Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56374

⸱

31 sierpnia 2017

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest wyizolowanie DNA wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) z zainfekowanych komórek w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych za pomocą spektrometrii mas. Chociaż białka, które wchodzą w interakcje z genomami wirusów, odgrywają główną rolę w określaniu wyniku infekcji, kompleksowa analiza białek związanych z genomem wirusa nie była wcześniej możliwa. Tutaj demonstrujemy metodę, która umożliwia bezpośrednie oczyszczanie genomów HSV-1 z zakażonych komórek. Replikujące się DNA wirusa jest selektywnie znakowane zmodyfikowanymi nukleotydami, które zawierają alkinową grupę funkcyjną. Wyznakowane DNA jest następnie specyficznie i nieodwracalnie znakowane poprzez kowalencyjne przyłączenie azydku biotyny za pomocą katalizowanej miedzią(I) cykloaddycji azydku alkiny lub reakcji klikania. DNA znakowane biotyną jest oczyszczane na kulkach pokrytych streptawidyną, a powiązane białka są eluowane i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Metoda ta umożliwia selektywne celowanie i izolację widełek replikacyjnych HSV-1 lub całych genomów ze złożonych środowisk biologicznych. Co więcej, adaptacja tego podejścia pozwoli na badanie różnych aspektów infekcji wirusem opryszczki, a także badanie genomów innych wirusów DNA.

Wprowadzenie

Wirusy mają ograniczoną zdolność do wykonywania podstawowych funkcji i dlatego polegają na czynnikach gospodarza, aby ułatwić krytyczne aspekty infekcji, w tym ekspresję genów wirusa, replikację, naprawę, rekombinację i transport. Aktywność tych czynników gospodarza jest często wzmacniana przez białka kodowane przez wirusa. Ponadto wirusy muszą unikać wykrywania i zakłóceń przez odpowiedzi komórkowe na infekcję wirusową. W związku z tym interakcje wirusa z gospodarzem decydują o wyniku infekcji. Niezwykle ważne jest zrozumienie, w jaki sposób wirusy zmieniają środowisko komórkowe, aby dostosować maszynerię komórkową do ułatwienia procesów wirusowych. Szczególnie interesujące jest określenie, które czynniki i procesy oddziałują na genomy wirusów w całym cyklu zakaźnym.

1. W jądrze genomy podlegają regulacji epigenetycznej, ulegają naprawie i rekombinacji oraz są pakowane w kapsydy, tak że pierwsze wiriony potomne są wytwarzane w czasie krótszym niż sześć godzin. Kompleksowa ocena białek związanych z genomem wirusa w trakcie infekcji stworzy podstawy do zbadania szczegółów molekularnych procesów działających na genomy wirusowe i dostarczy informacji na temat czynników wirusowych i komórkowych zaangażowanych w różne etapy infekcji.

Poprzednie metody badania czynników gospodarza związanych z infekcją wirusową obejmowały oczyszczanie białek wirusowych z powinowactwem do analizy powiązanych białek komórkowych2,3,4,5,6,7,8,9. Te testy były kluczowe dla identyfikacji czynników komórkowych zaangażowanych w reakcje przeciwwirusowe gospodarza, jak również modyfikację chromatyny wirusa, ekspresję genów i naprawę DNA. Trudno jest jednak ustalić, czy interakcje zależą od związku z vDNA, a proteomika dostarcza jedynie wglądu w interakcje, które zachodzą w funkcji określonego czynnika wirusowego. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) została wykorzystana do określenia, gdzie określone białka wirusowe i komórkowe wiążą się z genomami wirusów10,11,12,13,14,15 i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) w połączeniu z immunocytochemią umożliwiły wizualizację czynników komórkowych, które kolokalizować z vDNA16,17,18,19,20. Testy te pozwalają na analizę przestrzenną i czasową. Jednak ograniczenia obejmują potrzebę wysoce specyficznych przeciwciał, ograniczoną czułość oraz potrzebę wcześniejszego wglądu w interakcje wirusa z gospodarzem. W związku z tym opracowaliśmy metodę opartą na iPOND (izolacja białek na powstającym DNA)21 i aniPOND (accelerated native iPOND)22 do selektywnego znakowania i oczyszczania vDNA z zakażonych komórek w celu bezstronnej identyfikacji białek związanych z genomem wirusa za pomocą spektrometrii mas. Projekt iPOND odegrał zasadniczą rolę w badaniu dynamiki widełek replikacji komórkowej.

