Artykuł metodologiczny

Test konwersji wywołany wstrząsem w czasie rzeczywistym do wykrywania prionów CWD w materiale kałowym

DOI:

10.3791/56373

⸱

29 września 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół opisujący prostą, szybką i efektywną technikę wzmacniania prionów, metodę konwersji indukowanej wstrząsami w czasie rzeczywistym (RT-QuIC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika RT-QuIC to czuły test amplifikacji prionów in vitro bez komórek, oparty głównie na nieprawidłowym fałdowaniu i agregacji substratu rekombinowanego białka prionowego (PrP) przy użyciu nasion prionów jako matrycy do konwersji. RT-QuIC to nowatorska technika wysokoprzepustowa, która jest analogiczna do reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR). Wykrywanie wzrostu włókien amyloidowych opiera się na barwniku Tioflavinie T, który fluoryzuje po specyficznej interakcji z białkami bogatymi w β arkusze. W ten sposób tworzenie się amyloidu może być wykrywane w czasie rzeczywistym. Podjęliśmy próbę opracowania wiarygodnego nieinwazyjnego testu przesiewowego do wykrywania prionów przewlekłej choroby wyniszczającej (CWD) w ekstrakcie kałowym. W tym przypadku specjalnie dostosowaliśmy technikę RT-QuIC, aby ujawnić aktywność wysiewu PrPSc w kale jeleniowatych zakażonych CWD. Początkowo aktywność wysiewu przygotowanych przez nas ekstraktów kałowych była stosunkowo niska w RT-QuIC, prawdopodobnie ze względu na potencjalne inhibitory oznaczania w materiale kałowym. Aby poprawić aktywność wysiewu ekstraktów z kału i usunąć potencjalne inhibitory testów, zhomogenizowaliśmy próbki kału w buforze zawierającym detergenty i inhibitory proteazy. Poddaliśmy również próbki różnym metodologiom w celu zagęszczenia PrPSc na podstawie wytrącania białek przy użyciu kwasu fosforofosforanowego sodu i siły odśrodkowej. Na koniec ekstrakty z kału zostały przetestowane za pomocą zoptymalizowanego RT-QuIC, który obejmował wymianę substratu w protokole w celu poprawy czułości wykrywania. W związku z tym opracowaliśmy protokół czułego wykrywania aktywności wysiewu prionów CWD w kale przedklinicznych i klinicznych jeleniowatych za pomocą RT-QuIC, który może być praktycznym narzędziem do nieinwazyjnej diagnostyki CWD.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby prionowe lub pasażowalne encefalopatie gąbczaste (TSE) są zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, w tym chorobą Creutzfeldta-Jakoba (CJD) u ludzi, gąbczastą encefalopatią bydła (BSE) u bydła, trzęsawką owiec i kóz oraz przewlekłą chorobą wyniszczającą (CWD) u jeleniowatych 1,2. TSE charakteryzują się charakterystycznym gąbczastym wyglądem i utratą neuronów w mózgu. Zgodnie z hipotezą "tylko białko", priony składają się głównie z PrPSc ("Sc" dla trzęsawki) 3, nieprawidłowo sfałdowanej izoformy kodowanego przez gospodarza komórkowego białka prionowego, PrPC. PrPSc powstaje w wyniku przekształcenia PrPC w konformację wzbogaconą w arkusze β 4,5,6, który może działać jako ziarno do wiązania i przekształcania innych cząsteczek PrPC. Nowo wygenerowane cząsteczki PrPSc są włączane do rosnącego polimeru 7,8, który rozpada się na mniejsze oligomery, co skutkuje większą liczbą zakaźnych jąder. PrPSc jest podatny na agregację i jest częściowo odporny na proteazy 9,10.

CWD dotyka dzikich i hodowlanych łosi (Cervus canadensis), mulaków (Odocoileus hemionus), jeleni białoogonowych (WTD; Odocoileus virginianus), łoś (Alces alces) i renifer (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Uważa się, że jest to najbardziej zaraźliwa choroba prionowa z transmisją poziomą, której sprzyjają interakcje jeleniowatych i środowiskowe utrzymywanie się zakaźności 14,15. W przeciwieństwie do innych chorób prionowych, w których akumulacja i zakaźność PrPSc są ograniczone do mózgu, w CWD występują one również w tkankach obwodowych i płynach ustrojowych, np. ślinie, moczu i kale. 16,17,18.

