Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Summary

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Abstract

Kryteria odpowiedzi w ostrej białaczce szpikowej (AML) zostały niedawno ponownie ustalone, a badanie morfologiczne zostało wykorzystane do określenia, czy pacjenci osiągnęli całkowitą remisję (CR). U około połowy dorosłych pacjentów, którzy weszli do CR, dojdzie do nawrotu choroby w ciągu 12 miesięcy z powodu przerostu resztkowych komórek AML w szpiku kostnym. Kwantyfikacja tych pozostałych komórek białaczkowych, znana jako minimalna lub mierzalna choroba resztkowa (MRD), może być solidnym biomarkerem do przewidywania tych nawrotów. Co więcej, retrospektywna analiza kilku badań wykazała, że obecność MRD w szpiku kostnym pacjentów z AML koreluje ze słabym przeżyciem. Nie tylko cała populacja chorych na białaczkę, odzwierciedlona przez komórki zawierające fenotyp immunologiczny związany z białaczką (LAIP), jest związana z wynikiem klinicznym, ale także niedojrzała subpopulacja komórek macierzystych białaczki o niskiej częstotliwości (LSC), z których obie mogą być monitorowane za pomocą cytometrii przepływowej MRD lub podejść podobnych do MRD. Dostępność czułych testów, które umożliwiają wykrywanie resztkowych komórek białaczkowych (macierzystych) na podstawie cech specyficznych dla choroby lub związanych z chorobą (nieprawidłowe markery molekularne lub nieprawidłowe immunofenotypy) znacznie poprawiła ocenę MRD w AML. Biorąc jednak pod uwagę nieodłączną heterogeniczność i złożoność AML jako choroby, metody pobierania próbek szpiku kostnego i przeprowadzania analiz MRD i LSC powinny być zharmonizowane, gdy tylko jest to możliwe. W tym manuskrypcie opisano szczegółową metodologię odpowiedniego pobierania próbek aspiratu szpiku kostnego, transportu, przetwarzania próbek w celu optymalnej oceny wielokolorowej cytometrii przepływowej oraz strategii bramkowania do oceny MRD i LSC, aby pomóc w podejmowaniu decyzji terapeutycznych u pacjentów z AML.

Introduction

Ostra białaczka szpikowa (AML) to złośliwość szpiku kostnego charakteryzująca się defektami w programie dojrzewania, z nieprawidłową proliferacją i akumulacją mieloidalnych komórek progenitorowych, zahamowaniem prawidłowej hematopoezy i ostatecznie niewydolnością szpiku kostnego. Choroba jest wysoce niejednorodna pod względem morfologii, immunofenotypu, cytogenetyki, aberracji molekularnych i sygnatur ekspresji genów, a także odpowiedzi na leczenie i wyniku leczenia^1,2. Obecne postępowanie obejmuje chemioterapię indukcyjną w celu osiągnięcia całkowitej remisji (CR), a następnie leczenie po remisji, które w dużej mierze opiera się na wynikach badań molekularnych, cytogenetycznych i immunofenotypowych i składa się z kilku cykli dodatkowej chemioterapii lub (autologicznego lub allogenicznego) przeszczepu komórek macierzystych³. Pomimo wysokich wskaźników remisji po intensywnej chemioterapii wynoszących do 90%, 5-letnie przeżycie u dorosłych wynosi tylko około 30%-40%, głównie ze względu na rozwój nawrotów, które są powszechnie oporne na chemioterapię, a tym samym bardzo trudne do leczenia. Wyniki u dzieci są lepsze, chociaż około jedna trzecia z nich również dochodzi do nawrotu choroby. Dlatego wczesne wykrycie zbliżającego się nawrotu choroby wypełni niezaspokojoną potrzebę medyczną i może ukierunkować terapię po remisji⁴.

Choroba resztkowa po terapii może odzwierciedlać sumę wszystkich mechanizmów/czynników oporności diagnozy i po diagnozie; stąd jej pomiar może być prognostyczny i pomocny w kierowaniu leczeniem. Możliwość zdefiniowania choroby resztkowej (dawniej nazywanej minimalną chorobą resztkową, a obecnie określanej jako mierzalna choroba resztkowa lub MRD) znacznie poniżej kryterium morfologicznego 5% komórek blastycznych zmienia krajobraz klasyfikacji ryzyka. Obecnie dwie metody najczęściej stosowane do wykrywania MRD to cytometria przepływowa i metoda molekularna, przy czym ta ostatnia jest oceniana za pomocą PCR z odwrotną transkryptazą (RT-qPCR)⁵ lub, choć na wczesnym etapie, za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Wiele badań zarówno u dorosłych, jak i u dzieci wykazało już, że różne podejścia MRD dostarczają silnych informacji prognostycznych w AML zarówno po terapii indukcyjnej, jak i konsolidacyjnej^6,7, a obecnie pojawia się nowa definicja obciążenia chorobą (lepsza od morfologicznej CR)⁸. Sugeruje to, że MRD oceniane za pomocą technik przepływowych i/lub molekularnych powinno stać się, a w rzeczywistości już się staje, standardem w każdym badaniu klinicznym w AML.

Ten manuskrypt omawia szczegółową procedurę cytometrii przepływowej w celu uzyskania dokładnej i powtarzalnej charakterystyki immunofenotypowej MRD w próbkach szpiku kostnego, w tym pobieranie szpiku kostnego i procedury przetwarzania poprzedzające cytometrię przepływową. Dostępność dobrej jakości próbek szpiku kostnego w momencie diagnozy i obserwacji ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego pomiaru w ośrodkach klinicznych i badaniach klinicznych. W rzeczywistości te względy przedanalityczne mają również kluczowe znaczenie dla molekularnych (PCR i NGS) podejść MRD. W celu charakterystyki immunofenotypowej MRD, markery o nieprawidłowej ekspresji są łączone z prawidłowymi markerami szpikowymi i progenitorowymi, w celu identyfikacji immunofenotypu związanego z białaczką (LAIP)9. MRD mierzy wypadkową wielu czynników wpływających na odpowiedź na leczenie, takich jak wrodzona lub nabyta oporność na leki w białaczce, farmakodynamika i kinetyka terapii, nadzór immunologiczny i przestrzeganie zaleceń. W związku z tym MRD jest bardzo silnym parametrem prognostycznym po diagnozie związanym z wynikiem klinicznym, gdy jest dychotomiczny na poziomie odcięcia określonym przez analizę charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). Dla naszej dorosłej kohorty AML w badaniu HOVON 42a poziom odcięcia ustalono na 0,1% komórek LAIP dodatnich/całkowitej liczby białych krwinek. Korzystając z tego kryterium do określenia negatywnego i dodatniego statusu MRD, można zidentyfikować grupę pacjentów, którzy mają znacznie gorszą częstość nawrotów, wolne od nawrotów i całkowite przeżycie⁶. Dodatkowo opisujemy pomiar niedojrzałych, lekoopornych komórek białaczkowych o cechach podobnych do komórek macierzystych (CD34 + CD38- komórki macierzyste białaczki lub LSC), które oferują silny predyktor wyniku pacjenta¹⁰. Podejścia LAIP i LSC tworzą razem podejście MRD oparte na cytometrii przepływowej. Podejście LAIP jest odpowiednie dla około 90% pacjentów, podczas gdy podejście LSC może być stosowane u około 80% pacjentów. Łącznie ponad 95% pacjentów może być ocenianych pod kątem jednego parametru lub obu.

