Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Wirusy mają ograniczoną zdolność do wykonywania podstawowych funkcji i dlatego polegają na czynnikach gospodarza, aby ułatwić krytyczne aspekty infekcji, w tym ekspresję genów wirusa, replikację, naprawę, rekombinację i transport. Aktywność tych czynników gospodarza jest często wzmacniana przez białka kodowane przez wirusa. Ponadto wirusy muszą unikać wykrywania i zakłóceń przez odpowiedzi komórkowe na infekcję wirusową. W związku z tym interakcje wirusa z gospodarzem decydują o wyniku infekcji. Niezwykle ważne jest zrozumienie, w jaki sposób wirusy zmieniają środowisko komórkowe, aby dostosować maszynerię komórkową do ułatwienia procesów wirusowych. Szczególnie interesujące jest określenie, które czynniki i procesy oddziałują na genomy wirusów w całym cyklu zakaźnym.

1. W jądrze genomy podlegają regulacji epigenetycznej, ulegają naprawie i rekombinacji oraz są pakowane w kapsydy, tak że pierwsze wiriony potomne są wytwarzane w czasie krótszym niż sześć godzin. Kompleksowa ocena białek związanych z genomem wirusa w trakcie infekcji stworzy podstawy do zbadania szczegółów molekularnych procesów działających na genomy wirusowe i dostarczy informacji na temat czynników wirusowych i komórkowych zaangażowanych w różne etapy infekcji.

Poprzednie metody badania czynników gospodarza związanych z infekcją wirusową obejmowały oczyszczanie białek wirusowych z powinowactwem do analizy powiązanych białek komórkowych^2,3,4,5,6,7^,8,9. Te testy były kluczowe dla identyfikacji czynników komórkowych zaangażowanych w reakcje przeciwwirusowe gospodarza, jak również modyfikację chromatyny wirusa, ekspresję genów i naprawę DNA. Trudno jest jednak ustalić, czy interakcje zależą od związku z vDNA, a proteomika dostarcza jedynie wglądu w interakcje, które zachodzą w funkcji określonego czynnika wirusowego. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) została wykorzystana do określenia, gdzie określone białka wirusowe i komórkowe wiążą się z genomami wirusów^{10,11,12,13,14,15} i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) w połączeniu z immunocytochemią umożliwiły wizualizację czynników komórkowych, które kolokalizować z vDNA^{16,17,18,19,20}. Testy te pozwalają na analizę przestrzenną i czasową. Jednak ograniczenia obejmują potrzebę wysoce specyficznych przeciwciał, ograniczoną czułość oraz potrzebę wcześniejszego wglądu w interakcje wirusa z gospodarzem. W związku z tym opracowaliśmy metodę opartą na iPOND (izolacja białek na powstającym DNA)²¹ i aniPOND (accelerated native iPOND)²² do selektywnego znakowania i oczyszczania vDNA z zakażonych komórek w celu bezstronnej identyfikacji białek związanych z genomem wirusa za pomocą spektrometrii mas. Projekt iPOND odegrał zasadniczą rolę w badaniu dynamiki widełek replikacji komórkowej.

W celu selektywnego oczyszczania genomów wirusowych z zakażonych komórek, replikujące vDNA jest znakowane nukleozydami modyfikowanymi etynylem, 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU) lub 5-etynylo-2'-deoksycytydyną (EdC) (Rysunek 1), a następnie kowalencyjną koniugację z azydkiem biotyny za pomocą chemii kliknięć, aby ułatwić jednoetapowe oczyszczanie genomów wirusowych i powiązanych białek na kulkach pokrytych streptawidyną (Rysunek 2B). Co ważne, infekcje przeprowadzane są w komórkach stacjonarnych, które nie są zaangażowane w replikację DNA komórkowego w celu umożliwienia specyficznego znakowania vDNA. Ponadto zakażenie HSV-1 powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego i hamuje replikację DNA komórkowego^23,24. Wirus może być wstępnie znakowany przed infekcją w celu analizy białek związanych z przychodzącymi genomami wirusa (Rysunek 1A) lub znakowany podczas replikacji DNA w celu analizy białek związanych z nowo zsyntetyzowanym vDNA (Rysunek 1B)²⁵. Co więcej, analiza pościgu impulsowego może być wykorzystana do zbadania natury białek związanych z widełkami replikacji wirusa (Rysunek 1C)²⁶. Ponadto, zmodyfikowane etynylem vDNA może być kowalencyjnie sprzężone z fluoroforem w celu przestrzennego badania dynamiki białek (Rysunek 2A i Rysunek 3). Obrazowanie pozwala na bezpośrednią wizualizację vDNA i jest uzupełniającym podejściem do walidacji interakcji vDNA-białko i może być dostosowane do śledzenia genomów wirusa przez cały czas infekcji. Przewidujemy, że podejścia te mogą być dalej modyfikowane w celu zbadania dowolnego aspektu infekcji opryszczkowej, w tym latencji i reaktywacji, oraz w celu zbadania innych wirusów DNA. Co więcej, znakowanie za pomocą 5-etynylourydyny (UE) może pozwolić na analizę genomów wirusa RNA.

