Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie elutriacji odśrodkowej do rozdzielania komórek pierwotnej ostrej białaczki limfoblastycznej na różne fazy cyklu komórkowego.

Streszczenie

Zdolność do synchronizacji komórek była kluczowa dla naszego zrozumienia regulacji cyklu komórkowego. Powszechnie stosowane techniki obejmują deprywację surowicy; substancje chemiczne, które zatrzymują komórki w różnych fazach cyklu komórkowego; lub zastosowanie mitotycznego wstrząsu, który wykorzystuje ich zmniejszone przyleganie. Jednak wszystkie te rzeczy mają wady. Na przykład głód surowicy działa dobrze dla normalnych komórek, ale gorzej dla komórek nowotworowych z upośledzonymi punktami kontrolnymi cyklu komórkowego z powodu aktywacji onkogenu lub utraty supresorów guza. Podobnie, populacje komórek poddane działaniu substancji chemicznej mogą być siedliskiem uszkodzeń wywołanych przez leki i wykazywać zmiany związane ze stresem. Techniką, która pozwala obejść te problemy, jest przeciwprądowa elutriacja odśrodkowa (CCE), w której komórki są poddawane dwóm przeciwstawnym siłom, sile odśrodkowej i prędkości płynu, co skutkuje oddzieleniem komórek na podstawie wielkości i gęstości. Ponieważ komórki przechodzące przez cykl zazwyczaj się powiększają, CCE można wykorzystać do rozdzielenia komórek na różne fazy cyklu komórkowego. Tutaj stosujemy tę technikę do pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej. W optymalnych warunkach można uzyskać zasadniczo czystą populację komórek w fazie G1 i wysoce wzbogaconą populację komórek w fazach G2/M z doskonałą wydajnością. Te populacje komórek idealnie nadają się do badania zależnych od cyklu komórkowego mechanizmów działania leków przeciwnowotworowych oraz do innych zastosowań. Pokazujemy również, w jaki sposób modyfikacje standardowej procedury mogą prowadzić do nieoptymalnej wydajności i omawiamy ograniczenia tej techniki. Przedstawiona szczegółowa metodologia powinna ułatwić zastosowanie i zbadanie tej techniki w odniesieniu do innych typów komórek.

Wprowadzenie

Hodowane komórki zazwyczaj rosną asynchronicznie, a pojedyncze komórki są obecne w różnych fazach cyklu komórkowego. Niektóre organizmy wykazują naturalnie synchroniczne cykle komórkowe lub mogą być synchronizowane przez określone bodźce fizjologiczne. Na przykład jądra w gigantycznych plazmodiach śluzowca Physarum polycephalum dzielą się w wysoce synchroniczny sposób¹, a komórki zielonych alg Desmodesmus quadricauda mogą być synchronizowane przez naprzemienne okresy światła i ciemności². Chociaż takie organizmy oferują unikalne cechy eksperymentalne, nieodpowiednio modelują złożoność komórek ssaków. Zdolność do sztucznej synchronizacji populacji komórek ssaków ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat regulacji cyklu komórkowego i molekularnych podstaw punktów kontrolnych cyklu komórkowego. Typowe metody obejmują deprywację surowicy, blokowanie i uwalnianie substancji chemicznych lub wykorzystywanie cech fizycznych^3,4. Wycofanie surowicy często powoduje, że komórki przechodzą w stan spoczynku, a ponowne dodanie surowicy sprzyja powrotnemu wejściu cyklu komórkowego w fazę G1⁵. Inhibitory chemiczne obejmują czynniki takie jak nadmiar tymidyny lub hydroksymocznika, które blokują komórki na granicy G1/S, lub inhibitory mikrotubul, które zazwyczaj zatrzymują komórki w fazie M^3,4. Podejścia, które wykorzystują cechy fizyczne, obejmują mitotyczne wytrząsanie, które może być wykorzystane do wzbogacenia komórek mitotycznych, ponieważ są one mniej przylegające niż komórki interfazowe⁶. Jednak wszystkie te techniki mają potencjalne wady. Na przykład nie wszystkie typy komórek zachowują żywotność przy braku surowicy lub obecności inhibitorów chemicznych, a wydajność komórek po mitotycznym wstrząsaniu jest ograniczona bez wcześniejszej synchronizacji z inhibitorami mitotycznymi.

