Artykuł metodologiczny

Modelowanie zakażenia rozwijającego się ludzkiego mózgu wirusem Zika in vitro przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

12.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56404

⸱

19 września 2017

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Novartis Institutes for BioMedical Research, 2Stanley Center for Psychiatric Research, Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology and Harvard Stem Cell Institute, Harvard University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje technikę używaną do modelowania infekcji wirusem Zika rozwijającego się ludzkiego mózgu. Korzystając z linii komórek macierzystych typu dzikiego lub zmodyfikowanych, naukowcy mogą wykorzystać tę technikę do odkrycia różnych mechanizmów lub metod leczenia, które mogą wpływać na wczesną infekcję mózgu i wynikającą z niej małogłowie w zarodkach zakażonych wirusem Zika.

Streszczenie

Niedawne pojawienie się wirusa Zika (ZIKV) w populacjach podatnych doprowadziło do nagłego wzrostu małogłowia i innych zaburzeń neurorozwojowych u noworodków. Chociaż komary są główną drogą przenoszenia wirusa, wykazano również, że rozprzestrzenia się on poprzez kontakt seksualny i pionową transmisję z matki na płód. W tym ostatnim przypadku transmisji, ze względu na unikalny tropizm wirusowy ZIKV, uważa się, że wirus atakuje głównie nerwowe komórki progenitorowe (NPC) rozwijającego się mózgu.

Tutaj opisana jest metoda modelowania infekcji ZIKV i wynikającej z niej mikrocefalii, która występuje, gdy ludzkie organoidy mózgowe są wystawione na działanie żywego ZIKV. Organoidy wykazują wysoki poziom wirusa w populacji neuronalnych przodków i wykazują ciężką śmierć komórek i małogłowie w miarę upływu czasu. Ten trójwymiarowy model organoidu mózgowego pozwala naukowcom na przeprowadzanie eksperymentów dopasowanych do gatunku w celu obserwacji i potencjalnej interwencji w przypadku infekcji ZIKV rozwijającego się ludzkiego mózgu. Model zapewnia lepszą przydatność w porównaniu ze standardowymi metodami dwuwymiarowymi i zawiera specyficzną dla człowieka architekturę komórkową i ekspresję białek, które nie są możliwe w modelach zwierzęcych.

Wprowadzenie

Wirus Zika (ZIKV) szybko rozprzestrzenił się w Mikronezji, Polinezji Francuskiej i obu Amerykach, a ostatnio wykazano, że przekracza barierę łożyskową1,2 w celu zainfekowania rozwijającego się mózgu płodu, prowadząc do chorób neurorozwojowych, takich jak małogłowie3,4,5,6 . Długoterminowy wpływ na życie tych pacjentów oraz obecny brak leczenia skłoniły badaczy i klinicystów do podjęcia działań mających na celu lepsze zrozumienie mechanizmów stojących za zakażeniem i replikacją wirusa ZIKV. Wcześniejsze badania dotyczyły zakażenia ZIKV systemami in vitro w różnych fizjologicznie istotnych typach komórek7,8,9, a także in vivo10 z immunokompetentnymi i z obniżoną odpornością myszy11,12,13 i naczelne inne niż ludzie14,15,16. Oprócz tych bardziej konwencjonalnych technik, kilka grup wdrożyło organoidy mózgowe pochodzące z komórek macierzystych, aby lepiej zrozumieć infekcję ZIKV rozwijającego się ludzkiego mózgu. Grupy te wykorzystały ludzkie organoidy mózgowe do potwierdzenia fenotypu mikrocefalii17,18, zbadaj receptory związane z wejściem wirusa19, zbadaj fizjologiczne reakcje na infekcję20,21, i potencjalnie przeprowadź badanie pod kątem kandydatów na leki22. Tutaj opisano technikę szybkiego wytwarzania i infekowania organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych, jak pokazano wcześniej19, aby lepiej zrozumieć infekcję ZIKV rozwijającego się ludzkiego mózgu.

Ponieważ organoidy są tworzone ze standardowych kultur pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), technika ta pozwala na uzyskanie odpowiedzi na różne pytania naukowe dotyczące infekcji wirusowej rozwijającego się mózgu. Na przykład, inżynieria CRISPR może być wykorzystana do modyfikacji tych linii PSC przed infekcją organoidów w szybszym tempie niż większość badań genetycznych in vivo19. Dodatkowo, w przeciwieństwie do standardowych dwuwymiarowych (2D) kultur różnicujących, organoidy wykazują złożoną architekturę komórkową, która ma kluczowe znaczenie dla kortykogenezy, a ostatnie badania wykazały, że architektura ta może zostać zakłócona po infekcji21. Wreszcie, stosunkowo niski koszt wytwarzania organoidów pozwala na eksperymenty i badania przesiewowe o wyższej przepustowości w porównaniu z modelami in vivo. Z drugiej strony, wykorzystanie organoidów do badania ZIKV ma pewne wady. Chociaż organoidy są znacznie bardziej istotne biologicznie niż kultury 2D, istnieją dodatkowe wyzwania związane z oceną organoidów ze względu na ich trójwymiarowy (3D) charakter. Obrazowanie i dysocjacja organoidów zwykle wymaga większej ilości sprzętu i większych inwestycji zasobów niż w przypadku standardowych kultur 2D. Ponadto organoidy nie mają składników unaczynieniowych i immunologicznych, które są obecne w modelach in vivo, dlatego badaczom zainteresowanym tymi aspektami infekcji wirusowej zaleca się poszukiwanie alternatywnego protokołu.