1. Hodowla komórkowa, infekcja wirusowa i znakowanie EdC (Rysunek 1)

Następujący protokół obejmuje pracę z wirusami. Prosimy o zapoznanie się z protokołami bezpieczeństwa biologicznego Twojej instytucji dotyczącymi bezpiecznego obchodzenia się z wirusami i innymi czynnikami biologicznymi. Protokół ten został zatwierdzony przez Institutional Review Board Uniwersytetu w Pittsburghu.

1. Trypsynizować zlewającą się kolbę do hodowli tkankowej o długości 150 cm² komórek MRC-5 i przenieść komórki na płytkę do hodowli tkankowej o długości 600 cm² zawierającą 100 ml DMEM plus 10% FBS. Inkubować w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO₂ przez 3 - 4 dni do osiągnięcia zbiegu i fazy stacjonarnej. Zlewająca się miska o długości 600 cm² zawiera ~7 x 10⁷ komórek. Przygotować 1 tabliczkę dla każdego warunku i 1 tabliczkę dla każdej odpowiadającej jej kontroli ujemnej.
   UWAGA: Komórki muszą osiągnąć fazę stacjonarną, aby zahamować replikację komórkowego DNA, aby zapewnić, że w kolejnych krokach znakowane i oczyszczane jest tylko vDNA.
   UWAGA: Każda próbka wymaga uzupełniającej, nieznakowanej kontroli ujemnej przygotowanej przy użyciu tych samych warunków infekcji i punktu czasowego bez dodatku EdC.
   UWAGA: Pomniejszona wersja tego eksperymentu powinna być przeprowadzana w tandemie, aby przetestować znakowanie DNA komórkowego poprzez obrazowanie przy użyciu porównywalnego wzrostu komórek, infekcji, warunków znakowania EdC i punktów czasowych (patrz Krok 2).
2. Rozcieńczyć 7 x 10⁸ PFU HSV-1 w 7 ml zimnego soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS). Usunąć podłoże wzrostowe i przechowywać w temperaturze 37 °C. Aby zainfekować, dodaj rozcieńczonego wirusa o pojemności 7 ml do komórek MRC-5 i kołysz się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po adsorpcji usuń inokulum, przepłucz 50 ml TBS o temperaturze pokojowej i zastąp oryginalną pożywkę wzrostową. Inkubować w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO₂ . Etap ten należy przeprowadzić dla każdego warunku doświadczalnego i kontroli ujemnej.
   UWAGA: Zwiększone znakowanie EdC można osiągnąć przy użyciu mutantów HSV-1 wadliwych pod względem ekspresji wirusowej dUTPazy (gen UL50) i/lub glikozylazy uracylowej (gen UL2). dUTPaza HSV-1 ma niską specyficzność substratową i może zmniejszać aktywację kilku analogów nukleozydów^25,27.
3. Oznacz genomy wirusów za pomocą EdC. Postępuj zgodnie ze wskazówkami, aby oznaczyć przychodzące genomy (1.3.1.), replikujące genomy (1.3.2.) lub widełki replikacyjne wirusa (1.3.3.).
   UWAGA: Należy wykonać tylko Krok 1.3.1, 1.3.2 lub 1.3.3 w zależności od tego, czy w kolejnych krokach mają być analizowane odpowiednio genomy przychodzące, genomy replikowane czy widełki replikacyjne.
   UWAGA: EdU lub f-ara EdU można zastąpić EdC. Toksyczność analogów nukleozydów powinna być monitorowana i minimalizowana.
   1. Użyj wstępnie oznakowanych zapasów do przeprowadzenia infekcji w kroku 1.2 i przejdź do kroku 2 lub 3 w ciągu 4 godzin po infekcji (hpi), aby zbadać niezreplikowane vDNA ( Rysunek 1A).
      UWAGA: Przygotuj wstępnie oznaczone zapasy wirusów, korzystając z wcześniej opisanego protocol²⁵. Zapasy wirusów muszą zostać przepuszczone przez kolumnę G-25 w celu usunięcia pozostałości EdC.
   2. Znakowanie replikacji vDNA poprzez dodanie 5 - 25 μM EdC do pożywki do hodowli komórkowych zakażonych komórek przez 2 - 4 godziny (Figura 1B). Przed dodaniem rozcieńczyć EdC w 1 ml pożywki wzrostowej.
   3. Aby oznaczyć widełki replikacyjne wirusa, po rozpoczęciu replikacji vDNA (≥4 hpi), znakuj impulsowo replikację vDNA za pomocą 5 - 25 μM EdC przez 5-20 min. Aby gonić, przepłucz 3x pożywką chase zawierającą 25 - 100 μM 2'deoksycytydyny (deoksyC), a następnie inkubuj w obecności pożywki chase przez dodatkowe 20-40 minut (Rysunek 1C).
      UWAGA: Przed użyciem należy zrównoważyć temperaturę impulsu i pożywki do 37 °C i 5% CO₂ .
      UWAGA: W przypadku eksperymentów z pogonią za impulsami ważne jest, aby wziąć pod uwagę czas potrzebny nukleozydom na wejście do komórki i fosforylację, zanim będą mogły zostać włączone do replikacji DNA. Trzeba to ustalić empirycznie.
      UWAGA: Aby określić rozdzielczość eksperymentów z pościgiem impulsowym, należy obliczyć szybkość replikacji wirusa w zastosowanych warunkach eksperymentalnych. Można to określić za pomocą ilościowego PCR genomów wirusa podczas jednoetapowego przebiegu czasowego wzrostu²⁶.
      UWAGA: W celu obrazowania genomów wirusowych przejdź do Kroku 2, a w celu oczyszczenia genomów wirusa przejdź do Kroku 3.