Na koniec, ta publikacja zawiera szczegółowy opis operacyjny do oceny MRD za pomocą cytometrii przepływowej. Obejmuje to: 1) harmonizację i/lub standaryzację procedur pobierania próbek szpiku kostnego, 2) wytyczne dotyczące transportu próbek, 3) szczegółowy opis wykrywania komórek białaczkowych za pomocą FACS przy użyciu kilku paneli przeciwciał, w tym podejść z pojedynczą rurką komórkową w celu scharakteryzowania LSC, 4) ustawienie maszyn FACS do standardowych pomiarów, 5) programy analityczne do pomiarów MRD i 6) programy analityczne do wykrywania LSC.

Staramy się pokazać wszystkie aspekty procedury, w tym przygotowanie próbki, ponieważ rzadko się o tym mówi, podczas gdy jest to ważna kwestia dla jakości końcowego wyniku. Aspiracja szpiku kostnego i biopsja to procedury kliniczne stosowane do oceny komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym. Wykonuje się je razem z pełną morfologią krwi (CBC) i rozmazem krwi. Optymalna metoda aspiracji szpiku kostnego ma kluczowe znaczenie dla dokładnej diagnozy i obserwacji pomiaru MRD. Ponadto udany aspirat szpiku kostnego powinien zawierać wystarczającą liczbę komórek do przeprowadzenia analizy przepływu LAIP i LSC (co najmniej 10 milionów żywych komórek). W tym miejscu opisujemy sposób wykonania aspiracji szpiku kostnego i podajemy wytyczne, które powinny skutkować odpowiednim pobraniem próbek komórek (i ograniczeniem potencjału hemodilucji) potrzebnym do dokładnej diagnostyki i dodatkowych badań. Te rozważania przedanalityczne mają również zasadnicze znaczenie dla molekularnych (PCR i NGS) podejść MRD. Wszystkie próbki do immunofenotypowania należy poddać preferencyjnej obróbce w ciągu 24 godzin od pobrania. Chociaż nie jest to zalecane, próbki szpiku kostnego i krwi obwodowej mogą być nadal przetwarzane i analizowane, jeśli są przechowywane do 72 godzin w temperaturze otoczenia. Ponadto wszystkie czynności związane z materiałem powinny być wykonywane w sterylnych warunkach, aby umożliwić kriokonserwację sterylnych komórek do późniejszych badań/oceny jakości itp.

Protocol

Protokół jest zgodny z wytycznymi kodeksu badawczego i komisji etyki badań Centrum Medycznego Uniwersytetu VU.

1. Aspiracja szpiku kostnego i przygotowanie próbki

1. Przygotowanie pacjenta i materiału
   1. Napełnij jedną lub dwie strzykawki o pojemności 10 ml 1% lidokainą za pomocą igły o rozmiarze 16. Wymień igłę na igłę o rozmiarze 21.
   2. Umieść dwie krople 5% EDTA na szkiełku zegarka.
   3. Ustawić szkiełka podstawowe (n=15 ze spójną numeracją pacjentów i datą) do przygotowania rozmazu.
   4. Ułóż pacjenta w bocznej pozycji odleżynowej. Zlokalizuj górny tylny grzbiet biodrowy i zaznacz długopisem.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, tylny górny kręgosłup biodrowy znajduje się na szerokość jednej ręki dystalnie do grzebienia biodrowego i na szerokość jednej ręki bocznie do linii środkowej. U kobiet rzeczywisty kręgosłup może być nieco bardziej boczny, u niektórych mężczyzn nieco bardziej przyśrodkowy.
   5. Zdezynfekuj skórę chlorheksydyną 0,5-1% w etanolu od zamierzonego obszaru biopsji na zewnątrz okrężnymi ruchami.
   6. Otwórz opakowanie sterylnych rękawiczek, załóż sterylne rękawiczki i połóż opakowanie na stole, aby stworzyć sterylne pole. Otwórz opakowanie z igłą do aspiracji i umieść je na sterylnym polu.
   7. Naciekają skórę i tkankę podskórną, a na końcu okostną. W okostnej podawać lidokainę w taki sposób, aby znieczulić obszar o średnicy 1 cm.
      UWAGA: Odpowiednie podawanie lidokainy do okostnej jest jednym z najważniejszych czynników wpływających na komfort pacjenta. Sprawdź, czy okostna została odpowiednio znieczulona, stukając wprowadzoną igłą w zamierzone miejsce biopsji i zapytaj, czy pacjent odczuwa ból. Uwaga: Dzieci są w pełni znieczulone podczas całego zabiegu.
   8. Trzymać igłę do zasysania (15 Ga x 2,8") bliższym końcem dłoni i palcem wskazującym przyłożyć do boku metalowego trzonka igły w pobliżu końcówki; ta pozycja zapewnia lepszą kontrolę.
   9. Wprowadzić igłę ruchem obrotowym (szybkim naprzemiennym ruchem pronacyjnym/supinacyjnym) przez skórę w kierunku kręgosłupa biodrowego i doprowadzić igłę do kontaktu z tylnym kręgosłupem biodrowym.
   10. Upewnij się, że igła została wprowadzona do znieczulonego obszaru okostnej; pacjent powinien odczuwać tylko ucisk, a nie ból. Jeśli pacjent odczuwa ból, zmień położenie igły lub podaj więcej lidokainy.
   11. Używając delikatnego, ale mocnego nacisku, przesuwaj igłę, obracając ją na przemian w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara i przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Wejście do jamy szpiku jest na ogół wykrywane przez zmniejszony opór.
   12. Wyjąć trzpień z igły. Podłączyć pustą strzykawkę o pojemności 10 ml do igły.
   13. Zastosować podciśnienie, wycofując tłok strzykawki delikatnym pociągnięciem. Ostrzeż pacjenta, że może odczuwać skurcze i ból podczas odsysania szpiku. Jeśli nie zostanie uwolniona wystarczająca ilość kolców szpiku kostnego, należy wykonać kolejną aspirację za pomocą jednego szybkiego pobrania. Większość kolców znajdzie się w pierwszych 1-2 ml uzyskanych z początkowego pociągnięcia. Odsysać tylko 1-2 ml, aby uniknąć rozcieńczania próbki.
       UWAGA: Rozcieńczenie spowoduje hemodilucję i może zakłócić wyniki MRD).
   14. Wyjąć strzykawkę i umieścić trzpień w igle do aspiracji. Wyrzuć część szpiku do szkiełka zegarkowego, a resztę do probówki o pojemności 8 ml pokrytej heparyną.
       Uwaga: Odwróć każdą probówkę natychmiast po umieszczeniu aspiratu szpiku w probówce z próbką, aby zapewnić odpowiednią antykoagulację. Koagulacja szpiku kostnego jest często przyczyną nieodpowiedniego materiału. Dodatkowy szpik kostny można odessać z tego samego miejsca, ale najlepiej, aby igła była wysunięta na 5-10 mm przed pobraniem nowego aspiratu. Najlepiej nie wykonywać więcej niż 2 losowania na poziom wstawiania. Upewnij się, że oznaczyłeś probówki rosnącymi liczbami reprezentującymi pierwsze, drugie i/lub kolejne losowania. Powszechną zasadą jest użycie pierwszego losowania do najbardziej odpowiedniej analizy diagnostycznej.
   15. Alternatywnie, wycofać igłę z miejsca wprowadzenia i ponownie wprowadzić ją do jamy szpiku w odległości kilku milimetrów od pierwotnego miejsca wprowadzenia i powtórzyć procedurę.
       Uwaga: Nie zasysaj więcej niż 1-2 ml na pociągnięcie, aby uniknąć znacznego zanieczyszczenia krwi.
   16. Powtarzaj tak często, jak potrzebny jest materiał. Po odessaniu materiału potrzebnego do określonego protokołu badania klinicznego należy usunąć igłę do szpiku kostnego.
       UWAGA: W przypadku powolnej lub w inny sposób trudnej aspiracji szpiku kostnego pomocne może być użycie strzykawek, które zostały wstępnie przepłukane antykoagulantem. W przypadku suchego kranu należy wykonać biopsję trepanacyjną, która wykracza poza zakres niniejszego rękopisu.
2. Przygotowanie wymazów do badania morfologicznego
   1. W celu optymalnej oceny morfologicznej należy pobrać kolce (np. za pomocą plastikowej szpatułki) z aspiratu w szkiełku zegarkowym i umieścić je na szkiełku podstawowym.
   2. Delikatnie umieścić kolejne szkiełko szkiełkowe na szkiełku podstawowym ze szkiełkiem i delikatnie przesunąć; unikaj jakiegokolwiek nacisku.
      UWAGA: Tylko w przypadku bardzo dużych kolców szpiku kostnego można wywierać niewielki nacisk, aby zmniejszyć grubość rozprzestrzeniającej się komórki. Procedura korzysta z pomocy asystenta, który może zająć się probówkami z próbkami. Kluczowe znaczenie ma dokładne oznakowanie probówek numerem pacjenta i numerem sekwencyjnego pobrania szpiku kostnego.
   3. Dokładnie wysuszyć szkiełko, a następnie wykonać barwienie May Giemsa Grünwald (patrz tabela materiałów). Zbadaj pod mikroskopem świetlnym pod kątem morfologii (patrz Rysunek 1).
      UWAGA: Rysunek 1A pokazuje rozmazy zdrowego szpiku kostnego składającego się z różnych funkcjonalnych typów komórek, podczas gdy Rysunek 1B to pacjent z AML z głównie białaczkowymi blastami. Aby lepiej określić resztkowe obciążenie białaczką, należy przeprowadzić immunofenotypowanie.