Z wyjątkiem wczesnych cykli komórek embrionalnych, gdzie komórki stopniowo zmniejszają swój rozmiar w miarę podziału⁷, większość komórek przechodzących przez cykl przechodzi fazy wzrostu i staje się większa. Właściwość ta jest wykorzystywana w technice przeciwprądowej elutriacji odśrodkowej (CCE), która może być używana do rozdzielania komórek różniących się wielkością, a tym samym fazą cyklu komórkowego^8,9. Podczas CCE komórki znajdują się pod wpływem dwóch przeciwstawnych sił: siły odśrodkowej, która odpycha komórki od osi obrotu, oraz prędkości płynu (przeciwprądu), która popycha komórki w kierunku osi obrotu (Rysunek 1). Komórki w komorze elutriacyjnej osiągają pozycję równowagi, w której siły te są równe. Kluczowymi czynnikami decydującymi o położeniu równowagi są średnica i gęstość komórki. Wraz ze wzrostem natężenia przepływu roztworu buforowego, a siła oporu przeciwprądowego przeważa nad siłą odśrodkową, ustanawiana jest nowa równowaga, powodująca zmianę położenia komórek wewnątrz komory. Wszystkie komórki są przesuwane w kierunku wyjścia z komory, w wyniku czego mniejsze komórki opuszczają komorę jako pierwsze, podczas gdy większe komórki pozostają w komorze, dopóki natężenie przeciwprądu nie wzrośnie wystarczająco, aby ułatwić ich wyjście. Komórki wydostające się z komory elutriacyjnej wraz z kolejnymi wzrostami szybkości przepływu przeciwprądowego mogą być zbierane w określonych frakcjach, a każda frakcja zawiera komórki o sekwencyjnie rosnących rozmiarach. Zamiast przeprowadzać elutriację ze stopniowym wzrostem natężenia przeciwprądu, sekwencyjne zmniejszanie siły odśrodkowej poprzez zmniejszanie prędkości wirowania przyniesie ten sam wynik. Proces elutriacji wymaga optymalizacji w zależności od typu komórki, zastosowanego bufora elutriacyjnego i zastosowanej aparatury. Szybkość sedymentacji komórek w tych warunkach najlepiej opisuje prawo Stokesa: SV = [d²(ρ_{p-ρ m})/18η].ω²r, gdzie SV = prędkość sedymentacji; d = średnica cząstki; ρ_p = gęstość cząstki; ρ_m = gęstość bufora; η = lepkość buforu; ω = prędkość kątowa wirnika; i r = promieniowe położenie cząstki. Tak więc SV jest proporcjonalny do średnicy i gęstości komórki, a ponieważ średnica jest podniesiona do drugiej potęgi, przyczynia się bardziej niż gęstość, która jest na ogół stała przez cały cykl komórkowy.

Ważną zaletą CCE jest to, że komórki nie są poddawane ciężkim warunkom chemicznej obróbki lub deprywacji żywieniowej i mogą być odzyskiwane z doskonałą wydajnością, zasadniczo bez zakłóceń. Wymogiem jest, aby komórki, o których mowa, uległy znacznemu zwiększeniu średnicy, o co najmniej 30%, w miarę przechodzenia przez cykl komórkowy. Główną wadą jest koszt specjalistycznej wirówki, wirnika i akcesoriów. Niemniej jednak zdolność do przygotowania komórek wzbogaconych w określone fazy cyklu komórkowego przez CCE znacznie ułatwiła badania cyklu komórkowego w organizmach od drożdży po komórki ssaków^9,10. Co więcej, ostatnie postępy rozszerzają zastosowania na oddzielanie komórek od zdrowej tkanki do tkanki nowotworowej, rozdzielanie różnych typów komórek w heterogenicznych mieszaninach oraz do produkcji określonych typów komórek do immunoterapii⁹.

