Modelowanie zakażenia rozwijającego się ludzkiego mózgu wirusem Zika in vitro przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Summary

Ten protokół opisuje technikę używaną do modelowania infekcji wirusem Zika rozwijającego się ludzkiego mózgu. Korzystając z linii komórek macierzystych typu dzikiego lub zmodyfikowanych, naukowcy mogą wykorzystać tę technikę do odkrycia różnych mechanizmów lub metod leczenia, które mogą wpływać na wczesną infekcję mózgu i wynikającą z niej małogłowie w zarodkach zakażonych wirusem Zika.

Abstract

Niedawne pojawienie się wirusa Zika (ZIKV) w populacjach podatnych doprowadziło do nagłego wzrostu małogłowia i innych zaburzeń neurorozwojowych u noworodków. Chociaż komary są główną drogą przenoszenia wirusa, wykazano również, że rozprzestrzenia się on poprzez kontakt seksualny i pionową transmisję z matki na płód. W tym ostatnim przypadku transmisji, ze względu na unikalny tropizm wirusowy ZIKV, uważa się, że wirus atakuje głównie nerwowe komórki progenitorowe (NPC) rozwijającego się mózgu.

Tutaj opisana jest metoda modelowania infekcji ZIKV i wynikającej z niej mikrocefalii, która występuje, gdy ludzkie organoidy mózgowe są wystawione na działanie żywego ZIKV. Organoidy wykazują wysoki poziom wirusa w populacji neuronalnych przodków i wykazują ciężką śmierć komórek i małogłowie w miarę upływu czasu. Ten trójwymiarowy model organoidu mózgowego pozwala naukowcom na przeprowadzanie eksperymentów dopasowanych do gatunku w celu obserwacji i potencjalnej interwencji w przypadku infekcji ZIKV rozwijającego się ludzkiego mózgu. Model zapewnia lepszą przydatność w porównaniu ze standardowymi metodami dwuwymiarowymi i zawiera specyficzną dla człowieka architekturę komórkową i ekspresję białek, które nie są możliwe w modelach zwierzęcych.

Introduction

Wirus Zika (ZIKV) szybko rozprzestrzenił się w Mikronezji, Polinezji Francuskiej i obu Amerykach, a ostatnio wykazano, że przekracza barierę łożyskową1^,2 w celu zainfekowania rozwijającego się mózgu płodu, prowadząc do chorób neurorozwojowych, takich jak małogłowie3^,4,5^,6 . Długoterminowy wpływ na życie tych pacjentów oraz obecny brak leczenia skłoniły badaczy i klinicystów do podjęcia działań mających na celu lepsze zrozumienie mechanizmów stojących za zakażeniem i replikacją wirusa ZIKV. Wcześniejsze badania dotyczyły zakażenia ZIKV systemami in vitro w różnych fizjologicznie istotnych typach komórek^7,8,9, a także in vivo¹⁰ z immunokompetentnymi i z obniżoną odpornością myszy^11,12,13 i naczelne inne niż ludzie^14,15,16. Oprócz tych bardziej konwencjonalnych technik, kilka grup wdrożyło organoidy mózgowe pochodzące z komórek macierzystych, aby lepiej zrozumieć infekcję ZIKV rozwijającego się ludzkiego mózgu. Grupy te wykorzystały ludzkie organoidy mózgowe do potwierdzenia fenotypu mikrocefalii^17,18, zbadaj receptory związane z wejściem wirusa¹⁹, zbadaj fizjologiczne reakcje na infekcję^20,21, i potencjalnie przeprowadź badanie pod kątem kandydatów na leki²². Tutaj opisano technikę szybkiego wytwarzania i infekowania organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych, jak pokazano wcześniej¹⁹, aby lepiej zrozumieć infekcję ZIKV rozwijającego się ludzkiego mózgu.

Ponieważ organoidy są tworzone ze standardowych kultur pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), technika ta pozwala na uzyskanie odpowiedzi na różne pytania naukowe dotyczące infekcji wirusowej rozwijającego się mózgu. Na przykład, inżynieria CRISPR może być wykorzystana do modyfikacji tych linii PSC przed infekcją organoidów w szybszym tempie niż większość badań genetycznych in vivo¹⁹. Dodatkowo, w przeciwieństwie do standardowych dwuwymiarowych (2D) kultur różnicujących, organoidy wykazują złożoną architekturę komórkową, która ma kluczowe znaczenie dla kortykogenezy, a ostatnie badania wykazały, że architektura ta może zostać zakłócona po infekcji²¹. Wreszcie, stosunkowo niski koszt wytwarzania organoidów pozwala na eksperymenty i badania przesiewowe o wyższej przepustowości w porównaniu z modelami in vivo. Z drugiej strony, wykorzystanie organoidów do badania ZIKV ma pewne wady. Chociaż organoidy są znacznie bardziej istotne biologicznie niż kultury 2D, istnieją dodatkowe wyzwania związane z oceną organoidów ze względu na ich trójwymiarowy (3D) charakter. Obrazowanie i dysocjacja organoidów zwykle wymaga większej ilości sprzętu i większych inwestycji zasobów niż w przypadku standardowych kultur 2D. Ponadto organoidy nie mają składników unaczynieniowych i immunologicznych, które są obecne w modelach in vivo, dlatego badaczom zainteresowanym tymi aspektami infekcji wirusowej zaleca się poszukiwanie alternatywnego protokołu.

