Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy w Escherichia coli

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56430

⸱

3 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano prosty protokół nadekspresji i oczyszczania zoptymalizowanej pod kątem kodonów, ludzkiej cis-prenylotransferazy, w warunkach niedenaturujących, z Escherichia coli, wraz z testem aktywności enzymatycznej. Protokół ten można uogólnić na produkcję innych białek cis-prenylotransferazy w ilości i jakości odpowiednich do badań mechanistycznych.

Streszczenie

Prenylotransferazy (PT) to grupa enzymów, które katalizują wydłużenie łańcucha difosforanu allilu za pomocą izofosforanu tenylu (IPP) poprzez wielokrotne reakcje kondensacji. DHDDS (syntaza difosforanu dehydrodolichylu) jest eukariotycznym długołańcuchowym cis-PT (tworzącym podwójne wiązania cis w wyniku reakcji kondensacji), który katalizuje wydłużenie łańcucha difosforanu farnezylu (FPP, difosforanu allilu) poprzez wielokrotne kondensacje z difosforanem izopentenylu (IPP). DHDDS ma znaczenie biomedyczne, ponieważ niekonserwatywna mutacja (K42E) w enzymie powoduje barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, ostatecznie prowadząc do ślepoty. W związku z tym niniejszy protokół został opracowany w celu pozyskania dużych ilości oczyszczonych DHDDS, nadających się do badań mechanistycznych. W tym przypadku wykorzystano fuzję białek, zoptymalizowane warunki hodowli i optymalizację kodonów, aby umożliwić nadekspresję i oczyszczenie funkcjonalnie aktywnych ludzkich DHDDS w E. coli. Opisany protokół jest prosty, ekonomiczny i oszczędza czas. Homologia cis-PT między różnymi gatunkami sugeruje, że protokół ten może być również stosowany do innych eukariotycznych cis-PT, takich jak te biorące udział w syntezie kauczuku naturalnego.

Wprowadzenie

Prenylotransferazy to grupa enzymów, które katalizują wydłużanie łańcucha difosforanu allilu za pomocą difosforanu izopentenylu (IPP) poprzez wielokrotne reakcje kondensacji 1,2. Enzymy typu Z katalizują tworzenie podwójnych wiązań cis w wyniku reakcji kondensacji, podczas gdy enzymy typu E katalizują tworzenie podwójnych wiązań trans 3. cis-prenylotransferazy (cis-PT, enzymy typu Z) są klasycznie klasyfikowane według długości łańcucha produktu na krótkołańcuchowe (C15), średniołańcuchowe (C50-55) i długołańcuchowe (C70-120) 4. DHDDS (syntaza difosforanu dehydrodolichylu) jest eukariotycznym długołańcuchowym cis-PT, który katalizuje wydłużenie łańcucha difosforanu farnezylu (FPP, difosforanu allilowego) poprzez wielokrotne kondensacje z difosforanem izopentenylu (IPP) 1,5,6. Powoduje to powstanie difosforanu dehydrodolichylu, difosforanu poliprenylu C55-100służącego jako prekursor dolichylpirofosforanu, cząsteczki nośnika glikozylu zaangażowanej w glikozylację białek sprzężonych z N 1. Wśród Żydów aszkenazyjskich niekonserwatywna mutacja typu missense (K42E) w DHDDS powoduje autosomalne recesywne barwnikowe zwyrodnienie siatkówki 7,8. W związku z tym niniejszy protokół został opracowany w celu pozyskania oczyszczonych DHDDS nadających się do badań mechanistycznych.

Escherichia coli jest uważana za najwygodniejszego i najbardziej opłacalnego gospodarza do ekspresji białek rekombinowanych, a zatem jest również najczęściej używanym gospodarzem. Jednakże, gdy próbuje się heterologicznie nadekspresję białek w E. coli, należy wziąć pod uwagę specyficzne dla białka. Uzyskanie odpowiednio sfałdowanych, aktywnych białek rekombinowanych z E. coli, nie jest prostą sprawą ze względu na odmienne właściwości różnych białek. Opracowano wiele podejść mających na celu pokonanie tych przeszkód. W tym przypadku wykorzystano fuzję białek, zoptymalizowane warunki hodowli i optymalizację kodonów, aby umożliwić nadekspresję i oczyszczenie funkcjonalnie aktywnych ludzkich DHDDS w E. coli. Warto zauważyć, że poprzednia próba nadekspresji drożdży cis-PT bez fuzji białek nie powiodła się z powodu całkowitej nierozpuszczalności nawet w obecności detergentu 12. Opisany protokół jest prosty, opłacalny, oszczędza czas i pozwala na uzyskanie preparatów DHDDS odpowiednich do badań mechanistycznych. Biorąc pod uwagę homologię cis-PT wśród różnych gatunków, sugerujemy, że protokół ten może być również stosowany do innych eukariotycznych cis-PT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1 . Klonowanie cis-PT w celu nadekspresji u E. coli

