Trójwymiarowa hodowla komórkowa oparta na chipach w perfuzjonych mikrobioreaktorach

Summary

Opisujemy platformę opartą na chipach do trójwymiarowej hodowli komórek w mikro-bioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 milionów komórek, które mogą być hodowane w ściśle określonych warunkach w odniesieniu do przepływu płynów, napięcia tlenu itp. w sterylnej, zamkniętej pętli obiegowej.

Abstract

Opracowaliśmy oparty na chipach system hodowli komórek do trójwymiarowej hodowli komórek. Chip jest zwykle wytwarzany z nieulegających biodegradacji polimerów, np. poliwęglanu lub polimetakrylanu metylu metodą mikrowtrysku, mikrotłoczenia na gorąco lub mikrotermoformowania. Ale może być również wytwarzany z biodegradowalnych polimerów. Jego wymiary gabarytowe to 0,7 1 x 20 x 20 x 0,7 1 mm (wys. x szer. x dł.). Głównymi cechami zastosowanych chipów są albo siatka do 1156 sześciennych mikropojemników (cf-chip) każdy o wymiarach 120-300 x 300 x 300 μ (wys. x szer. x dł.), albo okrągłe wgłębienia o średnicy 300 μ i głębokości 300 μ (r-chip). Rusztowanie może pomieścić 10 mln komórek w konfiguracji trójwymiarowej. Aby zapewnić optymalne zaopatrzenie w składniki odżywcze i gazy, chip jest umieszczany w obudowie bioreaktora. Bioreaktor jest częścią zamkniętej pętli cyrkulacji sterylnej, która w najprostszej konfiguracji składa się dodatkowo z pompy rolkowej i zbiornika medium z zasilaniem gazem. Bioreaktor może pracować w trybie perfuzji, superfuzji, a nawet w trybie mieszanym. Udało nam się wyhodować linie komórkowe, a także komórki pierwotne przez kilka tygodni. W przypadku pierwotnych komórek wątroby szczurów możemy wykazać zachowanie funkcji organotypowych przez ponad 2 tygodnie. W przypadku linii komórkowych raka wątrobowokomórkowego możemy wykazać indukcję genów specyficznych dla wątroby, które nie są lub ulegają tylko niewielkiej ekspresji w standardowej hodowli jednowarstwowej. System może być również przydatny jako system hodowli komórek macierzystych, ponieważ pierwsze eksperymenty różnicowania na liniach komórek macierzystych były obiecujące.

Protocol

Ten artykuł opisuje użycie platformy opartej na chipie (rys. 1) do trójwymiarowej hodowli linii komórkowych, jak również komórek pierwotnych. Ponieważ wiele komórek wyraża funkcje organotypowe tylko w środowisku 3D, opracowaliśmy polimerowy chip, który zapewnia rusztowanie, do którego komórki mogą przylegać we wszystkich kierunkach przestrzennych i który może być zamontowany w obudowie bioreaktora w celu kontroli przepływu płynu, napięcia tlenu itp. W zależności od projektu eksperymentalnego, powierzchnia polimeru może być modyfikowana za pomocą różnych technik, np. naświetlania promieniami UV, PECVD, szczepienia γ lub konwencjonalnej chemii mokrej.

Rysunek 01

1. Odpowietrzanie i hydrofilizacja chipa

Przed użyciem chip musi zostać odpowietrzony i hydrofilizowany. W tym celu przeprowadzana jest seria alkoholowa. Roztwory izopropanolu składające się ze 100%, 70%, 50%, 30% izopropanolu w wodzie uzdatnionej DMPC są przygotowywane, a chip zanurza się w każdym stężeniu, zaczynając od 100% roztworu, przez okres do 30 sekund. Ostatnim etapem serii jest czysta woda uzdatniona pirowęglanem dimetylu (DMPC). Od tego momentu ważne jest, aby chip był mokry

.

2. Powłoka kolagenu I

Po serii alkoholowej, chip jest zwykle pokryty roztworem kolagenu I z ogona szczura. Z podstawowego roztworu kolagenu o stężeniu 2 mg/ml w 0,2% kwasie octowym podwielokrotność odpowiadającą 30 μg białka kolagenowego rozcieńcza się wodą poddaną działaniu DMPC do końcowej objętości 150 μl. W ten sposób powstaje powłoka kolagenowa powierzchni wióra o gęstości 10 μg kolagenu I na^cm2 powierzchni.

3. Inokulacja komórek raka wątrobowokomórkowego

Komórki raka wątrobowokomórkowego linii Hep G2 są trypsynizowane i zliczane. W przypadku eksperymentów krótkoterminowych (od 1 do 6 dni) 5*10,⁶ komórek zaszczepia się w każdym chipie i odpowiadającej im kontrolnej 6-centymetrowej kulturze tkankowej: szalkach Petriego. Aby zaszczepić, komórki chipa 5*10⁶ są ponownie zawieszane w pożywce hodowlanej o objętości 150 μl i umieszczane na mikrostrukturalnym obszarze chipa (ryc. 2). Następnie umieszcza się go w inkubatorze na 2-3 godziny. Podczas tego okresu inkubacji komórki osadzają się w mikropojemnikach i przylegają do rusztowania pokrytego kolagenem I.