Istnieje wiele technik tworzenia ludzkich organoidów i neurosfer w kulturze, które zazwyczaj mieszczą się w kategoriach wzorzystych lub niewzorcowych. Metody oparte na wzorcach implementują czynniki regulujące Wnt, BMP, TGFβ i inne szlaki sygnałowe, aby popchnąć różnicowanie w kierunku określonych linii²³. Metody bez wzorców, takie jak ta opisana tutaj, wykorzystują skłonność indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) do domyślnego różnicowania się w kierunku linii neuroektodermalnej²⁴. Po około trzech tygodniach różnicowania powstałe organoidy składają się z dużych, biomimetycznych struktur neuroepiteliowych, które zawierają kilka typów komórek, które obserwuje się we wcześnie rozwijającym się mózgu.

Technika wytwarzania organoidów ze standardowych, bezżywieniowych kultur PSC i infekowania tych organoidów ZIKV jest przedstawiona w całości. Wskazówki dotyczące metod hodowli potrzebnych do PSC bez karmienia można znaleźć w poprzednich publikacjach dotyczących metod^25,26. Dodatkowo, aby zastosować stałe ilości wirusa do wielu eksperymentów, ważne jest, aby obliczyć MOI z wyprzedzeniem. Odbywa się to poprzez przeprowadzenie infekcji komórek Vero, a następnie leczenie pożywką nakładkową, inkubację i barwienie immunologiczne. Opisy i metody tej techniki zostały już wcześniej opisane^19,27.

Gdy kultura PSC osiągnie docelową konfluencję 50%-70%, komórki są następnie dysocjowane i agregowane w 96-dołkowe płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Komórki są utrzymywane przez 3 dni w pożywce do konserwacji komórek macierzystych wolnych od ksenotypów (SCMM), a następnie przekształcane w pożywkę do indukcji neuronalnej przez pozostałą część hodowli. Gdy organoidy różnicują się przez 3 tygodnie, infekcja może zostać przeprowadzona. Rutynowo wykonując zdjęcia w ciągu tygodnia po zakażeniu, naukowcy będą obserwować postępującą śmierć komórki i rozerwanie działania organoidu. Naukowcy mogą również w tym czasie dysocjować organoidy, aby przeprowadzić profilowanie transkrypcyjne lub proteomiczne. Do obrazowania zaleca się metody kriosekcji i arkusza świetlnego, a naukowcy mogą spodziewać się wysokiego poziomu infekcji i replikacji wirusa, szczególnie w populacjach nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w organoidach. Ostatecznie technika ta pozwala naukowcom szybko zbadać mechanizmy infekcji wirusowej ludzkiego mózgu przy niskich kosztach i ograniczonym sprzęcie.

Protocol

1. Tworzenie organoidów mózgowych z hodowli 2D iPSC / hESC (Dzień 0)

Uwaga: Ten protokół zakłada, że utrzymanie komórek macierzystych (SC) odbywa się w pożywce SCMM z substratem witronektyny lub Geltrexu. W przypadku stosowania alternatywnej, wysokobiałkowej pożywki do hodowli komórek macierzystych, zaleca się przejście kultur SC do SCMM przez co najmniej dwa pasaże przed rozpoczęciem tworzenia organoidów. Protokół nie został przetestowany z metodami hodowli SC opartymi na karmicielu.

