Artykuł metodologiczny

Płynna biopsja na bazie mikroRNA: doświadczenia z klasyfikatorem sygnatury miRNA w osoczu (MSC) do badań przesiewowych w kierunku raka płuc

17.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56326

⸱

26 października 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental Oncology and Molecular Medicine, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, 2Unit of Thoracic Surgery, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przyjęty w badaniu przesiewowym BioMILD w celu przeprowadzenia testu klasyfikatora sygnatury krążącego mikroRNA do wczesnego wykrywania raka płuc.

Streszczenie

Opracowanie minimalnie inwazyjnego testu, takiego jak płynna biopsja, do wczesnego wykrywania raka płuc w fazie przedklinicznej, jest kluczowe dla poprawy wyników tej śmiertelnej choroby. MikroRNA (miRNA) to specyficzne tkankowo, małe, niekodujące RNA regulujące ekspresję genów, które mogą działać jako zewnątrzkomórkowi przekaźniki sygnałów biologicznych pochodzących z wzajemnego oddziaływania między guzem a otaczającym go mikrośrodowiskiem. Mogą one zatem stanowić idealnych kandydatów do wczesnego wykrywania raka płuc. W niniejszej pracy zaproponowano metodologiczny przepływ pracy do prospektywnej walidacji krążącego testu miRNA przy użyciu niestandardowych kart mikroprzepływowych i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym w próbkach osocza ochotników włączonych do badania przesiewowego w kierunku raka płuc. Ponadto, ponieważ uwalnianie miRNA związanych z hemolizą i bardziej ogólne problemy techniczne mogą mieć wpływ na analizę, przedstawiono również etapy kontroli jakości zawarte w standardowych procedurach operacyjnych. Protokół jest powtarzalny i daje wiarygodne wyniki ilościowe; Jednak w przypadku stosowania dużych serii klinicznych należy ostrożnie oceniać zarówno cechy przedanalityczne, jak i analityczne.

Wprowadzenie

Rak płuc jest najczęściej diagnozowanym nowotworem na świecie, stanowiąc około 25% wszystkich diagnoz raka1. Pomimo stałego spadku śmiertelności z powodu raka płuc w ciągu ostatnich 2 dekad, głównie z powodu zmniejszonego używania tytoniu, rak płuc pozostaje główną przyczyną zgonów z powodu raka zarówno u mężczyzn, jak i kobiet. Przewiduje się, że w 2017 r. będzie to około 25% i 20% wszystkich zgonów z powodu raka odpowiednio w Stanach Zjednoczonych i Europie1,2.

Ponieważ objawy zwykle nie występują we wczesnej fazie choroby, większość nowotworów płuc jest diagnozowana w późnych stadiach. Prowadzi to do ograniczonej możliwości interwencji terapeutycznej i słabej skuteczności zabiegów3. W związku z tym wiele wysiłków naukowych ma na celu zidentyfikowanie skutecznego testu do wczesnego wykrywania raka płuc.

Różnorodność badań przesiewowych pokazuje, że radiografia klatki piersiowej nie ma żadnej wartości w badaniach przesiewowych w kierunku raka płuc, podczas gdy niskodawkowa tomografia komputerowa (LDCT) jest lepszym narzędziem w porównaniu z radiografią do wykrywania wczesnego stadium raka płuc4. Ponadto wykazano, że badania przesiewowe z użyciem LDCT zmniejszyły śmiertelność z powodu raka płuc nawet o 20% wśród obecnych i byłych nałogowych palaczy5. Dane te przemawiają za stosowaniem badań przesiewowych w kierunku raka płuc w populacji wysokiego ryzyka, zgodnie z definicją zawartą w wytycznych kilku stowarzyszeń zawodowych4,6.

Warto zauważyć, że wśród głównych problemów związanych z badaniami przesiewowymi LDCT jest wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich i nadmierna diagnoza. W związku z tym społeczność naukowa poszukuje strategii przezwyciężenia tych problemów i zwiększenia swoistości testu przesiewowego LDCT. Przydatne może być tu opracowanie nieinwazyjnych biomarkerów komplementarnych. Do tej pory istnieje obszerna lista potencjalnych biomarkerów w trakcie badań, takich jak miRNA, DNA wolne od komórek, metylacja genów, małe białka i inne7.

Biomarkery oparte na krwi, w tym biomarkery odpowiedzi immunologicznej i krążące miRNA, to te, które osiągają bardziej zaawansowaną fazę walidacji8. Biomarkery odpowiedzi immunologicznej opierają się na wiedzy, że odpowiedzi immunologiczne zarówno przeciwko wewnątrzkomórkowym, jak i powierzchniowym antygenom nowotworowym są budowane u pacjentów z rakiem płuc9. Na przykład Ajona i wsp. oceniono rolę C4d, produktu degradacji klasycznego szlaku dopełniacza, w diagnostyce i rokowaniu raka płuc10. Poza tym, dostępny na rynku test surowicy autoprzeciwciał badający siedem antygenów związanych z nowotworem został zwalidowany u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca i wykazał 36% czułości i 91% swoistości11. Biomarkery odpowiedzi immunologicznej są interesujące, ale potrzebne są dalsze badania walidacyjne dla potencjalnego zastosowania klinicznego.

miRNA to endogenne małe niekodujące RNA o zachowanym mechanizmie i dużym znaczeniu funkcjonalnym we wszystkich królestwach zwierząt i roślin. Rolą miRNA jest regulacja translacji białek: hamują one ekspresję dużego zestawu docelowych genów12. Zostało dobrze udokumentowane, że zmiany w ekspresji miRNA przyczyniają się do patogenezy większości nowotworów u ludzi12,13,14. Ponadto zarówno komórki nowotworowe, jak i zrębowe uwalniają miRNA, stabilizowane przez ich włączenie do mikropęcherzyków lub poprzez asocjację z białkami wiążącymi RNA, do płynów ustrojowych, takich jak osocze i surowica15,16, urine17,and saliva18. Krążące miRNA mogą zatem odzwierciedlać odpowiedź gospodarza i dynamiczną interakcję między guzem a jego mikrośrodowiskiem19. Podsumowując, obserwacje te sprawiły, że krążące miRNA stały się obiecującą klasą biomarkerów do wykrywania raka u ludzi.