Istnieje wiele technik tworzenia ludzkich organoidów i neurosfer w kulturze, które zazwyczaj mieszczą się w kategoriach wzorzystych lub niewzorcowych. Metody oparte na wzorcach implementują czynniki regulujące Wnt, BMP, TGFβ i inne szlaki sygnałowe, aby popchnąć różnicowanie w kierunku określonych linii23. Metody bez wzorców, takie jak ta opisana tutaj, wykorzystują skłonność indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) do domyślnego różnicowania się w kierunku linii neuroektodermalnej24. Po około trzech tygodniach różnicowania powstałe organoidy składają się z dużych, biomimetycznych struktur neuroepiteliowych, które zawierają kilka typów komórek, które obserwuje się we wcześnie rozwijającym się mózgu.

Technika wytwarzania organoidów ze standardowych, bezżywieniowych kultur PSC i infekowania tych organoidów ZIKV jest przedstawiona w całości. Wskazówki dotyczące metod hodowli potrzebnych do PSC bez karmienia można znaleźć w poprzednich publikacjach dotyczących metod25,26. Dodatkowo, aby zastosować stałe ilości wirusa do wielu eksperymentów, ważne jest, aby obliczyć MOI z wyprzedzeniem. Odbywa się to poprzez przeprowadzenie infekcji komórek Vero, a następnie leczenie pożywką nakładkową, inkubację i barwienie immunologiczne. Opisy i metody tej techniki zostały już wcześniej opisane19,27.

Gdy kultura PSC osiągnie docelową konfluencję 50%-70%, komórki są następnie dysocjowane i agregowane w 96-dołkowe płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Komórki są utrzymywane przez 3 dni w pożywce do konserwacji komórek macierzystych wolnych od ksenotypów (SCMM), a następnie przekształcane w pożywkę do indukcji neuronalnej przez pozostałą część hodowli. Gdy organoidy różnicują się przez 3 tygodnie, infekcja może zostać przeprowadzona. Rutynowo wykonując zdjęcia w ciągu tygodnia po zakażeniu, naukowcy będą obserwować postępującą śmierć komórki i rozerwanie działania organoidu. Naukowcy mogą również w tym czasie dysocjować organoidy, aby przeprowadzić profilowanie transkrypcyjne lub proteomiczne. Do obrazowania zaleca się metody kriosekcji i arkusza świetlnego, a naukowcy mogą spodziewać się wysokiego poziomu infekcji i replikacji wirusa, szczególnie w populacjach nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w organoidach. Ostatecznie technika ta pozwala naukowcom szybko zbadać mechanizmy infekcji wirusowej ludzkiego mózgu przy niskich kosztach i ograniczonym sprzęcie.

Protokół

1. Tworzenie organoidów mózgowych z hodowli 2D iPSC / hESC (Dzień 0)

Uwaga: Ten protokół zakłada, że utrzymanie komórek macierzystych (SC) odbywa się w pożywce SCMM z substratem witronektyny lub Geltrexu. W przypadku stosowania alternatywnej, wysokobiałkowej pożywki do hodowli komórek macierzystych, zaleca się przejście kultur SC do SCMM przez co najmniej dwa pasaże przed rozpoczęciem tworzenia organoidów. Protokół nie został przetestowany z metodami hodowli SC opartymi na karmicielu.

