Opisujemy różne etapy wszczepiania przewlekłych sond silikonowych i rejestrowania komórek miejsca u myszy, które biegają z głową na bieżni wzbogaconej o wskazówki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wszczepienie przewlekłych sond krzemowych i zapis komórek miejsca hipokampa we wzbogaconym aparacie bieżni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ważnym warunkiem dla zrozumienia funkcji mózgu jest identyfikacja korelatów między zachowaniem a aktywnością komórki. Sondy krzemowe są zaawansowanymi elektrodami do elektrofizjologicznego rejestrowania aktywności neuronów na dużą skalę, ale procedury ich przewlekłego wszczepiania są wciąż słabo rozwinięte. Wiadomo, że aktywność komórek miejsca hipokampa koreluje z pozycją zwierzęcia w środowisku, ale mechanizmy leżące u podstaw są nadal niejasne. Aby zbadać komórki miejsca, opisujemy tutaj zestaw technik, które obejmują zarówno wytwarzanie urządzeń do przewlekłych implantów sond krzemowych, jak i monitorowanie aktywności pola miejsca w aparacie bieżni wzbogaconym o wskazówki. Mikronapęd i czapka są budowane poprzez dopasowanie i połączenie ze sobą plastikowych części wydrukowanych w 3D. Sonda krzemowa jest zamontowana na mikronapędzie, oczyszczona i pokryta barwnikiem. Pierwszą operację wykonuje się w celu zamocowania kapelusza na czaszce myszy. Małe punkty orientacyjne są wytwarzane i mocowane do pasa bieżni. Mysz jest wyszkolona do biegania z głową na bieżni. Druga operacja jest wykonywana w celu wszczepienia sondy krzemowej do hipokampa, po czym rejestrowane są szerokopasmowe sygnały elektrofizjologiczne. Na koniec sonda silikonowa jest odzyskiwana i czyszczona do ponownego użycia. Analiza aktywności komórek miejsca w bieżni ujawnia różnorodność mechanizmów pola miejsca, nakreślając korzyści płynące z tego podejścia.
Wprowadzenie
Sondy krzemowe mają kilka zalet dla zapisów elektrofizjologicznych, w tym fakt, że są zaprojektowane z ostrymi profilami minimalizującymi uszkodzenia tkanek i że prezentują precyzyjny układ gęsto upakowanych miejsc rejestracji1,2,3,4. Są one używane do badania różnych systemów u różnych gatunków, w tym u ludzi3,5,6, z różnymi podejściami1,7. Jednak ich powtarzające się użycie jest nadal stosunkowo ograniczone ze względu na ich koszt, kruchość i fakt, że brakuje wygodnych metod do przewlekłych eksperymentów8. Ostatnie postępy w technologii druku 3D umożliwiły niestandardowe projektowanie urządzeń, takich jak mikronapędy i płyty czołowe, aby umożliwić łatwiejszą obsługę tych delikatnych elektrod. W pierwszym kroku opiszemy, jak zbudować i używać zestawu narzędzi, które opracowaliśmy do implantacji przewlekłych sond krzemowych14.
Podczas gdy komórki miejsca są zazwyczaj badane przy użyciu swobodnie poruszających się zwierząt biegających w labiryntach, ostatnio były one również badane w środowiskach wirtualnych15 i na bieżni aparatii9 (Rysunek 1A). Te metody eksperymentalne mają tę zaletę, że zwierzęta mogą być skrępowane głową, co ułatwia korzystanie z technik mikroskopu 2-fotonowego15, patch-clamp16 i optrode9,10,11 technik, a także zapewnia lepszą kontrolę nad zachowaniem zwierząt i wskazówkami środowiskowymi12. W drugim kroku przedstawimy procedury szkolenia myszy i rejestrowania aktywności komórek miejsca w aparacie bieżniowym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Koreańskiego Instytutu Nauki i Technologii.
1. Przygotowanie mikronapędu i elektrody
- Montaż mikronapędu.
- Wydrukuj części mikronapędu (suwak, korpus i obudowę)14 za pomocą drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości. Upewnij się, że części nie mają wad.