1. Korzystając z regularnych metod konserwacji SC^25,26, doprowadź kultury do 50%-70% konfluencji. Zwykle jest to 3-4 dni po pasażowaniu, choć może to być zależne od metody hodowli i linii komórkowej.
   nuta: Do wyprodukowania pełnej 96-dołkowej płytki organoidów potrzebne są około 2 dołki z płytki 6-dołkowej.
2. Sprawdzaj kultury za pomocą mikroskopii jasnego pola przy powiększeniu 10X-20X, aby zapewnić zdrową morfologię kolonii, bez wykrywalnego różnicowania.
3. Doprowadzić SCMM do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej i rozmrozić do temperatury pokojowej fiolkę o pojemności 50 μl z 50 mM Y-27632 (inhibitorem skały) i 2 ml enzymatycznego odczynnika oddzielającego.
4. Przygotuj 96-dołkową płytkę z dnem U z ultra niskim nasadką (ULA), wielokanałową pipetę P200 i zbiornik na odczynnik o pojemności 25 ml.
5. Podajcie 45 ml SCMM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodajcie 45 μl 50 mM Y-27632. Dokładnie wymieszać przez rozcieranie.
6. Odessać próżniowo dwie studzienki zawierające SC i szybko dodać 1 ml bezenzymatycznego odczynnika oddzielającego do każdej studzienki za pomocą pipety P1000. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 minuty.
7. Odessać próżniowo studzienki poddane działaniu substancji i dodać 1 ml odczynnika enzymatycznego do oddzielania do każdej studzienki za pomocą pipety P1000.
   1. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 5 minut.
   2. Usuń płytkę i zbadaj leczone studzienki. Delikatnie postukaj w płytkę, aby rozbić zagregowane komórki. Jeżeli duże skupiska komórek są nadal widoczne, inkubować płytkę przez dodatkowe 2 minuty w temperaturze 37 °C. Powtarzać ten krok do momentu, gdy skupiska przestaną być widoczne gołym okiem.
8. Gdy komórki zostaną prawidłowo zdysocjowane, dodaj 1 ml SCMM do każdej studzienki, aby dezaktywować enzymy dysocjacyjne. Zebrać 4 ml zawiesiny komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i pobrać małą porcję do zliczenia komórek.
   1. Wszelkie pozostałe, nieoczyszczone studzienki z płytki konserwacyjnej należy umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
9. Podczas liczenia odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 x g przez 5 minut.
10. Określ całkowitą liczbę komórek i oblicz ilość roztworu SCMM + Y-27632, która będzie potrzebna do uzyskania zawiesiny 60 000 komórek/ml.
11. Ostrożnie odessać próżniowo supernatant i dodać obliczoną objętość roztworu SCMM + Y-27632. Wymieszaj 5-10 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml, zapewniając jednolitą zawiesinę komórek.
12. Natychmiast przenieś zawiesinę komórek do zbiornika odczynnika i odpipetuj 150 μl do każdej studzienki 96-dołkowej płytki ULA U-bottom za pomocą wielokanałowej pipety P200. W ten sposób powstaje 96 pojedynczych organoidów, z których każdy początkowo składa się z 9 000 komórek.
13. Odwirować płytkę o sile 150 x g przez 1 min.
14. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i nie naruszać płytki przez 48 godzin.

2. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 2)

1. Przygotuj 17 ml SCMM z 17 μl 50 mM Y-27643 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Podgrzać roztwór SCMM + Y-27632 do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej.
2. Wyjąć płytkę organoidową z inkubatora i za pomocą wielokanałowej pipety P200 o pojemności 75 μl powoli pobrać pożywkę z krawędzi studzienki w pierwszym rzędzie. Po pobraniu pożywki szybko wyrzuć pożywkę z powrotem do studzienki, aby podnieść luźne komórki i organoidy. Powtórz tę czynność dla każdego wiersza.
   nuta: Ta technika, zwana dalej "dyspersją", podnosi szczątki komórkowe i organoid do zawieszenia. Organoid szybko opada na dno studni, podczas gdy mniejsze zanieczyszczenia pozostają w zawieszeniu, co pozwala na ich usunięcie poprzez wymianę podłoża. Pomaga to zapobiec spoczywaniu organoidu w szczątkach komórkowych podczas hodowli.
   1. Po rozproszeniu wszystkich studzienek odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno każdej studzienki.
3. Powoli i ostrożnie odessać 75 μl pożywki z każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety P200 i dozować do zbiornika na odpady.
   nuta: Większość użytkowników od czasu do czasu odsysa organoid podczas regularnych karmień. Może się to zdarzyć w około 1% przypadków. Proszę odpowiednio zaplanować, aby upewnić się, że wystarczająca liczba organoidów przetrwa do eksperymentalnych punktów czasowych.
4. Przenieś roztwór SCMM + Y-27632 do zbiornika odczynnika i dozuj 150 μl do każdej studzienki organoidowej za pomocą wielokanałowej pipety P200.
5. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

3. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 3)

1. Podgrzej 17 ml SCMM do temperatury 37 °C, tym razem bez Y-27643.
2. Za pomocą wielokanałowej pipety P200 ustawionej na 100 μl rozproszyć wszystkie dołki płytki organoidowej (patrz krok 2.2). Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studni.
3. Przygotować zbiornik na odpady i przenieść podgrzany SCMM do zbiornika źródłowego.
4. Ostrożnie odessać 125 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 150 μl świeżego SCMM za pomocą wielokanałowej pipety P200.
5. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

4. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 4+)

Uwaga: Przeprowadzaj tę regularną konserwację co drugi dzień, aż do infekcji.

