Długoterminowe urządzenie do obrazowania na żywo do lepszej eksperymentalnej manipulacji larwami danio pręgowanego

Summary

Ten manuskrypt opisuje zWEDGI (Urządzenie do Zranienia i Uwięzienia Danio Zebra dla Wzrostu i Obrazowania), które jest urządzeniem przeznaczonym do orientacji i krępowania larw danio pręgowanego. Konstrukcja pozwala na przecięcie ogona i długoterminowe zbieranie obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości, przedstawiających gojenie się i regenerację ran.

Abstract

Larwa danio pręgowanego jest ważnym organizmem modelowym zarówno dla biologii rozwojowej, jak i gojenia ran. Co więcej, larwy danio pręgowanego są cennym systemem do obrazowania mikroskopowego dynamicznych zjawisk biologicznych w przestrzeni i czasie w wysokiej rozdzielczości z rozdzielczością komórkową. Jednak tradycyjna metoda enkapsulacji agarozy do obrazowania na żywo może utrudniać rozwój larw i odrastanie tkanek. Dlatego ten manuskrypt opisuje zWEDGI (Zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), które zostało zaprojektowane i wyprodukowane jako funkcjonalnie podzielone urządzenie do orientacji larw do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, umożliwiając jednocześnie przecięcie płetwy ogonowej w urządzeniu, a następnie nieograniczony rozwój i ponowny wzrost ogona. Urządzenie to pozwala na zranienie i długotrwałe obrazowanie przy zachowaniu żywotności. Biorąc pod uwagę, że forma zWEDGI jest drukowana w 3D, możliwość dostosowania jej geometrii sprawia, że można ją łatwo modyfikować do różnych zastosowań obrazowania danio pręgowanego. Co więcej, zWEDGI oferuje liczne korzyści, takie jak dostęp do larwy podczas eksperymentów w celu zranienia lub zastosowania odczynników, równoległa orientacja wielu larw w celu usprawnienia obrazowania oraz możliwość wielokrotnego użycia urządzenia.

Introduction

Zdolność regeneracyjna larw danio pręgowanego Danio rerio sprawia, że są one idealnym organizmem modelowym do badania reakcji rany, jak również gojenia i odrastania^1,2,3,4. Dostęp do szeregu transgenicznych linii do danio pręgowanego i anatomiczna przezroczystość danio pręgowanego dodatkowo zwiększają ich użyteczność w badaniach in vivo zdarzeń reakcji na rany, a także długoterminowych procesów regeneracyjnych⁴. Badanie tych procesów biologicznych przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości wymaga zatem urządzenia do obrazowania na żywo, które pozwala na wysoką stabilność i minimalny ruch larwy danio pręgowanego przy jednoczesnym zachowaniu żywotności. Kluczowe jest, aby urządzenie pozwalało na skuteczne zranienie, podczas gdy gojenie i regeneracja przebiegały bez wpływu urządzenia.

Standardowa metoda stabilizacji obrazowania na żywo, polegająca na osadzaniu larwy w agarozie podczas obrazowania na żywo, ogranicza wzrost i regenerację ran⁵ i może zwiększyć śmiertelność, ponieważ larwy zaczynają wykazywać oznaki stresu sercowego i martwicy tkanek po czterech godzinach⁴. Dlatego usunięcie agarozy z obszarów zainteresowania jest często konieczne, aby umożliwić normalny rozwój i regenerację⁶, narażając larwy na potencjalne uszkodzenia podczas odcinania agarozy. Ponadto, w przypadku techniki osadzania agarozy, użytkownik musi zorientować larwy w krótkim czasie, zanim agaroza zastygnie^5,6,7. Szybkie manipulowanie larwą wymaga nie tylko umiejętności użytkownika, ale także grozi uszkodzeniem larwy. Chociaż opisano metody stabilizacji larwy do obrazowania na żywo, aby obejść te wady, takie jak prążkowane studzienki agarowe³ lub divets⁸, użycie silikonowego smaru próżniowego do stworzenia komory obrazowania z rurami PVC lub innymi materiałami⁶ oraz rurki rotacyjne⁹, wiele z tych metod jest pracochłonnych, niechlujnych, często nie nadaje się do ponownego użycia i nie pozwala na manipulację środowiskiem (leczenie farmakologiczne, zranienia itp.) po zamontowaniu ryby.

