Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowaliśmy system hodowli komórkowej na chipie do trójwymiarowej uprawy komórek. Chip jest zazwyczaj produkowany z polimerów niebiodegradowalnych, np. poliwęglanu lub polimetakrylanu metylu, metodą mikro-wtryskowego formowania, mikro-tłoczenia na gorąco lub mikro-termoformowania. Może on być jednak również wykonany z polimerów biodegradowalnych. Jego całkowite wymiary wynoszą 0,7–1 x 20 x 20 x 0,7–1 mm (wys. x szer. x dł.). Główne cechy stosowanych chipów to albo siatka do 1156 sześciennych mikro-pojemników (cf-chip), z których każdy ma rozmiar 120-300 x 300 x 300 μm (wys. x szer. x dł.), albo wgłębienia okrągłe o średnicy 300 μm i głębokości 300 μm (r-chip). Rusztowanie może pomieścić 10 mln komórek w konfiguracji trójwymiarowej. W celu optymalnego dostarczania składników odżywczych i gazów chip jest umieszczany w obudowie bioreaktora. Bioreaktor stanowi część zamkniętego, sterylnego obiegu, który w najprostszej konfiguracji składa się dodatkowo z pompy perystaltycznej oraz zbiornika z pożywką z dopływem gazu. Bioreaktor może pracować w trybie perfuzji, superfuzji lub trybie mieszanym. Z powodzeniem hodowaliśmy linie komórkowe, a także komórki pierwotne przez okresy kilku tygodni. W przypadku pierwotnych hepatocytów szczura wykazaliśmy zachowanie funkcji organotypowych przez ponad 2 tygodnie. W przypadku linii komórkowych raka wątrobowokomórkowego wykazaliśmy indukcję genów specyficznych dla wątroby, które w standardowej hodowli monowarstwowej nie są lub są w niewielkim stopniu ekspresowane. System ten może być również użyteczny jako system hodowli komórek macierzystych, ponieważ pierwsze eksperymenty z różnicowaniem linii komórek macierzystych okazały się obiecujące.
Protokół
Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie platformy opartej na chipie (rys. 1) do trójwymiarowej hodowli linii komórkowych, a także komórek pierwotnych. Ponieważ wiele komórek wykazuje funkcje organotypowe wyłącznie w środowisku 3D, opracowaliśmy polimerowy chip, który stanowi rusztowanie, do którego komórki mogą przylegać we wszystkich kierunkach przestrzennych i który może zostać zamontowany w obudowie bioreaktora w celu kontroli przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. W zależności od projektu eksperymentalnego powierzchnię polimeru można modyfikować za pomocą różnych technik, np. naświetlania UV, PECVD, szczepienia γ lub konwencjonalnej chemii mokrej.
Rycina 01
1. Odpowietrzanie i hydrofilizacja chipa
Przed użyciem chip musi zostać odgazowany i zhydrofilizowany. W tym celu przeprowadza się serię kąpieli alkoholowych. Przygotowuje się roztwory izopropanolu o stężeniach 100%, 70%, 50% i 30% w wodzie traktowanej DMPC, a następnie chip zanurza się w każdym z tych stężeń, zaczynając od roztworu 100%, na czas do 30 s. Ostatnim etapem serii jest zanurzenie w czystej wodzie traktowanej Dimetylopirokarbonianem (DMPC). Od tego momentu kluczowe jest utrzymywanie chipu w stanie zwilżonym.
2. Powlekanie kolagenem I
Po serii kąpieli w alkoholach chip jest zazwyczaj powlekany roztworem kolagenu I pochodzącym z ogona szczura. Z roztworu stokowego kolagenu o stężeniu 2 mg/ml w 0,2% kwasie octowym pobiera się alikwot odpowiadający 30 μg białka kolagenu i rozcieńcza go wodą traktowaną DMPC do końcowej objętości 150 μl. W rezultacie powierzchnia chipu zostaje pokryta warstwą kolagenu o gęstości 10 μg kolagenu I na cm2 powierzchni.
3. Inokulacja komórek raka wątrobowokomórkowego
Komórki raka hepatokomórkowego linii Hep G2 poddaje się trypsynizacji i zliczaniu. W przypadku eksperymentów krótkoterminowych (od 1 do 6 dni) w każdym chipie oraz w odpowiadających im kontrolnych szalkach Petriego o średnicy 6 cm wysiewa się 5*106 komórek. Aby zaszczepić chip, 5*106 komórek resuspenduje się w 150 μl pożywki hodowlanej i nanosi na obszar mikrostrukturalny chipa (ryc. 2). Następnie chip umieszcza się w inkubatorze na 2-3 godziny. W czasie inkubacji komórki sedymentują do mikropojemników i przylegają do rusztowania powleczonego kolagenem I.