Immunohistochemia jest uważana za złoty standard w diagnostyce CWD do wykrywania dystrybucji PrPSc i zmian gąbczastych 19,20. Test ELISA, a w rzadszych przypadkach western blot są również wykorzystywane w diagnostyce CWD. Tak więc obecna diagnostyka choroby prionowej opiera się głównie na wykrywaniu prionów w tkankach pośmiertnych. Diagnostyka przedśmiertna CWD jest dostępna poprzez pobranie migdałków lub biopsji tkanki limfatycznej związanej z błoną śluzową odbytu i odbytu (RAMALT); Procedura ta jest jednak inwazyjna i wymaga schwytania zwierząt. W związku z tym wykorzystanie łatwo dostępnych próbek, takich jak mocz i kał, byłoby praktycznym sposobem wykrywania prionów CWD. Jednak odchody te zawierają stosunkowo niskie stężenia prionów poniżej granicy wykrywalności obecnych metod diagnostycznych. W związku z tym potrzebne jest bardziej czułe i wysokowydajne narzędzie diagnostyczne. Systemy konwersji in vitro, takie jak test cyklicznej amplifikacji nieprawidłowego fałdowania białek (PMCA) 21, test wysiewu amyloidu i test konwersji indukowanej wstrząsaniem w czasie rzeczywistym (RT-QuIC) 22,23,24 są bardzo potężnymi narzędziami do wykorzystania zdolności PrPSc do samorozprzestrzeniania się do naśladowania in vitro proces konwersji prionów, a tym samym zwiększyć obecność niewielkich ilości PrPSc do wykrywalnych poziomów 25,26. Metoda RT-QuIC wykorzystuje jednak fakt, że produkt konwersji wzbogacony w strukturę drugorzędową β arkuszy może specyficznie wiązać tioflawinę T (Th-T). Dlatego rekombinowany PrP (rPrP) po konwersji wysiewu wyrasta na fibryle amyloidowe, które wiążą Th-T, a tym samym można je wykryć w czasie rzeczywistym, mierząc fluorescencję Th-T wyrażoną jako względne jednostki fluorescencji (RFU) w czasie. Po monitorowaniu RFU może być używany do oceny względnych działań wysiewu i parametrów ilościowych, takich jak faza opóźnienia. Faza opóźnienia reprezentuje czas (h) wymagany do osiągnięcia progu, podczas którego konwersja rPrP na wczesnym etapie reakcji jest poniżej granicy wykrywalności fluorescencji Th-T. Koniec pozornej fazy opóźnienia, towarzyszący tworzeniu się wystarczającej ilości jądra amyloidu (zarodkowanie/wydłużenie), następuje, gdy fluorescencja Th-T przekracza poziom progowy i staje się dodatnia. Wzrost włókienek amyloidowych można wykryć w czasie rzeczywistym, a początkowa aktywność PrP,Sc lub wysiewu zawarta w próbce jest wzmacniana przez segmentację, która generuje więcej nasion. Nasiona te z kolei indukują szybką fazę wykładniczą wzrostu włókien amyloidowych.

Ponieważ ten test jest w stanie wykryć zaledwie 1 fg PrPSc 24, wysoka czułość kwalifikuje tę technikę do osiągnięcia diagnozy ante mortem lub nieinwazyjnej poprzez wykrycie PrPSc w różnych tkankach obwodowych, wydalinach lub innych rodzajach próbek o niskim poziomie zakaźności. RT-QuIC zdecydowanie zapewnia przewagę nad innymi testami ze względu na powtarzalność, praktyczność, szybkość (mniej niż 50 godzin) i niskie koszty w porównaniu z testami biologicznymi. Pozwala to uniknąć zawiłości technicznych, takich jak sonikacja stosowana w PMCA; Odbywa się to również w mikropłytce uszczelnionej taśmą, co minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia aerozolem każdej studzienki. Format wielodołkowy umożliwia analizę do 96 próbek w tym samym eksperymencie. Aby przeciwdziałać nawracającemu problemowi wyników fałszywie dodatnich i spontanicznej konwersji rPrP w testach konwersji in vitro, bardzo przydatne jest zastosowanie progu (punktu odcięcia) w RT-QuIC. Rzeczywiście, na podstawie wyników kontroli ujemnej (średnia RFU próbek ujemnych +5 SD 27) ustala się linię bazową, na podstawie której można dokonać rozróżnienia między próbkami dodatnimi i ujemnymi. Użycie czterech powtórzeń dla każdej próbki może zatem pomóc w zdefiniowaniu próbki jako dodatniej, gdy co najmniej 50% powtórzeń wykazuje sygnał pozytywny, tj. przecina granicę odcięcia 28. Homologia między nasionem a substratem nie jest wymagana w RT-QuIC, ponieważ np. w poprzednim badaniu stwierdzono, że rPrP chomika jest bardziej wrażliwym substratem w porównaniu z substratem homologicznym w ludzkich reakcjach wysiewanych PrPvCJD i zasiewanych trzęsawką owiec 29. Zasugerowano również, że chimeryczny rPrP chomika i owcy jest bardziej odpowiednim substratem niż ludzki rPrP do wykrywania ludzkich wariantów prionów CJD 30. W związku z tym stosowanie substratów rPrP z różnych gatunków jest bardzo powszechne w tym teście. Test ten został z powodzeniem zastosowany w kilku chorobach prionowych, takich jak sporadyczne CJD 31,32,33, genetyczne choroby prionowe 34, BSE 35,36,37, trzęsawka 23,36 oraz CWD 38,39,40,41,42. Badania z użyciem przetworzonego płynu mózgowo-rdzeniowego, krwi pełnej, śliny i moczu jako nasion w RT-QuIC zakończyły się sukcesem w wykrywaniu PrPSc 38,39,40,41,42. Aby zwiększyć zdolność wykrywania w próbkach takich jak osocze krwi, które mogą zawierać inhibitory tworzenia amyloidu, Orrú i wsp. (2011) opracował strategię usuwania potencjalnych inhibitorów powstawania amyloidu poprzez połączenie etapu immunoprecypitacji PrPSc (IP) i RT-QuIC, nazwanego testem "enhanced QuIC" (eQuIC). Ponadto zastosowano etap wymiany substratu po ~24 h czasie reakcji w celu poprawy czułości. Ostatecznie, już 1 ag PrPSc było wykrywalne przez eQuIC 30.