Naszym głównym zainteresowaniem było zrozumienie mechanizmu działania środków celujących w mikrotubule (MTA), takich jak alkaloidy barwinka i taksany. Uważano, że leki te działają wyłącznie na mitozę, blokując funkcję mikrotubul wrzeciona^11,12, ale ostatnie dowody sugerują, że mogą one również celować w mikrotubule międzyfazowe^13,14. Niedawno informowaliśmy, że pierwotne komórki ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) ulegają śmierci w fazie G1 lub w fazie M, gdy są leczone winkrystyną i innymi MTA w sposób zależny od cyklu komórkowego¹⁵. Zdolność do rozdzielenia WSZYSTKICH komórek na różne fazy cyklu komórkowego za pomocą CCE odegrała zasadniczą rolę w dojściu do tego wniosku. W tym artykule opisujemy szczegóły techniczne i oferujemy praktyczne wskazówki dotyczące zastosowania CCE do przygotowania pierwotnych komórek ALL w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół

UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany dla pierwotnych komórek B-ALL o średnicy od około 8 μm (faza G1) do 13 μm (fazy G2/M). W związku z tym określone prędkości wirówki i natężenia przepływu pompy mogą nie mieć zastosowania do ogniw o różnych zakresach wielkości. Niemniej jednak odpowiednie parametry elutriacji można oszacować za pomocą równania szybkości sedymentacji. Komórki są hodowane w określonym podłożu wolnym od surowicy, zgodnie z opisem¹⁶ o optymalnej gęstości 1 - 3 x 10⁶ komórek/ml. Z wyjątkiem zbierania frakcji, które przeprowadza się w temperaturze 4 °C przy użyciu probówek chłodzonych lodem, wszystkie etapy przeprowadza się w temperaturze pokojowej, a wirówkę ustawia się na 20 °C, maksymalnie 24 °C.

1. Przygotowanie buforu elucyjnego i materiałów

1. W celu zmniejszenia zlepiania się komórek należy przygotować bufor elutriacyjny ze zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) z czerwienią fenolową uzupełnioną 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS), w celu ochrony komórek przed stresem mechanicznym podczas procesu elutriacji, oraz 1,6 g/l soli dipotasowej kwasu 2-naftol-6,8-disulfonowego (NDA), która sprawia, że zewnętrzna część komórki jest naładowana ujemnie i zmniejsza zlepianie.
   1. Dodaj 1,6 g NDA do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
   2. W sterylnych warunkach dodać 35 ml HBSS z butelki o pojemności 1 l do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej NDA. Obracaj rurką, aż NDA się rozpuści.
   3. Za pomocą filtra 0,2 μm przenieś rozpuszczoną NDA do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie dodaj NDA do pozostałego 1 litra HBSS.
   4. Na koniec dodać 21 ml FBS do HBSS, aby uzyskać końcowe stężenie 2% (v/v).
      UWAGA: Bufor elutriacyjny może być przygotowany i przechowywany w temperaturze 4 °C do daty ważności na HBSS lub do momentu wystąpienia istotnej zmiany pH, na co wskazuje żółknięcie barwnika wskaźnikowego.
2. Oznacz stożkowe probówki o pojemności 50 ml do zbierania frakcji tak, aby były probówki oznaczone jako mycie 1 i 2 (W1 i W2), frakcje 1 - 20 (F1 - F20) i STOP.
   1. Wstępnie schłodź te rurki na lodzie przed zebraniem frakcji.