- Zamocuj suwak w korpusie mikronapędu za pomocą (rozmiar 000-120x1/4).
- nakrętkę (rozmiar 000-120x5/64 Hex) na końcówce.
- Obróć zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby przesunąć suwak w górę lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby przesunąć go w dół.
- Przymocuj skorupę do korpusu za pomocą (rozmiar 000-120x1/4).
- Montaż sondy na mikronapędzie.
- Zamocuj mikronapęd w pozycji poziomej pod mikroskopem lornetkowym.
- Użyj płaskiego zacisku krokodylkowego z gumową wyściółką, aby chwycić elastyczny sondy silikonowej, jednocześnie ostrożnie odłączając sondę od obudowy przesyłki za pomocą kleszczy. Przymocuj zacisk krokodylkowy do manipulatora.
- Za pomocą manipulatora połóż sondę silikonową na suwaku mikronapędu, równolegle do kierunku ruchu.
- Nałóż kroplę cementu dentystycznego (utwardzany w temperaturze pokojowej akrylowy materiał do naprawy zębów), aby przymocować sondę do suwaka. Popraw pozycję sondy, jeśli się przesunęła. Klej nie jest zalecany, ponieważ utwardza się bardzo szybko i utrudnia ponowne ustawienie elektrody.
- Przymocuj złącze sondy do uchwytu C (uchwytu złącza) za pomocą cementu dentystycznego.
- Czyszczenie i nakładanie barwnika na sondę.
- Zamocuj zespół Microdrive/sondy na urządzeniu do czyszczenia sondy. Urządzenie wyposażone jest w 2 małe obrotowe gąbki piankowe (niesterylne waciki). Wyreguluj odstęp za pomocą manipulatora.
- Namocz gąbki detergentem.
- Powoli przesuwaj sondę w górę iw dół między gąbkami, pozwalając na delikatny dotyk. Monitoruj proces czyszczenia pod mikroskopem.
- Przepłucz sondę wodą destylowaną. Zanurz sondę w alkoholu w celu sterylizacji.
- Nałóż Dil (lipofilowy barwnik fluorescencyjny) na tył trzonków sondy za pomocą wacika piankowego. Pozwoli to w późniejszym etapie na wizualizację lokalizacji trzonu w mózgu.
- Montaż czapki
- Wydrukuj części kapelusza (płytę główną, uchwyt łącznika i nasadkę)14 za pomocą drukarki 3D. 3 części pasują do siebie, tworząc szczelną obudowę.
- Włóż nakrętki (rozmiar M2 i 00-90x1/4) w szczeliny płyty głowicy i przymocuj za pomocą kleju i cementu dentystycznego.
- Włóż podkładkę w szczelinę nasadki i przymocuj cementem dentystycznym.
2. Operacja unieruchomienia kapelusza na czaszce
Wszystkie narzędzia używane do chirurgii są wcześniej sterylizowane w autoklawie. Urządzenie z suchymi kulkami ciepła służy do sterylizacji narzędzi, które ulegają zanieczyszczeniu i muszą być sterylizowane podczas operacji.
- Ustawić poziom izofluranu na 4% w celu rozpoczęcia znieczulenia. Umieść mysz w komorze anestezjologicznej na 5 minut.
- Zainstaluj mysz w aparacie stereotaktycznym.
- Zmniejsz poziom izofluranu do 1,5-2%. Dostosuj poziom podczas operacji w zależności od stanu zwierzęcia, częstości oddechów i temperatury ciała20.
- Nałóż maść na oczy na oczy.
- Ogolić skórę głowy i oczyść głowę zwierzęcia środkiem antyseptycznym (jodopowidonem). Zachowaj warunki aseptyczne podczas wszystkich etapów operacji.
- Wstrzyknąć bupiwakainę (1 mg/kg) pod skórę głowy. Wytnij i usuń część skóry ciemieniowej głowy myszy za pomocą cienkich nożyczek, aby odsłonić czaszkę na jej krawędziach. Użyj soli fizjologicznej i gąbki hemostatycznej, aby oczyścić i zatamować krwawienie podczas zabiegu.