  1. Korzystając z regularnych metod konserwacji SC25,26, doprowadź kultury do 50%-70% konfluencji. Zwykle jest to 3-4 dni po pasażowaniu, choć może to być zależne od metody hodowli i linii komórkowej.
    nuta: Do wyprodukowania pełnej 96-dołkowej płytki organoidów potrzebne są około 2 dołki z płytki 6-dołkowej.
  2. Sprawdzaj kultury za pomocą mikroskopii jasnego pola przy powiększeniu 10X-20X, aby zapewnić zdrową morfologię kolonii, bez wykrywalnego różnicowania.
  3. Doprowadzić SCMM do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej i rozmrozić do temperatury pokojowej fiolkę o pojemności 50 μl z 50 mM Y-27632 (inhibitorem skały) i 2 ml enzymatycznego odczynnika oddzielającego.
  4. Przygotuj 96-dołkową płytkę z dnem U z ultra niskim nasadką (ULA), wielokanałową pipetę P200 i zbiornik na odczynnik o pojemności 25 ml.
  5. Podajcie 45 ml SCMM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodajcie 45 μl 50 mM Y-27632. Dokładnie wymieszać przez rozcieranie.
  6. Odessać próżniowo dwie studzienki zawierające SC i szybko dodać 1 ml bezenzymatycznego odczynnika oddzielającego do każdej studzienki za pomocą pipety P1000. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 minuty.
  7. Odessać próżniowo studzienki poddane działaniu substancji i dodać 1 ml odczynnika enzymatycznego do oddzielania do każdej studzienki za pomocą pipety P1000.
    1. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 5 minut.
    2. Usuń płytkę i zbadaj leczone studzienki. Delikatnie postukaj w płytkę, aby rozbić zagregowane komórki. Jeżeli duże skupiska komórek są nadal widoczne, inkubować płytkę przez dodatkowe 2 minuty w temperaturze 37 °C. Powtarzać ten krok do momentu, gdy skupiska przestaną być widoczne gołym okiem.
  8. Gdy komórki zostaną prawidłowo zdysocjowane, dodaj 1 ml SCMM do każdej studzienki, aby dezaktywować enzymy dysocjacyjne. Zebrać 4 ml zawiesiny komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i pobrać małą porcję do zliczenia komórek.
    1. Wszelkie pozostałe, nieoczyszczone studzienki z płytki konserwacyjnej należy umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  9. Podczas liczenia odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 x g przez 5 minut.
  10. Określ całkowitą liczbę komórek i oblicz ilość roztworu SCMM + Y-27632, która będzie potrzebna do uzyskania zawiesiny 60 000 komórek/ml.
  11. Ostrożnie odessać próżniowo supernatant i dodać obliczoną objętość roztworu SCMM + Y-27632. Wymieszaj 5-10 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml, zapewniając jednolitą zawiesinę komórek.
  12. Natychmiast przenieś zawiesinę komórek do zbiornika odczynnika i odpipetuj 150 μl do każdej studzienki 96-dołkowej płytki ULA U-bottom za pomocą wielokanałowej pipety P200. W ten sposób powstaje 96 pojedynczych organoidów, z których każdy początkowo składa się z 9 000 komórek.
  13. Odwirować płytkę o sile 150 x g przez 1 min.
  14. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i nie naruszać płytki przez 48 godzin.

2. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 2)

  1. Przygotuj 17 ml SCMM z 17 μl 50 mM Y-27643 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Podgrzać roztwór SCMM + Y-27632 do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej.
  2. Wyjąć płytkę organoidową z inkubatora i za pomocą wielokanałowej pipety P200 o pojemności 75 μl powoli pobrać pożywkę z krawędzi studzienki w pierwszym rzędzie. Po pobraniu pożywki szybko wyrzuć pożywkę z powrotem do studzienki, aby podnieść luźne komórki i organoidy. Powtórz tę czynność dla każdego wiersza.
    nuta: Ta technika, zwana dalej "dyspersją", podnosi szczątki komórkowe i organoid do zawieszenia. Organoid szybko opada na dno studni, podczas gdy mniejsze zanieczyszczenia pozostają w zawieszeniu, co pozwala na ich usunięcie poprzez wymianę podłoża. Pomaga to zapobiec spoczywaniu organoidu w szczątkach komórkowych podczas hodowli.
    1. Po rozproszeniu wszystkich studzienek odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno każdej studzienki.
  3. Powoli i ostrożnie odessać 75 μl pożywki z każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety P200 i dozować do zbiornika na odpady.
    nuta: Większość użytkowników od czasu do czasu odsysa organoid podczas regularnych karmień. Może się to zdarzyć w około 1% przypadków. Proszę odpowiednio zaplanować, aby upewnić się, że wystarczająca liczba organoidów przetrwa do eksperymentalnych punktów czasowych.
  4. Przenieś roztwór SCMM + Y-27632 do zbiornika odczynnika i dozuj 150 μl do każdej studzienki organoidowej za pomocą wielokanałowej pipety P200.
  5. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

3. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 3)

  1. Podgrzej 17 ml SCMM do temperatury 37 °C, tym razem bez Y-27643.
  2. Za pomocą wielokanałowej pipety P200 ustawionej na 100 μl rozproszyć wszystkie dołki płytki organoidowej (patrz krok 2.2). Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studni.
  3. Przygotować zbiornik na odpady i przenieść podgrzany SCMM do zbiornika źródłowego.
  4. Ostrożnie odessać 125 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 150 μl świeżego SCMM za pomocą wielokanałowej pipety P200.
  5. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

4. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 4+)

Uwaga: Przeprowadzaj tę regularną konserwację co drugi dzień, aż do infekcji.