Krążące miRNA mogą być wykrywane przy użyciu różnych metod: platformy mikromacierzy20, ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR)21, oraz sekwencjonowanie nowej generacji (NGS)14,22. W ostatnich latach opracowano różne badania profilu ekspresji oparte na wyżej wymienionych technologiach. Mikromacierz to technologia o wysokiej przepustowości, która jest w stanie analizować do tysięcy miRNA w jednym teście. Ma jednak niższy zakres dynamiki i swoistość w porównaniu do RT-qPCR czy NGS. Ponadto mikromacierz jest metodą nieilościową, dlatego wymagana jest dalsza walidacja eksperymentalna. Metody oparte na sekwencjach mogą pozwolić na identyfikację nieznanych miRNA i są odpowiednie zwłaszcza w fazie odkrywania. Z drugiej strony, metody NGS są nadal drogie i wymagają specjalnego sprzętu oraz ekspertów bioinformatyków, co ogranicza ich zastosowanie w dużych kohortach walidacyjnych i w warunkach klinicznych23. W tej chwili RT-qPCR jest najczęściej stosowaną platformą do wykrywania krążącego miRNA w kontekście diagnostycznym/klinicznym24. Istnieją różne technologie RT-qPCR dostępne do analizy miRNA, ale najczęściej stosowaną jest RT z pętlą macierzystą, a następnie TaqMan PCR25. Technika ta jest niezwykle czuła i dokładna (dyskryminacja pojedynczego nukleotydu) i ma wysoki zakres dynamiki; jednak pozwala na wykrycie tylko znanych miRNA.

Badanie kontroli jakości mikroRNA (badanie miRQC) przeprowadzone przez Mestdagh et al. dokładnie zbadało charakterystykę niektórych dostępnych na rynku platform do profilowania miRNA w oparciu o trzy wyżej wymienione technologie26. Analizując 196 miRNA w próbkach tkanek i surowicy, oceniono wydajność różnych platform pod względem odtwarzalności, czułości, dokładności, swoistości i zgodności ekspresji różnicowej. Wyniki pokazały, że platformy oparte na technologiach NGS i mikromacierzy miały wyższą odtwarzalność i swoistość, ale platformy RT-qPCR były dokładniejsze, czułe i miały wyższy wskaźnik wykrywalności, szczególnie w przypadku próbek RNA o niskim poziomie wejściowym, takich jak płyny ustrojowe. Tym samym RT-qPCR wydaje się być najodpowiedniejszą metodą do potencjalnego zastosowania w rutynowej diagnostyce klinicznej.

W 2011 roku, Sozzi i wsp. przeanalizowali profil miRNA próbek osocza pobranych od ochotników biorących udział w pierwszym badaniu przesiewowym LDCT (badanie INT-IEO)27 i wygenerowano cztery sygnatury miRNA złożone przez wzajemne proporcje wśród 24 krążących miRNA. Sygnatury te były w stanie odróżnić osoby wolne od choroby od pacjentów z jakimkolwiek lub śmiertelnym rakiem płuc w czasie lub do 2 lat przed wykryciem choroby LDCT28. W kolejnym artykule ta sama grupa opisała po raz pierwszy klasyfikator sygnatury miRNA (MSC), uzyskany przez połączenie czterech sygnatur miRNA w celu stratyfikacji pacjentów na trzech poziomach ryzyka: wysokim, średnim i niskim. Jego przydatność kliniczna została potwierdzona w dużym retrospektywnym zestawie ponad 1000 osób włączonych do badania przesiewowego MILD, randomizowanego badania porównującego roczne lub dwuletnie ramiona LDCT z grupą obserwacyjną arm29. Rzeczywiście, połączenie MSC i LDCT zmniejszyło odsetek wyników fałszywie dodatnich LDCT o około 5 razy, a trzy grupy ryzyka MSC były związane z całkowitym przeżyciem.

Później, w 2013 roku w "Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori" (Mediolan, IT) rozpoczęto prospektywne badanie przesiewowe (BioMILD) wdrażające LDCT z testem MSC opartym na osoczu. Ochotnicy włączeni do badania BioMILD są poddawani LDCT i pobieraniu krwi, które są natychmiast przetwarzane w celu oddzielenia osocza w celu profilowania miRNA za pomocą specjalnie przygotowanych kart mikroprzepływowych. Kombinacja wyników LDCT i MSC definiuje specyficzny algorytm przesiewowy24.

W niniejszej pracy opisany jest cały protokół metodologiczny zastosowany w badaniu BioMILD, począwszy od pobrania próbki krwi, poprzez izolację osocza, ekstrakcję RNA, aż po profilowanie ekspresji 24 miRNA za pomocą specjalnie przygotowanych kart mikroprzepływowych RT-qPCR. Biorąc pod uwagę wysoką spójność i odtwarzalność, procedury te mogą być również stosowane do opracowywania płynnych biopsji na bazie miRNA w innych chorobach.

Protokół

Protokół został zatwierdzony przez komisję etyki badań naszej instytucji.

1. Pobieranie próbek osocza

  1. Zebrać 10 ml próbki krwi pełnej w probówkach Vacutainer z pokrytym sprayem K2EDTA i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: Aby zminimalizować hemolizę, oddziel osocze w ciągu 2 godzin. Nie przechowuj pełnej krwi w niskiej temperaturze (tj. 4 °C), aby uniknąć szoku termicznego i lizy komórek, które prowadzą do niespecyficznego uwalniania miRNA.
  2. W ciągu 1 godziny oddzielić osocze przez pierwszy etap wirowania w temperaturze 1,258 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  3. Przenieść supernatant osocza do probówki o pojemności 15 ml, ostrożnie unikając kontaktu z pierścieniem limfocytarnym.
  4. Odwirować osocze po raz drugi w temperaturze 1,258 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  5. Podzielić 1 ml osocza na 1,5 ml kriowialiów, unikając zbierania frakcji osocza u podstawy probówki.
  6. Przechowywać wszystkie podwielokrotności w temperaturze -80 °C, z wyjątkiem jednej przeznaczonej do oceny hemolizy. Analizę molekularną należy przeprowadzić w ciągu 5 tygodni.