1. Przed rozpoczęciem karmienia w 4 dniu należy przygotować pożywkę do indukcji neuronalnej (NI).
   1. Rozmrozić 250 μl podwielokrotności 2 mg/ml heparyny wraz z jedną fiolką o pojemności 5 ml z suplementem 100X N-2. Dodaj 250 μl heparyny, 5 ml 100X N-2 i 5 ml 100X MEM-NEAA do 500 ml DMEM/F12+GlutaMAX. Sterylny przefiltrować zmieszany roztwór w filtrze o pojemności 500 ml.
      nuta: Utrzymuj NI w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używany; NI utrzymuje się do dwóch tygodni przed przygotowaniem świeżej pożywki.
2. Podgrzać 17 ml pożywki NI do 37 °C.
3. Za pomocą wielokanałowej pipety P200 ustawionej na 100 μl rozproszyć wszystkie dołki płytki organoidowej (patrz krok 2.2). Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studni.
4. Przygotować zbiornik na odpady i przenieść podgrzany NI do zbiornika źródłowego.
5. Ostrożnie odessać 125 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 125 μl świeżego NI za pomocą wielokanałowej pipety P200.
6. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

5. Zakażenie organoidami wirusem ZIKV (~Dzień 24)

UWAGA: Po około 3 tygodniach różnicowania, w organoidzie pojawią się duże struktury neuroepitelialne i rozety, które będą bardzo podatne na infekcję ZIKV.

1. Doprowadź Earle's 1X Balanced Salt Solution (EBSS), 1X PBS i NI do temperatury 37 °C w gorącej kąpieli wodnej.
2. Rozcieńczyć ZIKV o znanym stężeniu w 1X EBSS do docelowej wielokrotności infekcji (MOI).
   nuta: Zaleca się miareczkowanie różnych MOI w celu uzyskania odpowiedzi na dawkę wirusa. Może się to różnić w zależności od szczepu wirusa; dla ATCC VR-1838 i ATCC VR-1843 typowe wartości MOI mieszczą się w zakresie od 0,1 do 10).
3. Ostrożnie usuń całe podłoże z organoidu za pomocą jednokanałowej pipety P200. Szybko dodaj 200 μl 1X PBS do każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety P200, aby umyć organoidy.
4. Ostrożnie usuń całe podłoże z organoidu za pomocą jednokanałowej pipety P200. Szybko dodaj 50 μl roztworu 1X tylko EBSS (pozorowana infekcja) lub wirusa ZIKV do studni i upewnij się, że organoid jest całkowicie zanurzony. Powtórzyć te czynności dla każdego organoidu, który ma być zakażony na potrzeby badania.
5. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 godziny
   nuta: Inkubacja pozorowanych zakażonych organoidów przez ten czas nie powinna znacząco wpłynąć na ich wzrost w porównaniu z organoidami niezakłóconymi.
6. Około 30 minut przed zakończeniem inkubacji wirusa przelać 25 ml NI do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i doprowadzić do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej.
7. Po zakończeniu ekspozycji na wirusa przemyj organoidy 200 μl 1X PBS dla każdej studzienki, pozwól organoidom osiąść przez 15 s, a następnie usuń 1X PBS za pomocą jednokanałowej pipety P200.
8. Dodaj 200 μl świeżego NI do każdej studzienki i umieść z powrotem w inkubatorze.
   1. Opcjonalnie: Dla punktu czasowego dnia 0 organoidy mogą być obrazowane godzinę po zakażeniu.
9. Kontynuuj hodowlę, zastępując 125 μl NI co drugi dzień metodą dyspersji (patrz krok 4). Pamiętaj, aby odpowiednio zutylizować zużyte media i końcówki, ponieważ zawierają one zakaźne cząsteczki ZIKV.