Dlatego też urządzenie zWEDGI (Rysunek 1) zostało zaprojektowane tak, aby przezwyciężyć niektóre z wad montażu agaru do długoterminowego obrazowania larw danio pręgowanego na żywo, jednocześnie umożliwiając manipulację próbką. zWEDGI składa się z trzech półotwartych, podzielonych komór (Rysunek 1A), aby umożliwić ładowanie, unieruchamianie, ranienie i obrazowanie larw danio pręgowanego w ciągu 2 do 4 dni po zapłodnieniu. Urządzenie jest wykonane z polidimetylosiloksanu (PDMS) i umieszczone na szkiełku nakrywkowym naczynia do obrazowania o średnicy 60 mm ze szklanym dnem. Prezentowany tutaj projekt był przeznaczony do badań nad gojeniem się ran, jednak zastosowanie modułowej konstrukcji i standardowych technologii wytwarzania sprawia, że projekt zWEDGI można modyfikować i poddawać różnorodnym procedurom eksperymentalnym, zwłaszcza w przypadku procedur, które wymagają minimalnych ograniczeń związanych z eksperymentalną manipulacją i długotrwałym obrazowaniem.

Protocol

Uwaga: Podstawowy projekt zWEDGI został opracowany dla larw danio pręgowanego, które są 2 do 4 dni po zapłodnieniu (dpf) i są zgodne z wytycznymi University of Wisconsin-Madison Research Animals Resource Center.

1. Projektowanie i druk 3D form

1. Modeluj komponent PDMS urządzenia z żądanymi geometriami i atrybutami w oprogramowaniu do modelowania 3D⁵. Utwórz zespół pustej formy i części PDMS i wygeneruj formę ujemną dla części PDMS, tworząc wnękę w formie odpowiadającą części PDSM. Zapisz formę jako plik .stl do druku 3D (Rysunek 2, Krok 1.1).
   UWAGA: Plik w formacie stereolitografii (.stl) przedstawiający projekt formy przedstawiony tutaj (Rysunek 1) jest dostępny do pobrania pod adresem https://morgridge.org/designs/.
2. Drukuj formy za pomocą fotopolimerowej drukarki 3D (Rysunek 2, Krok 1.2). Jeśli to możliwe, wykonaj wiele form na jednym wydruku, aby można było uformować więcej niż jedno urządzenie za pomocą jednej partii PDMS.
   UWAGA: Pokazany przykład został wydrukowany w trybie Hi-Res ze średnicą wiązki 0,075 mm i grubością warstwy 0,05 mm, przy użyciu żywicy fotopolimerowej⁵.
   1. Wyczyść formy za pomocą cienkiej szczotki, denaturatu w butelce z rozpylaczem i sprężonego powietrza, aby delikatnie wyszorować i usunąć nieutwardzoną żywicę. Usuń wszelki materiał z obszarów mikrokanałów.
   2. Po utwardzeniu form w aparacie UV przez 60 minut z każdej strony, ponieważ nieutwardzona rezygnacja jest toksyczna dla larw danio pręgowanego¹⁰.
3. Przeszlifuj stronę wnęki formy papierem ściernym o ziarnistości 200 na płaskiej powierzchni, aż wszystkie powierzchnie uszczelniające zetkną się z papierem ściernym (geometria kanału ładowania i obwód formy). Lekko przeszlifuj papierem ściernym o ziarnistości 400 i 600, stopniowo, aby uzyskać gładkie, płaskie powierzchnie na wszystkich okładzinach geometrycznych (Rysunek 2, Krok 1.3). Zmierz głębokość wnęki po szlifowaniu za pomocą wskaźnika zegarowego, aby sprawdzić, czy jest ona zbliżona do zaprojektowanej głębokości.
   1. Wyczyść formy i tarcze pokrywy (1 3/4 cala średnicy x 1/4 cala grubości, szkło borokrzemianowe lub akryl; jedna szklana osłona na formę), umieszczając je w myjce ultradźwiękowej wypełnionej wodą na 30 minut lub spłukując pod bieżącą wodą.
   2. Wysuszyć sprężonym powietrzem i wyczyścić zarówno formy, jak i pokrywy alkoholem izopropylowym i przefiltrowanym sprężonym powietrzem. Użyj czystej ławki jako miejsca do produkcji urządzeń, aby zminimalizować zanieczyszczenie zanieczyszczeniami unoszącymi się w powietrzu. Pozostaw oczyszczone foremki i szklane pokrywy na czystej ławce lub przykrytej szalce Petriego, aż będą potrzebne.

