Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nierówne nanowzorce na bazie dendrymerów do lokalnej kontroli adhezji powierzchni: metoda kierowania różnicowaniem chondrogennym

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56347

⸱

20 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę uzyskiwania nierównych nanowzorów na bazie dendrymerów, które pozwalają na nanoskalową kontrolę lokalnej gęstości powierzchni kwasu arginina-glicyna-asparaginowa (RGD) i zastosowano ją do badania adhezji komórek i różnicowania chondrogennego.

Streszczenie

Przyleganie i różnicowanie komórek jest uwarunkowane nanoskalowym rozmieszczeniem składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), przy czym duży wpływ mają lokalne stężenia. W tym miejscu przedstawiono metodę otrzymywania wielkoskalowych nierównych nanowzorów dendrymerów funkcjonalizowanych argininą, glicyną i kwasem asparaginowym (RGD), które pozwalają na nanoskalową kontrolę lokalnej gęstości powierzchni RGD. Nanowzorce powstają w wyniku adsorpcji powierzchniowej dendrymerów z roztworów o różnych stężeniach początkowych i charakteryzują się kątem zwilżania wody (CA), rentgenowską spektroskopią fotoelektronów (XPS) oraz technikami mikroskopii skaningowej, takimi jak skaningowa mikroskopia tunelowa (STM) i mikroskopia sił atomowych (AFM). Lokalna gęstość powierzchniowa RGD jest mierzona za pomocą obrazów AFM za pomocą map konturowych prawdopodobieństwa minimalnych odległości między cząstkami, a następnie korelowana z odpowiedzią adhezyjną i różnicowaniem komórek. Przedstawiona tutaj metoda nanowzorcowania jest prostą procedurą, którą można w prosty sposób skalować do dużych powierzchni. Dzięki temu jest w pełni kompatybilny z protokołami hodowli komórkowych i może być stosowany do innych ligandów, które wywierają zależny wpływ na komórki w zależności od stężenia.

Wprowadzenie

Tutaj opisujemy prostą i wszechstronną procedurę nanowzorcowania opartą na dendrymerach, aby uzyskać powierzchnie hodowli komórkowych, które pozwalają na kontrolę lokalnej adhezji w nanoskali. Szczegóły organizacji ECM w nanoskali zostały zgłoszone,1,2,3, a nanowzorce powierzchni adhezyjnych komórek dostarczyły głębokiego wglądu w wymagania komórkowe związane z adhezją4,5. Eksperymenty z wykorzystaniem nanowzorców opartych na litografii micelarnej wykazały wartość progową około 70 nm dla nanoodstępów peptydów RGD, przy czym adhezja komórek była znacznie opóźniona powyżej tej wartości6,7,8,9. Badania te podkreśliły również większy wpływ lokalnej niż globalnej gęstości ligandów na adhezję komórek9,10,11.

Podczas morfogenezy, interakcje komórek z otaczającym środowiskiem wywołują pierwsze zdarzenia różnicowania, które trwają aż do momentu powstania ostatecznych złożonych struktur tkankowych. W tym kontekście, nanowzorzyste powierzchnie zostały wykorzystane do zmierzenia się z wpływem początkowych interakcji komórka-powierzchnia na morfogenezę. Oparte na litografii nanowzory RGD o odstępach bocznych 68 nm w stopach Ti-40Nb typu β pomagają utrzymać niezróżnicowany fenotyp niezaangażowanych komórek macierzystych12, podczas gdy nanoprzestrzenie RGD między 95 a 150 nm zwiększają różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w kierunku adipogennych/osteogennych13,14,15 i chondrogenne losy16. Wykazano również, że samoorganizujące się makrocząsteczki zmodyfikowane składnikami sygnalizacyjnymi kierują adhezją i różnicowaniem komórek, zapewniając regulację architektury sygnałów w nanoskali17. W związku z tym, do badania adhezji komórek wykorzystano osadzanie dendrymerów z ugrupowaniami oddziałującymi z komórkami w ich zewnętrznej sferze18,19,20 na powierzchniach21,22, morphology23,24, and migration events25,26. Niemniej jednak brak charakterystyki powierzchni w tych badaniach utrudnia ustalenie jakiejkolwiek korelacji między konfiguracją powierzchni dendrymerów a odpowiedzią komórki.