Results

Podczas dnia powstawania organoidów, kultury SC powinny znajdować się w fazie logarytmicznej, w której są w 50%-70% zlewane, jak pokazano w Rysunek 1(A-C). Kultury powinny tworzyć zaokrąglone kolonie z wyraźnymi krawędziami, a studzienki powinny być wolne od różnic Rysunek 1(D-E). Jeśli dochodzi do różnicowania, zaleca się przeprowadzenie próby usunięcia w celu oczyszczenia dotkniętych obszarów na płytkach co najmniej jeden dzień przed utworzeniem organoidów. Jeśli duża część hodowli jest zróżnicowana, może być konieczne przeprowadzenie dodatkowego pasażu, rozmrożenie nowej fiolki lub zmiana technik hodowli komórek macierzystych, aby zapewnić, że organoidy są tworzone przez czyste hodowle komórek macierzystych.

Dysocjacja przez kombinację odczynników do oddzielenia bez enzymów i enzymatycznych powinna prowadzić do powstania głównie pojedynczych komórek, chociaż podczas liczenia mogą nadal występować małe agregaty komórek. Wydaje się, że obecność małych agregatów nie zakłóca tworzenia organoidów, chociaż może wpływać na dokładność liczenia. Zaleca się wielokrotne zliczanie na próbkę, a jeśli liczby różnią się o ponad 20%, może być konieczne wydłużenie czasu dysocjacji w celu dalszej izolacji komórek.

Gdy komórki zostaną zasiane i odwirowane na 96-dołkowej płytce ULA U-bottom (Rysunek 2A), pojawią się jako płaski, gęsty arkusz komórek na dnie każdej studzienki. Komórki będą się powoli agregować w ciągu najbliższych dwóch dni. Najlepiej nie naruszać płyty w ciągu tych 48 godzin, ponieważ siły mechaniczne mogą zakłócić luźno uformowane agregaty. Przez pierwsze 10 dni organoid pozostanie w większości kulisty i wzrośnie od ~300 μm do 600-800 μm (Rysunek 2B). Bardziej obserwowalne struktury zaczynają pojawiać się w organoidzie między 10 a 20 dniem (Ryc. 2 C-E). Do 24 dnia naukowcy powinni być w stanie obserwować struktury podobne do rozet za pomocą mikroskopii jasnego pola (Rysunek 2F). Kontynuując hodowlę, te struktury neuroepitelialne mogą zwiększać swoją ilość i rozmiar w ciągu kilku dni (Ryc. 2G). Podczas karmienia badacz zauważy znaczne ilości zanieczyszczeń gromadzących się na dnie każdej studzienki, szczególnie w ciągu pierwszych 2 tygodni hodowli. Technika dyspersji opisana w kroku 2.2 usuwa większość tych zanieczyszczeń komórkowych, aby zapobiec gromadzeniu się zanieczyszczeń apoptotycznych w wielu źródłach (Rysunek 3A). Szczątki te mogą zakłócać obrazowanie, mogą utrudniać obserwację i ilościowe określenie śmierci komórek wywołanej infekcją, a także mogą zapewniać asymetryczną sygnalizację do sąsiedniego organoidu, co może wpływać na różnicowanie. Jeśli technika dyspersji jest prawidłowo przeprowadzona, należy ją zmniejszyć (Rysunek 3B-C, 3D-E).

Zaleca się przeprowadzenie kriosekcji lub obrazowania za pomocą arkusza świetlnego w celu zbadania struktury korowej tworzącej się w organoidach. W organoidach dnia 25 struktury rozety i strefy komorowe są wyraźnie widoczne w barwieniu DAPI (Ryc. 4A) i fosfo-wimentyny (Ryc. 4 B). Obecność TBR2 (Rysunek 4C) wskazuje, że tworzą się pośrednie przodkinie, których morfologia sugeruje migrację na zewnątrz. Neurony MAP2+ (Rysunek 4D) zasiedlają zewnętrzne obszary każdej rozety. Na podstawie tych białek można uwidocznić strefę komorową (VZ), strefę podkomorową (SVZ), strefę pośrednią (IZ) i płytkę korową (CP) w każdej rozecie (Rysunek 4E,4E'). Można kontynuować hodowlę tych organoidów, aby obserwować późniejsze etapy rozwoju. Chociaż warstwy korowe nie są tak widoczne w tego typu organoidach, naturalne przejście do glejogenezy następuje podobnie jak w in vivo. Można to zaobserwować w organoidach dnia 108, w których duża część komórek wyraża MAP2 lub GFAP (Figura 4F-I).