2. PDMS Produkcja urządzenia zWEDGI

1. Wykonaj PDMS, wlewając 184 elastomer silikonowy polidimetylosiloksan (PDMS) w stosunku 5:1 (baza do aktywatora) do plastikowego kubka. Dobrze mieszaj przez 2 minuty drewnianym patyczkiem rzemieślniczym, mieszając żel na sobie, jak przy wyrabianiu chleba. Na 5 foremek użyj 10 g bazy i 2 g aktywatora.
   1. Mieszaninę odgazowującą w eksykatorze próżniowym przez 25 - 45 minut, aż wszystkie pęcherzyki znikną.
   2. Wypełnij wnękę każdej z wydrukowanych w 3D form około 0,75 ml PDMS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, aż forma nieznacznie przeleje się meniskiem (Rysunek 2, Krok 2.1).
   3. Odgazowuj napełnione formy przez 45 minut, aby usunąć dodatkowe pęcherzyki, które mogły powstać podczas napełniania.
2. Nałóż szklaną osłonę na formę wypełnioną PDMS, dociskając dysk pod kątem, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków (Rysunek 2, Krok 2.2). Pozwól, aby nadmiar PDMS został usunięty podczas nakładania szklanej osłony dysku.
3. Użyj małego zacisku zapadkowego, aby mocno przytrzymać tarczę pokrywy do formy.
   UWAGA: Tworzy to płaską powierzchnię po utwardzeniu PDMS i wytwarza otwory przelotowe, w których wydrukowane w 3D geometrie są zlicowane ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Alternatywnie, aby zwiększyć liczbę urządzeń, które można utwardzić za jednym razem, zbuduj urządzenie z wieloma zaciskami (np. Rysunek 2, Krok 2.3).
4. Utwardź urządzenie PDMS w zaciśniętych formach w temperaturze 100 ^oC w piekarniku przez 90 minut (Rysunek 2, Krok 2.4). Wyjmij foremki z piekarnika i pozostaw do ostygnięcia, aż będzie można je łatwo obsłużyć. Jeśli urządzenie mocujące jest metalowe, wyjmij zespół tarczy formy i pokrywy z zacisku, aby zapobiec dalszemu utwardzaniu PDMS przez metal z powodu ciepła resztkowego.
   UWAGA: Urządzenie najłatwiej wyjąć z formy, gdy jest jeszcze lekko ciepłe i nie do końca utwardzone. Jednak po wyjęciu formy z piekarnika i usunięciu pokrywy urządzenie może siedzieć przez kilka dni przed przystąpieniem do wyjmowania z formy. Jeśli urządzenie zostanie wyjęte z formy wkrótce po wyjęciu z pieca do utwardzania, umieść je na przykrytej szalce Petriego, aby zminimalizować zanieczyszczenia, a jednocześnie umożliwić mu pełne utwardzenie.

