokole jest atraumatyczne wprowadzenie papierowego punktu do bruzdy poddziąsłowej. Należy bezwzględnie unikać przerwania nabłonka skrzyżowania i krwawienia. Należy zachować dalszą ostrożność, aby nie zanieczyścić papierowych punktów i fiolek do przechowywania egzogennym DNA lub RNA. Samo przechowywanie jest wtedy również krytycznym krokiem. Próbki należy zamrażać bezpośrednio, najlepiej w temperaturze -80 °C. Pozwala to uniknąć zmian w składzie bakterii po pobraniu próbek, które zafałszowałyby wyniki sekwencjonowania.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów związanych z tą naukową produkcją wideo.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni Joachimowi Theusslowi (Centrum Badań Medycznych, Uniwersytet Medyczny w Grazu) za doskonałą pomoc techniczną przy produkcji wideo oraz Monice Farrell (Zarządzanie badaniami, Uniwersytet Medyczny w Grazu) jako talentowi głosowemu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ściernice papierowe stożkowe .02, sterylizowane | VDW Dental | 550 029 015 | http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2 |
| GC Masło kakaowe, tubka 10 g | GC EUROPE N.V. | 000387 | http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22 |
| Rondells niebieski | DIRECTA AB | Rondell Tabletki | http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767 |
| Great Lakes Nola Dry Field System Szczoteczka | do | zębów Great Lakes Ortho | 300-401 |
| http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626 Oral-B | http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro | ||
| micro-Ident plus11 | Hain Lifescience GmbH | 23312 | http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html |
| ParoCheck | Greiner Bio One International GmbH | 460020 | https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/ |
| Carpegen Perio Diagnostik | Carpegen GmbH | http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html | |
| probówki Reaktionsgefä ß e 1,5 ml | laktanu | CH77.1 do CH81.1 | www.waciki |
| mleczne | Henry Schein | 9003182 | www.henryschein.at |
Bibliografia
- Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183 (12), 3770-3783 (2001).
- Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).
- Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73 (2), 516-523 (2007).
- Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9 (259), 1-12 (2009).
- Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18 (11), 54-57 (2012).
- Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
- Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65 (1), 46-78 (2014).
- Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19 (4), 636-643 (2009).
- Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32 (7), 778-783 (2005).
- Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
- Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6 (1), 46-56 (2011).
- Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
- Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73 (2), 492-503 (2017).
- Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. , e2967(2011).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. , (2016).
- Kilian, M., et al. The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221 (10), 657-666 (2016).
- Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84 (9), 1266-1271 (2012).
- De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19 (2), 46-55 (2014).
- Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19 (6), 1501-1506 (2015).
- Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat? Clin Oral Invest. 18 (7), 1711-1718 (2014).
- Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142(2017).
- Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448(2016).
- Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27 (10), 722-732 (2000).
- Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5 (2), e9321(2010).
- Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27 (3), 182-201 (2012).
- Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. , (2014).
- Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. , e50815(2013).
- Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18 (6), 595-601 (2012).
- Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391 (1), 64-68 (2009).
- Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57 (5), 675-687 (2011).
- Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. , e4108(2012).
- Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122 (4), 347-352 (2014).
- Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51 (1), 10-14 (2006).
- Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 183-189 (2009).
- Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7 (5), 1016-1025 (2013).
- Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6 (6), 1176-1185 (2011).
- Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7 (8), e41606(2012).
- Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
- Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1 (3), 34-46 (2013).
- Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17 (4), 1209-1218 (2013).
Przedruki i uprawnienia