2. Montaż systemu elutriacji

1. Najpierw zainstaluj zespół stroboskopowy w wirówce tak, aby przewód zasilający był wyprowadzony z komory przez port po lewej stronie. Upewnij się, że lampa błyskowa stroboskopowa lamp znajduje się z przodu komory, tak aby zrównała się z viewokienko, gdy wirówka jest zamknięta.
   1. Zamocuj zespół na miejscu, najpierw dokręcając dwie z krzyżakowym w dwóch otworach w górnej części każdego wspornika, a następnie dokręcając skrzydełkowane w dolnej części każdego wspornika.
   2. Podłącz przewód zasilający do portu zasilania stroboskopu z tyłu wirówki.
2. Następnie ustaw wirnik prosto w dół na piaście napędu wirówki i zabezpiecz kluczem imbusowym z rękojeścią T.
   UWAGA: Jeśli wirówka nie jest potrzebna do celów innych niż elutriacja, zespół stroboskopowy i wirnik można przechowywać w wirówce między cyklami.
3. Po zabezpieczeniu wirnika umieść w wirniku zespół szybkozłączki zawierający komorę elutriacyjną, przeciwwagę, zespół uszczelnienia obrotowego i płytę montażową.
   1. Dociśnij równomiernie jedną ręką komorę elutriacyjną, a drugą ręką przeciwwagę, aż w wirniku zatrzasną się w otworach w płycie montażowej.
   2. Na koniec przymocuj kotwiący, umieszczając kołek po jednej stronie w otworze w zespole obrotowego uszczelnienia i zabezpieczając otwór oczkowy po drugiej stronie jedną ze z krzyżakowym (wymienionych w 2.1.1) na wsporniku po lewej stronie komory.
4. Następnie zmontuj system przepływu za pomocą pompy o zmiennej prędkości i rurki, aby przepompować bufor do komory elutriacyjnej i zebrać bufor wypływający z komory elutriacyjnej.
   1. Przełóż rurkę wejściową o rozmiarze 16 wychodzącą z pompy o zmiennej prędkości przez port w lewym górnym rogu komory wirówki, tak aby weszła do komory.
   2. Przymocuj złączkę do wolnego końca rurki wejściowej i włóż złączkę do otworu wejściowego z boku zespołu obrotowego uszczelnienia.
   3. Przełóż rurkę wyjściową rozmiaru 16 przez port i przymocuj ją do rurki przesyłowej w górnej części zespołu obrotowego uszczelnienia.
      UWAGA: System przepływu może również pozostać zmontowany między przebiegami elutriacji.
5. Na koniec włącz wirówkę i ustaw specyfikacje niezbędne do eksperymentu.
   1. Zmień identyfikator wirnika.
   2. Jeśli wirówka wymaga wprowadzenia czasu, ustaw na 2 godziny, co jest więcej niż wystarczające do zakończenia cyklu elutriacji.
   3. Ustaw temperaturę na 20 °C z maksymalną temperaturą 24 °C.
   4. Ustaw przyspieszenie na maksimum i opóźnienie na wolne.
   5. Na koniec ustaw prędkość na 867 x g.

