Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest wyizolowanie DNA wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) z zainfekowanych komórek w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych za pomocą spektrometrii mas. Chociaż białka, które wchodzą w interakcje z genomami wirusów, odgrywają główną rolę w określaniu wyniku infekcji, kompleksowa analiza białek związanych z genomem wirusa nie była wcześniej możliwa. Tutaj demonstrujemy metodę, która umożliwia bezpośrednie oczyszczanie genomów HSV-1 z zakażonych komórek. Replikujące się DNA wirusa jest selektywnie znakowane zmodyfikowanymi nukleotydami, które zawierają alkinową grupę funkcyjną. Wyznakowane DNA jest następnie specyficznie i nieodwracalnie znakowane poprzez kowalencyjne przyłączenie azydku biotyny za pomocą katalizowanej miedzią(I) cykloaddycji azydku alkiny lub reakcji klikania. DNA znakowane biotyną jest oczyszczane na kulkach pokrytych streptawidyną, a powiązane białka są eluowane i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Metoda ta umożliwia selektywne celowanie i izolację widełek replikacyjnych HSV-1 lub całych genomów ze złożonych środowisk biologicznych. Co więcej, adaptacja tego podejścia pozwoli na badanie różnych aspektów infekcji wirusem opryszczki, a także badanie genomów innych wirusów DNA.

Wprowadzenie

Wirusy mają ograniczoną zdolność do wykonywania podstawowych funkcji i dlatego polegają na czynnikach gospodarza, aby ułatwić krytyczne aspekty infekcji, w tym ekspresję genów wirusa, replikację, naprawę, rekombinację i transport. Aktywność tych czynników gospodarza jest często wzmacniana przez białka kodowane przez wirusa. Ponadto wirusy muszą unikać wykrywania i zakłóceń przez odpowiedzi komórkowe na infekcję wirusową. W związku z tym interakcje wirusa z gospodarzem decydują o wyniku infekcji. Niezwykle ważne jest zrozumienie, w jaki sposób wirusy zmieniają środowisko komórkowe, aby dostosować maszynerię komórkową do ułatwienia procesów wirusowych. Szczególnie inter....

Protokół

1. Hodowla komórkowa, infekcja wirusowa i znakowanie EdC (Rysunek 1)

Następujący protokół obejmuje pracę z wirusami. Prosimy o zapoznanie się z protokołami bezpieczeństwa biologicznego Twojej instytucji dotyczącymi bezpiecznego obchodzenia się z wirusami i innymi czynnikami biologicznymi. Protokół ten został zatwierdzony przez Institutional Review Board Uniwersytetu w Pittsburghu.

1. Trypsynizować zlewającą się kolbę do hodowli tkankowej o długości 150 cm² komórek MRC-5 i przenieść komórki na płytkę do hodowli tkankowej o długości 600 cm² zawierającą 100 ml DMEM plus 10% FBS. Inku....

Wyniki

Zastosowanie chemii klik w celu oczyszczania DNA z komórek zostało po raz pierwszy zrealizowane za pomocą metody iPOND²¹. Celem metody iPOND jest oczyszczanie komórkowych widełek replikacyjnych w celu identyfikacji związanych z nimi białek. Zaadaptowaliśmy tę technikę do specyficznego badania oddziaływań białek z vDNA podczas infekcji. Modyfikacja tego podejścia w celu znakowania genomów wirusowych EdC (Rycina 1), w połączeniu z synchr.......