2. Transport materiału do dalszej obróbki

1. Przygotowanie próbek do transportu
   1. Aby upewnić się, że materiał nie będzie przeciekał, a rurki nie pękną, upewnij się, że opakowanie jest prawidłowe (patrz Rysunek 2).
      UWAGA: Z naszych i innych doświadczeń wynika, że żywotność komórek jest najlepiej zachowana, gdy szpik kostny jest przechowywany w temperaturze pokojowej. W przypadku transportu długotrwałego najlepiej jest to osiągnąć za pomocą "żelowego wkładu" w temperaturze pokojowej, który pomaga w utrzymaniu stabilności temperatury podczas transportu.
   2. Oznacz opakowania etykietami i dodaj odpowiednie formularze, aby uniknąć zagubienia opakowania, przedłużającego się transportu lub zmiany pacjentów.
      UWAGA: Powinien on zawierać co najmniej: (Formularz 1) Dane pacjenta. Powinno to obejmować numer badania i zwykle "datę urodzenia". Niezbędne do prawidłowego przetworzenia materiału po przybyciu do laboratorium odbiorczego jest wyraźne stwierdzenie o specjalnie zamówionej analizie laboratoryjnej (diagnostyka molekularna, immunofenotypowanie, MRD itp.) na tym formularzu. (Formularz 2) Adres i numer telefonu osoby wyznaczonej do kontaktów, a w razie potrzeby dokumenty do odprawy celnej. Aby uniknąć zagubienia paczek w przesyłce, laboratorium wysyłające zawsze powiadamia laboratorium odbierające, że próbka została wysłana. Zaleca się korzystanie z funkcji "śledzenia i śledzenia".
2. Pobieranie próbek z innych instytutów
   1. Upewnij się, że w instytucie istnieje odpowiednia logistyka, aby otrzymać próbkę w laboratorium, gdy tylko zostanie ona dostarczona do instytutu.
      UWAGA: Dla optymalnej organizacji logistycznej wymagane jest laboratorium centralne, które odbiera i zbiera cały materiał z lokalnej kliniki oraz ze szpitali zewnętrznych. W szczególności niezbędne jest przypisanie protokołów dystrybucji i jasna komunikacja z laboratoriami wykonawczymi.
   2. Po otrzymaniu próbek należy dokładnie zanotować odpowiednią numerację w formie papierowej oraz w zabezpieczonej bazie danych zawierającej ważne pola, takie jak numer identyfikacyjny MRD, numer identyfikacyjny specyficzny dla badania, numer rejestracyjny szpitala, instytut wysyłający, data urodzenia, rodzaj materiału (szpik kostny lub krew obwodowa), liczba białych krwinek (WBC), data aspiracji szpiku kostnego, data pomiaru próbki oraz wszelkie uwagi istotne dla jakości pomiaru.
      UWAGA: Najlepiej, aby ta baza danych była również wyposażona w dodatkowe dane (lub była połączona z innymi bazami danych) wyników analizy oraz dalsze dane pacjenta, takie jak dane uzupełniające.