2. Ocena hemolizy za pomocą pomiarów spektrofotometrycznych

  1. Bezpośrednio po etapie rozdzielania osocza, w kuwecie do spektrofotometrii, rozcieńczyć próbkę osocza w stosunku 1:10 w 1X PBS (np. 100 μL osocza w 900 μL 1X PBS) i wymieszać w celu homogenizacji.
    Uwaga: Próbki osocza nie należy zamrażać przed pomiarami spektrofotometrycznymi, ponieważ zamrażanie i rozmrażanie próbki (w szczególności w próbkach lipemicznych) może powodować powstawanie flokulatów, które zakłócają analizę spektrofotometryczną.
  2. Odczytać absorbancję przy 375 nm, 414 nm, 541 nm i 576 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis, z korekcją linii podstawowej ustaloną na 750 nm i długością drogi 10 mm. Wykonać ślepy pomiar przy użyciu 1 ml 1x PBS.
  3. Obliczyć stosunek absorbancji przy 414 nm do 375 nm; jeśli jest wyższy niż 1,4, należy rozważyć próbę poddaną hemolizie i powtórzyć pobranie krwi (QC1 w tabeli 1).

3. Ekstrakcja całkowitego RNA z osocza

  1. Przygotować roztwór 1-tioglicerolu/homogenizacji (OMG) z 20 μl 1-tioglicerolu na ml roztworu homogenizacyjnego. Ponieważ 1-tioglicerol jest lepki, należy ostrożnie odpipetować pipetę, aby uzyskać dokładny pomiar. Przed użyciem schłodzić roztwór OMG na lodzie lub w temperaturze 2-10 °C.
    UWAGA: Roztwór roboczy jest stabilny w temperaturze 2-10 °C przez 1 miesiąc.
  2. Zawiesić liofilizowaną DNazę I, dodając do fiolki 275 μl wody wolnej od nukleaz i delikatnie wymieszać (nie wirować). Jako pomoc wizualną dodać 5 μl niebieskiego barwnika do odtworzonej DNazy I i dozować roztwór do jednorazowych podwielokrotności w probówkach bez nukleaz. Rozpuszczoną DNazę I przechowywać w temperaturze od -30 °C do -10 °C.
  3. Zaczynając od 200 μl osocza, dodaj 200 μl schłodzonego roztworu OMG.
  4. Vortex 15-30 s, aby zapewnić pełną homogenizację. Jeśli dojdzie do pienienia, pozwól próbce osiąść na lodzie.
  5. Dodać 200 μl buforu do lizy i 25 μl proteinazy K do homogenizowanej próbki i wirować przez 20 s.
  6. Inkubować próbki przez 15 minut w termomikserze podgrzanym do temperatury 37 °C.
  7. Załaduj wkład dla każdej próbki na tacę pokładową instrumentu i umieść zatyczkę we właściwej pozycji.
  8. Przenieś lizat do odpowiedniej pozycji we wkładzie instrumentu.
  9. Dodać 5 μl roztworu DNazy I do odpowiedniego miejsca we wkładzie
    10. .
  10. Dodać 60 μl wody wolnej od nukleaz do podstawy każdej probówki elucyjnej.
  11. Wybierz metodę "RSC miRNA Tissue" i rozpocznij automatyczny przebieg oczyszczania. Całkowite próbki RNA mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.

4. RT oparty na Taq

  1. Użyj puli starterów Taq RT z interesującymi miRNA, aby przekształcić RNA w cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji mikroRNA Taq.
  2. Przygotuj 12 μl mieszanki reakcyjnej RT na lodzie w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zgodnie z instrukcją zestawu, używając 6 μl niestandardowej puli starterów Taq RT.
  3. Dodać 3 μl całkowitego RNA, aby uzyskać końcową objętość 15 μl i inkubować w lodzie przez 5 minut.
  4. Załaduj reakcję RT na termocykler skonfigurowany w następujący sposób: 16 °C przez 30 min, 42 °C przez 30 min, 85 °C przez 5 min i utrzymuj w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: cDNA można przechowywać w temperaturze od -15 do -20 °C przez co najmniej tydzień.

5. Wstępne wzmocnienie

  1. Wymieszaj 2,5 μl każdego produktu RT z 12,5 μl Taq Master Mix 2x, 3,75 μl Custom Taq pool i 6,25 μl wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 25 μl.
  2. Przeprowadź reakcję wstępnego amplifikacji za pomocą termocyklera zgodnie z następującym profilem termicznym: 95 °C przez 10 minut, 55 °C przez 2 minuty, 72 °C przez 2 minuty, 12 cykli po 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 4 minuty, następnie utrzymuj w temperaturze 99,9 °C przez 10 minut i w temperaturze 4 °C.
  3. Rozcieńczyć produkt, dodając 175 μL 0,1X TE, pH 8,0,
    Uwaga: Rozcieńczony produkt można przechowywać w temperaturze od -15 do -20 °C przez co najmniej tydzień.

6. Reakcja RT-qPCR na niestandardowych kartach mikroRNA Taq Array

  1. Użyj 384-dołkowej karty mikroRNA microfluidicCustom Taq Array, aby zmierzyć poziomy w osoczu 24 specyficznych miRNA (wykrytych w dwóch egzemplarzach) na 8 próbkach jednocześnie. Identyfikator miRBazy (v21) dla 24 miRNA to: has-miR-101-3p, has-miR-106a-5p, has-miR-126-3p, has-miR-133a-3p, has-miR-140-3p, has-miR-140-5p, has-miR-142-3p, has-miR-145-5p, has-miR-148b-3p, has-miR-15b-5p, has-miR-16-5p, has-miR-17-5p, has-miR-197-3p, has-miR-19b-3p, has-miR-21-5p, has-miR-221-3p, has-miR-28-3p, has-miR-30b-5p, has-miR-30c-5p, has-miR-320a, has-miR-451a, has-miR-486-5p, has-miR-660-5p i has-miR-92a-3p.
  2. Wymieszaj 1,13 μl rozcieńczonej próbki PreAmp z 56,25 μl 2X Taq Universal Master Mix i 55,69 μl wody wolnej od nukleaz w probówce o pojemności 0,5 ml.
  3. Załaduj do 8 mieszanin reakcyjnych PCR na niestandardowe karty mikroRNA Taq Array.
  4. Wirować przy 311 x g przez 2 min.
  5. Zapieczętuj niestandardową kartę za pomocą zgrzewarki do kart tablicowych.
  6. Przeprowadź reakcję w czasie rzeczywistym za pomocą systemu Real-Time PCR, modyfikując parametry cyklu w następujący sposób: 94,5 °C przez 10 minut, 40 cykli po 97 °C przez 30 s i 59,7 °C przez 60 s.