W celu selektywnego oczyszczania genomów wirusowych z zakażonych komórek, replikujące vDNA jest znakowane nukleozydami modyfikowanymi etynylem, 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU) lub 5-etynylo-2'-deoksycytydyną (EdC) (Rysunek 1), a następnie kowalencyjną koniugację z azydkiem biotyny za pomocą chemii kliknięć, aby ułatwić jednoetapowe oczyszczanie genomów wirusowych i powiązanych białek na kulkach pokrytych streptawidyną (Rysunek 2B). Co ważne, infekcje przeprowadzane są w komórkach stacjonarnych, które nie są zaangażowane w replikację DNA komórkowego w celu umożliwienia specyficznego znakowania vDNA. Ponadto zakażenie HSV-1 powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego i hamuje replikację DNA komórkowego23,24. Wirus może być wstępnie znakowany przed infekcją w celu analizy białek związanych z przychodzącymi genomami wirusa (Rysunek 1A) lub znakowany podczas replikacji DNA w celu analizy białek związanych z nowo zsyntetyzowanym vDNA (Rysunek 1B)25. Co więcej, analiza pościgu impulsowego może być wykorzystana do zbadania natury białek związanych z widełkami replikacji wirusa (Rysunek 1C)26. Ponadto, zmodyfikowane etynylem vDNA może być kowalencyjnie sprzężone z fluoroforem w celu przestrzennego badania dynamiki białek (Rysunek 2A i Rysunek 3). Obrazowanie pozwala na bezpośrednią wizualizację vDNA i jest uzupełniającym podejściem do walidacji interakcji vDNA-białko i może być dostosowane do śledzenia genomów wirusa przez cały czas infekcji. Przewidujemy, że podejścia te mogą być dalej modyfikowane w celu zbadania dowolnego aspektu infekcji opryszczkowej, w tym latencji i reaktywacji, oraz w celu zbadania innych wirusów DNA. Co więcej, znakowanie za pomocą 5-etynylourydyny (UE) może pozwolić na analizę genomów wirusa RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa, infekcja wirusowa i znakowanie EdC (Rysunek 1)

Następujący protokół obejmuje pracę z wirusami. Prosimy o zapoznanie się z protokołami bezpieczeństwa biologicznego Twojej instytucji dotyczącymi bezpiecznego obchodzenia się z wirusami i innymi czynnikami biologicznymi. Protokół ten został zatwierdzony przez Institutional Review Board Uniwersytetu w Pittsburghu.