Nanowzorce dendrymeru o porządku podobnym do cieczy i określonych odstępach można uzyskać, gdy dendrymery adsorbują się na nisko naładowanych powierzchniach z roztworów o niskiej sile jonowej. 27 Na podstawie tej właściwości, prezentujemy tutaj metodę uzyskiwania wielkoskalowych nierównych nanowzorów dendrymerów funkcjonalizowanych RGD na nisko naładowanych powierzchniach, które pozwalają na nanoskalową kontrolę lokalnej gęstości powierzchni RGD. Kąt zwilżania wody (CA), rentgenowska spektroskopia fotoelektronów (XPS) i techniki mikroskopii z sondą skaningową (nanowzorce STM i AFM) pokazują, że lokalne gęstości ligandów można regulować, modyfikując początkowe stężenie dendrymerów w roztworze. Lokalna gęstość powierzchniowa RGD jest określana ilościowo na podstawie obrazów AFM za pomocą map konturowych prawdopodobieństwa minimalnych odległości między cząstkami, a następnie korelowana z eksperymentami komórkowymi. W porównaniu z innymi technikami nanowzorcowania4, nanowzorce oparte na dendrymerach są proste i można je łatwo skalować do dużych powierzchni, dzięki czemu są w pełni kompatybilne z zastosowaniami hodowli komórkowych. Nanowzorce są używane jako bioaktywne substraty do oceny wpływu lokalnej gęstości powierzchni RGD na adhezję komórek28 oraz na chondrogenizną indukcję MSCs dorosłego człowieka29. Nasze wyniki pokazują, że nanowzorce oparte na dendrymerach RGD podtrzymują wzrost komórek, a adhezja komórek jest wzmacniana przez wysoką lokalną gęstość powierzchni RGD. W eksperymentach różnicowania pośrednia adhezjalność komórek do substratów sprzyjała kondensacji MSC i wczesnemu różnicowaniu chondrogennemu. Ze względu na łatwość, z jaką można modyfikować obwodowe grupy dendrymerów, opisana tutaj metoda może być dalej rozszerzona na inne ligandy ECM, które wywierają zależny od stężenia wpływ na komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża

  1. Wyżarzanie 1,4 x 1,1 cm Au(111) na podłożach mikowych.
    1. Umieścić podłoże Au(111) na płycie szklano-ceramicznej i wyżarzać je płomieniem butanowym przez 3 minuty. Pozostawić podłoże do ostygnięcia w atmosferze argonu. Powtórz ten krok dla każdego podłoża Au(111).
      UWAGA: Podłoża Au(111) należy stosować bezpośrednio po wyżarzaniu.
  2. Przygotowanie podłoży szklanych pokrytych poli(L-kwasem mlekowym) (PLLA).
    1. Wytnij i umyj szkiełka szklane.
      1. Pokrój szkiełka mikroskopowe na 18 szkiełek o wymiarach 1,25 cm x 1,25 cm za pomocą frezu z diamentową końcówką. Zrób małe wgłębienie na dolnej stronie każdego slajdu, aby można było później odróżnić górną i dolną stronę.
      2. Dokładnie umyj szkiełka wodą dejonizowaną, a następnie 96% etanolem. Pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu.
    2. Przygotować 2% roztwór PLLA.
      1. Dodać 200 mg PLLA do 10 ml 1,4-dioksanu w probówce ciśnieniowej. Dodaj mieszadło i szczelnie zamknij tubkę.
      2. Umieścić rurkę ciśnieniową w kąpieli glicerynowej na płycie grzejnej o temperaturze 60 °C pod delikatnym mieszaniem przez 24 godziny, a następnie przenieść roztwór do szklanej fiolki o pojemności 15 ml.
    3. Powlekanie szkiełek roztworem PLLA.
      1. Umieścić szkiełka podstawowe i fiolkę z roztworem PLLA na czystej płycie grzejnej w temperaturze 60 °C. Upewnij się, że szkiełka są skierowane do góry i pozostawić je na co najmniej 10 minut, aby osiągnęły wymaganą temperaturę.
      2. Przygotować powlekarkę wirową i ustawić program określony w tabeli 1.
      3. Umieść jedno z szkiełek zadrukowaną do góry na powlekarce wirowej, używając systemu próżniowego. Za pomocą pipety Pasteura nanieś 0,25 ml roztworu PLLA na szkiełko, upewniając się, że cała powierzchnia jest pokryta. Uruchom program do powlekania. Powtórz ten krok dla każdego slajdu.