3. Gruntowanie systemu elutriacji

1. Najpierw, aby wysterylizować system elutriacji, umieść rurkę zbiornika w plastikowej butelce o pojemności 500 ml zawierającej 5% wybielacza i umieść rurkę wyjściową w pustej plastikowej butelce na odpady o pojemności 1 l.
   1. Włącz pompę i ustaw prędkość na 25 ml/min i pozwól, aby 5% wybielacz przepłynął przez cały system elutriacji, aż zostanie wypompowany z rurki wyjściowej do butelki na odpady.
   2. Włącz wirówkę i pozwól jej osiągnąć maksymalną wyznaczoną prędkość (867 x g), aby uwolnić pęcherzyki i przeciwciśnienie.
   3. Zatrzymaj wirówkę. Gdy wirnik przestanie się obracać, otwórz pokrywę i sprawdź, czy komora nie ma wycieków.
   4. Jeśli nie ma wycieków, pozwól roztworowi wybielacza przepływać przez system przez co najmniej 5 minut.
2. Następnie przepłukać system wodą autoklawowaną, ponieważ wybielacz może prowadzić do tworzenia się osadów z buforu elutriacyjnego, które mogą prowadzić do zlepiania się komórek, a także powodować ich uszkodzenie.
   1. Umieść rurkę zbiornika w 1 litrowej butelce z autoklawowaną wodą i pozwól jej przepłukać przez co najmniej 10 minut.
3. Po przepłukaniu wodą wprowadzić do układu bufor elutriacyjny. Użyj szklanej butelki o pojemności 150 ml, która została poddana autoklawie, aby utworzyć zbiornik na bufor elucyjny i komórki.
   1. Dodać 100 ml buforu elucyjnego do butelki i przesunąć rurkę zbiornika do szklanej butelki tak, aby probówka znalazła się na samym dnie.
   2. Uruchom wirówkę i pozwól, aby bufor przepłynął przez system, aby wypłukać wodę.
   3. Gdy butelka zbiornika jest prawie pusta, a woda zostanie całkowicie wypłukana z systemu, przenieś rurkę wyjściową z butelki na odpady do zbiornika, tak aby bufor był zawracany przez system.
4. Na koniec wyreguluj viewokienko tak, aby komora elutriacyjna była widoczna z aktualną prędkością.
   1. Naciśnij przycisk zasilania lampy stroboskopowej na zewnątrz wirówki, aby lampa się włączyła. Przekręć pokrętło elutriacji również na zewnątrz wirówki maksymalnie w lewo.
   2. Patrząc przez okno podglądu, powoli przekręć pokrętło w prawo, aż komora elutriacyjna pojawi się w polu widzenia, a światło stroboskopowe zdąży się z obrotem wirnika.
      UWAGA: System elutriacji można pozostawić w tym stanie, dopóki komórki nie zostaną przygotowane.

4. Przygotowanie próbki komórki

1. Policz komórki i podnieś od 300 do 400 milionów w pożywce wzrostowej do kilku stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Wiruj komórki w temperaturze 1210 x g przez 3 minuty.
2. Odessać pożywkę wzrostową i ponownie zawiesić komórki w 25 ml buforu elucyjnego, delikatnie pipetując w górę iw dół.
3. Aby zmniejszyć zlepianie się komórek, przepuść komórki dwukrotnie przez igłę o rozmiarze 25.
   1. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml narysuj komórki, a następnie przymocuj igłę o rozmiarze 25 i przełóż komórki na wewnętrzną ściankę sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie 25 ml przejdzie przez igłę.
   2. Zaopatrz się w nową igłę i strzykawkę i powtórz powyższy proces raz.
      Uwaga: Igły strzykawkowe należy umieszczać w pojemnikach na ostre przedmioty.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby komórki były przepychane przez igłę bezpośrednio przed wprowadzeniem ich do systemu elutriacji, aby ograniczyć zlepianie się komórek do minimum.