  1. Przed rozpoczęciem karmienia w 4 dniu należy przygotować pożywkę do indukcji neuronalnej (NI).
    1. Rozmrozić 250 μl podwielokrotności 2 mg/ml heparyny wraz z jedną fiolką o pojemności 5 ml z suplementem 100X N-2. Dodaj 250 μl heparyny, 5 ml 100X N-2 i 5 ml 100X MEM-NEAA do 500 ml DMEM/F12+GlutaMAX. Sterylny przefiltrować zmieszany roztwór w filtrze o pojemności 500 ml.
      nuta: Utrzymuj NI w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używany; NI utrzymuje się do dwóch tygodni przed przygotowaniem świeżej pożywki.
  2. Podgrzać 17 ml pożywki NI do 37 °C.
  3. Za pomocą wielokanałowej pipety P200 ustawionej na 100 μl rozproszyć wszystkie dołki płytki organoidowej (patrz krok 2.2). Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studni.
  4. Przygotować zbiornik na odpady i przenieść podgrzany NI do zbiornika źródłowego.
  5. Ostrożnie odessać 125 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 125 μl świeżego NI za pomocą wielokanałowej pipety P200.
  6. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

5. Zakażenie organoidami wirusem ZIKV (~Dzień 24)

UWAGA: Po około 3 tygodniach różnicowania, w organoidzie pojawią się duże struktury neuroepitelialne i rozety, które będą bardzo podatne na infekcję ZIKV.

  1. Doprowadź Earle's 1X Balanced Salt Solution (EBSS), 1X PBS i NI do temperatury 37 °C w gorącej kąpieli wodnej.
  2. Rozcieńczyć ZIKV o znanym stężeniu w 1X EBSS do docelowej wielokrotności infekcji (MOI).
    nuta: Zaleca się miareczkowanie różnych MOI w celu uzyskania odpowiedzi na dawkę wirusa. Może się to różnić w zależności od szczepu wirusa; dla ATCC VR-1838 i ATCC VR-1843 typowe wartości MOI mieszczą się w zakresie od 0,1 do 10).
  3. Ostrożnie usuń całe podłoże z organoidu za pomocą jednokanałowej pipety P200. Szybko dodaj 200 μl 1X PBS do każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety P200, aby umyć organoidy.
  4. Ostrożnie usuń całe podłoże z organoidu za pomocą jednokanałowej pipety P200. Szybko dodaj 50 μl roztworu 1X tylko EBSS (pozorowana infekcja) lub wirusa ZIKV do studni i upewnij się, że organoid jest całkowicie zanurzony. Powtórzyć te czynności dla każdego organoidu, który ma być zakażony na potrzeby badania.
  5. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 godziny
    nuta: Inkubacja pozorowanych zakażonych organoidów przez ten czas nie powinna znacząco wpłynąć na ich wzrost w porównaniu z organoidami niezakłóconymi.
  6. Około 30 minut przed zakończeniem inkubacji wirusa przelać 25 ml NI do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i doprowadzić do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej.
  7. Po zakończeniu ekspozycji na wirusa przemyj organoidy 200 μl 1X PBS dla każdej studzienki, pozwól organoidom osiąść przez 15 s, a następnie usuń 1X PBS za pomocą jednokanałowej pipety P200.
  8. Dodaj 200 μl świeżego NI do każdej studzienki i umieść z powrotem w inkubatorze.
    1. Opcjonalnie: Dla punktu czasowego dnia 0 organoidy mogą być obrazowane godzinę po zakażeniu.
  9. Kontynuuj hodowlę, zastępując 125 μl NI co drugi dzień metodą dyspersji (patrz krok 4). Pamiętaj, aby odpowiednio zutylizować zużyte media i końcówki, ponieważ zawierają one zakaźne cząsteczki ZIKV.

Wyniki

W dniu tworzenia organoidów hodowle SC powinny znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego, wykazując 50%-70% konfluencji, co przedstawiono na Rysunku 1(A-C). Hodowle powinny tworzyć zaokrąglone kolonie z wyraźnymi krawędziami, a studzienki powinny być wolne od różnicowania Rysunek 1(D-E). Jeśli dochodzi do różnicowania, zaleca się przeprowadzenie selektywnego usuwania komórek w celu oczyszczenia dotkniętych obszarów na płytkach co najmniej jeden dzień przed tworzeniem organoidów. Jeśli zróżnicowana jest znaczna część hodowli, konieczne może być przeprowadzenie dodatkowego pasażu, rozmrożenie nowej fiolki lub zmiana technik hodowli komórek macierzystych, aby zapewnić, że organoidy są tworzone z czystych hodowli komórek macierzystych.

Dysocjacja poprzez zastosowanie kombinacji odczynników do odrywania komórek bez udziału enzymów oraz odczynników enzymatycznych powinna doprowadzić do uzyskania głównie pojedynczych komórek, choć podczas liczenia nadal mogą być obserwowane małe agregaty komórek. Obecność niewielkich agregatów nie wydaje się zakłócać tworzenia organoidów, jednak może wpływać na dokładność liczenia. Zaleca się wykonanie wielokrotnych pomiarów dla każdej próbki; jeśli wyniki różnią się o ponad 20%, może być konieczne wydłużenie czasu dysocjacji w celu dalszej singularyzacji komórek.