  1. Uzyskaj wektor ekspresyjny pET-32b, przeznaczony do klonowania i ekspresji wysokiego poziomu sekwencji białkowych połączonych z białkiem 109aa tioredoksyny (TRX) 17 i zoptymalizowaną pod kątem kodonu E. coli 18 sekwencją kodującą pełnej długości cis-PT.
  2. Zadbaj o to, aby przed sekwencją cis-PT znajdowało się miejsce cięcia proteazy TEV (proteazy wirusa wytrawiania tytoniu) (ENLYFQ/G, gdzie "/" oznacza punkt rozszczepienia) 9, a następnie krótki elastyczny łącznik (SGSGSG, w celu zwiększenia dostępności miejsca cięcia) przed sekwencją cis-PT (Rysunek 1A). Dodaj również odpowiednie miejsca ograniczeń 5' i 3' do klonowania.
  3. Sklonuj zsyntetyzowany konstrukt DNA do wektora pET-32b przy użyciu standardowych technik ligacji 10.

2 . Nadekspresja ludzkich DHDDS w E. coli

  1. Przekształć kompetentne komórki E. coli T7 z ekspresją za pomocą konstruktu DHDDS TRX-fusion zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przekształcone komórki należy pokryć płytką zgodnie z instrukcjami producenta na LB-agar w warunkach selektywnych ampicyliny (200 mg/l).
  3. Zaszczepić wybrane kolonie w 100 ml pożywki LB w kulturach starterowych kolb o pojemności 250 ml z ampicyliną w ilości 100 mg/l i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C ze stałym wstrząsaniem przy 200 obr./min.
  4. Zaszczepić 80 ml kultury w dwóch 5-litrowych kolbach (40 ml na kolbę), z których każda zawiera 1,5 l pożywki 2x YT (16 g/l tryptonu, 10 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l NaCl) ze 100 mg/l ampicyliny.
  5. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, stale wytrząsając przy 180 obr./min, aż do osiągnięcia OD600nm = 0,5.
  6. Obniżyć temperaturę do 16 °C i indukować komórki, dodając 0,5 mM izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Kontynuuj inkubację w tych samych warunkach przez 16-20 godzin w celu ekspresji białka.
  7. Zebrać komórki przez odwirowanie (10 000 x g przez 10 min).
    Uwaga: W tym miejscu można wstrzymać protokół; osad komórek należy przechowywać w temperaturze -80°C do czasu oczyszczenia.

3 . Oczyszczanie ludzkich DHDDS

  1. Ponownie zawiesić komórki w buforze A (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanolu), 1 μg/ml DNazy I i mieszaninie inhibitorów proteazy.
  2. Homogenizować komórki za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego.
  3. Zakłócić działanie komórek za pomocą mikrofluidyzatora lub jego odpowiednika przy ciśnieniu 12 000 - 15 000 psi 11.
  4. Odwirować lizat komórkowy przy 40 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Odzyskać supernatant zawierający frakcję rozpuszczalną.
  5. Załadować supernatant do chromatografii o sile 5 - 10 ml chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali kobaltowych (Co2+-IMAC) 12 kolumnę 10 mM imidazolu, a następnie dokładnie przemyć buforem A i 10 mM imidazolem w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania białka.
  6. Eluować nadekspresję białek buforem A uzupełnionym 250 mM imidazolem.
  7. Usunąć imidazol za pomocą 53 ml preparatywnej kolumny odsalającej zrównoważonej buforem A.
  8. Dodaj proteazę TEV znakowaną 6xHis (1 mg proteazy TEV na 50 mg białka) do eluowanych białek, aby usunąć ich znakowane 6xHisem białko fuzyjne TRX w temperaturze 4 °C przez noc.
  9. Załaduj rozszczepione białka do kolumny Co2 + -IMAC, zrównoważonej buforem A uzupełnionym 5 mM imidazolem, aby usunąć rozszczepione 6x znakowane Hisem białko fuzyjne TRX i proteazę TEV.
  10. Zebrać przepływ i zagęścić do 3 - 4 ml za pomocą filtra odśrodkowego o masie cząsteczkowej 30 kDa.
  11. Załadować skoncentrowane białko do kolumny chromatograficznej superdex-200 z wykluczeniem wielkości, zrównoważonej buforem A w celu ostatecznego oczyszczenia. Białko eluuje się w postaci dimeru (~76 kDa).
  12. Wybierz odpowiednie frakcje, porównując profil elucji z krzywą kalibracyjną kolumny.
  13. Oceń czystość preparatu za pomocą SDS-PAGE.
  14. Określić stężenie białka potrzebne do dalszych eksperymentów i błyskawicznego zamrożenia podwielokrotności oczyszczonych, skoncentrowanych białek w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

4 . Analityczna chromatografia wykluczająca wielkość (SEC)

  1. Aby zapewnić zdolność białka do wytrzymania cykli zamrażania i rozmrażania, należy rozmrozić porcję zamrożonych białek i odwirować przy 21 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnych agregatów. Zebrać supernatant.
  2. Załaduj białka do kolumny analitycznej superdex-200 wstępnie zrównoważonej z 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanolem, używając ultra-sprawnego systemu chromatografii cieczowej 13,14.
  3. Monitorować fluorescencję tryptofanu (λex = 280 nm, λem = 350 nm) w celu wykrycia elucji elucji białek. Upewnij się, że masz ważną krzywą kalibracyjną do oceny masy cząsteczkowej - takie krzywe są dostępne u producentów kolumn SEC.