  1. Trypsynizować zlewającą się kolbę do hodowli tkankowej o długości 150 cm2 komórek MRC-5 i przenieść komórki na płytkę do hodowli tkankowej o długości 600 cm2 zawierającą 100 ml DMEM plus 10% FBS. Inkubować w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 przez 3 - 4 dni do osiągnięcia zbiegu i fazy stacjonarnej. Zlewająca się miska o długości 600 cm2 zawiera ~7 x 107 komórek. Przygotować 1 tabliczkę dla każdego warunku i 1 tabliczkę dla każdej odpowiadającej jej kontroli ujemnej.
    UWAGA: Komórki muszą osiągnąć fazę stacjonarną, aby zahamować replikację komórkowego DNA, aby zapewnić, że w kolejnych krokach znakowane i oczyszczane jest tylko vDNA.
    UWAGA: Każda próbka wymaga uzupełniającej, nieznakowanej kontroli ujemnej przygotowanej przy użyciu tych samych warunków infekcji i punktu czasowego bez dodatku EdC.
    UWAGA: Pomniejszona wersja tego eksperymentu powinna być przeprowadzana w tandemie, aby przetestować znakowanie DNA komórkowego poprzez obrazowanie przy użyciu porównywalnego wzrostu komórek, infekcji, warunków znakowania EdC i punktów czasowych (patrz Krok 2).
  2. Rozcieńczyć 7 x 108 PFU HSV-1 w 7 ml zimnego soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS). Usunąć podłoże wzrostowe i przechowywać w temperaturze 37 °C. Aby zainfekować, dodaj rozcieńczonego wirusa o pojemności 7 ml do komórek MRC-5 i kołysz się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po adsorpcji usuń inokulum, przepłucz 50 ml TBS o temperaturze pokojowej i zastąp oryginalną pożywkę wzrostową. Inkubować w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 . Etap ten należy przeprowadzić dla każdego warunku doświadczalnego i kontroli ujemnej.
    UWAGA: Zwiększone znakowanie EdC można osiągnąć przy użyciu mutantów HSV-1 wadliwych pod względem ekspresji wirusowej dUTPazy (gen UL50) i/lub glikozylazy uracylowej (gen UL2). dUTPaza HSV-1 ma niską specyficzność substratową i może zmniejszać aktywację kilku analogów nukleozydów25,27.
  3. Oznacz genomy wirusów za pomocą EdC. Postępuj zgodnie ze wskazówkami, aby oznaczyć przychodzące genomy (1.3.1.), replikujące genomy (1.3.2.) lub widełki replikacyjne wirusa (1.3.3.).
    UWAGA: Należy wykonać tylko Krok 1.3.1, 1.3.2 lub 1.3.3 w zależności od tego, czy w kolejnych krokach mają być analizowane odpowiednio genomy przychodzące, genomy replikowane czy widełki replikacyjne.
    UWAGA: EdU lub f-ara EdU można zastąpić EdC. Toksyczność analogów nukleozydów powinna być monitorowana i minimalizowana.
    1. Użyj wstępnie oznakowanych zapasów do przeprowadzenia infekcji w kroku 1.2 i przejdź do kroku 2 lub 3 w ciągu 4 godzin po infekcji (hpi), aby zbadać niezreplikowane vDNA ( Rysunek 1A).
      UWAGA: Przygotuj wstępnie oznaczone zapasy wirusów, korzystając z wcześniej opisanego protocol25. Zapasy wirusów muszą zostać przepuszczone przez kolumnę G-25 w celu usunięcia pozostałości EdC.
    2. Znakowanie replikacji vDNA poprzez dodanie 5 - 25 μM EdC do pożywki do hodowli komórkowych zakażonych komórek przez 2 - 4 godziny (Figura 1B). Przed dodaniem rozcieńczyć EdC w 1 ml pożywki wzrostowej.
    3. Aby oznaczyć widełki replikacyjne wirusa, po rozpoczęciu replikacji vDNA (≥4 hpi), znakuj impulsowo replikację vDNA za pomocą 5 - 25 μM EdC przez 5-20 min. Aby gonić, przepłucz 3x pożywką chase zawierającą 25 - 100 μM 2'deoksycytydyny (deoksyC), a następnie inkubuj w obecności pożywki chase przez dodatkowe 20-40 minut (Rysunek 1C).
      UWAGA: Przed użyciem należy zrównoważyć temperaturę impulsu i pożywki do 37 °C i 5% CO2 .
      UWAGA: W przypadku eksperymentów z pogonią za impulsami ważne jest, aby wziąć pod uwagę czas potrzebny nukleozydom na wejście do komórki i fosforylację, zanim będą mogły zostać włączone do replikacji DNA. Trzeba to ustalić empirycznie.
      UWAGA: Aby określić rozdzielczość eksperymentów z pościgiem impulsowym, należy obliczyć szybkość replikacji wirusa w zastosowanych warunkach eksperymentalnych. Można to określić za pomocą ilościowego PCR genomów wirusa podczas jednoetapowego przebiegu czasowego wzrostu26.
      UWAGA: W celu obrazowania genomów wirusowych przejdź do Kroku 2, a w celu oczyszczenia genomów wirusa przejdź do Kroku 3.