W celu oczyszczenia ekstraktów z kału i usunięcia ewentualnych inhibitorów testów w kale, próbki kału pobrane na etapie przedklinicznym i klinicznym od łosia po eksperymentalnym zakażeniu jamy ustnej zostały zhomogenizowane w buforze zawierającym detergenty i inhibitory proteazy. Ekstrakty z kału poddano następnie różnym metodologiom w celu zagęszczenia PrPSc w próbkach wykorzystujących wytrącanie białek poprzez wytrącanie kwasu fosforaungstycznego sodu (NaPTA). Metoda wytrącania NaPTA, po raz pierwszy opisana przez Safara i wsp.43, służy do koncentracji PrPSc w próbkach testowych. Inkubacja NaPTA z próbką skutkuje preferencyjnym wytrącaniem PrPSc zamiast PrPC. Jednak mechanizm molekularny jest nadal niejasny. Ten krok pomógł również powstrzymać i zapobiec spontanicznej konwersji rPrP, którą obserwuje się w niektórych przypadkach. Na koniec ekstrakty z kału przetestowano za pomocą zoptymalizowanego RT-QuIC przy użyciu mysiego rPrP (aa 23-231) jako substratu i z uwzględnieniem wymiany substratu w protokole w celu poprawy czułości wykrywania.

Wyniki tutaj pokazują, że ta ulepszona metoda może wykrywać bardzo niskie stężenia prionów CWD i zwiększa czułość wykrywania i swoistości w próbkach kału w porównaniu do protokołu bez wytrącania NaPTA i wymiany substratu. Metoda ta potencjalnie może być stosowana do innych tkanek i płynów ustrojowych i może być bardzo przydatna do nadzoru nad CWD u dzikich i żyjących w niewoli jeleniowatych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. RT-QuIC przy użyciu materiału kałowego