2. Nanowzorce dendrymerów

  1. Przygotowanie roztworów dendrymeru funkcjonalizowanego RGD (RGD-CYS-D1) 28.
    1. Rozpuścić 5 mg dendrymeru w 6,494 ml wody dejonizowanej. To jest roztwór A.
      UWAGA: Roztwór podstawowy dendrymeru należy zużyć w ciągu 6 miesięcy od przygotowania.
    2. Sonikować roztwór A przez 10 minut i przygotować roztwory B i C zgodnie z tabelą 2.
    3. Sonikować roztwór C przez 10 minut i przygotować roztwory D, E i F zgodnie z tabelą 2.
    4. Roztwory B, C, D, E i F należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Roztwór A może być przechowywany w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
  2. Nanomodelowanie dendrymerów RGD-CYS-D1 na podłożach
    1. W kapturze do hodowli tkankowej wysterylizuj substraty, naświetlając je światłem UV przez 13 min.
      UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy substraty z nanowzorcami mają być używane jako substraty do hodowli komórkowych. W takim przypadku należy zachować sterylne warunki (kaptur do hodowli tkankowej, sterylne materiały, roztwory i techniki) dla kolejnych etapów.
    2. Umieść każde podłoże stroną zadrukowaną do góry w dołkach talerza, ostrożnie dotykając ich pęsetą.
    3. Sonikować roztwory B, C, D, E i F przez 10 minut.
    4. Przepuścić roztwory dendrymeru RGD-Cys-D1 przez filtr o średnicy 0,22 μm za pomocą strzykawki bezpośrednio do studzienek zawierających substraty (2 ml/studzienkę). Zalecane są co najmniej trzy repliki na stężenie dendrymeru. Zamknij i uszczelnij płytkę i pozostaw ją w temperaturze pokojowej (RT) na 16 godzin.
    5. Usuń i wyrzuć roztwory. Umyj podłoża sterylną wodą dejonizowaną i wysusz. Przechowywać podłoża w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Przygotowanie substratów kontrolnych

Uwaga: Wszystkie kroki zostały wykonane w sterylnym kapturze do hodowli tkanek i użyto tylko sterylnych materiałów, roztworów i technik. Użyto co najmniej sześciu substratów kontrolnych (trzy repliki kontroli dodatniej i trzy repliki kontroli ujemnej).

  1. W kapturze do hodowli tkankowych wysterylizuj podłoża, naświetlając je światłem UV przez 13 minut.
  2. Substraty kontrolne do eksperymentu z adhezją fibroblastów.
    1. Jako kontrolę ujemną należy stosować podłoża wyżarzane płomieniowo Au(111). Złoto ma dobrze znany efekt denaturacji białek, który nadaje właściwości antykomórkowe adhezyjne28. Sonikować wszystkie roztwory i filtrować przed inkubacją substratu.
    2. W przypadku kontroli pozytywnej zanurzyć wyżarzane płomieniowo podłoża Au(111) w roztworze modyfikowanego RGD tiolu PEG, mono-11-merkaptoundekanamidu glikolu etylenowego (RGD-PEG-SH)30 i eteru mono-11-merkaptoundecylowego glikolu trietylenowego (PEG-SH) w stosunku molowym 1:100 w 96% etanolu przez 16 godzin w temperaturze pokojowej.
    3. Podłoża dokładnie umyć w etanolu i osuszyć argonem. Podłoża należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Substraty kontrolne dla chondrogenezy.
    1. Użyj nieskazitelnych substratów PLLA jako kontroli negatywnej. Bez żadnej obróbki powierzchniowej PLLA wykazuje słabe połączenie z żywymi komórkami. 31
    2. Do kontroli dodatnich należy przygotować 5 ml fibronektyny o stężeniu 0,1 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować każdy substrat PLLA z 1,6 ml roztworu fibronektyny przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    3. Usuń i wyrzuć roztwór fibronektyny, a podłoża umyj PBS. Podłoża należy przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Charakterystyka powierzchni