Dyskusja

Protokół ten obejmuje wiele etapów, które, jeśli nie będą przestrzegane ostrożnie, mogą skutkować znacznym zmniejszeniem wydajności białka lub zanieczyszczeniem DNA komórkowego. Bardzo ważne jest, aby komórki stacjonarne były używane do wszystkich eksperymentów, aby zapewnić, że DNA komórkowe nie jest znakowane i oczyszczane. Można to potwierdzić przez brak komórkowych polimeraz DNA w próbce białka, ponieważ HSV-1 nie wykorzystuje komórkowej polimerazy DNA do syntezy genomu. Podczas etapów znakowania EdC i pobierania jąd.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki MRC-5	ATCC	CCL-171
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gibco	26140-179
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	Zastąpione 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 12 mM  (do wzrostu w kolbach) lub 30 mM (do wzrostu w szalkach) wodorowęglinian sodu
600 cm2 naczynie do hodowli tkankowych	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris Sól fizjologiczna buforowana (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine
		HSV-1	Zapasy z mianami większymi niż 1x109 PFU/ml działają najlepiej
Sephadex G-25  kolumna (kolumna odsalająca PD-10)	GE Healthcare	17085101
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5&ostra;-etynylo-2&ostra;-deoksycytydyna (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Rozpuść w DMSO, aby przygotować 40 mM bulionu, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 ° C
2´-deoxycytydyna (deoksyC)	Sigma-Aldrich	D3897	Rozpuścić w wodzie, aby przygotować 40 mM bulionu, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 ° C
Bufor do ekstrakcji jądrowej (NEB)			Przygotuj świeży (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM sacharozy, 0,5% Igepal)
Skrobak do komórek	Bellco glass	7731-22000	Autoklaw przed użyciem
Roztwór błękitu trypanowego	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7,2 (10x)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (przed użyciem rozcieńczyć do 1x w sterylnej wodzie)
Pięciowodny siarczan miedzi (II) (CuSO4-5H2O)	Fisher Scientific	C489	Przygotuj 100 mM zapasu i przechowuj w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 1 miesiąca
(+) L-askorbinian sodu	Sigma-Aldrich	A4034	Świeżo przygotuj 100 mM bulionu i przechowuj na lodzie do czasu użycia
Azydek biotyny	Invitrogen	B10184	Przygotuj 10 mM bulionu w DMSO, podwielokrotność i przechowuj w temperaturze -20 &; C na okres do 1 roku
Click Reaction Mix			Przygotować bezpośrednio przed użyciem, dodając odczynniki we wskazanej kolejności (10 ml: 8,8 ml 1x PBS, 200 ml 100 mM CuSO4, 25 ml 10 mM azydu biotyny, 1 ml 100 mM askorbinianu sodu)
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11697498001	Rozpuść w 1 ml wody, aby przygotować 50x bulion, można przechowywać w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 1 tygodnia lub bezpośrednio dodać 1 tabletkę do 50 ml buforu
Bufor zamrażający			Przygotuj świeże (7 ml 100% glicerolu, 3 ml NEB, 200 μ L 50x inhibitor proteazy)
Bufor B1			Przygotuj świeży (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x inhibitor proteazy)
Bufor B2			Przygotuj świeży (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% Igepal, 1x inhibitor proteazy)
Bufor B3			Przygotuj świeży (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x inhibitor proteazy)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer wyposażony w sondę mikrokońcówkową 3 mm	Sonics	VCX 130
Falcon		352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Rotator Mini-Tube	Fisher Scientific	260750F
2x Laemmli bufor			Wymieszaj 400 mg SDS, 2 ml 100% glicerolu, 1,25 ml 1 M Tris (pH 6,8) i 10 mg błękitu bromofenolowego w 8 ml wody. Przechowywać w 4  ° C przez okres do 6 miesięcy. Przed użyciem dodać 1 M DTT do końcowego stężenia 200 mM.
Zamki do probówki 1,5 ml	Fisher Scientific	NC9679153
Standardowe odczynniki
western NOVEX Zestaw do barwienia na niebiesko koloidalne	Invitrogen	LC6025
12-dołkowe naczynie do hodowli tkankowych	Corning	3513
Szkiełka nakrywkowe	Autoklaw Fisher Scientific	12-545-100	przed użyciem
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-552-5
16% paraformaldehyd	Mikroskopia elektronowa Sciences	15710	Rozcieńczyć do 3,7% w 1x PBS przed użyciem
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	Przygotuj 3% w 1x PBS
Bufor permeabilizacyjny (0,5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	Przygotuj 0,5% Triton-X 100 w 1x PBS
Koktajl reakcji na kliknięcie - Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 488	Sondy molekularne	C10337	Przygotuj zgodnie z protokołem producenta
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	Przygotuj 10 mg / ml w wodzie, można przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez okres do 1 roku
Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-ICP8	Abcam	ab20194	Użyj rozcieńczenia 1:200 w 1x PBS
Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-UL42 (2H4)	Abcam	ab19311	Użyj rozcieńczenia 1:200 w 1x PBS
Goat anty-mysie przeciwciało drugorzędowe sprzężone 594	Life Technologies	a11005	Użyj rozcieńczenia 1:500 w 1x PBS
Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
2x SDS-roztwór wodorowęglanu			2% SDS, 200 mM NaHCO3
Fenol:chloroform:alkohol			Wymieszać 25:24:1 co najmniej 1 dzień przed użyciem, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C w ciemności
chloroform: alkohol			Wymieszaj 24:1 co najmniej 1 dzień przed użyciem, przechowuj w temperaturze pokojowej w ciemności
10x Tris EDTA (TE), pH 8,0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (rozcieńczyć do 1x przed użyciem)
Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCR	Qiagen	28104
3 M octan sodu pH 5,2
Qubit 2.0 Fluorometr	Invitrogen	Q32866
Zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32851
Probówki do testów kubitowych	Invitrogen	Q32856
Mikroskop fluorescencyjny wyposażony w oprogramowanie
			Mikrowirówka do probówek 1,5 ml
Wirówka stołowa do probówek 15 i 50 ml Komórka
inkubator kultur Komora
			bezpieczeństwa biologicznego
Bloki			65 ° C oraz 95 ° Z

Filtr siatkowy do próbek do blottingu izoamylowy izoamylowy doobrazowania grzewcze