- Usuń okostną za pomocą skrobaka.
- Znajdź punkty odniesienia na skull21: szew bregma, lambda, koronalny i strzałkowy. Wyreguluj kąt główki wzdłuż osi strzałkowej tak, aby punkty Bregma i lambda znajdowały się na tej samej wysokości.
- Wywierć dwa otwory (o średnicy ~0,5 mm) w czaszce na elektrody odniesienia i uziemiające. Otwory powinny znajdować się w odległości około 1 mm ogonowej i 1 mm bocznej od Lambda.
- Włóż elektrody uziemiające i referencyjne (rozmiar 000-120x1/16 miniaturowe ze stali nierdzewnej sprzężone przewodowo ze złączami kołkowymi).
- Nałóż aktywator zębiny wiążący światło ultrafioletowe (UV) na czaszkę, a następnie przyłóż światło UV przez 45-60 s.
- Nałóż warstwę cementu dentystycznego na krawędzie czaszki. Unikaj rozprowadzania cementu na skórze i włosach myszy.
- Przymocuj płytkę głowy do manipulatora stereotaktycznego i umieść ją nad czaszką. Powoli opuść płytę głowy, aż lekko dotknie czaszki, i nałóż cement dentystyczny na styku z czaszką. Pozwól cementowi dentystycznemu utwardzić się przez 15 minut.
- Usuń znieczulenie. Przymocuj uchwyt złącza i zaślepkę do płyty głowicy. Umieścić mysz w klatce po podskórnym wstrzyknięciu ketaprofenu w dawce 5 mg/kg.
- Wstrzykiwać podskórnie ketaprofen w dawce 5 mg/kg mc. przez dwa następne dni i uważnie obserwować, czy nie występują objawy bólu. Myszy zazwyczaj budzą się ze znieczulenia w ciągu 20-40 minut. Implant kapelusza jest stosunkowo lekki (3,34 g), dzięki czemu myszy nie mają problemów z podnoszeniem głowy, bieganiem w labiryntach i wspinaniem się po krawędziach domowej klatki.
3. Trening behawioralny
- Po 7-dniowym okresie rekonwalescencji pooperacyjnej należy rozpocząć ograniczanie ilości wody w dawce 1 ml dziennie.
- Aby wykonać pas bieżni, wytnij kawałek aksamitnej tkaniny (5 cm na 1-2 m) i przymocuj do niego małe przedmioty za pomocą gorącego kleju. Przymocuj wyprostowane przedmioty na krawędziach paska, aby nie przeszkadzać w ruchu myszy.
- Zamocuj pasek na kołach bieżni, zszywając ze sobą dwa końce.
- Zamontuj głowicę myszy zamocowaną w bieżni, wkładając i dokręcając dwie płyty głowicy w szczeliny płyty mocującej głowicę.
- Zacznij trenować mysz, aby biegała z głową skrępowaną na bieżni, aby zdobyć nagrodę w postaci wody. Dostarcz nagrodę w postaci wody przez port do lizania. Początkowo kładź mysz na bieżni na okres 10 minut, 3 razy dziennie.
- Gdy mysz przyzwyczai się do fiksacji głowy i zacznie poruszać pasem (zwykle po ~3 dniach), wydłuż czas trwania sesji treningowej do 30 minut. Po 2-3 tygodniach niektóre myszy przeprowadzają ponad 100 prób w ciągu 30 minut (próba polega na pełnym obrocie pasa).
- Wybierz myszy wykazujące najlepsze wyniki behawioralne w eksperymentach nagraniowych.
4. Implantacja sondy krzemowej
- Umieść mysz pod narkozą.
- Zamontuj mysz w aparacie stereotaktycznym, mocując płytę główną. Oczyść powierzchnię czaszki solą fizjologiczną.
- Znajdź markery stereotaktyczne: szew bregma, lambda, koronalny i strzałkowy. Zmierz odległość do punktu wstawienia i zaznacz go.
- Ostrożnie wywierć kość, aż stanie się cienka i przezroczysta. Zwilżyć i oczyścić solą fizjologiczną podczas wiercenia.