  1. Obrazowanie AFM
    1. Wykonaj obrazowanie AFM podłoży PLLA w celu analizy chropowatości. Ponieważ dendrymery mają średnicę 4-5 nm, dla prawidłowej wizualizacji nanowzorów należy uzyskać wartości chropowatości 1 nm. Wykonaj również obrazowanie AFM nanowzorców. W obu przypadkach wykonaj AFM w trybie stukania w powietrzu.
    2. Wybrać wspornik krzemowy o stałej sprężystości k = 40 N/m i częstotliwości rezonansowej ν = 300 kHz i zamontować go na sprzęcie AFM.
    3. Zamontuj próbkę na stoliku mikroskopu sił atomowych. W zależności od konfiguracji aparatu, specyfikacje strojenia i obrazowania mogą się różnić. Zapoznaj się z instrukcją producenta.
    4. Zbliżyć się do próbki końcówką mikroskopu aż do kontaktu.
    5. Aby zobrazować PLLA do analizy chropowatości, wybierz co najmniej cztery reprezentatywne obszary o wymiarach 20x20 μm na podłoże z trzech niezależnych substratów. Aby zobrazować nanowzorce dendrymerów, należy wybrać co najmniej trzy reprezentatywne obrazy 5×5 μm na substrat z trzech niezależnych substratów na warunek (początkowe stężenie dendrymera w roztworze). Aby uniknąć uszkodzenia warstwy dendrymeru podczas obrazowania, dostosuj wartość zadaną, aby utrzymać siłę na minimalnym poziomie.
      UWAGA: Wybór obszaru obrazowania zależy również od zakresu pracy skanera piezoelektrycznego. W tym zakresie należy zapoznać się z instrukcją obsługi przyrządu.
    6. Przetwarzaj obrazy wysokości AFM, dopasowując każdą linię skanowania do funkcji poziomowania wielomianów za pomocą zastrzeżonego oprogramowania producenta aparatu AFM, a następnie analizuj te z PLLA w celu obliczenia chropowatości powierzchni. Analiza średniej kwadratowej (RMS) może stanowić odpowiednią opcję.
  2. Lokalny pomiar gęstości powierzchni RGD.
    1. Uzyskaj progi obrazu przetworzonych obrazów wysokości AFM, aby wybrać dendrymery na powierzchni.
    2. Określ pozycje cząstek za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu i użyj ich do uzyskania minimalnych odległości między cząstkami (dmin).
    3. Wykreślić wartości dmin w z do odpowiednich pozycji cząstek, aby uzyskać mapy konturowe prawdopodobieństwa dla dmin. Dostosuj skalę kolorów wykresu, aby uwidocznić obszary o największej lokalnej gęstości powierzchni RGD (dmin < 70 nm).
    4. Określ ilościowo obszar regionów o największej lokalnej gęstości powierzchni RGD za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. W obliczeniach należy uwzględnić obszary agregatów dendrymerowych.
  3. Obrazowanie STM.
    Uwaga: Obrazowanie STM można wykonać tylko dla nanowzorców na przewodzących podłożach Au(111). Pomiary wykonywane są w powietrzu.
    1. Umieścić nanowzorzyste podłoże w uchwycie na próbkę w urządzeniu STM. Sprawdź połączenie elektryczne między próbką a uchwytem za pomocą testera.
    2. Wytrawić końcówkę z wybranego materiału sondy (tj. Pt 0,8: Ir 0,2) o średnicy zapewniającej prawidłowe dopasowanie do głowicy urządzenia STM. Wytrawianie można wykonać zarówno przez cięcie ręczne, jak i przez trawienie elektrochemiczne. 32
      UWAGA: Wytrawianie elektrochemiczne renderuje bardziej symetryczne końcówki.
    3. Zamontuj końcówkę w głowicy urządzenia STM i podłącz próbkę.
    4. Ustaw "prąd" w kanale sprzężenia zwrotnego (w tego typu pomiarze prąd będzie stały dzięki strojeniu ze sprzężeniem zwrotnym). Dostosuj nastawę napięcia i prądu polaryzacji oraz rozmiar skanowania, aby uzyskać obraz w dobrej rozdzielczości po zatrzaśnięciu końcówki.
      UWAGA: Wybór obszaru obrazowania zależy również od zakresu pracy skanera piezoelektrycznego. W tym zakresie należy zapoznać się z instrukcją obsługi przyrządu.
    5. Przetwarzanie obrazów topograficznych STM poprzez dopasowanie każdej linii skanowania do funkcji poziomowania wielomianów przy użyciu zastrzeżonego oprogramowania producenta aparatu STM.
  4. Pomiary CA.
    1. Zmierzyć CA na nanowzorcach substratów metodą siedzącej kropli w trzech różnych pozycjach na trzech niezależnych podłożach w każdym warunku (początkowe stężenie dendrymeru w roztworze) za pomocą optycznego systemu CA.
    2. Napełnij mikrostrzykawkę wodą dejonizowaną i ustaw parametry w oprogramowaniu CA tak, aby wytwarzały krople o wielkości 1 μl.
    3. Umieścić próbkę na stoliku tak, aby powierzchnia próbki była wyraźnie widoczna na komputerze do obrazowania.
    4. Przesunąć strzykawkę z mikromanipulatorem, aż zbliży się do powierzchni i dozować kroplę na powierzchnię. Zapisz obraz natychmiast po stabilizacji kropli.
      UWAGA: W pomiarach CA bardzo ważne jest kontrolowanie wilgotności w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
    5. Przeanalizuj CA zmierzone za pomocą zastrzeżonego oprogramowania producenta aparatury CA. Sposób montażu może być dostosowany do wymagań użytkownika. Opcjonalnie może być metoda montażu eliptycznego.