Po wysianiu komórek i odwirowaniu ich w płytce 96-dołkowej z wypukłym dnem ULA (Rysunek 2A), będą one widoczne jako płaska, gęsta warstwa komórek na dnie każdego dołka. W ciągu kolejnych dwóch dni komórki będą powoli agregować. Zaleca się, aby nie zakłócać płytki podczas tych 48 godzin, ponieważ siły mechaniczne mogą rozbić luźno uformowany agregat. Przez pierwsze 10 dni organoid pozostanie w większości sferyczny i urośnie z ~300 µm do 600-800 µm (Rysunek 2B). Bardziej widoczne struktury zaczynają pojawiać się w organoidzie między 10. a 20. dniem (Rysunek 2C-E). Do 24. dnia badacze powinni być w stanie zaobserwować struktury przypominające rozety za pomocą mikroskopii w jasnym polu (Rysunek 2F). Podczas dalszej hodowli struktury neuroepitelialne te mogą zwiększać swoją liczbę i rozmiar w ciągu kilku dni (Rysunek 2G). Podczas dokarmiania badacz zauważy znaczne ilości debris gromadzące się na dnie każdego dołka, szczególnie podczas pierwszych 2 tygodni hodowli. Technika dyspersji opisana w kroku 2.2 usuwa większość tych debris komórkowych, aby zapobiec gromadzeniu się debris apoptotycznych podczas wielokrotnych dokarmiań (Rysunek 3A). Debris te mogą zakłócać obrazowanie, utrudniać obserwację i kwantyfikację indukowanej infekcją śmierci komórkowej oraz mogą dostarczać asymetrycznych sygnałów do sąsiedniego organoidu, co mogłoby wpłynąć na różnicowanie. Jeśli technika dyspersji zostanie przeprowadzona prawidłowo, zjawisko to powinno zostać ograniczone (Rysunek 3B-C, 3D-E).

Zaleca się wykonanie kriosekcji lub obrazowania arkuszem światła (lightsheet imaging) w celu zbadania struktury korowej tworzącej się wewnątrz organoidów. W organoidach z 25. dnia uprawy struktury rozetkowe i strefy komorowe są wyraźnie widoczne w barwieniu DAPI (Rycina 4A) oraz fosfo-wimentyną (Rycina 4B). Obecność TBR2 (Rycina 4C) wskazuje na tworzenie się progenitorów pośrednich o morfologii sugerującej migrację na zewnątrz. Neurony MAP2+ (Rycina 4D) zasiedlają zewnętrzne obszary każdej rozety. Na podstawie tych białek można zwizualizować strefę komorową (VZ), strefę podkomorową (SVZ), strefę pośrednią (IZ) oraz blaszkę korową (CP) w obrębie każdej rozety (Rycina 4E,4E'). Można kontynuować hodowlę tych organoidów, aby obserwować późniejsze etapy rozwoju. Choć warstwowanie korowe nie jest w tym typie organoidów tak wyraźne, następuje naturalne przejście do gliogenezy, podobnie jak ma to miejsce in vivo. Można to zaobserwować w organoidach z 108. dnia, w których znaczna część komórek wykazuje ekspresję MAP2 lub GFAP (Rycina 4F-I).

Użytkownicy mogą spodziewać się różnic w wielkości organoidów około 3 dni po infekcji ZIKV, w zależności od zastosowanej wielokrotności zakażenia (MOI) wirusa (Rycina 5A-B). Po upływie tych 3 dni w studniach z zainfekowanymi organoidami pojawi się również więcej debris komórkowego w porównaniu do studni kontrolnych. Różnica w wielkości organoidów będzie narastać w ciągu kolejnego tygodnia, aż do momentu, gdy zainfekowane organoidy zaczną się rozpadać (Rycina 5C-D). Na tym etapie można zastosować różne analizy w celu zbadania mechanizmów infekcji, w tym ekstrakcję viralnego RNA oraz kriosekcjonowanie (zalecane przeciwciała wymieniono w tabeli materiałów). Po kriosekcjonowaniu użytkownicy zaobserwują znaczną obecność wirusa w regionie apikalnym struktur neuroepitelialnych, co sugeruje podatność komórek progenitorowych neuronów (NPCs) na infekcję ZIKV (Rycina 6). Immunofluorescencja sekcji organoidów wykaże również wzrost ekspresji kaspazy-3 w formie rozszczepionej w zainfekowanych organoidach (Rycina 7).