Użytkownicy mogą spodziewać się różnic w wielkości organoidów przez około 3 dni po zakażeniu ZIKV, w zależności od wirusowego MOI zastosowanego do organoidów (Rysunek 5A-B). Po tych 3 dniach nastąpi również wzrost ilości szczątków komórkowych w zainfekowanych studniach w porównaniu ze studniami pozorowanymi. Ta różnica w wielkości organoidów będzie się zwiększać w ciągu następnego tygodnia, aż do momentu, gdy zainfekowane organoidy zaczną się rozpadać (Ryc. 5C-D). Na tym etapie można zastosować różne testy do zbadania mechanizmów infekcji, w tym ekstrakcji wirusowego RNA i kriosekcji (zalecane przeciwciała podane w tabeli materiałów). Podczas kriosekcji użytkownicy zaobserwują dużą obecność wirusa w obszarze wierzchołkowym struktur neuroepitelialnych, co sugeruje podatność nerwowych komórek progenitorowych (NPC) na infekcję ZIKV (Ryc. 6). Immunofluorescencja podzielonych organoidów wykaże również wzrost ekspresji rozszczepionej kaspazy-3 w zakażonych organoidach (Ryc. 7).

Rysunek 1: Morfologia kolonii komórek macierzystych przed powstaniem organoidów.
Kolonie powinny być zlewające się w 50%-70% w momencie dysocjacji, aby wytworzyć dużą liczbę spójnych organoidów. (A) Nieliczne, niedawno wysiane kultury nie osiągnęły jeszcze fazy logarytmicznej wzrostu i nie wytworzą wielu organoidów. (B) Gdy komórki osiągną właściwe zbieganie, są gotowe do dysocjacji. Ważne jest również, aby kolonie te były kontrolowane w celu upewnienia się, że nie są zróżnicowane. (C) Kolonie, które zostaną zabrane zbyt daleko, osiągną nadmierną konfluencję i nie są zalecane do tworzenia organoidów. Kultury w tym stanie z większym prawdopodobieństwem zawierają komórki różnicujące. (D) Krawędzie kolonii powinny być wyraźne, ze spójną morfologią zaokrąglonych komórek w środku i lekko wydłużonymi komórkami w kierunku krawędzi. (E) W kulturach powinno występować minimalne zróżnicowanie. Jeśli w centrach lub na krawędziach kolonii (białe groty strzałek) obserwuje się większe, spłaszczone komórki, które stanowią więcej niż około 1% hodowli, zaleca się przeprowadzenie selekcji lub dodatkowych pasaży w celu utworzenia jednolitej populacji komórek macierzystych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wzrost organoidów mózgowych w czasie.
(A) Schemat wytwarzania organoidów mózgowych z PSC 2D utrzymywanych w pożywce wolnej od ksenotypów i karmy. (B) Przez pierwsze 8 dni organoidy pozostaną w większości kuliste z kilkoma wykrywalnymi cechami. Średnica organoidu będzie wynosić od około 300 μm do 500 μm. (CE) W dniu 10 jaśniejsze obszary zaczną być wykrywalne na obrzeżach organoidów i stracą one swój kulisty kształt. Będą one nadal zwiększać swój rozmiar do około 1 mm średnicy, w dużej mierze w zależności od linii komórkowej używanej do produkcji organoidów. (F) Po około 20 dniach różnicowania użytkownicy zaobserwują tworzenie się struktur neuroepitelialnych (czarne groty strzałek) w przezroczystych obszarach obwodowych większości organoidów. Mają one morfologię przypominającą pierścień, ze strukturami wierzchołkowymi i podstawnymi naśladującymi te z rozwijającej się kory. (G) Te struktury neuroepitelialne będą nadal rosły i zwiększały swój rozmiar przez około 20-30 dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Oczyszczanie z resztek komórkowych za pomocą techniki dystrybucji dyspersyjnej.
Podczas wzrostu organoidów należy spodziewać się dużej ilości śmierci komórki, co może prowadzić do gromadzenia się resztek komórkowych otaczających podstawę organoidu. (A) Przedstawiona technika dyspersji pozwala naukowcom usunąć większość tych zanieczyszczeń podczas każdego karmienia. Aby to zrobić, za pomocą wielokanałowej pipety P200 powoli pobieraj zużyte podłoże i szybko je wydalaj, aby podnieść organoid i resztki komórek do zawiesiny. Organoid szybko opadnie na dno studni, w którym to czasie można przeprowadzić regularne karmienie. Przykłady organoidów z dnia 6 przed (B) i po (C) karmieniu dyspersyjnym wskazują na znaczną redukcję zanieczyszczeń. Trwa to przez kilka tygodni, jak pokazał organoid z 18 dnia przed (D) i po (E) karmieniu dyspersyjnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Charakterystyka organoidów mózgowych za pomocą immunohistochemii.