2. Obrazowanie DNA znakowanego EdC (Rysunek 2A)

UWAGA: Przydatne jest przeprowadzenie obrazowania w połączeniu z metodą oczyszczania genomu wirusa, aby sprawdzić, czy DNA komórkowe nie jest znakowane w eksperymentach. Obrazowanie może być również wykorzystywane do wizualizacji charakteru znakowanego vDNA i walidacji danych proteomicznych. Przykłady wzorców barwienia DNA komórkowego i wirusowego są pokazane na Rysunek 3.

  1. Przeprowadzić infekcje i znakowanie EdC, jak wskazano w kroku 1, z wyjątkiem stosowania zmniejszonych warunków na szkiełkach nakrywkowych w 12-dołkowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 1 ml pożywki wzrostowej.
  2. Napraw komórki za pomocą 1 ml 3,7% paraformaldehydu w 1x PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu przepłukać komórki 2x 1 ml 3% BSA w PBS.
    Uwaga: Paraformaldehyd może spowodować poważne lub trwałe obrażenia. Przestrzegaj środków ostrożności.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać stosowanie protokołu, a szkiełka nakrywkowe można przechowywać w temperaturze 4 °C w drugim praniu przez okres do 3 dni.
  3. Przepuszczalność komórek za pomocą 1 ml buforu do przepuszczalności [patrz tabela materiałów] przez 20 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania.
  4. Spłucz 1 ml 3% BSA, a następnie zablokuj 1 ml 3% BSA w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania.
  5. Dodaj 1 ml koktajlu reakcji na kliknięcie [patrz tabela materiałów] do szkiełek nakrywkowych, aby kowalencyjnie skoniugować azydek Alexa Fluor 488 z DNA znakowanym EdC. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut podczas kołysania. Odessać i spłukać dwa razy 1 ml PBS.
  6. Wybarwić DNA komórkowe 1 ml rozcieńczenia Hoechst w stosunku 1:2 000 w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania. Odessać i spłukać dwa razy 1 ml PBS.
  7. Barwienie przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi zgodnie ze standardowymi protokołami immunofluorescencji pośredniej25.
    UWAGA: Znakowane vDNA kolokalizuje się z ICP8, ICP4 lub UL42, a znakowane DNA komórkowe kolokalizuje się z barwieniem Hoechsta.
  8. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych i komórkach obrazu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
    UWAGA: Preparaty można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.

3. Oczyszczanie vDNA i powiązanych białek

UWAGA: Kilka aspektów tego protokołu zostało zaadaptowanych z Leung et al.22
UWAGA: Wszystkie i odczynniki należy przed użyciem schłodzić na lodzie, a wszystkie czynności należy wykonać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.