figure-results-1
Rycina 1: Morfologia kolonii komórek macierzystych przed formowaniem organoidów.
W momencie dysocjacji kolonie powinny osiągnąć konfluencję na poziomie 50%-70%, aby uzyskać dużą liczbę jednolitych organoidów. (A) Rzadkie, niedawno wysiane hodowle nie osiągnęły jeszcze fazy logarytmicznego wzrostu i nie wytworzą wielu organoidów. (B) Po osiągnięciu odpowiedniej konfluencji komórki są gotowe do dysocjacji. Ważne jest również sprawdzenie tych kolonii w celu upewnienia się, że nie zachodzi w nich różnicowanie. (C) Kolonie, które rozrosły się zbyt mocno, osiągną nadmierną konfluencję i nie są zalecane do formowania organoidów. Hodowle w tym stanie z większym prawdopodobieństwem zawierają komórki różnicujące się. (D) Krawędzie kolonii powinny być wyraźne, z jednolitym obrazem morfologicznym: zaokrąglone komórki w centrum i lekko wydłużone komórki w kierunku krawędzi. (E) W hodowlach powinno występować minimalne różnicowanie. Jeśli w centrach lub na krawędziach kolonii zaobserwowano większe, spłaszczone komórki (białe groty strzałek), które stanowią więcej niż około 1% hodowli, zaleca się ich usunięcie metodą pick-to-remove lub przeprowadzenie dodatkowych pasażowań w celu uzyskania jednorodnej populacji komórek macierzystych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Wzrost organoidów mózgu w czasie. 
(A) Schemat produkcji organoidów mózgu z 2D PSCs hodowanych w medium wolnym od komponentów pochodzenia zwierzęcego (xeno-free) i bez użycia komórek karmionek (feeder-free). (B) Przez pierwsze 8 dni organoidy pozostaną w większości sferyczne z niewielką liczbą wykrywalnych cech. Średnica organoidu będzie wynosić od około 300 µm do 500 µm. (C-E) W 10. dniu wokół obwodu organoidów zaczną być widoczne wyraźniejsze obszary, a one same utracą sferyczny kształt. Będą nadal zwiększać swoje rozmiary do średnicy około 1 mm, co zależy w dużej mierze od linii komórkowej użytej do produkcji organoidów. (F) Po około 20 dniach różnicowania w przejrzystych obszarach obwodowych większości organoidów zaobserwuje się formowanie struktur neuroepitelialnych (czarne groty strzałek). Mają one morfologię pierścieniowatą, ze strukturami apikalnymi i bazalnymi naśladującymi te występujące w rozwijającej się korze mózgowej. (G) Struktury neuroepitelialne te będą nadal rosnąć i zwiększać swoje rozmiary przez około 20-30 dni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Usuwanie szczątków komórkowych za pomocą techniki karmienia z dyspersją.
Podczas wzrostu organoidów spodziewana jest znaczna liczba obumarłych komórek, co może prowadzić do gromadzenia się szczątków komórkowych wokół podstawy organoidu. (A) Przedstawiona technika dyspersji pozwala badaczom na usunięcie większości tych szczątków podczas każdego karmienia. Aby to osiągnąć, należy za pomocą wielokanałowej pipety P200 powoli wciągnąć zużytą pożywkę, a następnie szybko ją wypuścić, aby unieść organoid i szczątki komórkowe w zawiesinie. Organoid szybko opadnie na dno dołka, po czym można przeprowadzić standardowe karmienie. Przykłady organoidu w 6. dniu przed (B) i po (C) karmieniu z dyspersją wykazują znaczną redukcję szczątków. Procedura ta jest kontynuowana przez kilka tygodni, co obrazuje organoid w 18. dniu przed (D) i po (E) karmieniu z dyspersją. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Charakterystyka organoidów mózgowych za pomocą immunohistochemii.
Przedstawiono obrazy organoidów mózgowych wykonane za pomocą mikroskopii arkuszowej (lightsheet), stanowiące przykład powstałej architektury komórkowej. W 25. dniu DAPI (A) oraz fosfo-wimentyna (B) wskazują odpowiednio poszczególne rozety oraz strefy komórkowe. (C) TBR2 znakuje pośrednie komórki progenitorowe migrujące na zewnątrz, a MAP2 (D) znakuje neurony, które powstały w blaszce korowej. (E,E') Połączenie tych białek wyraźnie pokazuje odtworzenie rozwoju kory w modelach organoidów mózgowych. (F-I) Do 108. dnia nastąpiła gliogeneza, a znaczną część organoidu zasiedlają mieszane populacje komórek GFAP+ i MAP2+. VZ = strefa komórkowa, SVZ = strefa podkomórkowa, IZ = strefa pośrednia, CP = blaszka korowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Degradacja zainfekowanych organoidów. 
(A) Obrazy w polu jasnym organoidów mózgowych w grupie Mock oraz zainfekowanych ZIKV przy MOI = 0.1 i 10. Obrazy wykonano bezpośrednio po infekcji (Dzień 0), a także 3 i 6 dni po infekcji. (B-C) Obrazy w polu jasnym detrytusu komórkowego otaczającego (B) organoidy z grupy mock oraz (C) organoidy zainfekowane ZIKV przy MOI = 10, 3 dni po infekcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rycina 6: Krioprzecięcia i immunofluorescencja zainfekowanych organoidów.
Organoidy w 24. dniu zostały poddane działaniu ZIKV przy MOI = 0.1, a następnie po 6 dniach wykonano ich krioprzecięcia. Na tym etapie widoczna jest wyraźna obecność wirusa w strefach komorowej, podkomorowej i pośredniej organoidu, gdzie znajdują się komórki progenitorowe neuronów i glia radialna. (A) Dzięki barwieniu jąder regiony neuroepithelialne są wyraźnie widoczne (białe strzałki) ze względu na wysoką gęstość jąder tworzących struktury pierścieniowate wokół powierzchni apikalnej. (B) Poprzez barwienie koperty wirusowej można zaobserwować stosunkowo wysoką obecność wirusa w obrębie tych struktur rozetkowych (białe groty strzałek). Należy zauważyć, że niewielka ilość wirusa występuje w różnych niezidentyfikowanych komórkach obwodowych. (C-D) Barwienie MAP2 lub inne barwienia specyficzne dla neuronów wykazują obecność w kulturach neuronów, które – po nałożeniu na barwienie wirusowe – nie wydają się być zainfekowane przez wirusa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rycina 7: Immunofluorescencja kaspazy-3 w formie rozszczepionej w zainfekowanym organoidzie.
Po infekcji można zastosować wskaźniki apoptozy, aby zbadać mechanizmy śmierci komórkowej występujące w organoidach. W tym przykładzie organoidy w 24. dniu były eksponowane na ZIKV przy MOI=0,1, a następnie poddano je kriosekcjonowaniu po 6 dniach. (A) Niezinfekowane organoidy nie wykazują obecności otoczki wirusowej (białko 4G2) oraz minimalnej ilości rozszczepionej kaspazy-3 wynikającej z homeostatycznej apoptozy zachodzącej w tkance. (B) Zainfekowane rozetki zaczynają wykazywać zwiększone poziomy apoptozy. (C) Rozetki wykazujące ciężką infekcję w barwieniu 4G2 mają również tendencję do wysokich poziomów rozszczepionej kaspazy-3 w tych obszarach. Istnieje bezpośrednia korelacja między stopniem nasilenia infekcji a ekspresją rozszczepionej kaspazy-3 w zainfekowanych rozetkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Istnieje kilka zastrzeżeń, które należy wziąć pod uwagę przy wykorzystywaniu ludzkich organoidów mózgowych do badania infekcji ZIKV. Jedną z ważnych kwestii jest to, że tworzenie i struktura organoidów jest w dużym stopniu zależna od linii komórek macierzystych, z której powstają. Zachowaj ostrożność podczas porównywania linii komórkowych, w tym linii inżynierii izogenicznej; Najlepiej jest wyciągać wnioski na podstawie wielu subklonów, a najlepiej wielu linii komórek macierzystych. Dodatkowo, ze względu na tę różnicę w liniach komórkowych, zaleca się eksperymenty pilotażowe w celu zapewnienia, że w organoidach zachodzi prawidłowe różnicowanie. Podczas gdy struktury neuronabłonkowe są widoczne pod mikroskopią jasnego pola, sugeruje się również przeprowadzenie eksperymentów qRT-PCR lub kriosekcji w celu znalezienia markerów różnicowania neuronalnego, takich jak PAX6 lub fosfo-wimentyna.