5 . Kinetyka enzymów - Aktywność zależna od czasu 15,16,17

  1. Aby zapewnić aktywność oczyszczonego białka, należy zmieszać 5 μM oczyszczonego DHDDS z 10 μM FPP i 50 μM 14C-IPP, aby zainicjować reakcję w buforze A z 0,5 mM MgCl2 w temperaturze 22 - 30 °C.
    Uwaga: Dokładne warunki reakcji mogą się różnić w przypadku preparatów cis-PT innych niż DHDDS. Co więcej, aktywność DHDDS zależy również od temperatury i [Mg2+].
    Uwaga: 14C-IPP jest radioaktywny i powinien być używany zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa radiacyjnego.
  2. Pobrać 15 μl próbek z reakcji po 0, 2, 4 i 6 godzinach, po natychmiastowym wygaszeniu reakcji przez dodanie 15 μl buforu A uzupełnionego 20 mM EDTA (do końcowego stężenia 10 mM EDTA).
  3. Dodać 1 mlH2nasyconego O-butanolem 1-butanolu i dokładnie odwirować, aby wyekstrahować produkty reakcji.
    Uwaga: W tym miejscu protokół można zatrzymać, a próbki można zachować do późniejszego odczytu.
  4. Dodać koktajl scyntylacyjny do próbek i za pomocą licznika scyntylacyjnego oznaczyć ilościowo produkty reakcji w fazie butanolowej obejmujące 14C wraz z radioaktywnością 15 μl mieszaniny reakcyjnej, co odpowiada promieniotwórczości całkowitej.
  5. Odejmij odczyty tła zmierzone przy użyciu próbek 0 h od każdego punktu czasowego i oblicz procent wykorzystanych 14C-IPP.
  6. Obliczyć inkorporację netto 14C-IPP w każdym punkcie czasowym, obliczając procent wykorzystany z całkowitych 14stężeń C-IPP i wykreślić wyniki w funkcji czasu. Oczekuje się, że z czasem nastąpi wzrost liczby 14C-IPP netto.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny przegląd zastosowanego tutaj konstruktu oraz procesu oczyszczania przedstawiono na Rysunku 1. Próbki uzyskane na każdym etapie oczyszczania pokazano na Rysunku 2. Ta analiza SDS-PAGE obrazuje etapowe oczyszczanie DHDDS, prowadzące do otrzymania wysoce czystego produktu. Rysunek 3 przedstawia wyniki analitycznej chromatografii SEC oczyszczonego enzymu, wykazując, że białko występuje wyłącznie w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół oczyszczania funkcjonalnych ludzkich DHDDS w komórkach E. coli jest prosty i skuteczny, co pozwala na nadekspresję i oczyszczenie białka w ciągu 3-4 dni, gdy dostępny jest odpowiedni konstrukt. Takie protokoły oczyszczania białek mają szczególne znaczenie ze względu na przełomowe odkrycia w sekwencjonowaniu genomu, które dostarczyły wielu informacji na temat genetyki wielu chorób 18, co wymagało opracowania wysokoprzepustowych metod w celu scharakteryzowania mechani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Centrum Doskonałości Badawczej (I-CORE) w Biologii Strukturalnej Komórki Izraelskiej Fundacji Naukowej (1775/12) oraz granty Izraelskiej Fundacji Naukowej 1721/16 i 2338/16 (Y.H.) oraz 825/14 (D.K.). Wsparcie Fundacji Fields Estate dla D.K. jest bardzo cenne. Praca ta została wykonana przez Ilana Edriego i Michała Goldenberga w częściowym spełnieniu wymagań pracy doktorskiej na Wydziale Lekarskim Uniwersytetu w Tel Awiwie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pET-32bNovagen69016-3
T7 Express  lysY  Kompetentny  E. coli  (Wysoka wydajność)NEBC3010I
cKompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazyRoche11873580001
żywica przelewowa TALONGE Healthcare28-9574-99
Kolumna odsalająca HiPrep 26/10 GE Healthcare17508701
HiLoad 16/60 superdex-200 GE Healthcare28989335
superdex-200 wzrost 5/150 GL GE Healthcare28990945
14C-pirofosforan izoopentenyluPerkin-ElmerNEC773050UC 
pirofosforan trans,trans-farnezyluSigma44270-10MG

Bibliografia

  1. Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
  2. Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
  3. Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
  4. Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
  5. Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
  6. Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
  7. Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
  8. Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
  9. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  10. Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
  11. Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
  12. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
  13. Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
  14. Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457(2011).
  15. Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
  16. Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
  17. Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
  18. Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
  19. Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
  20. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  21. Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21(2014).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nadekspresja DHDDSoczyszczanie bia ektest aktywno ci enzymatycznejoptymalizacja kodon wchromatografia powinowactwa z kobaltemchromatografia elowaanaliza SDS PAGEzapalenie b ony naczyniowej siatk wkisynteza izoprenoid w
Nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy w Escherichia coli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.