  1. Zbierz jądra.
    UWAGA: Przed izolacją jąder formaldehyd może być użyty do sieciowania białek z DNA. Bardziej rygorystyczne warunki prania mogą być następnie stosowane podczas oczyszczania DNA na kulkach pokrytych streptawidyną. Aby zapoznać się z warunkami sieciowania i mycia, patrz Sirbu i wsp.21.
    1. Zastąp pożywkę wzrostową 20 ml buforem do ekstrakcji jąder (NEB) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 4 °C, od czasu do czasu kołysząc. Jądra staną się widoczne w mikroskopie.
    2. Zeskrobać jądra z płytki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przez 10 minut przy 2 500 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzania jąder, odrzucać supernatant.
      UWAGA: Barwienie błękitem trypanowym może być stosowane do weryfikacji izolacji jąder od komórek.
    3. Delikatnie usunąć pastylkę jądrową w 10 ml PBS, przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osadzać przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć PBS.
      UWAGA: Jądra mogą zostać zamrożone, a protokół może zostać wstrzymany w tym momencie. W tym celu należy delikatnie zawiesić granulat jądrowy w buforze zamrażającym o pojemności 500 μl i inkubować probówkę w łaźni etanolowej/suchego lodu. Zamrożone jądra przechowywać w temperaturze -80 °C. Przed użyciem rozmrozić jądra w temperaturze pokojowej, szybko przenieść do lodu, dodać 10 ml PBS, delikatnie rozdrobnić do wymieszania, osadzać przez odwirowanie przez odwirowanie w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C i całkowicie usunąć PBS. Zamrażanie jąder może skutkować zmniejszoną wydajnością.
  2. Kowalencyjnie sprzężony azydek biotyny z vDNA znakowanym EdC.
    1. Zawiesić ponownie osad jądrowy w 10 ml mieszance reakcyjnej na klik [patrz tabela materiałów], delikatnie pipetując 5 razy w górę i w dół za pomocą pipety 10 mL
      UWAGA: Ważne jest, aby odczynniki wchodzące w skład mieszaniny reakcji kliknięcia były dodawane we wskazanej kolejności.
    2. Obracać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Podczas obracania przygotuj i schłodź B1, B2 i B3 [patrz tabela materiałów].
    3. Jądra osadów przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć mieszaninę reakcji kliknięcia i umyć osad przez delikatne ponowne zawieszenie w 10 ml PBS i odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C.
    4. Delikatnie zawiesić ponownie granulat jądrowy w 1 ml PBS i przenieść do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki pipety o dużym otworze. Jądra osadów przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć PBS i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie.
      UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a zamrożone jądra mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C. Rozmrażanie przez zamrożenie pomaga w późniejszej lizie, dlatego zaleca się błyskawiczne zamrożenie jąder nawet po przejściu do kroku 3.3 tego samego dnia.
  3. Liza jąder i fragmentacja DNA.
    1. Rozmrozić jądra na lodzie i ponownie zawiesić w 500 μl buforu B1, pipetując w górę i w dół. Inkubować na lodzie przez 45 minut.
    2. Sonifikuj próbki 6 razy przez 30 s każda przy 40% amplitudzie za pomocą sondy mikrokońcówkowej 3 mm. Umieść próbki na lodzie na 30 s między impulsami. Po sonikacji próbki powinny być klarowne, nie mętne.
      UWAGA: Warunki sonikacji powinny być zoptymalizowane dla poszczególnych sonikatorów. Szczegółowe instrukcje dotyczące optymalizacji warunków sonikacji można znaleźć w Leung et al.22.
    3. Resztki komórek osadu przez odwirowanie w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Rozmiar granulki powinien się znacznie zmniejszyć. Przefiltrować supernatant przez sitko do komórek 100 μM i zatrzymać przepływ.
    4. Dodać 500 μl buforu B2 do przefiltrowanego supernatantu. 900 μl tej próbki zostanie użyte w kroku 3.4.2.