2. Obrazowanie DNA znakowanego EdC (Rysunek 2A)

UWAGA: Przydatne jest przeprowadzenie obrazowania w połączeniu z metodą oczyszczania genomu wirusa, aby sprawdzić, czy DNA komórkowe nie jest znakowane w eksperymentach. Obrazowanie może być również wykorzystywane do wizualizacji charakteru znakowanego vDNA i walidacji danych proteomicznych. Przykłady wzorców barwienia DNA komórkowego i wirusowego są pokazane na Rysunek 3.

1. Przeprowadzić infekcje i znakowanie EdC, jak wskazano w kroku 1, z wyjątkiem stosowania zmniejszonych warunków na szkiełkach nakrywkowych w 12-dołkowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 1 ml pożywki wzrostowej.
2. Napraw komórki za pomocą 1 ml 3,7% paraformaldehydu w 1x PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu przepłukać komórki 2x 1 ml 3% BSA w PBS.
   Uwaga: Paraformaldehyd może spowodować poważne lub trwałe obrażenia. Przestrzegaj środków ostrożności.
   UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać stosowanie protokołu, a szkiełka nakrywkowe można przechowywać w temperaturze 4 °C w drugim praniu przez okres do 3 dni.
3. Przepuszczalność komórek za pomocą 1 ml buforu do przepuszczalności [patrz tabela materiałów] przez 20 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania.
4. Spłucz 1 ml 3% BSA, a następnie zablokuj 1 ml 3% BSA w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania.
5. Dodaj 1 ml koktajlu reakcji na kliknięcie [patrz tabela materiałów] do szkiełek nakrywkowych, aby kowalencyjnie skoniugować azydek Alexa Fluor 488 z DNA znakowanym EdC. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut podczas kołysania. Odessać i spłukać dwa razy 1 ml PBS.
6. Wybarwić DNA komórkowe 1 ml rozcieńczenia Hoechst w stosunku 1:2 000 w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania. Odessać i spłukać dwa razy 1 ml PBS.
7. Barwienie przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi zgodnie ze standardowymi protokołami immunofluorescencji pośredniej²⁵.
   UWAGA: Znakowane vDNA kolokalizuje się z ICP8, ICP4 lub UL42, a znakowane DNA komórkowe kolokalizuje się z barwieniem Hoechsta.
8. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych i komórkach obrazu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
   UWAGA: Preparaty można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.