7. Ekstrapolacja danych i generowanie wskaźników

  1. Użyj oprogramowania, aby uzyskać surowe wartości Ct, ustawiając automatyczną linię bazową w celu usunięcia sygnałów tła i ustalony próg 0,15 dla wszystkich testów i próbek. Usuń miejsca o słabych krzywych wzmocnienia i/lub słabych pasywnych sygnałach odniesienia.
  2. Eksportuj surowe wartości Ct w formacie ".xls" i użyj średniej wartości Ct dwóch duplikatów do dalszej analizy.
  3. Skoreluj poziomy ekspresji miRNA z historycznymi pomiarami na próbkach badań klinicznych (Tabela 2). Jeśli co najmniej 50% próbek na każdej karcie mikroprzepływowej wykonanej na zamówienie daje korelację Pearsona < 97,5, powtórz analizę karty (QC2 w tabeli 1).
  4. Obliczyć -ΔCts między wszystkimi miRNA, równoważne wartościom log2 stosunków miRNA.

8. Ocena hemolizy na podstawie powiązanej sygnatury miRNA

  1. Wygeneruj sygnaturę miRNA związaną z hemolizą, używając następujących proporcji miRNA z odpowiednimi wartościami odcięcia (wartości log2) dla próbek osocza o krótkim przechowywaniu (1-5 tygodni w temperaturze -80 °C): miR-126/451 < −0,07, 15b/451 < −3,67, 221/451 < −3,18, 30b/451 < −1,1, 126/486-5p < −0,33, 15b/486-5p < −3,86, 221/486-5 p < −3,17, 30B/486-5P < −1,42, 126/92A < 1,8, 15b/92a < −1,8, 221/92a < −1,04, 30b/92a < 0,87, 126/16 < −2,85, 15b/16 < −6,33, 221/16 < −5,9, 30b/16 < −3,68.
  2. Klasyfikować jako próbki zhemolizowane, w których co najmniej 50% proporcji (8 z 16) przekracza odpowiednią wartość odcięcia (QC3 w tabeli 1).

9. Definicja poziomu ryzyka: wysoki, średni i niski

  1. Zdefiniuj cztery sygnatury proporcji miRNA składających się na MSC, zgodnie z opisem w Rysunek 3: ryzyko choroby (RD), ryzyko choroby agresywnej (RAD), obecność choroby (PD) i obecność choroby agresywnej (PAD).
  2. Dla każdej sygnatury należy określić proporcje przekraczające odpowiednią wartość odcięcia dla próbek osocza przechowywanych w krótkim czasie (1-5 tygodni w temperaturze -80 °C). Liczba przekroczeń współczynników potrzebnych do uznania za dodatnie wynosi 9 z 27 dla RD i PD oraz 14 z 28 dla RAD i PAD (Rysunek 3A).
  3. Przypisz każdej próbce odpowiedni poziom ryzyka MSC w następujący sposób: niskie ryzyko, jeśli RDneg ∩ PDneg ∩ RADneg ∩ PADneg; pośrednie ryzyko, jeśli RDpos ∪PDpos ∩ RADneg ∩ PADneg; lub wysokie ryzyko, jeśli RADpos ∪ PADpos (Rysunek 3B).

Wyniki

Badanie BioMILD jest prospektywnym badaniem w kierunku wczesnego wykrywania raka płuc, którego celem jest przetestowanie efektywności połączonego podejścia LDCT-MSC jako testów przesiewowych pierwszej linii w dużej kohorcie osób palących intensywnie. Każdemu ochotnikowi przypisywana jest klasa ryzyka na podstawie testu miRNA, który ocenia stosunki między 24 krążącymi w osoczu cząsteczkami miRNA. Jak szeroko raportowano30,31,32, hemoliza jest krytycznym problemem w analizie krążącego miRNA, ponieważ z powodu nieswoistego uwalniania miRNA przez komórki krwi można uzyskać fałszywe wyniki. W proponowanym schemacie metodologicznym opisano etap przedanalitycznej kontroli jakości (QC1 w Tabeli 1) w celu zidentyfikowania hemolizowanych, a tym samym niezdatnych do analizy, próbek osocza. Rysunek 1 przedstawia analizę spektrofotometryczną hemolizowanych (Rysunek 1A) i niehemolizowanych (Rysunek 1B) próbek osocza z odpowiednimi wartościami A414/A375. W kontekście klinicznym, w którym wynik testu molekularnego jest kluczowy dla opieki nad ochotnikiem, QC1 pozwala na powtórzenie pobrania krwi i, w większości przypadków, odzyskanie próbki.

Po obróbce molekularnej należy dokładnie ocenić wydajność RT-qPCR, aby zidentyfikować ewentualne problemy techniczne. Rycina 2A przedstawia RT-qPCR o niskiej wydajności wynikającej ze słabego sygnału referencyjnego pasywnego. W takim przypadku zaleca się ponowne naniesienie produktu preamplifikacji na nową kartę mikroprzepływową. Gdy RT-qPCR przebiega prawidłowo, jak na Rycynie 2B, karta przechodzi do pierwszego kroku pokolumnej kontroli jakości, aby upewnić się, że wartości ekspresji miRNA są porównywalne z pomiarami historycznymi (QC2 w Tabeli 1). Jeśli krok QC2 zakończy się niepowodzeniem, podczas odwrotnej transkrypcji lub w reakcjach preamplifikacji mógł wystąpić problem techniczny i w takim przypadku wygodniej jest powtórzyć całą obróbkę molekularną, zaczynając od odwrotnej transkrypcji.