3. Plazmowe łączenie zWEDGI ze szklanym naczyniem

1. Zacisnąć formę zawierającą urządzenie PDMS w imadle stołowym tak, aby geometrie formy były skierowane do góry, równolegle do stołu roboczego.
   1. Rozpocznij wyjmowanie urządzenia PDMS, zwalniając zaczep PDMS z formy za pomocą pęsety z płaską końcówką. Pracuj pęsetą na obwodzie formy (jak wyjmowanie ciasta z patelni (Rysunek 2, Krok 3.1)).
   2. Użyj przefiltrowanego sprężonego powietrza i pęsety, aby delikatnie wyciągnąć urządzenie z formy, przytrzymując uchwyt i wdmuchując powietrze pod urządzenie. Pracuj powoli, pozwalając, aby powietrze pomogło oddzielić PDMS od formy, zwracając szczególną uwagę na końcówki pęsety wokół cienkich odcinków tunelu.
2. Umieść urządzenie PDMS do góry nogami na wewnętrznej stronie pokrywy naczynia ze szklanym dnem tak, aby kliny tunelu ograniczającego dotykały plastiku (Rysunek 2, Krok 3.2).
3. Umieść pokrywę naczynia z odwróconym do góry nogami zWEDGI i odpowiednie naczynie ze szklanym dnem w myjce plazmowej z wewnętrzną szklanką skierowaną do góry (Rysunek 2, Krok 3.3).
   1. Opróżnij komorę czyszczenia plazmowego, aż ciśnienie osiągnie 500 mTorr.
   2. Ustaw moc o częstotliwości radiowej (RF) na wysoką. Wystaw urządzenie i antenę na działanie częstotliwości radiowej przez około 2 minuty. Powoli rozhermetyzuj komorę i umieść urządzenie wraz z naczyniem w okapie w pomieszczeniu czystym.
4. Wyjmij urządzenie PDMS z pokrywy naczynia. Odwróć PDMS zWEDGI do właściwej orientacji na szkle, umieszczając go ostrożnie na środkowej studzience szklanego dna naczynia (Rysunek 2, Krok 3.4)
   1. Używając tylnej części pęsety, lekko dociśnij urządzenie PDMS, aby upewnić się, że pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione pod spodem. Zastosuj nacisk wokół drobnych geometrii mikrokanałów i wygładź PDMS aż do krawędzi (Rysunek 5C).
      UWAGA: Pełny kontakt między PDMS a szkłem zapewnia lepszą przyczepność dzięki wiązaniu plazmowemu. Urządzenie zWEDGI może być łączone plazmowo z innymi formatami naczyń ze szklanym dnem, takimi jak 6-dołkowa płytka ze szklanym dnem (Rysunek 2C).
   2. Umieść pokrywę na misce urządzenia przed wyjęciem z okapu w pomieszczeniu czystym.
      UWAGA: Po przymocowaniu urządzeń do szkła protokół można wstrzymać do czasu, aż będą gotowe do użycia.

4. Przygotowanie kanału i ładowanie larw

Uwaga: Ogólna hodowla danio pręgowanego była prowadzona według Księgi Danio pręgowanej, dostępnej online na stronie http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Dorosłe osobniki i zarodki danio pręgowanego utrzymywano zgodnie z wcześniejszym opisem¹. Użyto dzikiego szczepu typu AB. Postępuj zgodnie z Protokołem Opieki nad Zwierzętami instytucji, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wymagań dotyczących obrazowania żywych larw.

1. Przepłukać kanały co najmniej 100 μl 70% etanolu na kanał, używając mikropipety do przepłukania przez tunel ograniczający. Usuń etanol i spłucz 2 lub 3 razy wodą podwójnie destylowaną. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
2. Napełnij kanały odtłuszczonym mlekiem (o stężeniu 1% rozcieńczonym w wodzie) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować przywieranie larw do szklanego szkiełka nakrywkowego naczynia. Następnie delikatnie zanurz urządzenie kilka razy w podwójnie destylowanej wodzie w celu spłukania. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu do góry nogami.
   UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać protokół. To przygotowanie urządzenia zWEDGI można wykonać na kilka dni przed użyciem. Przechowywać pod przykryciem w temperaturze pokojowej.
3. Przygotuj 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (LMP), łącząc 100 μl 2% stopionej agarozy LMP ze 100 μl 2x trikainy (0,4 mg/ml trikainy - 3-aminobenzoesanu etylu) w buforze E3¹¹ wstępnie podgrzanym do 38 ^oC. Utrzymuj 1% roztwór agarozy/trikainy w temperaturze 38 ^oC w gorącym bloku, aby zapobiec żelowaniu.
   UWAGA: Do mikroskopii wielofotonowej ¹¹ należy użyć niepigmentowanych wariantów danio pręgowanego (takich jak casper¹²) lub utrzymywać larwy w E3 zawierające 0,2 mM N-fenylotiomocznik, aby zapobiec tworzeniu się pigmentu¹¹, aby zminimalizować absorpcję długości fal bliskiej podczerwieni przez pigment.
   Uwaga: N-fenylotiomocznik jest toksyczny. Postępuj zgodnie z zasadami instytucji dotyczącymi utylizacji.
4. Znieczulić larwy w buforze E3 zawierającym 0,2 mg/ml trikainy (Trikaina/E3)¹¹. Poczekaj, aż larwy będą nieruchome i nie będą reagować na bodziec dotykowy.
5. Wstępnie zwilż kanały kilkoma mikrolitrami Tricainy/E3.
   1. Złap pojedynczą larwę za pomocą końcówki pipety z szerokim otworem. Umieść larwy w kanale załadowczym (Rysunek 3A). Za pomocą końcówki do pipet lub podobnego narzędzia ustaw larwę w komorze załadowczej w taki sposób, aby strona grzbietowa była skierowana w stronę prostszej krawędzi komory ładowania, a ogon był skierowany w stronę tunelu ograniczającego (Rysunek 3B).
   2. Ostrożnie pobrać płyn z komory do ranienia, pozwalając larwie spłynąć do tunelu ograniczającego (Rysunek 3C). Usuń większość płynu, utrzymując wilgoć wokół larwy (Rysunek 3D). Proces ten można wspomóc poprzez lekkie przechylenie naczynia w kierunku komory do nawijania.
6. Umieść 1% agarozy LMP w Tricaine/E3 (~38 ^oC) nad głową larwy, wypełniając komorę załadowczą (Rysunek 3E). Pozwól agarozie zestalić się, a larwa znajduje się we właściwej pozycji. Dodaj Trikainę/E3 do komory do ranienia w razie potrzeby, aby utrzymać nawodnienie. Powtórz ten proces ładowania dla pozostałych 2 kanałów.
7. Za pomocą igły strzykawkowej ostrożnie usuń agarozę, która przedostała się przez tunel ograniczający do komory ranienia (Rysunek 3F). Dodać dodatkową trikainę/E3 tuż nad agarozą (do zranienia, krótkotrwałego obrazowania lub izolacji leczenia rany) lub w celu napełnienia szalki hodowlanej (do obrazowania długoterminowego). Załóż pokrywkę naczynia hodowlanego, aby zapobiec parowaniu. Larwy mogą być w tym momencie obrazowane (niezranione) lub zranione.