3. Oczyszczanie vDNA i powiązanych białek

UWAGA: Kilka aspektów tego protokołu zostało zaadaptowanych z Leung et al.²²
UWAGA: Wszystkie i odczynniki należy przed użyciem schłodzić na lodzie, a wszystkie czynności należy wykonać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.

1. Zbierz jądra.
   UWAGA: Przed izolacją jąder formaldehyd może być użyty do sieciowania białek z DNA. Bardziej rygorystyczne warunki prania mogą być następnie stosowane podczas oczyszczania DNA na kulkach pokrytych streptawidyną. Aby zapoznać się z warunkami sieciowania i mycia, patrz Sirbu i wsp.²¹.
   1. Zastąp pożywkę wzrostową 20 ml buforem do ekstrakcji jąder (NEB) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 4 °C, od czasu do czasu kołysząc. Jądra staną się widoczne w mikroskopie.
   2. Zeskrobać jądra z płytki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przez 10 minut przy 2 500 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzania jąder, odrzucać supernatant.
      UWAGA: Barwienie błękitem trypanowym może być stosowane do weryfikacji izolacji jąder od komórek.
   3. Delikatnie usunąć pastylkę jądrową w 10 ml PBS, przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osadzać przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć PBS.
      UWAGA: Jądra mogą zostać zamrożone, a protokół może zostać wstrzymany w tym momencie. W tym celu należy delikatnie zawiesić granulat jądrowy w buforze zamrażającym o pojemności 500 μl i inkubować probówkę w łaźni etanolowej/suchego lodu. Zamrożone jądra przechowywać w temperaturze -80 °C. Przed użyciem rozmrozić jądra w temperaturze pokojowej, szybko przenieść do lodu, dodać 10 ml PBS, delikatnie rozdrobnić do wymieszania, osadzać przez odwirowanie przez odwirowanie w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C i całkowicie usunąć PBS. Zamrażanie jąder może skutkować zmniejszoną wydajnością.
2. Kowalencyjnie sprzężony azydek biotyny z vDNA znakowanym EdC.
   1. Zawiesić ponownie osad jądrowy w 10 ml mieszance reakcyjnej na klik [patrz tabela materiałów], delikatnie pipetując 5 razy w górę i w dół za pomocą pipety 10 mL
      UWAGA: Ważne jest, aby odczynniki wchodzące w skład mieszaniny reakcji kliknięcia były dodawane we wskazanej kolejności.
   2. Obracać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Podczas obracania przygotuj i schłodź B1, B2 i B3 [patrz tabela materiałów].
   3. Jądra osadów przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć mieszaninę reakcji kliknięcia i umyć osad przez delikatne ponowne zawieszenie w 10 ml PBS i odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C.
   4. Delikatnie zawiesić ponownie granulat jądrowy w 1 ml PBS i przenieść do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki pipety o dużym otworze. Jądra osadów przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć PBS i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie.
      UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a zamrożone jądra mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C. Rozmrażanie przez zamrożenie pomaga w późniejszej lizie, dlatego zaleca się błyskawiczne zamrożenie jąder nawet po przejściu do kroku 3.3 tego samego dnia.
3. Liza jąder i fragmentacja DNA.
   1. Rozmrozić jądra na lodzie i ponownie zawiesić w 500 μl buforu B1, pipetując w górę i w dół. Inkubować na lodzie przez 45 minut.
   2. Sonifikuj próbki 6 razy przez 30 s każda przy 40% amplitudzie za pomocą sondy mikrokońcówkowej 3 mm. Umieść próbki na lodzie na 30 s między impulsami. Po sonikacji próbki powinny być klarowne, nie mętne.
      UWAGA: Warunki sonikacji powinny być zoptymalizowane dla poszczególnych sonikatorów. Szczegółowe instrukcje dotyczące optymalizacji warunków sonikacji można znaleźć w Leung et al.²².
   3. Resztki komórek osadu przez odwirowanie w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Rozmiar granulki powinien się znacznie zmniejszyć. Przefiltrować supernatant przez sitko do komórek 100 μM i zatrzymać przepływ.
   4. Dodać 500 μl buforu B2 do przefiltrowanego supernatantu. 900 μl tej próbki zostanie użyte w kroku 3.4.2.
   5. Pobrać podwielokrotność każdego warunku izolacji DNA (50 μl lub 1/20 objętości) i dodać 50 μl 2x roztwór wodorowęglanu SDS [patrz tabela materiałów]. Przejdź do protokołu izolacji DNA (krok 3.6).
   6. Pobrać podwielokrotność każdego warunku dla białka wejściowego (50 μl lub 1/20 objętości) i dodać 50 μl 2x bufor do próbki Laemmli, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Użyć w kroku 3.5.6.