Ostatni etap kontroli jakości (QC3 w Tabeli 1) ocenia hemolizę również na poziomie molekularnym. Poziomy ekspresji 4 miRNA specyficznych dla erytrocytów (mir-16, mir-451, mir-486-5p i mir-92a) porównano z poziomami 4 miRNA niezwiązanych z hemolizą (mir-126, mir-15b, mir-221 i mir-30b), generując sygnaturę miRNA związaną z hemolizą, składającą się z 16 (4 x 4) stosunków miRNA. Próbki dodatnie klasyfikuje się jako hemolizowane, natomiast próbki ujemne przechodzą do końcowej klasyfikacji poziomu ryzyka MSC, zgodnie z opisem w sekcji 9 protokołu oraz na Rysunku 3.

Analiza widm absorpcyjnych, stosunek A414/A375, cztery wykresy widm porównujące właściwości optyczne.
Rycina 1: Analiza spektrofotometryczna świeżych próbek osocza. Profile spektrofotometryczne (A) 2 hemolizowanych oraz (B) 2 niehemolizowanych próbek osocza, z pomiarem stosunku absorbancji między długościami fal A414 a A375. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy amplifikacji 24 miRNA i pojedynczego miRNA; schemat wyników qPCR dla ekspresji genów.
Rysunek 2: Wydajność RT-qPCR w analizie kart mikroprzepływowych. Wykresy amplifikacji i wieloskładnikowe porównujące karty mikroprzepływowe o (A) słabej i (B) dobrej jakości. Na każdym panelu przedstawiono wszystkie 24 miRNA oraz pojedyncze, przykładowe miRNA. Wykresy wieloskładnikowe ilustrują sygnały referencyjne pasywne występujące w tych reakcjach RT-qPCR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mapa ciepła ekspresji genów z kolorystyczną analizą wyników i identyfikatorami próbek.
Rycina 3: Algorytm MSC do stratyfikacji ryzyka. Reprezentatywne wyniki dla 6 próbek osocza od ochotników biorących udział w badaniu przesiewowym BioMILD.(A) Sygnatury stosunków miRNA dla ryzyka choroby (RD), ryzyka agresywnej postaci choroby (RAD), występowania choroby (PD), występowania agresywnej postaci choroby (PAD) oraz odpowiadające im wartości odcięcia (log2) dla próbek osocza przechowywanych w -80 °C przez co najmniej 1 tydzień i do 5 tygodni. (B) Kombinacja czterech sygnatur w celu stratyfikacji analizowalnych próbek na wysoki (H), pośredni (I) i niski (L) poziom ryzyka MSC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Pułapki i wyzwania związane z metodologicznym przepływem pracy
Ponieważ BioMILD jest pierwszym prospektywnym badaniem analizującym krążące miRNA jako narzędzie diagnostyczne, progi i punkty odcięcia wykorzystane do analizy danych zostały wygenerowane na podstawie serii retrospektywnych. Aby przezwyciężyć problem różnych interwałów przechowywania próbek osocza, parametry mogą zostać dopracowane w celu uzyskania ewentualnego wzrostu wydajności MSC. Niemniej jednak przed rozpoczęciem analizy miRNA należy dokładnie ocenić kilka aspektów całego procesu, takich jak kryteria włączenia, pobieranie i przetwarzanie próbek oraz algorytm bioinformatyczny przyjęty do analizy danych. Poniższe sekcje skupią się na najbardziej krytycznych punktach przepływu pracy opisanym w niniejszym artykule, odnosząc się do głównych problemów każdego pojedynczego kroku, a następnie proponując strategie ich przezwyciężenia.

Badana populacja
Kryteria włączenia do badania przesiewowego BioMILD to: osoby w wieku 50-75 lat, nałogowi obecni lub byli (mniej niż 10 lat) palacze z co najmniej 30-letnim stażem pracy i bez wcześniejszej historii raka w ciągu 5 lat. W tej populacji szacowana częstość występowania i zapadalność na raka płuc w ciągu roku wynosiła odpowiednio około 1% i 0,7%. W celu zastosowania testu MSC zgodnie z opisem w proponowanym protokole, analizowana populacja powinna zachować podobne cechy. W szczególności opisany powyżej etap QC2 obejmuje porównanie z podanymi danymi historycznymi uzyskanymi z podobnej populacji. Podczas gdy korelacja poniżej 97,5 może wskazywać na problemy techniczne, z drugiej strony większość osób ze zmienionymi poziomami krążącego miRNA odzwierciedlającymi ryzyko zachorowania na raka płuc znajduje się w rzeczywistości poniżej tego progu. Innymi słowy, jeśli etap QC2 z parametrami podanymi tutaj zostanie zastosowany do populacji o wyższym ryzyku zachorowania na raka płuc, może wykluczyć dopuszczalne próbki. Następnie należy zdefiniować nowe, właściwe parametry referencyjne, które są specyficzne dla każdej analizowanej populacji zgodnie z oczekiwanymi wynikami.

Pobieranie krwi i hemoliza
Pobieranie próbek biologicznych jest kluczowym etapem przedanalitycznym, ponieważ może pogorszyć jakość i charakterystykę próbki, a tym samym zmienić końcowe wyniki analiz. Jeśli chodzi o próbki krwi, ważne jest, aby pobrać świeżą krew i przetworzyć próbkę tak szybko, jak to możliwe. Próbki nie powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C ani zamrażane po pobraniu krwi, ponieważ zamrażanie i rozmrażanie kanałów może wywołać lizę komórek (hemolizę) i degradację RNA. Aby zminimalizować proces hemolizy, sugeruje się oddzielenie osocza w ciągu 2 godzin od pobrania krwi31 .

Hemoliza jest w dużej mierze spowodowana rozpadem czerwonych krwinek (RBC) i w konsekwencji uwalnianiem ich zawartości w otaczającym środowisku. Może to stanowić problem dla krążących testów miRNA, ponieważ uwalnianie wewnątrzkomórkowej zawartości erytrocytów dramatycznie zmienia profil mikroRNA we krwi, potencjalnie wpływając na dokładność analizy opartej na osoczu30.

Możliwość zidentyfikowania również minimalnych poziomów hemolizy w próbkach osocza ma kluczowe znaczenie dla badań opartych na krążących miRNA jako biomarkerach. Hemolizę można początkowo ocenić za pomocą oględzin, ponieważ po dwóch etapach wirowania kolor osocza może wahać się od żółtego do czerwonego w przypadku próbek o wysokim stopniu hemolizy. Jednak zwykłe oględziny mogą nie być wystarczająco czułe w kontekście badań nad biomarkerami molekularnymi.