    5. Pobrać podwielokrotność każdego warunku izolacji DNA (50 μl lub 1/20 objętości) i dodać 50 μl 2x roztwór wodorowęglanu SDS [patrz tabela materiałów]. Przejdź do protokołu izolacji DNA (krok 3.6).
    6. Pobrać podwielokrotność każdego warunku dla białka wejściowego (50 μl lub 1/20 objętości) i dodać 50 μl 2x bufor do próbki Laemmli, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Użyć w kroku 3.5.6.
  4. Zwiąż biotynylowane DNA z kulkami pokrytymi streptawidyną.
    1. Przygotuj kulki magnetyczne Streptawidyny T1, przenosząc 300 μl zawiesiny kulek do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Przygotuj jedną tubkę koralików na próbkę. Przemyj koraliki 3x za pomocą 1 ml buforu B2, wirując w celu ponownego zawieszenia, przykładając magnes do oddzielenia kulek i zasysając bufor do mycia.
      UWAGA: Zoptymalizowane warunki wiązania skutkują maksymalizacją wydajności i minimalnym wiązaniem tła. Eksperymentalnie ustalono, że kulki magnetyczne Streptawidyny T1 mają znacznie większą zdolność wiązania niż kulki agarozowe, a także inne kulki Streptawidyny i mniej wiązania tła niż kulki Streptawidyny C1 (Figura 4A).
    2. Dodać 900 μl próbki z etapu 3.3.4. do umytych kulek i obracać przez noc w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Nie wirować koralików po dodaniu do nich próbki.
      UWAGA: Jeśli znaczne ilości DNA lub białka zostaną wyizolowane w nieznakowanej kontroli ujemnej, etap ten można skrócić z nocy do 4 godzin, aby zmniejszyć wiązanie tła.
  5. Umyj kulki i wymyj vDNA i związane z nimi białka.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie końcówek filtrujących w pozostałych krokach.
    1. Umieścić próbki w magnetycznym stojaku na probówki do mikrofugowania, usunąć supernatant, delikatnie zawiesić ponownie w 1 ml buforu B2, obracać w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    2. Powtórz krok 3.5.1 trzy razy.
    3. Umieścić próbki w magnetycznym stojaku na probówki do mikrofugowania, usunąć supernatant, delikatnie zawiesić ponownie w 1 ml buforu B3 i obracać w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    4. Przenieś 100 μl mieszaniny kulek (1/10 objętości) do nowej probówki w celu izolacji związanego DNA. Przyłóż tę rurkę do magnesu, usuń supernatant, ponownie zawieś kulki w 100 μl 1x roztworze wodorowęglanu SDS i przejdź do protokołu izolacji DNA (krok 3.6).
    5. Nanieść probówkę zawierającą pozostałą mieszaninę kulek o objętości 900 μl z kroku 3.5.3. na magnes, usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 50 μl 2x bufor do próbek Laemmli, aby wymyć kompleksy białkowe i DNA-białko.
    6. Próbki gotować w temperaturze 95 °C przez 15 minut, wirować, szybko wirować w mikrofugach i stosować magnes. Przenieść eluat do nowej probówki, błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Użyj zaślepek, aby upewnić się, że rurki nie otwierają się podczas gotowania.
      UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.
    7. Analizuj próbki białek za pomocą barwienia Coomassie Blue, western blotting lub spektrometrii mas zgodnie ze standardowymi procedurami25. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 4 i Rysunek 5.
      UWAGA: Aby określić, czy wydajność białka jest wystarczająca do spektrometrii mas, 7,5 μl każdej próbki wykorzystuje się do analizy za pomocą barwienia Coomassie Blue i 7,5 μl do western blotting reprezentatywnego białka związanego z genomem wirusa (ICP4, ICP8 lub UL42). Ta sama objętość lizatów z kroku 3.3.6. są uruchamiane równolegle w celu kontroli poziomów białka wejściowego. Pozostała próbka (35 μl) jest następnie analizowana za pomocą spektrometrii mas, jak opisano wcześniej25.
  6. Izolacja DNA
    1. Inkubować próbki z etapów 3.3.5 i 3.5.4 w temperaturze 65 °C przez 4-16 godzin. W razie potrzeby usunąć próbkę z kulek magnetycznych.
    2. Ekstrahować próbki za pomocą 150 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (PCI) i przenieść fazę wodną do nowej probówki.