Pokazano obrazy organoidów mózgowych w arkuszu świetlnym, aby dostarczyć przykładu tworzącej się architektury komórkowej. W 25 dniu DAPI (A) i fosfor-wimentyna (B) wskazują odpowiednio poszczególne rozety i strefy komorowe. (C) TBR2 oznacza pośrednie komórki progenitorowe, które migrują na zewnątrz, a MAP2 (D) oznacza neurony, które uformowały się w płytce korowej. (E,E') Połączenie tych białek wyraźnie pokazuje rekapitulację rozwoju kory mózgowej w modelach organoidów mózgowych. (F-I) Do 108 dnia nastąpiła glejogeneza, z mieszaniną komórek GFAP+ i MAP2+ zasiedlających większość organoidu. VZ = strefa komorowa, SVZ = strefa podkomorowa, IZ = strefa pośrednia, CP = płytka korowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Degradacja zainfekowanych organoidów.
(A) Obrazy jasnego pola organoidów mózgowych zakażonych Mock i ZIKV przy MOI = 0,1 i 10. Zdjęcia wykonano bezpośrednio po zakażeniu (dzień 0), a także 3 i 6 dni po zakażeniu. (B-C) Obrazy w jasnym polu szczątków komórek otaczających (B) pozorowane i (C) zakażone ZIKV w MOI = 10 organoidów mózgowych 3 dni po zakażeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Kriosekcja i immunofluorescencja zakażonych organoidów.
Organoidy dnia 24 wystawiono na działanie ZIKV przy MOI = 0,1 i poddano kriosekcji 6 dni później. Na tym etapie występuje wyraźna obecność wirusa w strefach komorowych, podkomorowych i pośrednich organoidu, w których znajdują się nerwowe komórki progenitorowe i promieniowy glej. (A) Poprzez barwienie jądrowe, te obszary neuroepitelialne są wyraźnie widoczne (białe strzałki) dużej gęstości jąder, które tworzą struktury przypominające pierścienie wokół powierzchni wierzchołkowej. (B) Poprzez barwienie otoczki wirusa można zaobserwować stosunkowo wysoką obecność wirusa w tych strukturach rozetowych (białe groty strzał). Należy zauważyć, że niewielka ilość wirusa jest obecna w różnych niezidentyfikowanych komórkach obwodowych. (C-D) MAP2 lub inne barwniki specyficzne dla neuronów pokazują, że w kulturach obecne są neurony, które nie wydają się być zainfekowane wirusem, gdy są pokryte barwnikiem wirusowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Rozszczepiona immunofluorescencja kaspazy-3 zakażonego organoidu.
Po zakażeniu można użyć wskaźników apoptotycznych do zbadania mechanizmów śmierci komórki, które zachodzą w organoidach. W tym przykładzie organoidy dnia 24 wystawiono na działanie ZIKV przy MOI = 0,1 i poddano kriosekcji 6 dni później. (A) Niezakażone organoidy nie wykazują otoczki wirusa (białko 4G2) i minimalną ilość rozszczepionej kaspazy-3 z powodu homeostatycznej apoptozy zachodzącej w tkance. (B) Zainfekowane rozety zaczynają wykazywać podwyższony poziom apoptozy. (C) Rozety, które wykazują ciężką infekcję poprzez barwienie 4G2, również mają tendencję do wykazywania wysokich poziomów rozszczepionej kaspazy-3 w tych regionach. Istnieje bezpośrednia korelacja między nasileniem infekcji a rozszczepioną ekspresją kaspazy-3 w zakażonych rozetach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Istnieje kilka zastrzeżeń, które należy wziąć pod uwagę przy wykorzystywaniu ludzkich organoidów mózgowych do badania infekcji ZIKV. Jedną z ważnych kwestii jest to, że tworzenie i struktura organoidów jest w dużym stopniu zależna od linii komórek macierzystych, z której powstają. Zachowaj ostrożność podczas porównywania linii komórkowych, w tym linii inżynierii izogenicznej; Najlepiej jest wyciągać wnioski na podstawie wielu subklonów, a najlepiej wielu linii komórek macierzystych. Dodatkowo, ze względu na tę różnicę w liniach komórkowych, zaleca się eksperymenty pilotażowe w celu zapewnienia, że w organoidach zachodzi prawidłowe różnicowanie. Podczas gdy struktury neuronabłonkowe są widoczne pod mikroskopią jasnego pola, sugeruje się również przeprowadzenie eksperymentów qRT-PCR lub kriosekcji w celu znalezienia markerów różnicowania neuronalnego, takich jak PAX6 lub fosfo-wimentyna.