Prostą, przedanalityczną metodą identyfikacji zhemolizowanych próbek osocza jest pomiar spektrofotometryczny przy długości fali (λ) = 414 nm głównej absorbancji piku oksyhemoglobiny, po odpowiednim dostosowaniu do wszelkich innych źródeł zakłóceń. Z tego powodu znormalizowaliśmy pik 414 nm do wartości absorbancji przy 375 nm, co wskazuje na zawartość lipidów33. Alternatywnie lub lepiej, w połączeniu, można zastosować wynik hemolizy niezależnej od lipemii (HS)34. Ta procedura oparta na spektrofotometrii może zidentyfikować co najmniej 6,1 mg/dl wolnej hemoglobiny. W przeciwnym razie próbki poddane hemolizie można zidentyfikować poprzez wykrycie miRNA specyficznych dla erytrocytów. Ponieważ nawet bardzo niski procent hemolizy może wywołać znaczny wzrost poziomów miRNA specyficznych dla erytrocytów32, Fortunato i in. zidentyfikowali specyficzną sygnaturę związaną z hemolizą na podstawie 16 proporcji miRNA, które mogą skutecznie klasyfikować hemolizę w próbkach osocza33. Wszystkie wymienione testy mogą być stosowane łącznie, ponieważ stosunek absorbancji 414/375 i/lub HS są przyjmowane w fazie przedanalitycznej, co pozwala zaoszczędzić dalsze koszty, podczas gdy pomiar miRNA związanych z hemolizą może być stosowany w fazie poanalitycznej jako etap kontroli jakości.

Izolacja krążących miRNA i czystość RNA
Procedura ekstrakcji RNA jest bardzo ważnym krokiem dla powodzenia kolejnych analiz. Zaczynając od próbki o niskiej wartości wejściowej, takiej jak osocze, ekstrakcja musi być tak wydajna, jak to tylko możliwe, aby zapewnić dokładną kwantyfikację miRNA. Osocze charakteryzuje się wysokimi stężeniami wielu białek, w tym nukleaz i innych składników, które mogą zakłócać dalsze reakcje enzymatyczne RT-qPCR i wpływać na wykrywanie krążących miRNA. W tego typu badaniach zastosowano kilka metod ekstrakcji, ale ogólnie rzecz biorąc, ekstrakcja organiczna, a następnie wzbogacanie RNA na bazie krzemionki pozwala na usunięcie inhibitorów osocza lepiej niż sam trizol35. Niemniej jednak w ciągu ostatnich kilku lat ekstrakcja ręczna została zastąpiona ekstrakcją automatyczną. Mniejsze ryzyko zanieczyszczenia, wyższa odtwarzalność i ekonomiczne wykorzystanie czasu to główne zalety zautomatyzowanych systemów w porównaniu z ręcznymi protokołami izolacji. Co więcej, zautomatyzowane metody ekstrakcji pozwoliły uzyskać najwyższe ilości miRNA z próbek krwi i najwyższą skuteczność w porównaniu z protokołami ręcznymi36.

Problem z normalizacją
Normalizacja poziomu miRNA w osoczu jest nadal kwestią kontrowersyjną. Rzeczywiście, różnice w jakości lub ilości próbki mogą przeszkadzać w identyfikacji prawdziwych zmian w poziomach ekspresji miRNA spowodowanych obecnością lub ryzykiem chorób, a tym samym prowadzić do niejednoznacznych interpretacji danych i mylących wniosków. Do tej pory brak konsensusu skutkował różnymi strategiami normalizacji37.

Całkowite RNA wyekstrahowane z próbek osocza jest zwykle poniżej progu standardowych metod kwantyfikacji, takich jak spektrofotometria UV lub spektrofotometria oparta na fluorescencji, co wyklucza standaryzację masy RNA38. W związku z tym jako dane wejściowe do reakcji RT należy wybrać stałą objętość, a nie stałą ilość eluowanego RNA39.

Transkrypty porządkowe używane do analizy miRNA w próbkach tkanek, takich jak RNU48 i RNU6, nie nadają się do normalizacji zewnątrzkomórkowych pomiarów miRNA, ponieważ oba nie zawsze są wykrywalne w krążeniu ze względu na degradację za pośrednictwem RNazy40, a także są rozregulowane w sposób specyficzny dla choroby37. Nie jest jasne, czy jakiekolwiek krążące miRNA mogą być skutecznie wykorzystywane jako kontrole referencyjne. Na przykład miR-16 jest często proponowany do sprzątania, ale różne badania wykazały, że jest on rozregulowany w próbkach osocza pacjentów z rakiem 28,37. Co więcej, poziom miR-16 jest silnie dotknięty hemolizą30.

Podczas gdy w przypadku testów wysokoprzepustowych mierzących kilka miRNA i normalizujących się na średniej wartości ekspresji jest ogólnie akceptowane41, gdy konieczne jest przeanalizowanie ograniczonej liczby miRNA, nie można zastosować tego podejścia normalizacyjnego. Aby ominąć problem normalizacji, Boeri i in. wcześniej ustalili algorytm oparty na wzajemnych proporcjach między 24 miRNA28. Takie podejście, mimo że jest bardzo przydatne dla rozwoju narzędzia diagnostycznego, nie pozwala łatwo na rozróżnienie skutecznie zmienionych miRNA, które mogą odgrywać rolę w rozwoju nowotworu, a tym samym zidentyfikowanie miRNA jako działających kalibratorów. Inna skuteczna strategia, przyjęta przez grupę Bianchi i wsp., która opracowała test miR w surowicy do wczesnego wykrywania raka płuc, opierała się na normalizacji na średniej geometrycznej grupy 6 "miRNA surowicy porządkowej", różniących się mniej między próbkami i klasami pacjentów42.