  1. Przygotowanie ekstraktów z kału jeleniowatych
    1. Wykonaj homogenat kału, dodając 1 g materiału kałowego do 10 ml buforu ekstraktu z kału (20 mM fosforanu sodu, pH 7,1, 130 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF i 1x kompletne inhibitory proteazy, wolne od EDTA), aby uzyskać końcowe stężenie 10% (w/v). Bufor homogenizacyjny może być przygotowany przed utylizacją i przechowywany w temperaturze -20 °C.
    2. Homogenizować granulki kału (1 g) i bufor (10 ml) w probówkach (np. probówkach gentleMACS M) za pomocą dysocjatora z wstępnie ustawionym programem producenta dla białek przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok dwa do trzech razy, aż próbki kału zostaną całkowicie zhomogenizowane w buforze.
    3. Uszczelnij probówki parafilmem i umieść je na platformie kołyszącej lub wytrząsarce obrotowej na 1 godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej.
    4. Odwirować probówki o stężeniu 18 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Zebrać sklarowane nad osadem zawierające ekstrakty białkowe i rozdzielić je na probówki o pojemności 1,5 ml. Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do dalszych zastosowań.
  2. Stężenie PrPSc w ekstraktach z kału
    UWAGA: W celu skoncentrowania prionów CWD w próbkach ekstraktu kału, poprawiając w ten sposób czułość wykrywania przez RT-QuIC, do protokołu dodaje się etap wytrącania białka.
    1. Metoda wytrącania NaPTA
    2. Dodać 250 μl 10% (w/v) N-lauryl sarkozynianu (sarkozylu) do 1 ml ekstraktu z białka kałowego, aby uzyskać końcowe stężenie sarkozylu 2% (v/v).
    3. Szczelnie zamknąć probówki zawierające próbki parafilmem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy ciągłym wytrząsaniu z prędkością 1 400 obr./min w termomieszalniku.
    4. Dostosować mieszaninę ekstraktu z białek kałowych i sarkozylu z roztworem podstawowym zawierającym 10% (m/v) kwasu fosfatungsowego sodu i 170 mM chlorku magnezu o pH 7,4, aby uzyskać końcowe stężenie 0,3% (w/v) kwasu fosfatungsowego sodu w próbkach.
    5. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, stale wstrząsając przy 400 obr./min.
    6. Odwirować próbki w temperaturze 14 °C przez 30 minut w temperaturze 15 800 x g. Ostrożnie usunąć supernatanty.
    7. Przemyć granulki, ponownie umieszczając je w buforze do przemywania (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X 100, 10 mM EDTA, 0,5% deoksycholanu sodu (w/v) i 0,1% sarkozylu (w/v)).
    8. Odwirować próbki w temperaturze 14 °C przez 15 minut przy 15 800 x g. Ostrożnie usunąć supernatanty.
    9. Zawiesić granulki w 100 μl (1/10 pierwotnej objętości ekstraktu z białek kału) buforu rozcieńczającego RT-QuIC.
      UWAGA: Bufor rozcieńczający RT-QuIC (20 mM fosforan sodu, pH 6,9, 130 mM NaCl, 0,1% SDS (w/v) i 1 X N2 suplement) przygotowuje się przed użyciem. Całkowita objętość 10 ml jest filtrowana przez filtr strzykawkowy acrodisc o średnicy 0,2 μm za pomocą strzykawki, a następnie przechowywana w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    10. Próbki poddane działaniu NaPTA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu wykorzystania ich w teście RT-QuIC.
  3. Test RT-QuIC
    1. Przygotować świeży 10 mM roztwór podstawowy Th-T (0,032 g Th-T w 10 ml podwójnie destylowanegoH2O).
    2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy Th-T w stosunku 1:10 w podwójnie destylowanymH2O, aby uzyskać końcowe stężenie Th-T wynoszące 1 mM, przefiltrować go przez filtr strzykawkowy akrotarczowy 0,2 μm za pomocą strzykawki.
    3. Rozmrozić rekombinowany substrat PrP (rPrP, aa 23-231) myszy (10 μg/ml na reakcję RT-QuIC) przechowywany w temperaturze -80 °C na lodzie.
    4. Załaduj jednorazowo 500 μl substratu rPrP do mikroprobówek z filtrem wykluczającym o wielkości 100 kDa i odwiruj przy 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (jedna probówka/filtr może być użyta do dwóch razy).
    5. Uwolniony substrat przenieść do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    6. Rozmrozić bufor rozcieńczający RT-QuIC przechowywany w temperaturze -20 °C.
    7. Rozcieńczyć nasiona (ekstrakt z białka kału) w buforze rozcieńczającym RT-QuIC:
      Próbka nierozcieńczona: użyć nierozcieńczonego ekstraktu z białka kału
      Rozcieńczony 2 x 10-1