4. Zwiąż biotynylowane DNA z kulkami pokrytymi streptawidyną.
   1. Przygotuj kulki magnetyczne Streptawidyny T1, przenosząc 300 μl zawiesiny kulek do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Przygotuj jedną tubkę koralików na próbkę. Przemyj koraliki 3x za pomocą 1 ml buforu B2, wirując w celu ponownego zawieszenia, przykładając magnes do oddzielenia kulek i zasysając bufor do mycia.
      UWAGA: Zoptymalizowane warunki wiązania skutkują maksymalizacją wydajności i minimalnym wiązaniem tła. Eksperymentalnie ustalono, że kulki magnetyczne Streptawidyny T1 mają znacznie większą zdolność wiązania niż kulki agarozowe, a także inne kulki Streptawidyny i mniej wiązania tła niż kulki Streptawidyny C1 (Figura 4A).
   2. Dodać 900 μl próbki z etapu 3.3.4. do umytych kulek i obracać przez noc w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Nie wirować koralików po dodaniu do nich próbki.
      UWAGA: Jeśli znaczne ilości DNA lub białka zostaną wyizolowane w nieznakowanej kontroli ujemnej, etap ten można skrócić z nocy do 4 godzin, aby zmniejszyć wiązanie tła.
5. Umyj kulki i wymyj vDNA i związane z nimi białka.
   UWAGA: Zaleca się stosowanie końcówek filtrujących w pozostałych krokach.
   1. Umieścić próbki w magnetycznym stojaku na probówki do mikrofugowania, usunąć supernatant, delikatnie zawiesić ponownie w 1 ml buforu B2, obracać w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
   2. Powtórz krok 3.5.1 trzy razy.
   3. Umieścić próbki w magnetycznym stojaku na probówki do mikrofugowania, usunąć supernatant, delikatnie zawiesić ponownie w 1 ml buforu B3 i obracać w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
   4. Przenieś 100 μl mieszaniny kulek (1/10 objętości) do nowej probówki w celu izolacji związanego DNA. Przyłóż tę rurkę do magnesu, usuń supernatant, ponownie zawieś kulki w 100 μl 1x roztworze wodorowęglanu SDS i przejdź do protokołu izolacji DNA (krok 3.6).
   5. Nanieść probówkę zawierającą pozostałą mieszaninę kulek o objętości 900 μl z kroku 3.5.3. na magnes, usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 50 μl 2x bufor do próbek Laemmli, aby wymyć kompleksy białkowe i DNA-białko.
   6. Próbki gotować w temperaturze 95 °C przez 15 minut, wirować, szybko wirować w mikrofugach i stosować magnes. Przenieść eluat do nowej probówki, błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Użyj zaślepek, aby upewnić się, że rurki nie otwierają się podczas gotowania.
      UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.
   7. Analizuj próbki białek za pomocą barwienia Coomassie Blue, western blotting lub spektrometrii mas zgodnie ze standardowymi procedurami²⁵. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 4 i Rysunek 5.
      UWAGA: Aby określić, czy wydajność białka jest wystarczająca do spektrometrii mas, 7,5 μl każdej próbki wykorzystuje się do analizy za pomocą barwienia Coomassie Blue i 7,5 μl do western blotting reprezentatywnego białka związanego z genomem wirusa (ICP4, ICP8 lub UL42). Ta sama objętość lizatów z kroku 3.3.6. są uruchamiane równolegle w celu kontroli poziomów białka wejściowego. Pozostała próbka (35 μl) jest następnie analizowana za pomocą spektrometrii mas, jak opisano wcześniej²⁵.
6. Izolacja DNA
   1. Inkubować próbki z etapów 3.3.5 i 3.5.4 w temperaturze 65 °C przez 4-16 godzin. W razie potrzeby usunąć próbkę z kulek magnetycznych.
   2. Ekstrahować próbki za pomocą 150 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (PCI) i przenieść fazę wodną do nowej probówki.
   3. Ekstrahować pozostałą część PCI za pomocą 100 μl Tris-EDTA (TE) i dodać fazę wodną do nowej probówki.
   4. Ekstrahować próbki za pomocą 200 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1).
   5. Oczyść fazę wodną za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Wskaźnik pH w buforze PB zmieni kolor na fioletowy po dodaniu do próbki. Dodać 10 μl 3M NaOAc pH 5,0, aby obniżyć pH próbki.
   6. Określ stężenie DNA za pomocą fluorometru.
      UWAGA: Ten protokół zazwyczaj daje 100 - 400 ng DNA związanego z koralikami. Nie należy wykrywać DNA w eluacie kontroli ujemnej, do której nie dodano EdC w kroku 1.3.
   7. DNA może być przechowywane w probówce o niskiej zawartości wiązania DNA w temperaturze 4 lub -20 °C i może być wykorzystywane do PCR w czasie rzeczywistym lub wysokoprzepustowej analizy sekwencjonowania.