5. Hodowla komórkowa

UWAGA: Wszystkie kroki zostały wykonane w kapturze do hodowli tkankowej, a użyto tylko sterylnych materiałów, roztworów i technik.

  1. Eksperyment z adhezją fibroblastów.
    1. Hodowla mysich fibroblastów embrionalnych NIH 3T3 z wczesnych pasaży (< 10) w temperaturze 37 °C i 4,6% atmosferze CO2 w pożywce podstawowej z wysokim poziomem glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% L-glutaminą, 1% penicyliną-streptomycyną i 1% pirogronianem sodu (pożywka wzrostowa). Zalecane są kolby T75 do całkowitego wysiewu 500 000 komórek na kolbę w 10 ml pożywki wzrostowej.
    2. Usuwaj starą pożywkę za pomocą pipety o pojemności 10 ml co 2 dni i zastąp ją 10 ml świeżo przygotowanej pożywki wzrostowej.
    3. Hoduj komórki w pożywce wzrostowej, aż osiągną około 80% zbieżności, a następnie usuń pożywkę i dodaj 5 ml trypsyny na kolbę. W celu zapewnienia prawidłowego oddzielenia komórek od dna kolby, roztwór trypsyny powinien utrzymywać kontakt z komórkami przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Dodać 5 ml pożywki wzrostowej na kolbę i zebrać komórki w probówce wirówkowej. Odwirować komórki przy 470 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki wzrostowej. Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru.
    5. Przenieść substraty do studzienek, które nie zostały poddane działaniu hodowli tkankowej (nieprzylegające).
    6. Wysiewać komórki na podłożach o gęstości 4 000 komórek/cm2 w pożywce wzrostowej i inkubować je przez 4,5 godziny w temperaturze 37 °C i atmosferze 10%CO2.
  2. Chondrogenna indukcja MSCs.
    1. Hodowla ludzkich MSCs z wczesnych pasaży (<5) w temperaturze 37 °C i atmosferze 4,6% CO2 w pożywce wzrostowej MSC. Zalecane są kolby T75 do całkowitego wysiewu 500 000 komórek na kolbę w 10 ml pożywki wzrostowej.
    2. Zmieniaj podłoże co 3 dni (zgodnie z opisem w 5.1.2).
    3. Trypsynizować komórki przed osiągnięciem 80% konfluencji, a następnie odwirować je i ponownie zawiesić w pożywce wzrostowej MSC (jak opisano w 5.1.3). Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru.
    4. Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić je w 10 ml pożywki indukującej chondrogenezę.
    5. Przenieść substraty z płytek na nowe płytki dołkowe, które nie zostały poddane działaniu hodowli tkankowej (nieprzylegające). Wysiewaj komórki na podłożach o gęstości 3 000 komórek/cm2.
    6. Zmieniaj pożywkę chondrogenną co 3 dni (zgodnie z opisem w 5.1.2).

6. Utrwalanie komórek i barwienie immunologiczne

UWAGA: Następujące kroki można wykonać w warunkach niesterylnych.