    3. Ekstrahować pozostałą część PCI za pomocą 100 μl Tris-EDTA (TE) i dodać fazę wodną do nowej probówki.
    4. Ekstrahować próbki za pomocą 200 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1).
    5. Oczyść fazę wodną za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Wskaźnik pH w buforze PB zmieni kolor na fioletowy po dodaniu do próbki. Dodać 10 μl 3M NaOAc pH 5,0, aby obniżyć pH próbki.
    6. Określ stężenie DNA za pomocą fluorometru.
      UWAGA: Ten protokół zazwyczaj daje 100 - 400 ng DNA związanego z koralikami. Nie należy wykrywać DNA w eluacie kontroli ujemnej, do której nie dodano EdC w kroku 1.3.
    7. DNA może być przechowywane w probówce o niskiej zawartości wiązania DNA w temperaturze 4 lub -20 °C i może być wykorzystywane do PCR w czasie rzeczywistym lub wysokoprzepustowej analizy sekwencjonowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie chemii klikalnej do oczyszczania DNA z komórek zostało po raz pierwszy zrealizowane za pomocą metody iPOND21. Celem iPOND jest oczyszczanie komórkowych widełek replikacyjnych w celu identyfikacji powiązanych z nimi białek. Zaadaptowaliśmy tę technikę do specyficznych badań interakcji białkowych z vDNA podczas infekcji. Modyfikacja tego podejścia w celu znakowania genomów wirusowych EdC (Rysunek 1), w połączeniu z synchroni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten obejmuje wiele etapów, które, jeśli nie będą przestrzegane ostrożnie, mogą skutkować znacznym zmniejszeniem wydajności białka lub zanieczyszczeniem DNA komórkowego. Bardzo ważne jest, aby komórki stacjonarne były używane do wszystkich eksperymentów, aby zapewnić, że DNA komórkowe nie jest znakowane i oczyszczane. Można to potwierdzić przez brak komórkowych polimeraz DNA w próbce białka, ponieważ HSV-1 nie wykorzystuje komórkowej polimerazy DNA do syntezy genomu. Podczas etapów znakowania EdC i pobierania jąd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Hannah Fox za pomoc w przygotowaniu tego rękopisu. Prace te były wspierane przez grant NIH R01AI030612.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki MRC-5ATCCCCL-171
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco26140-179
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-082Zastąpione 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 12 mM  (do wzrostu w kolbach) lub 30 mM (do wzrostu w szalkach) wodorowęglinian sodu
600 cm2 naczynie do hodowli tkankowychThermo Fisher Scientific166508
Tris Sól fizjologiczna buforowana (TBS), pH 7,4137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine
HSV-1Zapasy z mianami większymi niż 1x109 PFU/ml działają najlepiej
Sephadex G-25  kolumna (kolumna odsalająca PD-10)GE Healthcare17085101
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher ScientificD128-1
5&ostra;-etynylo-2&ostra;-deoksycytydyna (EdC)Sigma-AldrichT511307Rozpuść w DMSO, aby przygotować 40 mM bulionu, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 ° C 
2´-deoxycytydyna (deoksyC)Sigma-AldrichD3897Rozpuścić w wodzie, aby przygotować 40 mM bulionu, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 ° C 
Bufor do ekstrakcji jądrowej (NEB)Przygotuj świeży (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM sacharozy, 0,5% Igepal)
Skrobak do komórekBellco glass7731-22000Autoklaw przed użyciem
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT8154
PBS, pH 7,2 (10x)1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (przed użyciem rozcieńczyć do 1x w sterylnej wodzie)
Pięciowodny siarczan miedzi (II) (CuSO4-5H2O)Fisher ScientificC489Przygotuj 100 mM zapasu i przechowuj w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 1 miesiąca
(+) L-askorbinian soduSigma-AldrichA4034Świeżo przygotuj 100 mM bulionu i przechowuj na lodzie do czasu użycia
Azydek biotynyInvitrogenB10184Przygotuj 10 mM bulionu w DMSO, podwielokrotność i przechowuj w temperaturze -20 &; C na okres do 1 roku 