- Ostrożnie usuń przerzedzoną kość i oponę twardą za pomocą precyzyjnych kleszczy. Utrzymuj powierzchnię mózgu mokrą solą fizjologiczną przez cały czas.
- Przymocuj zespół Microdrive/sonda krzemowa do manipulatora stereotaktycznego. Umieść sondę krzemową tuż nad kraniotomią. Przykręć silikonowy uchwyt złącza sondy do płyty głowicy.
- Podłącz wzmacniacz nagrywający i elektrody uziemiające/referencyjne. Osłoń mysz folią aluminiową, aby chronić przed szumami elektromagnetycznymi. Uruchom system nagrywania, aby monitorować aktywność elektryczną mózgu.
- Powoli włóż sondę krzemową do mózgu za pomocą mikromanipulatora. Stale sprawdzaj sygnały elektryczne, przebytą odległość manipulatora i trzonki sondy (upewnij się, że penetrują mózg). Aktywność jednostek jest widoczna w korze, podczas gdy istota biała pod spodem jest stosunkowo cicha. Aktywność jednostki pojawia się ponownie, gdy trzonki dotykają piramidalnej warstwy hipokampa. W tym momencie należy wycofać sondę krzemową na 200 μm (następnego dnia użyj mikronapędu, aby wprowadzić trzpień z powrotem do warstwy piramidalnej).
- Przykryj powierzchnię mózgu mieszaniną wosku kostnego i oleju mineralnego.
- Przymocuj mikronapęd do płyty głowicy za pomocą cementu dentystycznego. Pozwól cementowi dentystycznemu utwardzić się przez 15 minut. Następnie odłącz mikronapęd od manipulatora stereotaktycznego i załóż z powrotem czapkę.
- Umieścić mysz z powrotem w klatce i podać podskórnie wstrzyknięcie ketaprofenu w dawce 5 mg/kg. Sprawdź, czy nie ma oznak bólu. Ta operacja jest znacznie mniej inwazyjna niż pierwsza, a myszy są zazwyczaj aktywne w ciągu 45 minut po wybudzeniu się ze znieczulenia. Pozwól jednak myszy dojść do siebie przez cały dzień, ponieważ sonda krzemowa musi ustabilizować się w mózgu.
5. Nagrywanie
- Zamontuj głowicę myszy zamocowaną na bieżni. Zdejmij czapkę kapelusza.
- Podłącz wzmacniacz nagrywający i rozpocznij nagrywanie.
- Pierwszego dnia użyj mikronapędu, aby przesunąć sondę krzemową do piramidalnej warstwy hipokampa. Każdy obrót w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara przesuwa trzpienie o 200 μm głębiej. Powoli dostosuj pozycję trzpienia (~20-50 μm na raz), aż pojawią się oscylacje tętnienia13 i aktywność jednostki.
- W kolejnych dniach dostosuj pozycję trzonka i odczekaj ~1 godzinę przed zarejestrowaniem aktywności hipokampa, podczas gdy mysz biegnie po pasku. Aby utrzymać dobrą jakość sygnału nagrywania przez kilka dni, usuń twarde przedmioty i niski sufit z klatki myszy, aby zminimalizować ryzyko uderzenia czapki o twarde powierzchnie.
6. Odzyskiwanie sondy
- Umieść mysz pod narkozą.
- Zamontuj mysz w aparacie stereotaktycznym, mocując płytę główną. Zdejmij czapkę kapelusza.
- Umieść manipulator stereotaktyczny tuż nad mikronapędem. Przymocuj mikronapęd do manipulatora. Odkręć uchwyt złącza od płyty czołowej. Wykręć łączącą obudowę i korpus mikronapędu.
- Pod nadzorem mikroskopu lornetkowego powoli pociągnij zespół mikronapędu/sondy silikonowej za pomocą manipulatora stereotaktycznego, pozostawiając część skorupy z tyłu.