3. Konfiguracja cytometru przepływowego

Uwaga: Ta sekcja jest oparta na instrukcjach Euroflow. ¹¹

1. Ustawienie napięć fotopowielacza (PMT) dla parametrów FCS SSC i docelowych kanałów fluorescencyjnych
   1. W celu uzyskania parametrów FCS SSC uruchom cytometr przepływowy i wykonaj "Konfigurację i śledzenie cytometru (CST)" na cytometrze przepływowym z kulkami CST (patrz tabela materiałów). Liza czerwonych krwinek od zdrowego dawcy (opisana w punkcie 4.1).
      1. Utwórz nowy eksperyment (w menu: Eksperyment, Nowy eksperyment wybierz Pusty eksperyment) za pomocą oprogramowania producenta (patrz tabela materiałów) z wykresem kropkowym rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC) w celu ustawienia parametrów FSC i SSC. Nadaj temu eksperymentowi nazwę FSC/SCC PMT z datą. Najpierw użyj aktualnych ustawień cytometru (kliknij prawym przyciskiem myszy: "zastosuj aktualny CST"). Ustawienia te zostały wygenerowane za pomocą kontroli wydajności CST przy użyciu koralików kalibracyjnych CST (patrz tabela materiałów). Dostosuj FSC i SSC, aby uwidocznić limfocyty w "globalnych ustawieniach eksperymentu". Uwaga: w naszym cytometrze przepływowym są to odpowiednio 285 V i 400 V. Zaznacz opcję "Włącz kompensację" w: Inspector/Instrument Settings/Compensation.
      2. Aby ocenić wielkość komórek (FSC) i ziarnistość (SSC), rozpocznij pomiar nieznakowanych lizowanych komórek krwi obwodowej za pomocą funkcji "pozyskania komórek". Bramkować limfocyty i dostosować/dostroić napięcia FSC i SSC, aby osiągnąć następujące średnie wartości docelowe dla bramkowanej populacji limfocytów: FSC: 100 000 (zakres 95 000 - 105 000); SSC: 15 000 (zakres 13 000 - 17 000).
      3. Zbieraj i rejestruj dane, mierząc co najmniej 10 000 zdarzeń. Sprawdzić średnie wartości docelowe FSC i SSC dla bramkowanych limfocytów i w razie potrzeby ponownie dostosować.
   2. Do ustawiania docelowych kanałów fluorescencyjnych PMT wykorzystuje się 8-szczytowe cząstki kalibracyjne z kulkami tęczowymi (patrz tabela materiałów).
      1. Utwórz nowy eksperyment na FACS dla 7 szczytów. Utwórz arkusz roboczy "Docelowa średnia intensywność fluorescencji (MFI)" ze wszystkimi niezbędnymi wykresami punktowymi (n=2; FSC w porównaniu z SSC, FITC w porównaniu z PE), histogramy (n=8; jeden histogram dla każdego detektora fluorescencji) oraz statystyki przedstawiające referencyjne wartości szczytowe (MFI i współczynnik zmienności (CV)) dla każdego kanału fluorescencji.
      2. Przygotować świeżo roztwór zawierający 1 kroplę (± 60 μl) kulek tęczowych w 1 ml dH₂O. Delikatnie przemieszać, aby wymieszać kulki w roztworze.
      3. Użyj ustawień PMT napięć FSC/SSC od góry i rozpocznij pomiar fluorescencji koralików tęczowych za pomocą funkcji "acquire" (bez nagrywania) przy "NISKIM" natężeniu przepływu z progiem 5,000. Użyj "prostokątnego przycisku bramki", aby zabramkować populację koralików singletowych P1 na wykresie punktowym FSC i SSC. Bramka 7^th PEAK - Populacja P2 na wykresie kropkowym FITC w porównaniu z PE.
      4. Kontynuuj akwizycję 7-szczytowego zawieszenia koralików Rainbow i dostosuj/dostrój napięcia PMT we wszystkich kanałach fluorescencyjnych, aby osiągnąć docelowe wartości MFI zgodnie z adnotacjami kanałów docelowych MFI dostarczonych z koralikami.
      5. Użyj opcji "Record", aby zebrać dane o około 10 000 zdarzeń i sprawdzić MFI dla koralików 7th Peak. W razie potrzeby skoryguj napięcie PMT. Po osiągnięciu docelowych wartości MFI dla 7. szczytu zapisz/zastąp plik dla końcowych wartości PMT.
      6. Zapisz końcowe wartości PMT i nazwij plik PMT Setup z datą, która zostanie zapisana w katalogu oprogramowania producenta. Użyj tej konfiguracji PMT, aby skorygować rozlanie się dla każdego barwnika fluorescencyjnego.
2. Ustawienia kompensacji fluorescencji
   1. Oznaczyć probówkę dla niebarwionej kontroli i każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem (patrz tabela S1 dla zastosowanych fluorochromów). Odpipetować 100 μl buforu do każdej probówki.
   2. Dokładnie przemieszać fiolkę z wielokolorowymi kulkami kompensacyjnymi (patrz tabela materiałów), a następnie dodać 1 pełną kroplę (± 60 μL) tych kulek do każdej probówki.
      UWAGA: Unikaj kapania koralików z boku rurki podczas dodawania ich do każdej tubki. Może to prowadzić do niskiego stężenia ściegu i może mieć wpływ na wyniki matrycy kompensacji.
   3. Odpipetować odpowiednią objętość obliczoną dla jednego testu przeciwciała sprzężonego z fluorochromem wystarczającą (która byłaby wystarczająca do zabarwienia^10-6 komórek) do odpowiedniej probówki i dokładnie odwirować. Nie dodawać przeciwciała do niebarwionej probówki kontrolnej. Inkubować przez 15 do 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej (RT).
   4. Dodać 4 ml buforu do przemywania (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)/0,05% azydek-0,1% albumina surowicy ludzkiej (HSA) (patrz tabela materiałów)) do każdej probówki. Odwirować probówki o masie 300g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulkę kulki, dodając 0,2 ml buforu do przemywania do każdej probówki. Dokładnie wymieszaj rurki.
   5. Otwórz oprogramowanie analityczne producenta (patrz tabela materiałów) i utwórz nowy eksperyment (W menu: Eksperyment, Nowy eksperyment wybierz Pusty eksperyment) i zmień nazwę na plik kompensacyjny z bieżącą datą.
   6. Przejdź do "ustawień cytometru" i użyj ustawienia PMT z sekcji 3.1. Upewnij się, że próg w FSC wynosi 5 000, a wartości kompensacji wszystkich użytych fluorochromów wynoszą zero.
   7. W razie potrzeby twórz formanty kompensacji, w tym rury specyficzne dla etykiety. Pamiętaj, aby dołączyć niepoplamioną kontrolkę. Wybierz z menu: Eksperyment, Ustawienia kompensacji, Utwórz kontrolki kompensacji.
   8. Załaduj niezabarwioną rurkę kontrolną i wyreguluj bramkę P1 wokół populacji koralików singletowych i upewnij się, że bramka P1 zawiera tylko koraliki singletowe.
   9. Kliknij prawym przyciskiem myszy bramkę P1 i wybierz "Zastosuj do wszystkich kontrolek kompensacji". Zapisz dane dla wszystkich pojedynczo znakowanych lamp fluorescencyjnych. Sprawdź, czy bramka P2 obejmuje populację dodatnią na każdym histogramie fluorescencji. W razie potrzeby wyreguluj bramę.
   10. Oblicz odszkodowanie. Wybierz Eksperyment, Ustawienia wynagrodzenia, Oblicz kompensację.
   11. Jeśli obliczenie odszkodowania nie powiedzie się, zostanie wyświetlony komunikat o błędzie. Dokonaj niezbędnych korekt i przelicz ponownie. Gdy obliczenie wynagrodzenia zakończy się pomyślnie, pojawi się okno dialogowe z monitem o podanie nazwy konfiguracji wynagrodzenia.
   12. Wprowadź nazwę (na przykład ustawienia kolorów RRR-MM-DD 8), a następnie kliknij, połącz i zapisz. Ustawienia wynagrodzeń zostaną również zapisane w katalogu ustawień wynagrodzeń.
       UWAGA: Te same ustawienia mogą być używane we wszystkich eksperymentach z użyciem tych samych fluoroforów.