5. Ranienie i obrazowanie larw

1. Za pomocą sterylnego ostrza skalpela przeciąć płetwę ogonową tylnie do struny grzbietowej¹¹ w komorze do nawijania (Rysunek 3G, H). W razie potrzeby dodać więcej tricainy/E3 i założyć pokrywkę naczynia hodowlanego.
   UWAGA: Alternatywnie, w zależności od interesującego nas okna rozwojowego, larwy mogą zostać zranione, pozostawione do regeneracji w E3 i utrzymywane w inkubatorze (28,5 ^oC) do pożądanego czasu obrazowania, w którym to momencie można je umieścić w kanałach, jak opisano powyżej.
2. Zamontuj urządzenie zWEDGI ze znieczulonymi larwami na odwróconym mikroskopie we wkładzie scenicznym, który pomieści szklane dno naczynia o średnicy 60 mm. Zlokalizuj ogon larwy w najwyższym kanale, obracając naczynie w razie potrzeby, aby ogon znalazł się w żądanej pozycji. Obraz zgodnie z wymaganiami dla konkretnego eksperymentu.
   Uwaga: zWEDGI ma szerokie zastosowanie w mikroskopii świetlnej o wysokiej rozdzielczości, w tym we fluorescencji szerokokątnej i laserowej mikroskopii skaningowej. Podczas obrazowania larw danio pręgowanego należy wziąć pod uwagę szereg parametrów, ale konkretne parametry obrazowania zależą od instrumentu, próbki i eksperymentu. W tym przypadku ogon larwy został zobrazowany na specjalnie zbudowanym mikroskopie wielofotonowym^5,11 z wykorzystaniem następujących parametrów: 40-krotny obiektyw do zanurzenia w wodzie na dużą odległość roboczą, wzbudzenie laserowe 890 nm, filtr emisyjny 445/20 nm i rozdzielczość 512 x 512.

6. Koniec eksperymentu

1. Wyjmij szalkę zWEDGI z mikroskopu. Poddać larwy eutanazji, umieszczając zWEDGI w lodowatej kąpieli wodnej lub w temperaturze 4 ^oC na co najmniej 20 minut i ocenić brak bicia serca i krążenia.
   UWAGA: Ponieważ larwy są przechowywane w oddzielnych komorach, larwy można odzyskać pojedynczo, delikatnie pociągając za agar za pomocą kleszczy lub pipety. Agar można usunąć z okolicy głowy, a larwę wykorzystać do dodatkowych procedur, takich jak utrwalenie w celu barwienia przeciwciał lub przetworzyć w celu ekstrakcji RNA lub białka.
2. Po usunięciu larw i agaru należy oczyścić zWEDGI etanolem i wodą destylowaną, jak opisano w kroku 4.1 i ustawić do góry nogami do wyschnięcia na powietrzu. Przechowywać pod przykryciem w chłodnym, suchym miejscu. W razie potrzeby ponownie pokryć odtłuszczonym mlekiem (krok 4.2) przed następnym użyciem.
   UWAGA: zWEDGI mogą być wielokrotnie używane, aż PDMS zacznie odchodzić od szkła.