Należy również przewidzieć znaczną zmienność między organoidami w obrębie tej samej linii komórkowej. Ze względu na niewzorcowy charakter protokołu, liczba i wielkość struktur neuroepitelialnych może się różnić między poszczególnymi organoidami. Zazwyczaj można spodziewać się co najmniej dwóch dużych (>200 μm średnicy na D24) rozet nerwowych na organoid. Z tego powodu badania podłużne, takie jak obserwacja zmiany wielkości organoidów po zakażeniu, są szczególnie pouczające. Mogą również wystąpić różnice między partiami, a najbardziej prawdopodobną przyczyną tego jest niedokładne liczenie komórek lub wysiew. Zaleca się przeprowadzenie wielokrotnego liczenia i upewnienie się, że zawiesina komórek jest dobrze wymieszana przed wysiewem na 96-dołkowe płytki ULA U-bottom.

Podczas hodowli organoidów na 96-dołkowych płytkach ULA U-bottom, zaplanuj zaobserwowanie znacznych efektów parowania wokół krawędzi płytek. Idealnie jest wypełnić te studnie PBS i pracować tylko z 60 studzienkami środkowymi. Ze względu na parowanie organoidy w studzienkach zewnętrznych będą narażone na inne warunki niż te w środku, co prawdopodobnie wpłynie na ich wzrost i różnicowanie. Proszę wziąć to pod uwagę przy planowaniu liczby organoidów, które będą potrzebne do eksperymentów. Dodatkowo organoidy zaczną zarastać format 96-dołkowy po około 30 dniach, co będzie widoczne z powodu przebarwienia pożywki hodowlanej. Jeśli planujesz przenieść organoidy po upływie 30 dni, zaleca się przeniesienie organoidów na płytkę ULA 24-dołkową. Aby przeprowadzić transfer, użyj nożyczek, aby przeciąć końcówkę P1000 tak, aby otwór był znacznie większy niż same organoidy, i przenieś organoidy przez pipetowanie.

Ludzkie organoidy mózgowe mają ogromny potencjał w pogłębianiu wiedzy na temat rozwoju neurologicznego i chorób. Zachęca się badaczy do modyfikowania protokołu w razie potrzeby. Na przykład, można zaimplementować czynniki wzorcowe, aby poprawić efektywność różnicowania w kierunku określonych typów komórek, co pozwoli im zbadać wpływ wirusa na określone regiony anatomiczne. Neurorozwojowe skutki ZIKV są nadal słabo poznane, ale to nowe podejście zapewni naukowcom dostępny, szybki i wysokoprzepustowy sposób badania mechanizmów infekcji.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bezenzymatyczny odczynnik odpryskujący, ReLeSR	StemCell Technologies	5873
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML
DMEM/F12 (1X) Uzupełniany glutaminianem DMEM/F12 (1X)	Gibco	10565-018	(+)2.438 g/L wodorowęglan sodu, (+)Suplement N-2 pirogronianu sodu
(100X)	Gibco	17502-048
MEM Aminokwasy endogenne (MEM-NEAA)	Gibco	11140-050
Zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30029.02
Filtr Stericup (500 ml)	Milipore	220009-140
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-dołkowy, okrągłodenny	Corning	7007
o małej objętości resztkowej (25 ml)	Integra	4312
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+	Rainin	17013810
Duża wirówka, kompatybilna z płytką hodowlaną	Wirnik	75007210
Culture	Scientific	75005706
Vero Cells	ATCC	CCL-81	Do ekspansji wirusa, w razie potrzeby
Wirus Zika ( Szczep Uganda)	ATCC	VR-1838	Można stosować inne szczepy
Wirus Zika (szczep Puerto Rico)	ATCC	VR-1843	Można stosować inne szczepy
fosfo-wimentyna	MBL	D076-3	mysia poliklonalna,  1:250 rozcieńczenie
TBR2	Abcam	ab23345	poliklonalny królik, rozcieńczenie 1:300
MAP2	Novus	NB300-213	kurczak poliklonalne, rozcieńczenie 1:1500
GFAP	Cell Signaling Technologies	CST12389S	poliklonalny królik, rozcieńczenie 1:200
D1-4G2 białko otoczki flawiwirusa	EMD Millipore	MAB10216	mysi monoklonalny, rozcieńczenie 1:500
rozszczepiona kaspaza-3	Technologie sygnalizacji komórkowej	9661	poliklonalny królik, rozcieńczenie 1:200
488 anty-mysie IgG	Thermo Fisher	A-11001	koza poliklonalna, 1:1000
594 anty-królicza IgG	Thermo Fisher	A-11037	koza poliklonalna, 1:1000 rozcieńczenie
647 anty-kurczak IgY	Thermo Fisher	A-21449	koza poliklonalna, 1:1000 rozcieńczenie