4. Ocena cytometrii przepływowej (LAIP i LSC)

Uwaga: Tutaj opisujemy procedurę masowej lizy przed barwieniem, która umożliwia barwienie preferowanym stężeniem WBC. Większość protokołów MRD wykorzystuje to podejście, chociaż niektóre z powodzeniem stosowały inne opcje, takie jak barwienie przed lizą. Barwienie całego szpiku kostnego przed lizą minimalizuje preferencyjną utratę komórek¹², ale ma tę wadę, że jest nieprzewidywalne, zbyt niskie stężenia komórek.

1. Masowa liza komórek
   Uwaga: Niezmodyfikowane próbki należy trzymać poziomo w temperaturze pokojowej, gdy nie można przeprowadzić akwizycji metodą cytrometrii przepływowej tego samego dnia, aby rozpocząć całą procedurę następnego dnia.
   1. Zawiesić antykoagulowaną próbkę szpiku kostnego do jednorodności, kilkakrotnie odwracając próbkę. Oznaczyć stężenie komórek szpiku kostnego (liczba białych krwinek (WBC)) za pomocą komory do zliczania komórek z roztworem Tuerka do barwienia komórek (patrz tabela materiałów).
   2. Odpipetować potrzebną objętość szpiku kostnego do oddzielnej probówki o pojemności 15 ml. Ilość komórek zależy od liczby oddzielnych probówek barwiących; do jednego barwienia (jedna probówka) należy użyć około 2 x 10⁶ białych krwinek do pomiarów LAIP i 8 x 10⁶ białych krwinek do pomiaru probówki LSC.
   3. Lizować czerwone krwinki, dodając roztwór lizujący (patrz tabela materiałów). Wymagana objętość roztworu lizującego powinna być 10 razy większa od objętości zawiesiny komórek.
   4. Delikatnie wymieszać przez odwrócenie i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przez 7 minut 800 g w temperaturze pokojowej stężenia. Odrzucić supernatant (np. za pomocą pompy próżniowej lub pipety Pasteura). Zawiesić osad komórkowy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)/0,05% albuminy surowicy ludzkiej (HSA) azydku-0,1% (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej. Użyć maksymalnej objętości probówki.
   5. Wirować przez 7 minut 800 g w temperaturze pokojowej stężenia. Odrzucić supernatant (np. za pomocą pompy próżniowej lub pipety Pasteura). Ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS/0,05% azydku-0,1% HSA do stężenia komórek 100x10⁶ WBC/ml i podzielić na liczbę przewidzianych probówek.
2. Barwienie komórek do cytometrii przepływowej
   1. Odpipetować roztwór koktajlowy przeciwciał monoklonalnych (MoAb) wymieszać z odpowiednimi probówkami do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i inkubować z lizowanymi komórkami szpiku kostnego przez 15 minut w ciemności.
      UWAGA: Jest to bardzo ważne, gdy stosowane są barwniki tandemowe. Na przykład zapoznaj się z mieszankami paneli standardowo stosowanymi w naszym laboratorium (tabela S1).
   2. Umyj komórki 3 ml PBS/0,05% azydku-0,1% HAS. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 400g. Odrzucić supernatant (np. za pomocą pompy próżniowej lub pipety Pasteura) i ponownie zawiesić osad komórek w 300 μl PBS/0,05% azydku-0,1% HSA.
   3. Do pomiaru LSC: zawiesić osad komórkowy w 400 μl PBS/0,05% azydku-0,1% HSA i dodać 4 μl ślepych kulek (np. Spherotech, patrz tabela materiałów) w celu wykorzystania jako ujemna populacja kontrolna w analizie.
   4. Otwórz układ eksperymentu MRD lub LSC w FACS (patrz tabela materiałów) i zmierz dla MRD co najmniej 100 000 zdarzeń bramkowanych WBC do pomiaru próbek pacjentów z AML w momencie diagnozy i 1X10⁶ WBC dla próbek AML w okresie obserwacji. W eksperymentach LSC należy zmierzyć co najmniej 4x10⁶ WBC zarówno w momencie diagnozy, jak i obserwacji, aby uzyskać wiarygodny wynik LSC.
   5. Zapisz dane przy użyciu ustandaryzowanej odpowiedniej nazwy pliku do analizy wyników. Sporządź spis różnych zmierzonych markerów na komórkach AML i komórkach macierzystych AML (dodatni, ujemny, ekspresja nad/niedostateczna) i przechowuj te dane w dzienniku laboratoryjnym.
   6. W przypadku, gdy nie ma dostępnej diagnozy LAIP, zmierz wszystkie 4 probówki podczas obserwacji, aby upewnić się, że wszelkie możliwe mierzalne LAIP mogą zostać zidentyfikowane w inny niż normalny sposób.
   7. Wybierz najbardziej wiarygodne LAIP(s)¹³ ustalone w momencie diagnozy i uzyskaj jak najwięcej zdarzeń, ale > zdefiniowanych minimalnych liczbach.

5. Identyfikacja immunofenotypów związanych z białaczką (LAIP): Analizy różnych populacji komórek

Uwaga: Pliki FCS mogą być analizowane za pomocą kilku programów do optymalnej wizualizacji różnych populacji komórek (zobacz tabelę materiałów).