Należy również przewidzieć znaczną zmienność między organoidami w obrębie tej samej linii komórkowej. Ze względu na niewzorcowy charakter protokołu, liczba i wielkość struktur neuroepitelialnych może się różnić między poszczególnymi organoidami. Zazwyczaj można spodziewać się co najmniej dwóch dużych (>200 μm średnicy na D24) rozet nerwowych na organoid. Z tego powodu badania podłużne, takie jak obserwacja zmiany wielkości organoidów po zakażeniu, są szczególnie pouczające. Mogą również wystąpić różnice między partiami, a najbardziej prawdopodobną przyczyną tego jest niedokładne liczenie komórek lub wysiew. Zaleca się przeprowadzenie wielokrotnego liczenia i upewnienie się, że zawiesina komórek jest dobrze wymieszana przed wysiewem na 96-dołkowe płytki ULA U-bottom.

Podczas hodowli organoidów na 96-dołkowych płytkach ULA U-bottom, zaplanuj zaobserwowanie znacznych efektów parowania wokół krawędzi płytek. Idealnie jest wypełnić te studnie PBS i pracować tylko z 60 studzienkami środkowymi. Ze względu na parowanie organoidy w studzienkach zewnętrznych będą narażone na inne warunki niż te w środku, co prawdopodobnie wpłynie na ich wzrost i różnicowanie. Proszę wziąć to pod uwagę przy planowaniu liczby organoidów, które będą potrzebne do eksperymentów. Dodatkowo organoidy zaczną zarastać format 96-dołkowy po około 30 dniach, co będzie widoczne z powodu przebarwienia pożywki hodowlanej. Jeśli planujesz przenieść organoidy po upływie 30 dni, zaleca się przeniesienie organoidów na płytkę ULA 24-dołkową. Aby przeprowadzić transfer, użyj nożyczek, aby przeciąć końcówkę P1000 tak, aby otwór był znacznie większy niż same organoidy, i przenieś organoidy przez pipetowanie.