Click Reaction MixPrzygotować bezpośrednio przed użyciem, dodając odczynniki we wskazanej kolejności (10 ml: 8,8 ml 1x PBS, 200 ml 100 mM CuSO4, 25 ml 10 mM azydu biotyny, 1 ml 100 mM askorbinianu sodu)   
Kompletny koktajl inhibitorów proteazyRoche11697498001Rozpuść w 1 ml wody, aby przygotować 50x bulion, można przechowywać w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 1 tygodnia lub bezpośrednio dodać 1 tabletkę do 50 ml buforu
Bufor zamrażającyPrzygotuj świeże (7 ml 100% glicerolu, 3 ml NEB, 200 μ L 50x inhibitor proteazy)
Bufor B1Przygotuj świeży (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x inhibitor proteazy)
Bufor B2Przygotuj świeży (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% Igepal, 1x inhibitor proteazy)
Bufor B3Przygotuj świeży (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x inhibitor proteazy)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer wyposażony w sondę mikrokońcówkową 3 mmSonicsVCX 130
Falcon352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65601
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Rotator Mini-TubeFisher Scientific260750F
2x Laemmli buforWymieszaj 400 mg SDS, 2 ml 100% glicerolu, 1,25 ml 1 M Tris (pH 6,8) i 10 mg błękitu bromofenolowego w 8 ml wody. Przechowywać w 4  ° C przez okres do 6 miesięcy. Przed użyciem dodać 1 M DTT do końcowego stężenia 200 mM.
Zamki do probówki 1,5 mlFisher ScientificNC9679153
Standardowe odczynniki
western NOVEX Zestaw do barwienia na niebiesko koloidalneInvitrogenLC6025
12-dołkowe naczynie do hodowli tkankowychCorning3513
Szkiełka nakrywkoweAutoklaw Fisher Scientific12-545-100przed użyciem
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-552-5
16% paraformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences15710Rozcieńczyć do 3,7% w 1x PBS przed użyciem
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP1605Przygotuj 3% w 1x PBS
Bufor permeabilizacyjny (0,5% Triton-X 100)Sigma-AldrichT8787Przygotuj 0,5% Triton-X 100 w 1x PBS
Koktajl reakcji na kliknięcie - Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 488Sondy molekularneC10337Przygotuj zgodnie z protokołem producenta
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399Przygotuj 10 mg / ml w wodzie, można przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez okres do 1 roku
Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-ICP8Abcamab20194Użyj rozcieńczenia 1:200 w 1x PBS
Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-UL42 (2H4)Abcamab19311Użyj rozcieńczenia 1:200 w 1x PBS
Goat anty-mysie przeciwciało drugorzędowe sprzężone 594Life Technologiesa11005Użyj rozcieńczenia 1:500 w 1x PBS
Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
2x SDS-roztwór wodorowęglanu2% SDS, 200 mM NaHCO3
Fenol:chloroform:alkoholWymieszać 25:24:1 co najmniej 1 dzień przed użyciem, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C w ciemności
chloroform: alkoholWymieszaj 24:1 co najmniej 1 dzień przed użyciem, przechowuj w temperaturze pokojowej w ciemności
10x Tris EDTA (TE), pH 8,0100 mM Tris, 10 mM EDTA (rozcieńczyć do 1x przed użyciem)
Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCRQiagen28104
3 M octan sodu pH 5,2
Qubit 2.0 FluorometrInvitrogenQ32866
Zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HSInvitrogenQ32851
Probówki do testów kubitowychInvitrogenQ32856
Mikroskop fluorescencyjny wyposażony w oprogramowanie
Mikrowirówka do probówek 1,5 ml
Wirówka stołowa do probówek 15 i 50 ml Komórka
inkubator kultur Komora
bezpieczeństwa biologicznego
Bloki65 ° C oraz 95 ° Z
Filtr siatkowy do próbek do blottingu izoamylowy izoamylowy doobrazowania grzewcze

Bibliografia

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242(2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie wirusowego DNAwirus opryszczki prostegochemia klikalnabiotynilowane DNAkulki streptawidynowespektrometria masreplikacja DNAizolacja jąder komórkowychsonikacjaanaliza białek
Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.