1. Populacja białych krwinek
   1. Bramkować komórki CD45-dodatnie i żywotne komórki pojawiające się, pomijając niskie FSC (komórki nieżywotne, komórki erytroidalne) na wykresie FSC / SSC; zawierają one WBC (Rysunek 3Ai). Pokaż WBC i użyj jednego z prymitywnych znaczników (na przykład CD34;Rysunek 3Aii), aby pomóc w ustaleniu ostatecznej pozycji wybuchów w obszarze de CD45dim (Rysunek 3Aiii).
   2. Bramkować komórki CD45dim i bramkować wstecznie komórki na wykresie FSC/SSC (Rysunek 3Bi). Usuń bramkę CD34 (Rysunek 3Bii), jednocześnie zgłaszając %komórki w tej bramce jako %blasts w drzewie populacji w programie. Pokaż wybuchy na wykresie SSC/CD34 i zabramuj dodatnie komórki CD34 (Rysunek 3Biii).
2. Limfocytów
   1. Używaj limfocytów jako kontroli wewnętrznej: populacje szpiku jako kontrola negatywna, a populacje limfoidalne jako kontrola pozytywna.
   2. Zacznij od populacji białych krwinek (Ryc. 4A). Limfocyty bramkowe jako populacja^{CD45 wysoka}/SSC (<silna klasa = "xfig" >Figura 4B).
   3. Upewnij się, że w bramce nie ma komórek szpikowych za pomocą CD34, CD117, CD13 lub CD33 i bramki dla komórek CD13 ujemnych / CD33 ujemnych (Figura 4CE). Nazwij tę populację "limfocytami" w drzewie populacji (Rysunek 4F).
3. LAIP w momencie rozpoznania
   1. Bramkować wybuchy, a następnie komórki dodatnie CD34 na wykresie SSC/CD34 i nazywać je "prymitywnymi markerami" w drzewie populacyjnym.
   2. Wykreśl prymitywne komórki, w tym przypadku CD34-dodatnie, i limfocyty na nowym wykresie z markerem limfoidalnym (CD7) przeciwko markerowi szpikowemu (CD33). Zbierz nieprawidłową populację (zobacz wytyczne w pliku uzupełniającym 1) i nazwij ją "LAIP dodatnią" w drzewie populacji.
      UWAGA: Ostateczny wybrany LAIP jest podawany jako % LAIP dla populacji wybuchu. Czułość, swoistość i stabilność LAIP mogą być ustalone jedynie przez personel posiadający duże doświadczenie w pomiarach MRD. Suma tych parametrów decyduje o jakości LAIP. Przykłady czterech różnych ocen LAIP w momencie diagnozy są podane w Rysunek 5 A-D.
   3. Określ wyrażenie LAIP (% na wybuchach) i zachowaj te dane w bazie danych lub pliku Excel.
   4. Sporządzanie raportów z analiz FACS i notatek dotyczących LAIP, które muszą być używane przy pomiarach MRD.
      UWAGA: Definicja LAIP jest zatwierdzana przez zespół ekspertów, ponieważ jest to cecha niezbędna do dokładnych pomiarów MRD w następstwie zdarzenia.
4. MRD w następstwie
   1. Bramka wybuchów jest opisana w punkcie 5.1, ale w zależności od punktu czasowego po terapii; prawidłowa ocena tej bramki może być trudna. Skoncentruj się na fenotypie LAIP, który został ustalony w momencie diagnozy i bramie dla niedojrzałej populacji.
   2. Zgodnie z opisem w 5.1. znajdź właściwą bramkę blastyczną w oparciu o zdefiniowaną aberrancję i pamiętaj o regenerującym się szpiku kostnym i normalnych wyrażeniach, aby je wyprowadzić
   3. Powtórz tę samą strategię bramkowania we wszystkich punktach obserwacji i określ MRD jako procent komórek LAIP w całej populacji białych krwinek. Zobacz przykłady Rysunek 6A i 6B.
   4. Dodatni wynik MRD należy zgłaszać, gdy % MRD wynosi ≥ 0,1% białych krwinek. Drukuj przeanalizowane dane w standardowym formacie, aby co tydzień omawiać je z zespołem MRD. Zarejestruj wyniki po osiągnięciu konsensusu. Niech wyniki zostaną zatwierdzone przez przełożonego przed przekazaniem wyników klinicystom.

6. Analiza MRD komórek macierzystych (LSC Single Tube)¹⁴

1. Analizy LSC w momencie rozpoznania i obserwacji
   1. Bramkować komórki blastyczne zgodnie z opisem w sekcji 5.1.
   2. Jako potencjalna kontrola ujemna dla CD38-, frakcja czerwonych krwinek bramkowych (tj. pozostałe krwinki czerwone po lizie, charakteryzujące się^niskim SSC/^niskim FSC i^{CD45 ujemnym}). W razie potrzeby martwe komórki i fragmenty komórek można wykluczyć za pomocą dodatkowej bramki na tej powierzchni.
   3. Określ w bramie białaczki subpopulację z ekspresją CD34. W tej populacji należy ^{wybrać komórki} CD34 ⁺ CD38 (użyć jako punktu odcięcia: górna granica ślepych kulek kalibracyjnych do określenia progu (patrz tabela materiałów), frakcję czerwoną lub użyć 10³ jako punktu odcięcia). Nazwij tę populację "^niskimi progenitorami CD38" (Rysunek 7).
      UWAGA: Patrz Plik uzupełniający 1, aby uzyskać więcej informacji na temat ustawiania poziomów odcięcia CD38.
   Określ w tej^niskiej populacji CD38 prawdziwą populację komórek macierzystych CD34 + CD38, używając mediany czerwonej frakcji, dolnej granicy ślepych kulek kalibracyjnych lub wybierz 10² jako punkt odcięcia (Rysunek 7).
   4. Zobacz Plik uzupełniający 1, aby uzyskać więcej informacji na temat ustawiania poziomów odcięcia CD38.
   5. W obu populacjach należy dokonać bramki białaczkowych komórek macierzystych w porównaniu z normalnymi hematopoetycznymi komórkami macierzystymi (LSC vs HSC), analizując każdy marker białaczkowy dostarczony w panelu (tj. CD45RA, combi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 i CD56 wszystkie w PE), CD123, CD33 i CD44).
   6. Wykreśl interesujący marker komórek macierzystych w porównaniu z innymi markerami komórek macierzystych, aby porównać pozytywność/negatywność z pozytywnością/negatywnością innych markerów i dostroić częstość LSC w porównaniu z HSC.
   7. Podaj procent niedojrzałych blastów, limfocytów, komórek CD34 +. Dla wszystkich oddzielnych markerów wymień całkowitą liczbę CD38^low i CD38^verylow oraz liczby CD38^low i CD38^verynis, które są markerami dodatnimi (a zatem nowotworowymi).
   8. Wybierz marker, który najlepiej odróżnia normalne hematopoetyczne komórki macierzyste od białaczkowych komórek macierzystych do dalszej analizy. Obliczać udział procentowy LSC i HSC jako procent całkowitego WBC.
      Uwaga: Odsetek LSC wynoszący ≥ 0,004% jest podawany jako LSC dodatni w momencie diagnozy, podczas gdy wartość odcięcia wynosi 0,0001% w obserwacji. Bramkowanie nieprawidłowych komórek macierzystych w próbkach kontrolnych jest podobne do analizy w momencie diagnozy, jednak liczba komórek w populacjach komórek macierzystych może być bardzo mała. Stąd konieczność zdobycia odpowiedniej liczby wydarzeń.

Results

U 90% pacjentów z AML można zidentyfikować co najmniej jeden LAIP. Aby wygenerować dokładny odsetek komórek LAIP+ w prymitywnych komórkach blastycznych w momencie diagnozy, odpowiednie ustawienie bramki blast ma kluczowe znaczenie i wymaga weryfikacji, jak pokazano na Rysunek 3. Przykład każdego pacjenta z określonym typem aberracji w prymitywnych komórkach CD34 + jest wizualizowany w Ryc. 5. Do pomiaru MRD w obserwacji wcześniej zdefiniowane komórki LAIP+ są bramkowane i definiowane jako procent komórek LAIP+ w WBC. W związku z tym ustawienie tej bramki ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia właściwych wyników MRD. Rysunek 6 pokazuje pacjenta, który pozostaje w całkowitej remisji oraz pacjenta, u którego dochodzi do nawrotu po uzyskaniu dodatnich wyników MRD (≥ 0,1%) po drugim cyklu terapii indukcyjnej.