  1. Usuń pożywkę i delikatnie umyj komórki PBS. Napraw je, dodając 10% roztwór formaliny przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Usuń formalinę i umyj komórki PBS.
  3. Zablokować wolne grupy aldehydowe przez dodanie 50 mM roztworu chlorku amonu (NH4Cl) do PBS. Pozostaw komórki na 20 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór NH4Cl i umyj komórki PBS.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C.
  4. Usunąć PBS i przepuszczalność komórek, dodając 0,1% roztwór saponiny w roztworze blokującym (1% albuminy w PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki PBS i przenieść próbki do nowej płytki studzienki.
  5. Inkubować komórki z roztworem przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze blokującym (Tabela 3) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyj komórki PBS.
  6. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi w roztworze blokującym (Tabela 3) przez 1 godzinę w temperaturze RT.
    UWAGA: Unikaj ekspozycji na światło.
  7. Usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyć komórki PBS i wysuszyć.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C w ciemności.
  8. Mocowanie próbki do obserwacji mikroskopowej: Za pomocą frezu z diamentową końcówką pociąć szkiełka nakrywkowe na wymiary 1,25 cm x 1,25 cm. Nałóż 50 μl podłoża mikroskopowego na próbki i delikatnie przykryj je wyciętymi szkiełkami nakrywkowymi.
  9. Przenieść próbki do wygodnego odbiornika, przykryć go folią aluminiową i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu obserwacji.

7. Obrazowanie komórek i analiza danych

UWAGA: Dla nieprzezroczystych Au(111) i grubych podłoży opartych na mikroszkiełkach, należy użyć mikroskopu pionowego.

  1. Eksperyment z adhezją fibroblastów.
    1. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową i obiektywy o małym (tj. 10x) i wysokim (np. 40x) powiększeniu. Wykonuj pomiary w powietrzu.
    2. Umieść próbkę na stoliku i zobrazuj jądra komórkowe za pomocą obiektywu 10X za pomocą wzbudzenia ultrafioletowego, długoprzepustowego filtra emisyjnego, aby uwidocznić barwienie Hoechst/DAPI.
    3. Obraz cytoszkieletu komórkowego i zrostów ogniskowych (FA) za pomocą obiektywu 40X, wybierając filtr mikroskopowy, który odpowiada odpowiednim specyfikacjom fluorochromu przeciwciała.
    4. Do kwantyfikacji FA użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby przekonwertować obrazy na pliki 8-bitowe. Usuń tło i przekonwertuj obrazy na binarne, ustawiając próg. Oblicz co najmniej 30 obrazów na próbkę i uwzględnij FA od 1 μm2 do obliczeń.
  2. Chondrogenna indukcja MSCs.
    1. Obraz komórki kondensauje się w początkowych stadiach indukcji chondrogennej (< 5 dni) za pomocą pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową i obiektyw o małym (tj. 10-krotnym) powiększeniu. Użyj wzbudzenia ultrafioletowego i filtra emisji długoprzepustowej, aby uwidocznić barwienie Hoechst/DAPI.
    2. Do pomiaru obszaru kondensatu należy użyć oprogramowania do przetwarzania obrazu, przekonwertować obrazy na pliki 8-bitowe, usunąć tło i wybrać próg, który podkreśla kontur zagregowany. Oblicz pole powierzchni cząstek.
    3. Obrazuj próbki barwione immunologicznie pod kątem FA, włókien aktynowych cytoszkieletu i specyficznego dla chrząstki kolagenu typu II alfa 1 (COL2A1) za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego przy dużym powiększeniu (tj. 40-60X). Pobierać skrawki w reprezentatywnych odstępach czasu (tj. 0,5–1 μm).
    4. Aby przetworzyć stos, użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu. Konwertuj obrazy na pliki 8-bitowe, usuń tło i ustaw je jako binarne, ustawiając próg. Poddać działaniu co najmniej trzy kondensaty komórkowe na każdy warunek trzech niezależnych próbek.
    5. Określ ilościowo obszary barwione białkiem FA ze strefy podstawowej kondensatów komórkowych i wyraź je jako odpowiedni procent powierzchni podzielony przez liczbę jąder komórkowych na obrazie.
    6. Aby zmierzyć barwienie COL2A1, użyj konfokalnych projekcji z i określ ilościowo sumę rzutowanego obszaru (maksymalna powierzchnia COL2A1 na próbkę). Znormalizuj uzyskaną wartość powierzchni w stosunku do powierzchni odpowiedniego kondensatu.