      Rozcieńczony 2 x 10-2
      Rozcieńczony 2 x 10-3
    8. Przygotować roztwory podstawowe dla mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC:
      Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): 5X
      NaCl: 2 M roztwór podstawowy NaCl przygotowany w podwójnie destylowanymH2O.
      EDTA: 100 mM roztwór podstawowy EDTA przygotowany w podwójnie destylowanymH2O.
    9. Przed użyciem wszystkich roztworów (krok 1.3.8) należy przefiltrować każdy roztwór oddzielnie przez filtr strzykawkowy acrodisc o średnicy 0,2 μm za pomocą strzykawki i utrzymywać je w sterylnej temperaturze pokojowej.
    10. Przygotować całkowitą objętość mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC zgodnie z liczbą próbek (98 μl objętości reakcji na próbkę i cztery kontrpróby na próbkę), która ma być użyta, plus 10% tej objętości, aby upewnić się, że mieszanina jest wystarczająca do przeprowadzenia wszystkich reakcji.
      1. Za pomocą probówki o pojemności 15 ml przygotować mieszaninę reakcyjną RT-QuIC (20 mM fosforanu sodu, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μM Th-T, 10 μg/ml substratu rPrP i podwójnie destylowaną wodę w celu dostosowania końcowego stężenia rPrP w reakcji) przy użyciu roztworów podstawowych.
      2. Dobrze wymieszaj wszystkie roztwory, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety z końcówką filtrującą. Unikaj w jak największym stopniu stosowania wiru.
      3. Wlej mieszaninę do jednorazowego zbiornika do pipetowania o pojemności 50 ml.
      4. Za pomocą pipety wielokanałowej załadować 98 μl mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC do każdej studzienki 96-dołkowej optycznej płytki dennej.
    11. Do każdej reakcji RT-QuIC dodać 2 μl nierozcieńczonego lub 10-krotnie seryjnie rozcieńczonego ekstraktu z białek kału. Przetestuj każdą próbkę w czterech powtórzeniach.
      UWAGA: W każdym eksperymencie seryjne rozcieńczenia próbek kału (od nierozcieńczonych do 2 x 10-3) od zwierząt z ujemnym CWD i zweryfikowanych CWD są stosowane odpowiednio jako kontrole negatywne i pozytywne.
    12. Uszczelnić płytkę taśmą uszczelniającą przed inkubacją w czytniku płytek w temperaturze 42 °C przez 25 godzin, z powtarzającymi się cyklami 1 minuty, podwójnym wytrząsaniem orbitalnym (700 obr./min) i 1 minutą odpoczynku przez cały czas inkubacji.
    13. Zdefiniuj ustawienia pomiaru fluorescencji:
      Wzbudzenie: 450 nm
      Emisja: 480 nm
      Odczyt od dołu, liczba błysków: 20
      Wzmocnienie ręczne: 1000 (w zależności od maszyny)
      Czas integracji: 20 μs
    14. Po upływie 25 godzin wyjąć płytkę z czytnika płytek.
    15. Obracaj płytkę przy 3 000 x g przez 3 minuty, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia między studzienkami.
    16. Usuń uszczelkę z płyty.
    17. Przygotować nową 96-dołkową płytkę, dodając 90 μl mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC zawierającej świeży substrat i świeży barwnik fluorescencyjny Th-T, jak opisano w sekcjach 1.3.1-1.3.6.
    18. Przenieść 10 μl z każdego dołka pierwszej płytki do nowo przygotowanej płytki 96-dołkowej.
    19. Zapieczętować nową płytkę i kontynuować test RT-QuIC przez dodatkowe 50 godzin, postępując zgodnie z krokami opisanymi w kroku 1.3.13. Ten dodatkowy krok trwający 50 godzin sprawi, że całkowity czas reakcji wyniesie 75 h.
      UWAGA: Wszystkie procedury testu RT-QuIC są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    20. Zbierz dane.
      1. Odczytuj i dokumentuj sygnał fluorescencji Th-T każdej studzienki co 15 minut.
      2. Zbierz dane z całkowitych cykli za pomocą oprogramowania do analizy danych i przenieś je do arkusza kalkulacyjnego ze średnią czterokrotnych reakcji.
      3. Wykreśl średnie dane. Oś x odpowiada czasowi reakcji RT-QuIC (h), a oś y odpowiada względnym jednostkom fluorescencji (RFU). Każda krzywa odpowiada rozcieńczeniu znanej próbki.
      4. W każdym eksperymencie należy wyznaczyć próg, obliczając najwyższe średnie wartości kontroli ujemnej plus 5 odchyleń standardowych, zgodnie z opisem w aktualnie opublikowanej literaturze 41.
        UWAGA: Wszystkie kontrpróby, które przekroczyły zdefiniowany próg, uznaje się za dodatnie. Jeżeli co najmniej dwie z czterech kontrprób przekroczą próg, próbkę uznaje się za dodatnią.

