Trójwymiarowa hodowla komórkowa oparta na chipach w perfuzjonych mikrobioreaktorach

Summary

Opisujemy platformę opartą na chipach do trójwymiarowej hodowli komórek w mikro-bioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 milionów komórek, które mogą być hodowane w ściśle określonych warunkach w odniesieniu do przepływu płynów, napięcia tlenu itp. w sterylnej, zamkniętej pętli obiegowej.

Abstract

Opracowaliśmy oparty na chipach system hodowli komórek do trójwymiarowej hodowli komórek. Chip jest zwykle wytwarzany z nieulegających biodegradacji polimerów, np. poliwęglanu lub polimetakrylanu metylu metodą mikrowtrysku, mikrotłoczenia na gorąco lub mikrotermoformowania. Ale może być również wytwarzany z biodegradowalnych polimerów. Jego wymiary gabarytowe to 0,7 1 x 20 x 20 x 0,7 1 mm (wys. x szer. x dł.). Głównymi cechami zastosowanych chipów są albo siatka do 1156 sześciennych mikropojemników (cf-chip) każdy o wymiarach 120-300 x 300 x 300 μ (wys. x szer. x dł.), albo okrągłe wgłębienia o średnicy 300 μ i głębokości 300 μ (r-chip). Rusztowanie może pomieścić 10 mln komórek w konfiguracji trójwymiarowej. Aby zapewnić optymalne zaopatrzenie w składniki odżywcze i gazy, chip jest umieszczany w obudowie bioreaktora. Bioreaktor jest częścią zamkniętej pętli cyrkulacji sterylnej, która w najprostszej konfiguracji składa się dodatkowo z pompy rolkowej i zbiornika medium z zasilaniem gazem. Bioreaktor może pracować w trybie perfuzji, superfuzji, a nawet w trybie mieszanym. Udało nam się wyhodować linie komórkowe, a także komórki pierwotne przez kilka tygodni. W przypadku pierwotnych komórek wątroby szczurów możemy wykazać zachowanie funkcji organotypowych przez ponad 2 tygodnie. W przypadku linii komórkowych raka wątrobowokomórkowego możemy wykazać indukcję genów specyficznych dla wątroby, które nie są lub ulegają tylko niewielkiej ekspresji w standardowej hodowli jednowarstwowej. System może być również przydatny jako system hodowli komórek macierzystych, ponieważ pierwsze eksperymenty różnicowania na liniach komórek macierzystych były obiecujące.

Protocol

Ten artykuł opisuje użycie platformy opartej na chipie (rys. 1) do trójwymiarowej hodowli linii komórkowych, jak również komórek pierwotnych. Ponieważ wiele komórek wyraża funkcje organotypowe tylko w środowisku 3D, opracowaliśmy polimerowy chip, który zapewnia rusztowanie, do którego komórki mogą przylegać we wszystkich kierunkach przestrzennych i który może być zamontowany w obudowie bioreaktora w celu kontroli przepływu płynu, napięcia tlenu itp. W zależności od projektu eksperymentalnego, powierzchnia polimeru może być modyfikowana za pomocą różnych technik, np. naświetlania promieniami UV, PECVD, szczepienia γ lub konwencjonalnej chemii mokrej.

Discussion

Opracowaliśmy platformę opartą na chipach do trójwymiarowej hodowli komórek w aktywnie perfundowanych mikrobioreaktorach. Chipy mogą być wytwarzane z niebiodegradowalnych, jak i biodegradowalnych polimerów za pomocą mikrowtrysku, wytłaczania na gorąco, a także technik mikrotermoformowania ³. W zależności od projektu eksperymentalnego, powierzchnia polimeru może być modyfikowana przez promieniowanie UV ⁴. Linie komórkowe hepatocytów, jak również pierwotne hepatocyty szczurów mogą być z powodzeniem ho.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komórki	Inne	ATCC	HB-8065
Kolagen I z ogona szczura	Odczynnik	Roche Group	11 179 179 001
Zestaw PARIS	Odczynnik	Ambion	AM1921
Syto16	Odczynnik	Invitrogen	S7578
Przeciwciało anty cytokeratyny 18		Abcam	ab668	Pierwotne Ab, mysz monoklonalne, stosowane 1/100 w PBS
Przeciwciało anty E-kadheryny		Abcam	ab1416	Primary Ab, Mysz monoklonalne, stosowane 1/50 w PBS.
Odczynnik antyalbuminowy dla kóz		Bethyl Laboratories	E80-129	Primary Ab, kozia albumina anty-ludzka, używana 1/200 w PBS
Królik przeciwciało anty-mysie IgG1		Invitrogen	A11059	Secondary Ab, Alexa Mąka 488 sprzężona, używana 1/100 w PBS + 0,5% BSA
Cy3 odczynnik anty-kozi IgG		Jackson ImmunoResearch	705-165-003	Cy3 AffiniPure osioł a-kozioł IgG Ab, używany 1/700 w PBS + 0,5% BSA