8. Ilościowa analiza reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR)

UWAGA: Aby zapobiec skażeniu RNazą, używaj jednorazowych, sterylnych plastikowych naczyń i noś jednorazowe rękawiczki podczas pracy z odczynnikami i RNA. Zawsze stosuj odpowiednie mikrobiologiczne techniki aseptyczne i używaj odpowiedniego roztworu odkażającego w celu usunięcia zanieczyszczenia RNazą z powierzchni roboczych i przedmiotów jednorazowego użytku, takich jak wirówki i pipety.

  1. Wyizoluj całkowite RNA i sproszkowaj je w zaburzaczu RNA. Potraktuj próbki RNA DNazą i przekształć je w cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA.
  2. Przeprowadź qRT-PCR przy użyciu starterów dla czynnika transkrypcyjnego SOX9. Beta-2-mikroglobulina (B2M) i białko rybosomalne L13a (RPL13a) mogą być wykorzystywane jako geny porządkowe.
  3. Obliczyć poziomy ekspresji i znormalizować je względem kontroli ujemnej (PLLA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiamy metodę nanopatterningu, która pozwala na modyfikację adhezyjności powierzchni w skali nanometrycznej (Rycina 1). Struktura chemiczna RGD-Cys-D1 została pokazana na Rycynie 1A. Dendrymetry naniesiono na przewodzące elektrycznie powierzchnie Au(111) w celu przeprowadzenia charakterystyki STM o wysokiej rozdzielczości. Niskie stężenia dendrymerów w roztworze (do 10-5% w/w) pozwoliły na uzyskanie izo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas opracowywania opisanego protokołu należy wziąć pod uwagę szereg krytycznych kroków. Pierwsza z nich odnosi się do charakterystyki nanowzorców za pomocą technik mikroskopii z sondą skaningową. Aby uwidocznić nanowzorce, powierzchnia, na której powstaje wzór, musi mieć wartość chropowatości poniżej średniej średnicy dendrymerów, która wynosi około 4–5 nm mierzona za pomocą STM (rysunek 1B). Należy również wziąć pod uwagę, że obrazowanie STM o wysokiej rozdzielczości jest ograniczone do podłoży prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Oriolowi Font-Bachowi i Albertowi G. Castaño za pomoc w kwantyfikacji dmin. Dziękują również Zarządowi Zaawansowanej Mikroskopii Cyfrowej w Instytucie Badań nad Biomedycyną (IRB Barcelona), który pozwolił autorom nagrać film w swojej siedzibie. Prace te były wspierane przez Networking Biomedical Research Center (CIBER) z Hiszpanii. CIBER to inicjatywa finansowana przez VI Krajowy Plan Badań, Rozwoju i Innowacji na lata 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions oraz Instituto de Salud Carlos III, przy wsparciu Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego. Prace te były wspierane przez Komisję ds. Uniwersytetów i Badań Naukowych Departamentu Innowacji, Uniwersytetów i Przedsiębiorstw Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Został on również sfinansowany w ramach projektu OLIGOKODY (nr OLIGOKODY). MAT2012-38573-C02) i CTQ2013-41339-P, przyznane przez hiszpańskie Ministerstwo Gospodarki i Konkurencyjności, a także w ramach programu INTERREG V-A Hiszpania-Portugalia 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. dziękuje za wsparcie finansowe z hiszpańskiego Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności (nr IFI15/00151).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Złoto (111) na mice. 1,4x1,1 cm Spi Supplies466PS-AB
Mikroprowadnice szklane, gładkieCorning2947-75x25
Woda dejonizowanaMilipore18MΩ cm
Etanol 96%PanReac131085.1212
Kopolimer L-laktydu/DL-laktyduCorbion95/05 stosunek molowy
1,4 - dioksanSigma-Aldrich296309-1L
Olej silikonowy, wysokotemperaturowyAcros Organics174665000
SpinnerLaurellWS-650MZ-23NPP/Lite
Okap z przepływem laminarnym do hodowli tkankowychTelstarBio II AdvanceKlasa bezpieczeństwa biologicznego Szafa bezpieczeństwa biologicznego
Millex-GPSLGP033RB0,22 i mikro; m
Strzykawka 10 mlDiscardit309110
Mikroskop sił atomowychVeecoInstruments Wymiar 3000 Przyrząd
Krzemowe sondy AFM CzujnikibudżetoweTap300AI-GRezonans częstotliwości 300 kHz, k = 40 N/m
Skaningowy mikroskop tunelowyObrazowanie molekularneMikroskop
Pt0,8:Ir0,2 drutAdwentPT671012Średnica 0,25 mm
Oprogramowanie WSxM 4.0Nanotec electronica
zwilżania (CA)Dataphysics
Oprogramowanie SCA20Dataphysics
Rentgenowski spektrometr fotoelektronowyElektronika fizycznaPerkin-Elmer PHI 5500 System
Fibronektyna z osocza bydlęcegoSigma-AldrichF1141-1MG1,0 ml roztwór
Bufor fosforanowy Dulbecco (DPBS)Gibco21600-10Proszek
Fibroblasty zarodków myszyATCCATCC CRL-1658NIH/3T3
Zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM) płynna wysoka glukozaGibco11960044płynna wysoka glukoza, bez glutaminy, 500 ml
płodowej surowicy bydlęcej (FBS)Gibco16000044500 ml