Cechy płynnej biopsji na bazie miRNA i potencjalne zastosowanie
MSC na bazie osocza to molekularny nieinwazyjny test badany pod kątem wczesnej diagnostyki raka płuc u nałogowych palaczy. Test MSC może zidentyfikować osoby o średnim lub wysokim ryzyku przed wykryciem raka płuca za pomocą LDCT, z wysoką czułością (SE, 87%) i ujemną wartością predykcyjną (NPV, 99%). W szczególności MSC może wdrożyć badania przesiewowe LDCT poprzez zmniejszenie liczby wyników fałszywie dodatnich do 3,7% z 19,7% dla samego LDCT29. Test MSC okazał się również dobrym wynikiem prognostycznym, jeśli chodzi tylko o pacjentów z rakiem płuca i może być stosowany jako narzędzie monitorowania samodzielnie lub w połączeniu z innymi klinicznymi parametrami patologicznymi43,44. Potencjalnie test MSC może umożliwić większą spójność algorytmów diagnostycznych raka płuca, zmniejszając w ten sposób opłacalność badań przesiewowych.

Oprócz MSC opisano inne nieinwazyjne testy do wczesnego wykrywania raka płuc. Bianchi i wsp. zaproponował krążący test miR oparty na sygnaturze 34 miRNA45, a następnie zredukował go do sygnatury 13 miRNA42. Próbki surowicy do wykrycia i walidacji uzyskano z badania przesiewowego LDCT z ciągłą obserwacją osób palących (COSMOS), przeprowadzonego w Europejskim Instytucie Onkologii (IEO, Mediolan, Włochy). Test miR wykazał 78% dokładność wykrywania raka płuc u ochotników wysokiego ryzyka. Pomiędzy 13 surowicy-miRNA i 24 tworzących MSC, tylko 5 miRNA nakładało się na siebie (miR-92a, miR-30b, miR-30c, miR-148a i miR-140-5p). Może to wynikać z różnego rodzaju próbek wyjściowych (surowica vs. osocze) oraz z opracowania danych. W rzeczywistości do testu miR-Test, autorzy wybrali 6 miRNA zachowujących się jak porządkowanie w surowicy, z których 3 zostały również uwzględnione wśród proporcji miRNA MSC (miR-15b, miR-19b i miR-197). Niemniej jednak MSC w osoczu i test miR w próbkach surowicy bardziej szczegółowo potwierdzają zastosowanie płynnej biopsji na bazie miRNA do wykrywania raka płuc.

Profilowanie MiRNA w celu identyfikacji biomarkerów raka płuca przeprowadzono również na próbkach plwociny46. Plwocina może być łatwo pobrana, a poziomy ekspresji miRNA wydają się być w niej niezwykle stabilne. Jednak ochotnicy poddający się badaniom przesiewowym w kierunku raka płuc są w wieku powyżej 50-55 lat i są nałogowymi palaczami z chorobami współistniejącymi, takimi jak POChP, co utrudnia uzyskanie plwociny. Rzeczywiście, spośród różnych płynów ustrojowych, osocze jest jedną z najlepszych alternatyw do badania potencjalnej roli miRNA jako (ale nie tylko) biomarkerów raka płuc.

Ogólnie rzecz biorąc, procedura opisana w niniejszej pracy może być istotna w kontekście różnych chorób, bez ograniczeń co do rodzaju badanej patologii (od raka, po zaburzenia układu nerwowego i sercowo-naczyniowego lub cukrzycę) oraz pod względem celu zastosowania klinicznego (biomarker do diagnozy, rokowania, a nawet odpowiedzi na leczenie).

Oświadczenia

Gabriella Sozzi, Mattia Boeri i Ugo Pastorino są współtwórcami trzech wniosków patentowych licencjonowanych przez Gensignia Life Sciences, dotyczących podpisu miRNA ujawnionego w tym artykule. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku ze zgłoszoną pracą.

Podziękowania

Autorzy dziękują Paoli Suatoni, Elenie Bertocchi, Carolinie Ninni, Annamarii Calanca i Chiarze Banfi za obsługę ochotników w badaniach i za pomoc administracyjną; oraz Claudio Jacomelli i Claudio Citterio za zarządzanie danymi. Prace były wspierane przez Włoskie Stowarzyszenie Badań nad Rakiem [granty badawcze nr 15928 dla UP, 14318 dla GS i 12162 (program specjalny "Innowacyjne narzędzia do oceny ryzyka zachorowania na raka i wczesnej diagnozy", 5x1000)]; włoskie Ministerstwo Zdrowia [Grant No. RF-2010]; Grant UO1 CA166905 z National Cancer Institute (USA). MB był wspierany przez Fondazione Pezcoller Fellowship.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  1x PBS LonzaBE-17-516
20xTE Bufor o pH 8,0Sonda molekularnaT11493Rozcieńczyć roztwór podstawowy 20X, aby uzyskać końcowe stężenie  0,1X w wodzie wolnej od nukleaz
Woda wolna od nukleaz 
Zestaw tkanek miRNA Maxwell RSC PromegaAS1460Zestaw zawiera roztwór homogenizacyjny, DNazę I, proteinazę K, bufor do lizy i wkłady. W przypadku 1-tioglicerolu należy unikać wdychania oraz kontaktu ze skórą i oczami. Używaj go pod dygestoriami.
Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan Basen gruntujący Thermo Fisher4366596
Custom TaqMan RT Thermo Fisher4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X Thermo Fisher4391128
Niestandardowy TaqMan  Basen PreAmp Thermo Fisher4459657
TaqMan Universal Master Mix II, bez UNG 2x Niestandardowe4440048
TaqMan Thermo Fisher4449137Przenieś niestandardowe karty mikroRNA TaqMan Array do temperatury pokojowej przed załadowaniem próbek
Zestaw do pobierania krwi Vacutainer Safety-Lock Becton Dickinson367286-364815
Plastikowa rurka próżniowa K2EDTA.Zamknięcie Becton Dickinson366643Lavender BD Hemogard 
Kuweta PS półmikro VWR/PBI  643-0326Ścieżka światła 10 mm
NanoDrop 2000c Spektrofotometr UV-VISFiolki
1,5 ml Z359033Sigma-Aldrich
5810R EppendorfDoprowadzić wirówkę do 4 stopni Celsjusza; C przed rozpoczęciem pobierania osocza
Wirówka Heraeus Multifuge 3S+Thermo FisherD-37520
Mieszalnik VortexVelp ScientificaF202A0173
ThermoMixer T- shakerEuroclone A00564Doprowadź mikser termiczny do 37 & stopni; C przed rozpoczęciem RNA  ekstrakcja
Maxwell RSC InstrumentPromegaAS4500
GeneAmp PCR System 9700 termocykler System Thermo Fisher
ViiA 7 do PCR w czasie rzeczywistym Oprogramowanie Thermo Fisher
ViiA 7 RUO Thermo Fisher
Arrey Card Staker/SealerThermo Fisher4331770
karty mikroRNA Thermo Fisher kriogeniczne Thermo Fisher Wirówka do