Results

Urządzenie mikroprzepływowe zWEDGI PDMS jest funkcjonalnie podzielonym urządzeniem zaprojektowanym do obsługi czterech głównych funkcji (wymienionych poniżej) związanych z obrazowaniem na żywo gojenia i odrastania ran płetwy ogonowej u larw danio pręgowanego. PDMS został wybrany do produkcji zWEDGI, ponieważ jest nie tylko łatwo dostępny i stanowi branżowy standard biokompatybilności, ale także dobrze sprawdza się w formach. Dodatkowo PDMS sprawia, że urządzenie nadaje się do wielokrotneg...

Discussion

Zadaniem urządzenia zWEDGI jest uchwycenie obrazowania poklatkowego 3D poprzez stabilizację i orientację ryb w niewielkiej odległości roboczej obiektywu mikroskopu o wysokiej rozdzielczości. Spełniając te specyfikacje projektowe, jest to również ulepszenie w stosunku do tradycyjnego preparatu na bazie agaru do obrazowania na żywo. Istnieją trzy krytyczne etapy (poniżej) produkcji zWEDGI, które, jeśli nie zostaną wykonane prawidłowo, mogą skutkować wadliwymi urządzeniami:

Przygotowanie PDMS (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research Oprogramowanie do modelowania 3D	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA	3D Systems Inc.	23200-902	3D Systems Inc.
Żywica fotopolimerowa Accura 60	3D Systems Inc.	24075-902	3D Systems Inc.
alkohol denaturowany	Sunnyside	5613735
Aparatura do utwardzania UV	3D Systems Inc.	23363-101-00	3D Systems Inc.
Rękawice nitrylowe TouchNTuff	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, ziarnistość 600 T414 niebieski papier ścierny	Dysk ze	66261139359, 54, 52	MSC
, średnica 2"	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
środek do czyszczenia ultradźwięków	Branson	1510R-MTH
alkohol izopropylowy 70%	Hydrox	54845T43	McMaster-Carr
10 uncji przezroczystego plastikowego kubka	WNA Masterpiece	557405	Amazonka
6-calowy kij rzemieślniczy	Perfect Stix	Craft WTD-500	Amazon
Nazwa	>Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Wyprodukuj urządzenie zWEDGI PDMS
Sylgard 184 zestaw z elastomeru silikonowego	Kleje Dow-Corning	4019862	Ellworth
Strzykawka 10 ml	Becton Dickinson	305219	Vitality Medical Inc
eksykator	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 w zacisku zapadkowym	Pittsburgh	68974	Piec
laboratoryjny	Quincy Lab Inc.	przemysłowej 20GC	Global Dysza
filtrem sprężonego powietrza		Innotech	TA-N2-2000FT
Imadło próżniowe	Wilton Tool Group	63500	MSC Przemysłowe
naczynie ze szklanym dnem 55 mm; Szkło pokrywowe Micro-well 30 mm #1,5	Cellvis	D60-30-1,5-N	Cellvis
czyścik plazmowy	Harrick Plasma	PDC-001	Harrick Plasma
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ładowanie Larwy
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
100% etanol (przed użyciem rozcieńczony do 70% wodą)	Pharmco-aaper	111000200
Pipeta transferowa	Fisherbrand	13-711-5A	Fisher Scientific
mleko		2902887	MP Biomedicals
podwójnie destylowana woda
N-fenylotiormocznik	Sigma-Aldrich	P7629	Sigma-Aldrich
Trikaina (3-aminobenzoesan etylu)		C-FINQ-UE	Western Chemical
agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
(inkubator do suchej kąpieli)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3
końcówka do pipet z dużym otworem, 200 uL	Fisherbrand	02-707-134	Fisher Scientific
Końcówka do pipet ogólnego przeznaczenia, 200 uL	Fisherbrand	21-197-8E
Ostrze skalpela Fisher Scientific#15	Feather	2976
Igła strzykawkowa Amazon 25G	BD	BD305122	Fisher Scientific
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Obrazowanie
odwrócony mikroskop
Imaris oprogramowanie do obrazowania Bitplane