Ludzkie organoidy mózgowe mają ogromny potencjał w pogłębianiu wiedzy na temat rozwoju neurologicznego i chorób. Zachęca się badaczy do modyfikowania protokołu w razie potrzeby. Na przykład, można zaimplementować czynniki wzorcowe, aby poprawić efektywność różnicowania w kierunku określonych typów komórek, co pozwoli im zbadać wpływ wirusa na określone regiony anatomiczne. Neurorozwojowe skutki ZIKV są nadal słabo poznane, ale to nowe podejście zapewni naukowcom dostępny, szybki i wysokoprzepustowy sposób badania mechanizmów infekcji.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Priscilli L. Yang i Dominique J. Burri z Harvard Medical School za pomoc w początkowym rozmnażaniu i kwantyfikacji ZIKV. Chcielibyśmy również podziękować Nathanielowi D. Kirkpatrickowi za wsparcie w zakresie obrazowania. K.E. był wspierany przez Stanley Center for Psychiatric Research i Harvard Stem Cell Institute.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bezenzymatyczny odczynnik odpryskujący, ReLeSRStemCell Technologies5873
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100ML
DMEM/F12 (1X) Uzupełniany glutaminianem DMEM/F12 (1X)Gibco10565-018(+)2.438 g/L wodorowęglan sodu, (+)Suplement N-2 pirogronianu sodu
(100X)Gibco17502-048
MEM Aminokwasy endogenne (MEM-NEAA)Gibco11140-050
Zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS)GE Healthcare Life SciencesSH30029.02
Filtr Stericup (500 ml)Milipore220009-140
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-dołkowy, okrągłodennyCorning7007
o małej objętości resztkowej (25 ml)Integra4312
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+Rainin17013810
Duża wirówka, kompatybilna z płytką hodowlanąWirnik75007210
CultureScientific75005706
Vero CellsATCCCCL-81Do ekspansji wirusa, w razie potrzeby
Wirus Zika ( Szczep Uganda)ATCCVR-1838Można stosować inne szczepy
Wirus Zika (szczep Puerto Rico)ATCCVR-1843Można stosować inne szczepy
fosfo-wimentynaMBLD076-3mysia poliklonalna,  1:250 rozcieńczenie
TBR2Abcamab23345poliklonalny królik, rozcieńczenie 1:300
MAP2NovusNB300-213kurczak poliklonalne, rozcieńczenie 1:1500
GFAPCell Signaling TechnologiesCST12389Spoliklonalny królik, rozcieńczenie 1:200
D1-4G2 białko otoczki flawiwirusaEMD MilliporeMAB10216mysi monoklonalny, rozcieńczenie 1:500
rozszczepiona kaspaza-3Technologie sygnalizacji komórkowej9661poliklonalny królik, rozcieńczenie 1:200
488 anty-mysie IgGThermo FisherA-11001koza poliklonalna, 1:1000
594 anty-królicza IgGThermo FisherA-11037koza poliklonalna, 1:1000 rozcieńczenie
647 anty-kurczak IgYThermo FisherA-21449koza poliklonalna, 1:1000 rozcieńczenie
Zbiornik na odczynnik wirówkowy Thermo Scientific Thermal

Bibliografia

  1. Jurado, K. A., et al. Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages. JCI Insight. 1, 1-6 (2016).
  2. Quicke, K. M., et al. Zika Virus Infects Human Placental Macrophages. Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).
  3. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).
  4. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).
  5. Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. Zika Virus and Microcephaly. New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).
  6. Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally. Radiology. , 161584(2016).
  7. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, 8880-8896 (2015).
  8. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).
  9. Xu, M., et al. Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen. Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).
  10. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of virology. , 00009-00017 (2017).
  11. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).
  12. Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice. PLOS Pathog. 12, 1006004(2016).
  13. Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears. Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).
  14. Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nat Commun. 7, 12204(2016).
  15. Li, X. -F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).
  16. Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).
  17. Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. , (2016).
  18. Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352, 816-818 (2016).
  19. Wells, M. F., et al. Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection. Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).
  20. Dang, J., et al. Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).
  21. Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).
  22. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
  23. Eiraku, M., et al. Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  24. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2012).
  25. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8, 424-429 (2011).
  26. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
  27. Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons. J Vis Exp. , e10-e13 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

neuronalne komórki progenitorowehodowla organoidówekspozycja wirusowabarwienie immunohistochemicznezastosowanie w przesiewaniu lekówintegracja CRISPRmodelowanie mikrocefalii
Modelowanie zakażenia rozwijającego się ludzkiego mózgu wirusem Zika in vitro przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.