Użycie chemii kliknięć do oczyszczania DNA z komórek zostało po raz pierwszy osiągnięte metodą iPOND21. Celem iPOND jest oczyszczanie komórkowych widełek replikacyjnych w celu identyfikacji powiązanych białek. Dostosowaliśmy tę technikę do specyficznego badania interakcji białek vDNA podczas infekcji. Manipulacja podejściem do znakowania genomów wirusów za pomocą EdC (Rysunek 1), w połączeniu z zsynchronizowanymi infekcjami, pozwoliła na selektywną izolację i badanie oddzielnych populacji vDNA. DNA HSV-1 jest znakowane EdC (Rysunek 1) w celu ułatwienia kowalencyjnego przyłączenia do fluoroforu w celu obrazowania lub biotyny do oczyszczenia (Figura 2). Wirus może być wstępnie znakowany przed infekcją w celu analizy białek związanych z przychodzącymi genomami (Rysunek 1A) lub znakowany podczas replikacji DNA w celu analizy białek związanych z nowo zsyntetyzowanym vDNA (Rysunek 1B)25. Co więcej, analiza pościgu impulsowego może być wykorzystana do zbadania natury białek związanych z widełkami replikacji wirusa (Rysunek 1C)26. DNA może być wizualizowane w komórkach, aby dostarczyć informacji przestrzennych o naturze znakowanego DNA i wsparcia dla zidentyfikowanych interakcji vDNA-białko (Ryc. 3). Podsumowując, opisane tutaj protokoły pozwalają na proteomiczne badanie wielu aspektów produktywnej infekcji, aby zapewnić wgląd w dynamiczne zmiany zachodzące w genomach HSV-1. Podejścia te mogą być dalej dostosowywane do badania latencji i reaktywacji, do badania fenotypów związanych z mutantami wirusowymi oraz do badania innych wirusów DNA i RNA.

Aspekty tej metody oczyszczania białek zostały zaadaptowane z Leung et al. 22. Tutaj głównym ulepszeniem w oczyszczaniu DNA znakowanego EdC jest użycie kulek Streptawidyny T1 zamiast kulek agarozowych pokrytych streptawidyną. Aby zoptymalizować oczyszczanie DNA, przetestowano kilka rodzajów kulek pokrytych streptawidyną pod kątem niespecyficznego wiązania, gdy infekcja była przeprowadzana pod nieobecność EdC i pod kątem maksymalnego odzysku białka w obecności EdC (Figura 4A). W tych eksperymentach przeprowadzono western blot dla białka wiążącego vDNA ICP4. Oczyszczanie przeprowadzone na kulkach streptawidyny T1 skutkowało najmniejszym wiązaniem tła przy braku EdC i maksymalnym odzyskiem białka w obecności EdC.

Białka związane z vDNA mogą być identyfikowane za pomocą metod proteomicznych, w tym western blotting i spektrometrii mas. Western blotting może być stosowany do badania dynamiki znanych interakcji, a spektrometria mas może być stosowana jako bezstronne podejście do identyfikacji nowych białek związanych z vDNA. Przykład wydajności białka w funkcji zwiększenia znakowania EdC pokazano w Rysunek 4B. Rozmaz, a nie wyraźny wzór pasm, jest zwykle obserwowany przez barwienie Coomassie Blue. Jest to prawdopodobne, ponieważ w próbce białka znajduje się DNA lub dlatego, że jest go pod dostatkiem. Należy również zauważyć, że katalizator miedziany stosowany w reakcji kliknięcia może powodować częściową degradację białek i kwasów nukleinowych28,29. Za pomocą western blot podobne poziomy ICP4 są zwykle wykrywane w eluatach (Krok 3.5.5.) po oczyszczeniu vDNA, które było znakowane przez 60 minut EdC, jak obecne w tej samej ilości próbki wejściowej przygotowanej z listanów jądrowych (Krok 3.3.6.). Informacje te mogą być wykorzystane jako wskazówka do określenia, czy odzysk jest wystarczający do wysłania pozostałej próbki do analizy spektrometrii mas.

Nanochromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) może być przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem25 w celu identyfikacji białek związanych z oczyszczonym vDNA. Dane LC-MS/MS są analizowane poprzez porównanie wartości liczby widmowej (SpC) między próbką eksperymentalną znakowaną EdC a odpowiadającą jej nieznakowaną kontrolą ujemną. Białka uważa się za wzbogacone w próbie doświadczalnej na podstawie następujących kryteriów: 1) białko ma co najmniej 5 liczb spektralnych (SpC) w próbie doświadczalnej, 2) białko nie jest wykrywane w próbie kontrolnej lub jest wzbogacone w stosunku do kontroli co najmniej czterokrotnie w oparciu o podział wartości SpC, oraz 3) białko jest wzbogacone w stosunku do kontroli w dwóch lub więcej kontrpróbach biologicznych. Znormalizowany współczynnik obfitości widmowej (NSAF: ) może być wykorzystany do uwzględnienia różnic w masie cząsteczkowej (MW) i całkowitej wydajności białka. Równanie to określa względną obfitość poszczególnych białek w próbce i pozwala na bezpośrednie porównanie dwóch różnych warunków eksperymentalnych, w których oczyszczane są różne ilości vDNA (na przykład porównanie wejściowych genomów wirusowych (Rysunek 1A) z genomami replikowanymi (Figura 1B)).

Istnieje wiele sposobów prezentacji danych dotyczących wzbogacania białek. Niektóre przykłady obejmują wykresy kołowe, diagramy Venna i sieci interakcji białek. Wykresy kołowe mogą być używane do zilustrowania proporcji zidentyfikowanych białek, o których wiadomo, że funkcjonują w określonym procesie biologicznym (Rysunek 5A). Jednak problemy mogą pojawić się, gdy jedno białko ma więcej niż jedną funkcję biologiczną, co często ma miejsce. Trudno jest również porównywać dane na różnych wykresach kołowych. Diagramy Venna są przydatne do pokazania relacji między białkami zidentyfikowanymi w różnych warunkach eksperymentalnych, ale nie dostarczają żadnych funkcjonalnych informacji o zidentyfikowanych białkach (Rysunek 5B). Sieci interakcji białek przedstawiają wizualną ilustrację potencjalnych interakcji między zidentyfikowanymi białkami i dostarczają informacji o typach procesów biologicznych, które są zaangażowane (Rysunek 5C). Dostępnych jest kilka zasobów internetowych do mapowania przewidywanych interakcji białko-białko, w tym STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Gens/proteins)30. Narzędzia online są zazwyczaj przystosowane do przetwarzania danych proteomicznych pochodzących od różnych gatunków i dostarczają cennych informacji na temat białek gospodarza zaangażowanych w mechanikę genomu wirusa. Jednak białka wirusowe na ogół nie są uwzględniane w bazach danych, co może komplikować analizę. Dlatego ważne jest, aby zastanowić się nad głównymi wnioskami, które chciałoby się przekazać przy podejmowaniu decyzji o sposobie prezentacji danych proteomicznych.