5. Wprowadzenie próbki komórki do systemu elutriacji i pobieranie frakcji

1. Wprowadzić próbkę komórkową do systemu elutriacji, wlewając próbkę komórki do zbiornika zbiornika, przez który przechodzi pozostały bufor elutriacyjny.
   1. Pozwól komórkom wejść do systemu i osiągnąć równowagę w komorze elutriacyjnej.
      UWAGA: Proces ten zajmie około 5 minut, a postęp można śledzić, obserwując komórki, gdy wchodzą do komory przez okno podglądu. Aby upewnić się, że wszystkie komórki znajdują się w komorze, weź kroplę eluentu, umieść ją na szklanym szkiełku i obejrzyj pod mikroskopem. Jeśli próbka jest wolna od nienaruszonych komórek, potwierdza to ich zatrzymanie w komorze.
2. Rozpocznij zbieranie frakcji, gdy wszystkie komórki wejdą do komory, a w najszerszej części komory pojawi się wyraźna granica, w której komórki są w równowadze.
   1. Zacznij od przeniesienia rurki wyjściowej do stożkowej rurki o pojemności 50 ml oznaczonej W1. Zebrać 50 ml buforu elutriacyjnego dla tej frakcji, upewniając się, że masz oko na zbiornik zbiornika i w razie potrzeby uzupełnij buforem elutriacyjnym.
      UWAGA: Aby upewnić się, że wszystkie ogniwa weszły do systemu, poczekaj, aż zbiornik stanie się prawie pusty przed ponownym napełnieniem zbiornika po raz pierwszy. Po pierwszym napełnieniu nie trzeba będzie czekać, aż zbiornik stanie się prawie pusty. Nigdy NIE WOLNO dopuścić do opróżnienia zbiornika, ponieważ spowoduje to powstanie pęcherzyków i ciśnienia wstecznego w systemie.
   2. Po zebraniu 50 ml dla W1 jednocześnie zmień prędkość na 821 x g i przesuń probówkę wyjściową do stożkowej rurki oznaczonej W2 i zbierz 50 ml więcej z tą prędkością.
   3. Kontynuuj zmianę prędkości i zbieranie frakcji, jak wskazano w Tabeli 1. Upewnij się, że w zbiorniku zbiornika znajdują się media i przez cały czas utrzymuj stożkowe rurki na lodzie. Na koniec wyreguluj viewokienko, powoli obracając pokrętło w prawo wraz ze spadkiem prędkości.
   4. Po zebraniu wszystkich 20 frakcji zatrzymaj wirówkę i zbierz 50 ml do stożkowej probówki oznaczonej STOP.

6. Płukanie systemu elutriacji

1. Po całkowitym zatrzymaniu wirówki należy przepłukać system, umieszczając rurkę zbiornika w butelce o pojemności 1 l z autoklawowaną wodą, a rurkę wyjściową z powrotem do pojemnika na odpady.
   1. Zwiększ prędkość pompy do 50 ml/min i pozwól wodzie przepływać przez system, aż do jej wyczerpania.
2. Wyłącz pompę, wyjmij wąż wejściowy i wyjściowy z zestawu szybkozłączki i wyciągnij kołek z kotwiącego.
   1. Zdejmij szybkozłączkę z wirnika.
      UWAGA: W zależności od tego, do czego będzie używana wirówka, system elutriacji można teraz pozostawić bez zmian. W przeciwnym razie cały zespół można zdemontować w odwrotnej kolejności, jak opisano powyżej. Komorę elutriacyjną można wyjąć z szybkozłączki i oczyścić między przebiegami za pomocą ultradźwiękowej łaźni wodnej. Usuwa to zanieczyszczenia i zanieczyszczenia ze ściany komory, co może negatywnie wpłynąć na późniejsze przebiegi.

7. Analiza frakcji i zbieranie pul G1 lub G2/M.

Uwaga: Aby zademonstrować skuteczność elutriacji, każda frakcja jest analizowana pod kątem liczby komórek, średnicy komórki i zawartości DNA, a następnie tworzone są pule komórek w fazach G1 lub G2/M do analiz immunoblot, jak opisano w Reprezentatywnych wynikach. W tej sekcji protokołu opisano sposób tworzenia tych pul i przygotowywania ich do użytku eksperymentalnego.

1. Wirować każdą frakcję w temperaturze 2000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać z buforu elucyjnego.
2. Połącz ze sobą frakcje, aby uzyskać zarówno pulę faz G1, jak i pulę faz G2/M.
   1. W przypadku puli faz G1 ponownie zawiesić frakcje, które zostały zebrane w zakresie prędkości od 788 x g do 661 x g (F1 - F5) w łącznej objętości 1 ml roztworu soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dla puli faz G2/M należy ponownie zawiesić frakcje, które zostały zebrane w zakresie prędkości 387 x g i 333 x g (F17 - F20).
   2. Odwirować komórki o gramaturze 2000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać PBS.
3. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki wzrostowej i pobrać liczbę komórek.
4. Z każdej puli należy pobrać podwielokrotność do analizy pod kątem zawartości DNA za pomocą barwienia jodkiem propidyny i analizy cytometrycznej przepływowej¹⁵.
   UWAGA: Pozostałą część każdej puli można wykorzystać do dalszych eksperymentów.