L-glutaminaInvitrogen25030200 mM (100X)
Penicylina-streptomycynaInvitrogen15140
Pirogronian soduInvitrogen11360039100 ml
Kolby hodowlane T75Nunclon156499
TrypsinLife Technologies252000720,25% EDTA
WirówkaHermle LabortechnikZ 206 A
Falcon351143Nieprzywierające
hMMC POCHODZĄCE Z TKANKI TŁUSZCZOWEJATCCATCC PCS-500-011Fiolka na komórki 1 ml
MSC podłoże podstawoweATCCATCC PCS-500-030
Zestaw do wzrostu MSCATCCATCC PCS-500-040Niska surowica
Narzędzie do różnicowania chondrocytówATCCATCC PCS-500-051
Roztwór formalinySigma-AldrichHT5011-15MLneutralny buforowany, 10%
chlorek amonuSigma-AldrichA9434-500Gdo biologii molekularnej, odpowiedni do hodowli komórkowych, ≥ 99,5%
SaponinSigma-Aldrich47036-50G-Fdo biologii molekularnej, stosowany jako niejonowy środek powierzchniowo czynny, adiuwant
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA3059-50G
Królicze przeciwciało monoklonalne [Y113] anty-paxillinAbcamab32084Rozcieńczone 1:200
Mysz monoklonalna [1F5] antykolagenowa alfa-1 XX łańcuch Rozcieńczone przeciwciała AcrisAM00212PU-N: 1:400
Alexa Fluor 488-sprzężone kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) drugorzędoweInvitrogenA106672 mg / ml. Rozcieńczone 1:1000
Alexa Fluor 568-sprzężone kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) drugorzędoweInvitrogenA110362 mg / ml. Rozcieńczony w stosunku 1:1000
Hoechst 33342Thermo FisherH3570 10ML10 mg/mL. Rozcieńczony 1:1000
Szkło nakrywkowe 24x24 mmDeltalabD102424
FluoromountSigma-AldrichF4680-25ML
Mikroskop epifluorescencyjnyNikonEclipse E1000z kamerą CCD
Mikroskop konfokalnyLeica MicrosystemsLeica SPE Pionowy mikroskop konfokalny
ImageJ 1.50g darmowe oprogramowanie
Oprogramowanie MATLABFirma MATHWORKS, Inc.
Oprogramowanie OriginPro 8.5 z OriginLab
AFMPicoSPM System optycznego kąta wielotechniczny Płytka niepoddana hodowli tkankowej, 12-dołkowa Mikroskop pionowy http://imgej.nih.gov/ijWspółpraca

Bibliografia

  1. Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
  2. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
  3. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
  4. Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
  5. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  6. Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
  7. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
  8. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  9. Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
  10. Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
  11. Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
  12. Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046(2014).
  13. Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
  14. Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
  15. Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
  16. Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
  17. Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
  18. Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
  19. Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
  20. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
  21. Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
  22. Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96(2013).
  23. Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
  24. Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
  25. Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
  26. Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
  27. Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
  28. Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
  29. Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
  30. Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
  31. Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
  32. Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
  33. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  34. De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
  35. Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
  36. Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
  37. Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
  38. Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nanowzory dendrymeroweg sto powierzchniowa RGDadhezja kom rekmikroskopia si atomowychmikroskopia tunelowak t zwil ania wodrentgenowska spektroskopia fotoelektron wmezenchymalne kom rki macierzystekolagen typu II alpha 1
Nierówne nanowzorce na bazie dendrymerów do lokalnej kontroli adhezji powierzchni: metoda kierowania różnicowaniem chondrogennym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.