Rycina 2
4. Włożenie chipa do obudowy bioreaktora
Po okresie inkubacji chip zostaje wyjęty z inkubatora i zamontowany w obudowie bioreaktora. W tym celu, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, wstępnie zmontowany bioreaktor zostaje wyjęty z jałowego opakowania i rozłożony w stopniu umożliwiającym włożenie chipa. Chip jest ostrożnie przenoszony za pomocą jałowej pęsety i umieszczany w rowku zawierającym uszczelkę, która uszczelnia chip, co prowadzi do utworzenia komory górnej i dolnej w bioreaktorze. Następnie bioreaktor zostaje ponownie złożony i przeniesiony do inkubatora, gdzie zostaje podłączony do pompy, zasilania gazem oraz analizatora tlenu.
5. Napełnianie układu
Zaraz po podłączeniu bioreaktora do zbiornika z pożywką, pompy i zasilania gazem, zamknięta pętla cyrkulacyjna zostaje wypełniona pożywką. Odbywa się to poprzez odpowiednie ustawienie złączy trójdrożnych w taki sposób, aby uzyskano superfuzję, definiowaną jako przepływ pożywki nad górną powierzchnią chipa. Prowadzi to do usunięcia zamkniętego powietrza z obiegu bioreaktora bez konieczności usuwania komórek z rusztowania. Po całkowitym wypełnieniu układu pożywką, złącza trójdrożne przełącza się tak, aby uzyskać perfuzję, definiowaną jako przepływ od dołu chipa przez tkankę. W konfiguracji perfuzyjnej przepływ jest dostosowany do potrzeb komórek, co w przypadku hepatocytów zazwyczaj mieści się w zakresie 60-500 μl/min.
6. Pobieranie próbek
W trakcie eksperymentu można pobierać próbki pożywki. W tym celu strzykawki podłącza się do sterylnych portów znajdujących się na górnej części zbiornika z pożywką. Po pobraniu próbek porty sterylizuje się 70% izopropanolem.
7. Izolacja nienaruszonych komórek z chipa do dalszych zastosowań
Po zakończeniu eksperymentu bioreaktory zostają odłączone od zasilania gazem oraz pompy perystaltycznej, przeniesione do komory z laminarnym przepływem powietrza i rozmontowane zgodnie z wcześniejszym opisem. Za pomocą sterylnej pęsety chip zostaje wyjęty z obudowy bioreaktora, umieszczony w szalce Petri o średnicy 3,5 cm i przepłukany PBS. Następnie chip inkubuje się z trypsyną/EDTA (0,25%/0,53mM) przez 5-15 min w inkubatorze, aby odłączyć komórki od obszaru mikrostrukturalnego. Zebrana zawiesina komórkowa jest wirowana przez 5 min przy 600 g. Komórki można następnie wykorzystać w konwencjonalnych zastosowaniach analitycznych, np. do izolacji całkowitego RNA lub białek. Rutynowo izolujemy całkowite RNA (zestaw PARIS, Ambion Inc., Austin, Texas, USA) do analizy mikromacierzy i RT-PCR w czasie rzeczywistym. Ekspresję białek analizuje się za pomocą skaningowego mikroskopu laserowego po barwieniu immunohistochemicznym komórek wewnątrz chipu, ale można ją również badać innymi metodami, np. za pomocą cytometrii przepływowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowaliśmy platformę opartą na chipach do trójwymiarowej hodowli komórek w aktywnie perfundowanych mikrobioreaktorach. Chipy mogą być wytwarzane z polimerów niebiodegradowalnych, jak i biodegradowalnych, przy użyciu technik mikro wtryskiwania, hot embossingu oraz mikro termoformowania 3. W zależności od projektu eksperymentu powierzchnia polimeru może zostać zmodyfikowana za pomocą naświetlania promieniowaniem UV 4. W urządzeniach tych można z powodzeniem hodować linie komórkowe hepatocytów, a ta...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Mechthild Herschbach oraz Anke Dech za doskonałą pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Komórki | Inne | ATCC | HB-8065 | |
| Kolagen I z ogona szczura | Odczynnik | Roche Group | 11 179 179 001 | |
| Zestaw PARIS | Odczynnik | Ambion | AM1921 | |
| Syto16 | Odczynnik | Invitrogen | S7578 | |
| anty-cytokeratyna 18 | Przeciwciało | Abcam | ab668 | Przeciwciało pierwotne, mysie monoklonalne, stosowane w rozcieńczeniu 1/100 w PBS |
| Anty-E-kadheryna | Przeciwciało | Abcam | ab1416 | Przeciwciało pierwotne, mysie monoklonalne, stosowane w rozcieńczeniu 1/50 w PBS. |
| Kozie anty-albuminy | Odczynnik | Bethyl Laboratories | E80-129 | Przeciwciało pierwotne, kozie anty-ludzka albumina, stosowane w rozcieńczeniu 1/200 w PBS |
| Królicze anty-mysie IgG1 | Przeciwciało | Invitrogen | A11059 | Przeciwciało wtórne, koniugowane z Alexa Flour 488, stosowane w rozcieńczeniu 1/100 w PBS + 0.5 % BSA |
| Cy3 anty-kozie IgG | Odczynnik | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | Cy3 AffiniPure osioł a-kozie IgG Ab, stosowane w rozcieńczeniu 1/700 w PBS + 0.5% BSA |
Bibliografia
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion. Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).
- Welle, A., Gottwald, E. UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications. Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates. J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