Wyniki

Pierwotne komórki WSZYSTKIE (3 - 4 x 10⁸) zostały poddane elutriacji odśrodkowej i zebrane na dwie frakcje płuczące i dwadzieścia frakcji głównych, zgodnie z opisem w protokole. W tabeli 1 przedstawiono reprezentatywne dane, w których przedstawiono całkowitą liczbę komórek w każdej frakcji, a także odpowiadającą im prędkość wirnika. Ogólna wydajność wynosiła zazwyczaj ponad 80%. Pomiar średnicy komórki w poszczególnych frakcjach potwierdził, że średnica komórki wzrastała wraz z...

Dyskusja

Opisaliśmy metodę otrzymywania pierwotnych komórek ALL w różnych fazach cyklu komórkowego za pomocą CCE. W optymalnych warunkach można łatwo uzyskać zasadniczo czystą populację komórek w fazie G1 i wysoce wzbogaconą populację komórek w fazach G2/M z doskonałą wydajnością, a w razie potrzeby można również uzyskać komórki wysoce wzbogacone w fazie S. Przedstawione tutaj wyniki uzyskano przy użyciu jednej pierwotnej hodowli ALL (w szczególności ALL-5) i zasadniczo identyczne wyniki uzyskano przy użyciu niezależnej hodowli, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zbilansowany roztwór soli Hanksa	Lonza	10-508Q	Butelka 1 L
Płod Plus Serum bydlęce	Atlas Biologicals	FP-0500-A	Butelka 500 ml
Kwas 2-naptol-6,8-disulfonowy Sól dipotasowa	Acros Organics	212-672-4	100 g proszek
50 ml probówki	Denville Scientifics	C1062-P	500/opakowanie
Membrana PES 0,22 &mikro; m jednostka filtrująca	Millipore	SLGP033RB	250 sztuk w opakowaniu
Avanti J-26S XPI z Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V	Wirówka Beckman Coulter	B14544	kompatybilna z systemem elutriacji
Zestaw wirnika elutriatora JE 5.0	Beckman Coulter	356900	który zawiera wirnik, klucz imbusowy z rękojeścią T, zespół szybkozłączki (bez komory elutriacyjnej), kotwiący i zestaw stroboskopowy
Komora, standardowa, 4 ml, "A"	Beckman Coulter	356943	Standardowa komora elutriacyjna
Głowica pompy Masterflex L/S Easy-Load	Cole-Parmer	EW-07518-10
Napęd o zmiennej prędkości Masterflex L/S	Cole-Parmer	EW-07528-10
Silikonowa rurka do pompy Masterflex BioPharm utwardzana platyną, L/S 16	Cole-Parmer	EW-96420-16
25 G x 1,5 Igła Precision Glide	BD	305127	sterylne, jednorazowe igły
10 ml Luer-Lok strzykawka	BD	309604	sterylne, jednorazowe strzykawki
Vi-Cell XR	Beckman Coulter	383556
bufor do barwienia PI/RNazy	BD Pharmingen	550825	jodek propidyny/RNaza barwiący
bufor cyklina B1 (GNS1) mysie przeciwciało monoklonalne IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-245
cyklina D1 (DCS-6) mysie przeciwciało monoklonalne IgG	Święty Mikołaj Cruz Biotechnology	sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) Przeciwciało monoklonalne królika XPR	Technologia sygnalizacji komórkowej	8516s
GAPDH (14C10) królicze przeciwciało monoklonalne	Technologia sygnalizacji komórkowej	2118s
Kozioł anty-mysi koniugat IgG (H+L)-HRP	BioRad	170-6516
Kozioł anty-królik IgG (H+L)-HRP koniugat	BioRad	170-6515