Rysunek 1: Metody oznaczania DNA HSV-1. (A) Aby ocenić stan nadchodzącego wirusa, komórki MRC-5 w stanie spoczynku w G0 są infekowane wstępnie znakowanym HSV-1, a genomy są badane przy ciśnieniu mniejszym niż 4 hpi w celu zbadania niereplikowanego DNA wirusa. (B) Aby oznaczyć stan zreplikowanego wirusa, komórki MRC-5 są zakażone nieznakowanym HSV-1 i EdC (pomarańczowe gwiazdki) dodaje się do pożywki wzrostowej zakażonych komórek i inkubuje przez 2 - 4 godziny po rozpoczęciu replikacji wirusowego DNA (≥4 hpi). (C) Aby oznaczyć widełki replikacyjne wirusa, zakażone komórki są znakowane impulsowo EdC przez 5-20 minut. Widełki replikacyjne mogą być następnie ścigane za pomocą deoxyC. DNA znakowane EdC jest pomarańczowe. Ten rysunek został zmodyfikowany z Dembowskiego i DeLuca25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Procedury opisane w tym artykule do analizy DNA znakowanego EdC. (A) Zarys metody obrazowania DNA znakowanego EdC. Oznaczone DNA jest reprezentowane na zielono. (B) Zarys metody oczyszczania i dalszej analizy vDNA znakowanego EdC. Ten rysunek został zmodyfikowany z Dembowskiego i DeLuca25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wizualizacja DNA znakowanego EdC. Komórki zostały zainfekowane, oznaczone i zobrazowane zgodnie z opisem w Rysunek 1 i Rysunek 2. Pokazano reprezentatywne obrazy znakowanego DNA komórkowego i wirusowego. DNA komórkowe kolokalizuje się z barwieniem Hoechst, a vDNA z ICP4. Pasek skali: 5 μm.Ten rysunek został zmodyfikowany z Dembowski and DeLuca25 i Dembowski et al.26. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki oczyszczania białka. (A) Porównanie wydajności białka podczas etapów oczyszczania przy użyciu kilku różnych typów kulek pokrytych streptawidyną. Zakażenie przeprowadzono w obecności EdC (+) w celu porównania wydajności białka lub przy braku EdC (-) w celu porównania wiązania tła. Infekcje i znakowanie EdC przeprowadzono zgodnie z opisem w Rysunek 1B i kompleksy DNA-białko zostały oczyszczone zgodnie z krokami opisanymi w Rysunek 2B przy użyciu porównywalnych ilości różnych typów kulek pokrytych streptawidyną. Górny panel: Porównanie wydajności białka po oczyszczeniu na kulkach agarozowych pokrytych streptawidyną lub Streptawidynie M-280. Dolny panel: Porównanie wydajności białka po oczyszczeniu Streptawidyny M-270, M-280, Streptawidyny C1 lub Streptawidyny T1. Western blot przeprowadzono z przeciwciałem przeciwko białku wirusowemu ICP4. Oczyszczony ICP4 jest pokazany na pierwszym pasie dla porównania. Dłuższa ekspozycja dolnego panelu była konieczna, aby zaobserwować podobną intensywność ICP4 na pasach "280" jak w górnym panelu. (B) Przedstawiono reprezentatywne wyniki oczyszczania białek w funkcji czasu znakowania EdC. Infekcje i znakowanie EdC przeprowadzono zgodnie z opisem w Figura 1B i kompleksy DNA-białko zostały oczyszczone zgodnie z krokami opisanymi w Rysunek 2B przy użyciu kulek Streptawidyny T1. Znakowanie EdC przeprowadzono przez 0, 20, 40 lub 60 minut i pokazano wyniki barwienia Coomassie Blue (na górze) i western blotting (na dole). Western blot przeprowadzono z przeciwciałami specyficznymi dla ICP4, UL42 lub GAPDH. Próbkę eluatu pobrano z etapu 3.5.5. i lizatu od kroku 3.3.6. Strzałka wskazuje streptawidynę, a L oznacza drabinę białkową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykłady różnych sposobów prezentacji danych proteomicznych. (A) Wykresy kołowe podsumowują białka, które zostały zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas eluatów białkowych związanych z genomami wirusowymi oczyszczonymi w temperaturze 6 hpi. Wartości wskazują liczbę białek zidentyfikowanych dla każdej kategorii funkcjonalnej. T oznacza całkowitą liczbę zidentyfikowanych białek. Kolory oznaczają następujące kategorie: fioletowy - przetwarzanie RNA, czerwony - transkrypcja, zielony - przebudowa chromatyny, pomarańczowy - replikacja DNA, żółty - transport jądrowy, turkusowy - cytoszkielet, ciemnoniebieski - białka strukturalne HSV, a szary - inne/nieznane. (B) Diagramy Venna przedstawiają nakładanie się białek zidentyfikowanych jako związane z genomami wirusów przy 6, 8 lub 12 hpi. (C) Mapa STRING przedstawia białka wzbogacone na widełkach replikacyjnych wirusa po 5-minutowym impulsie EdC. Białka ludzkie wzbogacone 5-krotnie w porównaniu z nieznakowaną kontrolą ujemną są pokazane na mapie interakcji funkcjonalnych, która została wygenerowana przy użyciu STRING30 z ustawieniami danych w celu wyświetlenia tylko interakcji o wysokim poziomie ufności. Nazwy genów zostały użyte do mapowania interakcji. Kółka wskazują białka, które funkcjonują w tym samym procesie biologicznym. Ten rysunek został zmodyfikowany z Dembowski and DeLuca25 oraz Dembowski et al.26. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.