- Wyczyść sondę silikonową za pomocą urządzenia czyszczącego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Myszy najpierw trenowano w bieganiu na pasie o długości dwóch metrów pozbawionym wskazówek (Rysunek 1C). Po implantacji elektrod na bieżni zainstalowano nowy pas o tej samej długości, ale zawierający 3 pary wskazówek, aby wygenerować allocentryczne reprezentacje przestrzenne12,14. Sygnały szerokopasmowe rejestrowano z częstotliwością próbkowania 30 000 Hz, używając 250-kanałowego systemu rejestracji (...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przewlekłe rejestrowanie aktywności neuronalnej ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia procesów neuronalnych, takich jak pola miejsc w hipokampie. Nasze podejście do wykonywania przewlekłej implantacji sondy krzemowej różni się od innych metod 7,18,19,20 tym, że stosunkowo łatwo jest odzyskać pakiet elektrod pod koniec eksperymentu. Podczas gdy komórki miejsca są zwykle badane w warunkach swobod...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Program Instytucjonalny Koreańskiego Instytutu Nauki i Technologii (Projekty nr 2E26190 i 2E26170) oraz Program Naukowy Human Frontier (RGY0089/2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sonda krzemowa | Neuronexus | Buzsabi32 | Elektroda rejestrująca |
| System nagrywania | Intantech | RHD2132/RHD2000 | |
| Asiga | Pico Plus 27 | Drukarka wysokiej rozdzielczości do drukarki 3D z mikronapędem | |
| Stratasys | Mojo | Drukarka o niższej rozdzielczości do elementów kapelusza | |
| Aparat stereotaktyczny | Kopf | Model 963 | |
| Mikroskop lornetkowy | Leica | M60 | |
| Aparatura | Budujemy je |
Bibliografia
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Suner, S., Fellows, M. R., Vargas-Irwin, C., Nakata, G. K., Donoghue, J. P. Reliability of signals from a chronically implanted, silicon-based electrode array in non-human primate primary motor cortex. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 13 (4), 524-541 (2005).
- Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J Neurophysiol. 90 (2), 1314-1323 (2003).
- Hochberg, L. R., et al. Neuronal ensemble control of prosthetic devices by a human with tetraplegia. Nature. 442 (7099), 164-171 (2006).
- Okun, M., Lak, A., Carandini, M., Harris, K. D. Long Term Recordings with Immobile Silicon Probes in the Mouse Cortex. PLoS One. 11 (3), e0151180(2016).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568(2012).
- Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
- Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nat Neurosci. 15 (5), 769-775 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. Eur J Neurosci. 31 (12), 2279-2291 (2010).
- Geiller, T., Fattahi, M., Choi, J. S., Royer, S. Place cells are more strongly tied to landmarks in deep than in superficial CA1. Nat Commun. 8, 14531(2017).
- Ylinen, A., et al. Sharp wave-associated high-frequency oscillation (200 Hz) in the intact hippocampus: network and intracellular mechanisms. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 30-46 (1995).
- Battaglia, F. P., Sutherland, G. R., McNaughton, B. L. Local sensory cues and place cell directionality: additional evidence of prospective coding in the hippocampus. J Neurosci. 24 (19), 4541-4550 (2004).
- Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
- Kadir, S. N., Goodman, D. F., Harris, K. D. High-dimensional cluster analysis with the masked EM algorithm. Neural Comput. 26 (11), 2379-2394 (2014).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. J Neurosci Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
- Blumberg, M. S., Sokoloff, G., Tiriac, A., Del Rio-Bermudez, C. A valuable and promising method for recording brain activity in behaving newborn rodents. Dev Psychobiol. 57 (4), 506-517 (2015).
- Haiss, F., Butovas, S., Schwarz, C. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. J Neurosci Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Villette, V., Malvache, A., Tressard, T., Dupuy, N., Cossart, R. Internally Recurring Hippocampal Sequences as a Population Template of Spatiotemporal Information. Neuron. 88 (2), 357-366 (2015).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
- Danielson, N. B., et al. Distinct Contribution of Adult-Born Hippocampal Granule Cells to Context Encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
- Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. J Neurophysiol. 108 (1), 349-363 (2012).
- Wu, F., et al. An implantable neural probe with monolithically integrated dielectric waveguide and recording electrodes for optogenetics applications. J Neural Eng. 10 (5), 056012(2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