2. Oczyszczanie rekombinowanego białka prionowego (rPrP)

  1. Wzrost populacji bakteryjnej i ekspresja rPrP
    UWAGA: Do przygotowania rPrP użyto szczepu Escherichia coli (E. coli) Rosetta (DE3) przekształconego za pomocą wektora pET-24 kodującego mysi PrP (reszty 23-231).
    1. Rozmrozić zapas glicerolu Rosetty (DE3) przekształcony za pomocą pEt-24 mPrP(23-231) na lodzie.
    2. Smuga LB (Luria Bertani) z końcowym stężeniem kanamycyny 50 μg/ml i inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Upewnij się, że płytki są odwrócone do góry nogami, aby uniknąć kondensacji wilgoci w pożywkach stałych zawierających bakterie. Przygotuj dwie płytki, aby upewnić się, że co najmniej jedna z nich rośnie.
    3. Przygotuj 1 l LB i sterylizuj go w autoklawie, aby był sterylny.
    4. Uzupełnij 1 l sterylnej pożywki LB 1 ml kanamycyny (50 mg/ml) i 1 ml chloramfenikolu (34 mg/ml).
    5. Wybierz jedną kolonię z każdej płytki, używając jednorazowej pętli inokulacyjnej, aby zaszczepić 3 ml pożywki LB zawierającej kanamycynę i chloramfenikol.
    6. Umieścić minikultury w inkubatorze w temperaturze 37 °C ze stałym wytrząsaniem przy 225 obr./min przez 5-6 godzin.
    7. Dodaj mini-kultury do reszty oryginalnego 1 l pożywki LB razem z Express Autoinduction System 1 w celu indukcji ekspresji białka.
    8. Umieścić kulturę w kolbie o pojemności 2 l lub większej w inkubatorze w temperaturze 37 °C z ciągłym wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 20-24 godziny.
    9. Podziel 1 l kultury na 4 x 250 ml probówek wirówkowych.
    10. Wirować probówki zawierające kulturę o masie 3 750 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    11. Odrzucić supernatant i zebrać granulki bakteryjne w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml, a następnie zamrozić je w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania. Powstałe granulki ważyły od 3 do 4 g, co zapewnia dobry plon białka.
  2. Przygotowanie organu integracyjnego
    1. Rozmrażać zamrożone granulki (3-4 g) w temperaturze 37 °C przez kilka minut.
    2. Zamrozić granulat jeszcze raz na 10 minut w temperaturze -80 °C i ponownie rozmrozić. Powtórz ten krok zamrażania i rozmrażania jeszcze dwa razy.
    3. Zawiesić osad bakteryjny w odczynniku do lizy 1X (np. BugBuster Master Mix), dokładnie pipetując. Użyj 5 ml odczynnika na 1 g osadu bakteryjnego. Upewnij się, że mieszanka jest całkowicie homogenizowana.
    4. Inkubować homogenat na bujaku przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odwirować homogenat przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Wyrzuć supernatanty, ostrożnie je wylewając.
    7. Homogenizować granulki w tej samej objętości odczynnika do lizy 1X, jak użyto w poprzednim kroku.
    8. Inkubować homogenat przez 15 minut na bujaku w temperaturze pokojowej.
    9. Dodaj wystarczającą objętość odczynnika do lizy w proporcji 1:10 (0,1x), aby uzyskać całkowitą objętość homogenatu 40 ml. Wymieszaj przez odwrócenie, aby upewnić się, że dobrze się homogenizuje.
    10. Odwirować homogenat o stężeniu 7 900 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    11. Wyrzucić supernatant, ostrożnie go wlewając.
    12. Zawiesić osad w 40 ml 0,1x odczynnika do lizy
      13. .
    13. Odwirować homogenat przy 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    14. Sklarowany osad należy ostrożnie wyrzucić, wlewając go i przechowywać osad zawierający inkluzje w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetwarzania.
  3. Oczyszczanie białek
    1. Rozmrozić inkluzje w temperaturze pokojowej.
    2. Rozpuścić rozmrożone ciała inkluzyjne w 14 ml 8 M chlorowodorku guanidyny (38 g chlorowodorku guanidyny w 0,1 M NaPO4 pH 8,0 i napełnić zawiesinęH2Odo 50 ml; nie dostosowywać pH w roztworze końcowym) w celu rozpuszczenia białek.
    3. Upewnij się, że dobrze homogenizujesz, pipetując w górę i w dół.
    4. Inkubować lizat na bujaku w temperaturze pokojowej przez 50 minut.
    5. Przygotuj 18 g kulek z żywicy Ni-NTA (18 g na 3 do 4 g granulek bakteryjnych); przepłucz je 100 ml wody za pomocą próżni i 100 ml filtra butelkowego o pojemności 0,22 μm.
      1. Umieścić 18 g kulek żywicy Ni-NTA w probówce o pojemności 50 ml i dodać wystarczającą objętość buforu denaturującego (100 mM fosforanu sodu, 10 mM Tris, pH 8,0, 6 M chlorowodorku guanidyny, pH 8), aby uzyskać ostateczną objętość do 50 ml.
      2. Równowaga kulek w buforze denaturującym przez 50 minut na bujaczku w temperaturze pokojowej.
    6. Odwirować lizat inkluzji o stężeniu 16 000 x g przez 5 minut, aby usunąć nierozpuszczalne zanieczyszczenia.