Obecny protokół jest odpowiedni tylko do definiowania komórek macierzystych w komórkach CD34+, ponieważ dokładna charakterystyka tego przedziału wykazała, że populacja CD38- zawiera najsilniejszą frakcję komórek macierzystych. W celu oddzielenia LSC od HSC w obrębie tej frakcji stosuje się dodatkowe markery. Najczęściej wybieranymi markerami do rozróżnienia LSC są CD45RA i kanał combi zawierający 6 specyficznych markerów LSC oznaczonych PE. Na podstawie dalszych ocen klinicznych poziom odcięcia wynoszący ≥ 0,004% zdefiniowano jako LSC-dodatni i wiązał się z gorszym przeżyciem w momencie rozpoznania, podczas gdy poziom odcięcia 0,0001% zastosowano w następujący sposób¹⁰.

Rysunek 1: Rozmaz szpiku kostnego. A) zdrowy dawca i B) pacjent z AML (podtyp FAB 5). Plama Giemsy pokazana w 100-krotnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Prawidłowy materiał opakowaniowy dla płynów biologicznych. Więcej szczegółów na temat zasad i przepisów transportu płynów biologicznych można znaleźć na stronie internetowej¹⁵ Centers for Disease Control and Prevention. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Strategia bramkowania do definiowania komórek blastycznych. A) Bramkowanie CD45dim, B) Bramkowanie CD34+ wybuchy.

Rysunek 4: Limfocyty bramkujące. A) Niebieskie komórki to WBC pokazane na wykresie FSC/SSC, B) Zielone komórki to limfocyty charakteryzujące^{się wysokim} poziomem CD45 /^niskim SSC, C) Przykłady negatywności dla CD34, D) negatywnością dla CD117 i E) negatywnością dla CD13, F) Różne typy komórek są pokazane w przeglądowym drzewie populacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: LAIPs przy diagnozie AML. A) LAIP oparty na aberrencji krzyżowej (CD7 na komórkach eksprymujących CD33), B) LAIP oparty na różnicowaniu asynchronicznym (CD11b na komórkach eksprymujących CD13), C) LAIP oparty na nadekspresji w porównaniu z normalnymi komórkami (CD34^{bardzo wysoki} na komórkach eksprymujących CD13), D) LAIP oparty na niedostatecznej ekspresji w porównaniu z normalnymi komórkami (HLA-DR^niski poziom komórek eksprymujących CD33). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: LAIP przestrzegany podczas terapii. A) Definicja LAIP w momencie rozpoznania (CD34+/CD13+/CD33-) i utrata LAIP podczas obserwacji u pacjenta, który pozostawał w ciągłej całkowitej remisji, B) definicja LAIP w momencie rozpoznania (CD117+/CD7+/CD33+) i utrzymywanie się LAIP podczas obserwacji u pacjenta, u którego nastąpił nawrót choroby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Bramkowanie komórek macierzystych. A) Bramkowanie różnych populacji CD34 + / CD38 na podstawie kulek (^{CD38 niski} znajduje się poniżej górnej granicy kulek, podczas gdy^{CD38 bardzo niski} jest zdefiniowany jako prawdziwie ujemne komórki reprezentujące LSC i znajdują się poniżej mediany kulek), B) dwa przykłady pacjentów z rozróżnieniem między HSC i LSC w obserwacji na podstawie^negu CD45RA i ekspresji CD45RA^pos. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Dostępnych jest wiele danych, które wskazują na to, że dodatni wynik MRD jest związany ze słabym przeżyciem, a zatem ocena MRD może poprawić wyniki leczenia pacjentów, dostarczając dodatkowych informacji prognostycznych, na podstawie których można podjąć decyzje kliniczne. W związku z tym spójna i zharmonizowana metoda immunofenotypowej oceny MRD jest niezbędna, aby ostatecznie poprawić terapię pacjentów. Jest to również ważne przy porównywaniu badań klinicznych w różnych ośrodkach klinicznych i może ostatecznie pomóc w podejmowaniu decyzji klinicznych i służyć jako zastępczy kliniczny punkt końcowy dla całkowitego przeżycia. Przekonanie, że solidne wytyczne są gwarantowane dla dokładnych i spójnych pomiarów MRD, doprowadziło do wspólnego działania Europejskiej Sieci ds. Białaczki (ELN) w celu opracowania najnowocześniejszych wytycznych. Ten obszerny dokument zostanie opublikowany pod koniec 2017 r. i będzie miał zasadnicze znaczenie dla wielu grup badawczych i laboratoriów w przyszłości.

Krytyczne kroki w ramach protokołu

Ważnym, a często pomijanym aspektem analizy MRD jest wpływ jakości próbki na dokładne określenie MRD. Jest to bardziej widoczne, gdy materiał musi zostać przetransportowany do innych instytutów w ramach globalnych badań klinicznych, biorąc pod uwagę dodatkowe względy operacyjne, które należy wziąć pod uwagę w tych warunkach. Aby zmniejszyć ryzyko pomylenia informacji o pacjencie i terminowego dostarczenia próbek, kluczowe znaczenie ma odpowiednie podawanie. Również na tym etapie transportu wymagane są odpowiednie formularze i/lub import do elektronicznych systemów szpitalnych z jasnym przyporządkowaniem żądanej analizy. Istotne jest również zwrócenie uwagi na etap leczenia pobierania próbek MRD, ponieważ może ono mieć znaczenie dla podejmowania decyzji klinicznych (na przykład po drugim cyklu leczenia) i dlatego powinno być jasno określone. Stosowanie danych pozorowanych (takich jak np. 1 stycznia na rok urodzenia) zwiększa ryzyko pomylenia pacjentów lub analiz. Jeśli jest to wymagane przez prawo, należy zastosować alternatywny, zanonimizowany sposób identyfikacji.

Wszystkie próbki do immunofenotypowania należy poddać preferencyjnej obróbce w ciągu 24 godzin od pobrania. Chociaż nie jest to zalecane, próbki szpiku kostnego i krwi obwodowej mogą być nadal przetwarzane i analizowane, jeśli są przechowywane do 72 godzin w temperaturze otoczenia. Ponadto, wszystkie czynności związane z materiałem mogą być najlepiej wykonywane w sterylnych warunkach, więc dalsza kriokonserwacja komórek w (lokalnych) biobankach pozostaje istotna: wiele badań klinicznych ma dodatkowe analizy w celu dalszego zbadania komórek białaczkowych w odniesieniu do cech molekularnych, immunofenotypowych i funkcjonalnych, które zostaną przeprowadzone na późniejszym etapie. Jednak szczegóły dotyczące biobankowania nie wchodzą w zakres tego manuskryptu.

Stosowanie MRD jako narzędzia diagnostycznego oznacza, że potrzebuje ono akredytowanego laboratorium, nie tylko do cytometrii przepływowej, ale także w zakresie kontroli jakości oceny MRD. Może to wymagać dystrybucji próbek do określonych laboratoriów referencyjnych lub (ponownej) analizy plików przepływu z pomiarami MRD przez zespoły referencyjne.