Rysunek 2

4. Umieszczenie chipa w obudowie bioreaktora

Po okresie inkubacji, chip jest wyjmowany z inkubatora i montowany w obudowie bioreaktora. W tym celu pod czystym stołem wstępnie zmontowany bioreaktor jest wyjmowany ze sterylnego opakowania i demontowany do stopnia umożliwiającego wprowadzenie chipa. Z chipem ostrożnie obchodzi się sterylnymi kleszczami i umieszcza w rowku, w którym znajduje się uszczelka uszczelniająca chip, co powoduje wytworzenie górnej i dolnej komory w bioreaktorze. Następnie bioreaktor jest ponownie montowany i przenoszony do inkubatora, gdzie jest podłączony do pompy, zasilania gazem i analizatora tlenu.

5. Napełnianie systemu

Gdy tylko bioreaktor zostanie podłączony do zbiornika medium, pompy i zasilania gazem, zamknięta pętla cyrkulacyjna jest napełniana medium. Odbywa się to poprzez ustawienie 3-drożnych złączy w taki sposób, aby uzyskać superfuzję, która jest definiowana jako przepływ medium przez górną część chipa. Prowadzi to do odprowadzania zamkniętego powietrza z obiegu bioreaktora bez usuwania komórek z rusztowania. Po całkowitym napełnieniu systemu pożywką, łączniki 3-drożne są przełączane w taki sposób, że uzyskuje się perfuzję, która jest definiowana jako przepływ spod chipa przez tkankę. W konfiguracji perfuzyjnej przepływ jest dostosowywany do potrzeb komórki, które dla hepatocytów zwykle wahają się w zakresie 60-500 μl/min.

6. Pobieranie próbek

Podczas eksperymentu można pobrać próbki podłoża. W tym celu strzykawki są podłączane do sterylnych portów na górze zbiornika pożywki. Po pobraniu próbek porty są sterylizowane 70% izopropanolem.

7. Izolacja nienaruszonych komórek od chipa do dalszych zastosowań

Na końcu eksperymentu, bioreaktory są odłączane od zasilania gazem i pompy rolkowej, przenoszone na czyste stanowisko i demontowane zgodnie z wcześniejszym opisem. Za pomocą sterylnych kleszczyków chip jest usuwany z obudowy bioreaktora, umieszczany na szalce Petriego o średnicy 3,5 cm i spłukiwany PBS. Następnie chip jest inkubowany z trypsyną/EDTA (0,25%/0,53 mM) przez 5-15 minut w inkubatorze w celu odłączenia komórek od obszaru mikrostrukturalnego. Zebraną zawiesinę komórek odwirowuje się przez 5 minut przy 600 g. Komórki mogą być następnie wykorzystane do konwencjonalnych zastosowań końcowych, np. do izolacji całkowitego RNA lub białek. Rutynowo izolujemy całkowite RNA (zestaw PARIS, Ambion Inc., Austin, Teksas, USA) do analizy mikromacierzy i RT-PCR w czasie rzeczywistym. Ekspresja białek jest analizowana po immunohistochemicznym barwieniu komórek wewnątrz chipa za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego, ale może być również analizowana w inny sposób, np. za pomocą cytometrii przepływowej.

Discussion

Opracowaliśmy platformę opartą na chipach do trójwymiarowej hodowli komórek w aktywnie perfundowanych mikrobioreaktorach. Chipy mogą być wytwarzane z niebiodegradowalnych, jak i biodegradowalnych polimerów za pomocą mikrowtrysku, wytłaczania na gorąco, a także technik mikrotermoformowania ³. W zależności od projektu eksperymentalnego, powierzchnia polimeru może być modyfikowana przez promieniowanie UV ⁴. Linie komórkowe hepatocytów, jak również pierwotne hepatocyty szczurów mogą być z powodzeniem ho...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komórki	Inne	ATCC	HB-8065
Kolagen I z ogona szczura	Odczynnik	Roche Group	11 179 179 001
Zestaw PARIS	Odczynnik	Ambion	AM1921
Syto16	Odczynnik	Invitrogen	S7578
Przeciwciało anty cytokeratyny 18		Abcam	ab668	Pierwotne Ab, mysz monoklonalne, stosowane 1/100 w PBS
Przeciwciało anty E-kadheryny		Abcam	ab1416	Primary Ab, Mysz monoklonalne, stosowane 1/50 w PBS.
Odczynnik antyalbuminowy dla kóz		Bethyl Laboratories	E80-129	Primary Ab, kozia albumina anty-ludzka, używana 1/200 w PBS
Królik przeciwciało anty-mysie IgG1		Invitrogen	A11059	Secondary Ab, Alexa Mąka 488 sprzężona, używana 1/100 w PBS + 0,5% BSA
Cy3 odczynnik anty-kozi IgG		Jackson ImmunoResearch	705-165-003	Cy3 AffiniPure osioł a-kozioł IgG Ab, używany 1/700 w PBS + 0,5% BSA