    7. Dodać supernatant do zrównoważonych kulek i wyrzucić granulki.
    8. Umieść mieszankę na rockerze na 40 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wiązanie białka z żywicą Ni-NTA.
      UWAGA: Kulki chelatu niklu służą do oczyszczania PrP przez jego powinowactwo do niklu. Bogaty w histydynę N-końcowy region PrP powoduje powinowactwo do niklu(II), co pozwala białku wiązać się z jonami niklu bez żadnego jego tagu.
    9. Umyj FPLC wodą, aby wyczyścić obie linie (A i B).
    10. Przepuścić bufor denaturujący (100 mM fosforanu sodu, 10 mM Tris, pH 8,0, 6 M chlorowodorku guanidyny, pH 8) przez obie linie (A i B) w celu zalania układu (kolumna nie jest jeszcze podłączona).
    11. Załaduj żywicę na kolumnę. Upewnij się, że zminimalizowałeś pęcherzyki powietrza.
    12. Podłącz kolumnę do FPLC i uruchom gradient liniowy od 100% buforu denaturującego A i 0% buforu ponownie składającego B (100 mM fosforanu sodu, 10 mM Tris, pH 8,0) na początku do 0% buforu denaturującego i 100% buforu ponownego składania na końcu. Ta stopniowa zmiana odbywa się przy natężeniu przepływu 0,75 ml/min przez 240 minut i jest potrzebna do prawidłowego składania PrP.
      UWAGA: Podczas procesu oczyszczania chromatograficznego zdenaturowany PrP jest najpierw powoli ponownie fałdowany na żywicy poprzez zastosowanie liniowego gradientu buforu do ponownego fałdowania w celu zastąpienia buforu denaturującego. Ten krok usuwa również chaotropową guanidynę-HCl.
    13. Upewnij się, że 100% bufor do ponownego składania nadal przepływa przez kolumnę przez dodatkowe 30 minut z prędkością 0,75 ml/min.
    14. Przepłukać linię A wodą, a następnie roztworem buforowym elucyjnym (100 mM fosforanu sodu, 10 mM Tris, 500 mM imidazolu, pH 5,8) omijając kolumnę. Spowoduje to oczyszczenie buforu denaturującego, który został zastąpiony buforem elucyjnym w systemie AKTA.
    15. Elutować białko z prędkością 2 ml/min, prowadząc gradient liniowy przez 40 minut od 100% buforu do ponownego fałdowania B i 0% buforu elucyjnego A na początku do 0% buforu do ponownego fałdowania i 100% buforu elucyjnego.
      UWAGA: Wysokie stężenie imidazolu w buforze elucyjnym będzie konkurować z wiązaniem PrP z niklem(II). Pierwszorzędowy pik białka powinien zacząć eluować około 1/3 drogi przez gradient.
      1. Obserwuj chromatogram dla wzrostu OD 280 nm.
    16. Zbierz tylko probówki zawierające białko w środku dużego piku.
      UWAGA: Wymyte frakcje o objętości 2 ml każda zbiera się do probówek o pojemności 15 ml.
    17. Białko zawarte w probówkach należy natychmiast rozcieńczyć około 1/3 objętości (1 ml) buforu do dializy (10 mM fosforanu sodu, pH 5,8).
    18. Natychmiast umieść probówki na lodzie.
    19. Zebrać eluowane białko zawarte w probówkach.
    20. Ubogie białko w kasety dializacyjne (odcięcie masy cząsteczkowej 10 kDa).
    21. Umieścić kasety we wstępnie schłodzonym buforze do dializy (3,6 l) na 2 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie przenieść kasety do nowego buforu do dializy (3,6 l) na noc. Należy upewnić się, że bufor dializacyjny jest w ciągłym pobudzeniu.
    22. Przefiltrować białko po dializie przez filtr strzykawkowy 0,2 μm acrodisc za pomocą strzykawki.
    23. Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.
    24. W razie potrzeby zagęścić lub rozcieńczyć, aby dostosować stężenie białka do 0,3 mg/ml.
      UWAGA: Potwierdź czystość za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomassie Blue.
    25. Przygotować 1 ml porcji białka w probówkach do mikrowirówek i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia, zgodnie z opisem w protokole RT-QuIC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrakty kałowe CWD przygotowane na poziomie 10% (w/v) były w stanie wywołać reakcję RT-QuIC, jednak czułość wykrywania była niska 27. Użycie specyficznego buforu do homogenizacji kału było krytycznym krokiem w celu uniknięcia wysokiej fluorescencji tła w reakcjach RT-QuIC towarzyszącej zastosowaniu mysiego substratu rPrP zamiast rPrP jelenia, co pozwoliło uzyskać bardziej szczegółowe wyniki 27. Dodanie wytrącania NaPTA zmniejszyło spontani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RT-QuIC był wcześniej stosowany do wykrywania prionów CWD w moczu i ekstraktach kałowych zakażonych doustnie jeleni białoogonowych i mulaków 38. System przedstawiony w tym manuskrypcie jest zaadaptowaną metodą testu RT-QuIC. Do "klasycznego" testu RT-QuIC włączono dodatkowe kroki w celu poprawy wykrywania i czułości testu na obecność prionów CWD w materiale kałowym zakażonych zwierząt.