Bibliografia

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Malvezzi, M., et al. European cancer mortality predictions for the year 2017, with focus on lung cancer. Ann Oncol. , 10(2017).
  3. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (4), 271-289 (2016).
  4. Kanne, J. P. Screening for lung cancer: what have we learned. AJR Am. J Roentgenol. 202 (3), 530-535 (2014).
  5. Aberle, D. R., et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med. 365 (5), 395-409 (2011).
  6. Wender, R., et al. American Cancer Society lung cancer screening guidelines. CA Cancer J Clin. 63 (2), 107-117 (2013).
  7. Molina-Vila, M. A., et al. Liquid Biopsy in Non-Small Cell Lung Cancer. Front Med (Lausanne). , 69(2016).
  8. Sozzi, G., Boeri, M. Potential biomarkers for lung cancer screening. Transl Lung Cancer Res. 3 (3), 139-148 (2014).
  9. Shepherd, F. A., Douillard, J. Y., Blumenschein, G. R. Immunotherapy for non-small cell lung cancer: novel approaches to improve patient outcome. J Thorac Oncol. 6 (10), 1763-1773 (2011).
  10. Ajona, D., et al. Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer. J Natl Cancer Inst. 105 (18), 1385-1393 (2013).
  11. Boyle, P., et al. Clinical validation of an autoantibody test for lung cancer. Ann Oncol. 22 (2), 383-389 (2011).
  12. Hayes, J., Peruzzi, P. P., Lawler, S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends Mol Med. , (2014).
  13. Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 10 (10), 704-714 (2009).
  14. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med. 4 (3), 143-159 (2012).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 145-156 (2014).
  16. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10513-10518 (2008).
  17. Hanke, M., et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol. 28 (6), 655-661 (2010).
  18. Park, N. J., et al. Salivary microRNA: discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection. Clin Cancer Res. 15 (17), 5473-5477 (2009).
  19. Boeri, M., Pastorino, U., Sozzi, G. Role of microRNAs in lung cancer: microRNA signatures in cancer prognosis. Cancer J. 18 (3), 268-274 (2012).
  20. Castoldi, M., et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA. 12 (5), 913-920 (2006).
  21. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), 179(2005).
  22. Schulte, J. H., et al. Deep sequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versus unfavorable neuroblastoma. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5919-5928 (2010).
  23. Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. Biomed Res Int. , 731479(2015).
  24. Boeri, M., et al. Recent advances of microRNA-based molecular diagnostics to reduce false-positive lung cancer imaging. Expert Rev Mol Diagn. 15 (6), 801-813 (2015).
  25. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
  26. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  27. Pastorino, U., et al. Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results. Lancet. 362 (9384), 593-597 (2003).
  28. Boeri, M., et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3713-3718 (2011).
  29. Sozzi, G., et al. Clinical Utility of a Plasma-Based miRNA Signature Classifier Within Computed Tomography Lung Cancer Screening: A Correlative MILD Trial Study. J Clin Oncol. 32 (8), 768-773 (2014).
  30. Pritchard, C. C., et al. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila). 5 (3), 492-497 (2012).
  31. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), 24145(2011).
  32. Kirschner, M. B., et al. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4 (94), (2013).
  33. Fortunato, O., et al. Assessment of circulating microRNAs in plasma of lung cancer patients. Molecules. 19 (3), 3038-3054 (2014).
  34. Appierto, V., et al. A lipemia-independent NanoDrop((R))-based score to identify hemolysis in plasma and serum samples. Bioanalysis. 6 (9), 1215-1226 (2014).
  35. Kim, D. J., et al. Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation. J Mol Diagn. 14 (1), 71-80 (2012).
  36. Kulstein, G., Marienfeld, R., Miltner, E., Wiegand, P. Automation of DNA and miRNA co-extraction for miRNA-based identification of human body fluids and tissues. Electrophoresis. 37 (21), 2742-2750 (2016).
  37. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clin Chem. 61 (11), 1333-1342 (2015).
  38. Schlosser, K., McIntyre, L. A., White, R. J., Stewart, D. J. Customized Internal Reference Controls for Improved Assessment of Circulating MicroRNAs in Disease. PLoS ONE. 10 (5), 0127443(2015).
  39. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  40. Wang, K., et al. Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma. PLoS One. 7 (7), 41561(2012).
  41. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10 (6), 64(2009).
  42. Montani, F., et al. miR-Test: A Blood Test for Lung Cancer Early Detection. J Natl Cancer Inst. 19 (6), 063(2015).
  43. Sestini, S., et al. Circulating microRNA signature as liquid-biopsy to monitor lung cancer in low-dose computed tomography screening. Oncotarget. 20 (32), 32868-32877 (2015).
  44. Verri, C., et al. Mutational Profile from Targeted NGS Predicts Survival in LDCT Screening-Detected Lung Cancers. J Thorac. Oncol. (17), 10(2017).
  45. Bianchi, F., et al. A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer. EMBO Mol Med. 3 (8), 495-503 (2011).
  46. Gyoba, J., Shan, S., Roa, W., Bedard, E. L. Diagnosing Lung Cancers through Examination of Micro-RNA Biomarkers in Blood, Plasma, Serum and Sputum: A Review and Summary of Current Literature. Int J Mol Sci. 17 (4), 494(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Płynna biopsja mikroRNAanaliza krążącego miRNAmikrofluidyczny PCR na karcieprotokół izolacji RNAdetekcja za pomocą PCR w czasie rzeczywistymkontrola jakości hemolizyodwrotna transkrypcja TaqManreakcja preamplifikacji
Płynna biopsja na bazie mikroRNA: doświadczenia z klasyfikatorem sygnatury miRNA w osoczu (MSC) do badań przesiewowych w kierunku raka płuc
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.