W tym artykule opisano najważniejsze działania, od pobrania aspiratu szpiku kostnego po oznaczenie MRD w próbkach klinicznych - wymagające całego zespołu ekspertów z określonymi zadaniami, odpowiedzialnością i częstą komunikacją w celu skutecznej charakterystyki i analizy. Ponieważ każde zadanie ma kluczowe znaczenie dla procedury, zaleca się zapewnienie solidnej logistyki, w tym protokołów, w każdym laboratorium oraz wystarczającej liczby personelu pomocniczego, który został specjalnie przeszkolony do tego zadania. Ponadto, ze względu na to, że w części procedur występują pewne stosunkowo subiektywne kroki (zwłaszcza identyfikacja markerów nieprawidłowych LAIP i LSC), konieczne jest przeprowadzenie dyskusji na temat końcowego wyniku przez zespół i zatwierdzenie raportu końcowego przez zespół przełożonych. Obecnie prowadzone są prace nad oprogramowaniem komputerowym, które pomoże ustandaryzować analizę MRD (LAIP i LSC).

Modyfikacja i rozwiązywanie problemów

Każde laboratorium może mieć swój własny zestaw przeciwciał, które można wykorzystać do zdefiniowania różnych subpopulacji, chociaż posiadanie znormalizowanego szkieletu markerów jest niezbędne do uzyskania porównywalnych wyników, jak określono w dokumencie ELN State of the Art Guidelines for MRD, o którym mowa powyżej. Niezależnie od wybranych markerów, istnieją pewne kwestie, które mogą utrudnić analizę wyników i muszą być wzięte pod uwagę.

Ograniczenia techniki

Identyfikacja ekspresji nieprawidłowych markerów LAIP i LSC jest najpierw oceniana w momencie rozpoznania i monitorowana w czasie (w trakcie i po terapii) w celu dokładnej charakterystyki fenotypu MRD. Podczas gdy ponad 95% pacjentów można ocenić za pomocą LAIP lub LSC (lub obu), nadal niektórzy pacjenci nie mają zdefiniowanych LAIP lub nie mają CD34+CD38- LSC lub mają blasty CD34 ujemne lub brakuje im próbki diagnostycznej. W takich przypadkach nadal warto spróbować zmierzyć MRD za pomocą panelu przeciwciał tak szerokiego, jak pozwala na to liczba dostępnych komórek, a następnie wybrać najbardziej wiarygodny (dający najsilniejsze rozróżnienie komórek białaczkowych) LAIP. Biorąc pod uwagę, że odsetek pacjentów, u których ostatecznie dochodzi do nawrotu, nie jest w pełni podobny do immunofenotypu rozpoznanego, ze względu na niejednorodność choroby AML, pomiar szerokiego panelu przeciwciał w MRD jest i tak zalecany. Te zmiany immunofenotypowe obejmują komórki blastyczne i LSC i wykazano, że występują podczas terapii¹⁶ , a mierzalna choroba może być oparta na tych tak zwanych nadchodzących populacjach. W tej chwili nie ustalono jednak, czy wszystkie subpopulacje immunofenotypowe doprowadzą do nawrotu choroby, a zatem nie jest powszechną praktyką zgłaszanie terapii dostosowanej do MRD opartej na tych komórkach w badaniach klinicznych. Należy zauważyć, że ryzyko braku LSC z powodu przesunięć populacji jest zmniejszone dzięki podejściu jednoprobówkowemu, w którym najważniejsze markery definiujące aberrację znajdują się w jednym kanale cytometrii przepływowej (PE)¹⁴.

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod

Metoda opisana w tym protokole opiera się na definicji jednego lub więcej LAIP, które komórki są obserwowane podczas terapii. Wadą tej metody jest to, że niedawno wykazano, że LAIP może się zmieniać w trakcie terapii. W ten sposób niektóre nadchodzące populacje z różnymi nieprawidłowymi markerami mogą zostać pominięte. Aby tego uniknąć, najlepiej byłoby zmierzyć wszystkie nieprawidłowe markery, a nie tylko te, które stwierdzono w momencie diagnozy. Byłoby to wówczas podobne do podejścia "odmiennego od normalnego", które jest stosowane przez kilka laboratoriów¹⁷.

Przyszłe zastosowania

Ostatnio MRD zyskało dodatkową uwagę w związku z nowatorskim projektem badań klinicznych. W dobie specjalistycznych opcji leczenia i celowanej terapii lekowej, zastosowanie MRD jako miary wyniku skróci czas potrzebny do ustalenia skuteczności klinicznej nowych terapii, ostatecznie umożliwiając szybsze wprowadzenie pilnie potrzebnych opcji terapeutycznych do kliniki. Znaczenie odpowiedniej logistyki i praktycznego przeprowadzenia zharmonizowanej oceny MRD ma kluczowe znaczenie dla przyszłego sukcesu leczenia AML, ponieważ FDA bada obecnie możliwość zastosowania MRD jako zastępczego punktu końcowego zamiast miar całkowitego przeżycia¹⁸.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	BD Biosciences	120995496,060996589 oraz 013729	FACS Canto II
	BD Biosciences	555360	CD7 FITC
	DAKO	F076701	CD2 FITC
	Sanquin	M1613	CD36 FITC
	BD Biosciences	332778	CD15 FITC
	BD Biosciences	335039	CD45RA FITC
	BD Biosciences	345810	CD56 PE
	BD Biosciences	337899	CD22 PE
	BD Biosciences	345785	CD14 PE
	Miltenyi Biotec	130-080-801	CD133 PE
	BD Biosciences	562566	Clec12a PE
	BD Biosciences	565568	Tim-3 PE
	BD Biosciences	332774	CD7 PE
	BD Biosciences	333142	CD11b PE
	BD Nauki biologiczne	337899	CD22 PE
	BD Nauki biologiczne	345810	CD56 PE
	BD Nauki biologiczne	347222	CD34 PERCP-CY5.5
	BD Nauki biologiczne	558714	CD123 PERCP-CY5.5
	Beckman Coulter	B49221	CD117 PE-CY7
	BD Nauki biologiczne	562854	CD33 BV421
	BD Biosciences	345791	CD19 APC
	BD Biosciences	333143	CD11b APC
	BD Biosciences	345800	CD33 APC
	BD Biosciences	345807	CD38 APC
	BD Biosciences	641411	HLA-DR APC-H7
	BD Biosciences	560532	CD44 APC-H7
	BD Biosciences	562596	CD13 BV421
	BD Biosciences	348811	CD34 PE-CY7
	Beckman Coulter	A96416	CD45 Krome Orange
	BD Biosciences	655873	CD45 HV500c
	BD Biosciences	655051	koraliki CST
	BD Biosciences	555899	Pharm roztwór
	BD Biosciences	644204	Multicolor CompBeads
	BD Biosciences	655051	Koraliki
	BD Biosciences		FACSDiva oprogramowanie
	Cytognos		Infinicyt
	Spherotech	Euroflow RCP-30-5a
	Rozwiązanie
Spherotech	BCP-100-5	Puste kulki kalibracyjne cząstek
			Przepisy HSA
			Azydek
			ddH2O