Niska czułość detekcji w ekstraktach z kału doprowadziła nas do udoskonalenia protoko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Dr. Byronowi Caughey'owi (NIH Rocky Mountain Laboratories) za zapewnienie szkolenia i badania plazmidu ekspresji bakteryjnej PrP jeleniowatej. SG jest wspierany przez program Canada Research Chair. Dziękujemy, że SG otrzymuje fundusze na te badania od Genome Canada, Alberta Prion Research Institute oraz Alberta Agriculture and Forestry za pośrednictwem Genome Alberta i University of Calgary w celu wsparcia tych prac. Potwierdzamy grant badawczy przyznany przez Margaret Gunn Foundation for Animal Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
Acrodisc filtry do seringówPALL4652
amicon Ultra-15 Filtr odśrodkowyMilliporeUCF901024
BD 10 ml seringeVWRCA75846-842
ChloramfenikolSigma-AldrichC0378
Corning Filtry próżnioweSigma-Aldrich431118
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichE4884
gentleMACS M TubeMiltenyi Biotec130-093-236
Chlorowodorek guanidynySigma-AldrichG4505
ImidazolSigma-AldrichI5513
IzopropanolSigma-AldrichI9516
Siarczan kanamycynySigma-Aldrich60615
Rosół Luria-Bertani (LB)ThermoFisher Scientific12780029
Chlorek magnezuSigma-AldrichM9272
Suplement N2 (100X)ThermoFisher Scientific15502048
Sól sodowa N-lauroilsarkozyny (sarkozyl)Sigma-AldrichML9150
Urządzenia odśrodkowe Nanosep z membraną omega 100KTaśmy uszczelniające PALLOD100C34
NuncThermoFisher Scientific232702
Parafilm MVWR52858-000
fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Sigma-AldrichP7626
Tabletka inhibitora proteazyRoche
Chlorek soduSigma-AldrichS3014
Deoksycholan soduSigma-AldrichD6750
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Calbiochem7910-OP
fosforan soduSigma-Aldrich342483
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnySigma-AldrichS9763
Fosforan sodu jednozasadowy jednowodnySigma-AldrichS9638
Hydrat fosforanu sodu (NaPTA)Sigma-Aldrich496626
Tioflawina TSigma-AldrichT3516
Tris-Hydroksy-Metylo-Amino-Methan (Tris)Sigma-AldrichT6066
Triton-100Calbiochem9410-OP
Tween 20Sigma-AldrichP7949
Nazwa>FirmaNumer katalogowyKomentarze
Komercyjne i roztwory
BugBuster Master MixNogagen71456-4
Ni-NTA superflowQiagen1018401
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,4 (1X)Life TechnoligiesP5493
Ultraczysta woda destylowanaInvitrogen10977015
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Standardy i zestawy komercyjne
Express Autoinduction System 1Novagen71300-4
Pierce BCA Zestaw do oznaczania białekThermoFisher Scientific23227
NazwaCompanyNumer katalogowyUwagi
>Konfiguracja sprzętu
AKTA systemy oczyszczania białek FPLCGE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 WirówkaBeckman Coulter
Beckman Rotor JA-25.50Beckman Coulter
Beckman JA-10Beckman Coulter
Czytnik mikropłytek FLUOstar OmegaBMG Labtech
gentleMACS DisocjatorMiltenyi Biotec130-093-235
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sofware
Analiza danych MARS OprogramowanieBMG Labtech
GraphPad Prism6GraphPad
4693159001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835(2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88(2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93(2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848(2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217(2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217(2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187(2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915(2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983(2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377(2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203(2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488(2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277(2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116(2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie prion w CWDanaliza materia u ka owegowytr canie kwasem fosfotungstowymtest fluorescencyjny z tioflawin Trekombinowany substrat bia ka prionowegochroniczna wyniszczaj ca chorobapr bki ka u jeleniowatychaktywno zasiewania prion wprzesiewanie wysokoprzepustowe

Powiązane artykuły