Method Article

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

DOI:

10.3791/56474

⸱

November 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele wyjątkowych postępów zostało dokonanych w proteomice opartej na spektrometrii mas (MS), ze szczególnym postępem technicznym w chromatografii cieczowej (LC) połączonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) i zdolnością multipleksowania znakowania izobarycznego. W tym miejscu wprowadzamy protokół profilowania głębokiej proteomiki, który łączy znakowanie 10-pleksowym tandemowym znacznikiem masy (TMT) z rozbudowaną platformą LC/LC-MS/MS oraz korekcją interferencji obliczeniowej po MS w celu dokładnego ilościowego określenia całych proteomów. Protokół ten obejmuje następujące główne etapy: ekstrakcję i trawienie białek, znakowanie TMT, dwuwymiarowy (2D) LC, spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości i przetwarzanie danych obliczeniowych. Uwzględniono etapy kontroli jakości w celu rozwiązywania problemów i oceny zmienności eksperymentalnej. Za pomocą tego protokołu można z pewnością określić ilościowo ponad 10 000 białek w próbkach ssaków. Protokół ten można również zastosować do ilościowego oznaczania modyfikacji potranslacyjnych z niewielkimi zmianami. Ta multipleksowana, solidna metoda stanowi potężne narzędzie do analizy proteomicznej w różnych złożonych próbkach, w tym w hodowlach komórkowych, tkankach zwierzęcych i ludzkich próbkach klinicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w technologii sekwencjonowania nowej generacji doprowadziły do powstania nowego krajobrazu do badania systemów biologicznych i chorób ludzkich. Pozwoliło to na uzyskanie dużej liczby pomiarów genomu, transkryptomu, proteomu, metabolomu i innych układów molekularnych. Spektrometria mas (MS) jest jedną z najbardziej czułych metod w chemii analitycznej, a jej zastosowanie w proteomice gwałtownie rozszerzyło się po sekwencjonowaniu ludzkiego genomu. W dziedzinie proteomiki ostatnie kilka lat przyniosło znaczny postęp techniczny w analizach ilościowych opartych na MS, w tym możliwość znakowania izobarycznego i multipleksowania w połączeniu z rozległą chromatografią cieczową, a także postęp w oprzyrządowaniu, co pozwala na szybsze i dokładniejsze pomiary przy mniejszym zapotrzebowaniu na materiał próbki. Proteomika ilościowa stała się głównym nurtem podejścia do profilowania dziesiątek tysięcy białek i modyfikacji potranslacyjnych w wysoce złożonych próbkach biologicznych1,2,3,4,5,6.

Multipleksowane metody znakowania izobarycznego, takie jak znacznik izobaryczny do względnej i bezwzględnej oceny ilościowej (np. iTRAQ) oraz tandemowy znacznik masy (TMT) MS znacznie poprawiły przepustowość próbek i zwiększyły liczbę próbek, które mogą być analizowane w jednym eksperymencie1,6,7,8. Wraz z innymi metodami ilościowymi opartymi na MS, takimi jak kwantyfikacja bez znaczników i znakowanie stabilnych izotopów aminokwasami w hodowli komórkowej (tj. SILAC), potencjał tych technik w dziedzinie proteomiki jest znaczny9,10,11. Na przykład metoda TMT pozwala na analizę 10 próbek białek razem w 1 eksperymencie przy użyciu odczynników 10-plex. Te strukturalnie identyczne znaczniki TMT mają tę samą masę całkowitą, ale ciężkie izotopy są różnie rozmieszczone na atomach węgla lub azotu, co skutkuje unikalnym jonem reporterowym podczas fragmentacji MS/MS każdego znacznika, umożliwiając w ten sposób względną ocenę ilościową między 10 próbkami. Strategia TMT jest rutynowo stosowana do badania szlaków biologicznych, progresji choroby i procesów komórkowych12,13,14.

Znaczne ulepszenia techniczne ulepszyły systemy chromatografii cieczowej (LC) –MS/MS, zarówno pod względem separacji LC, jak i parametrów MS, aby zmaksymalizować identyfikację białek bez poświęcania dokładności ilościowej. Rozdzielanie peptydów w pierwszym wymiarze za pomocą techniki rozdzielania o wysokiej ortogonalności w stosunku do drugiego wymiaru ma kluczowe znaczenie w tego typu metodzie proteomiki typu shotgun w celu osiągnięcia maksymalnych wyników20. Chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami o wysokim pH (RPLC) zapewnia lepszą wydajność niż konwencjonalna chromatografia silnej kationowymienności20. Gdy RPLC o wysokim pH jest połączony z drugim wymiarem RPLC o niskim pH, poprawia się zarówno analityczny zakres dynamiczny, jak i pokrycie białek, co skutkuje możliwością identyfikacji większości wyrażonych białek podczas wykonywania analiz całego proteomu15,16,17,18. Inne osiągnięcia techniczne obejmują małe cząstki C18 (1,9 μm) i wydłużoną długą kolumnę (~1 m)19. Ponadto inne godne uwagi ulepszenia obejmują nowe wersje spektrometrów masowych z dużą szybkością skanowania, ulepszoną czułością i rozdzielczością20 oraz zaawansowane potoki bioinformatyczne do eksploracji danych MS21.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół, który zawiera najnowsze metodologie z modyfikacjami w celu poprawy zarówno czułości, jak i przepustowości, jednocześnie skupiając się na mechanizmach kontroli jakości podczas całego eksperymentu. Protokół obejmuje ekstrakcję i trawienie białek, znakowanie TMT 10-plex, frakcjonowanie RPLC zasadowego pH i kwaśnego pH, wykrywanie MS w wysokiej rozdzielczości oraz przetwarzanie danych MS (Rysunek 1). Ponadto wdrażamy kilka etapów kontroli jakości w celu rozwiązywania problemów i oceny zmienności eksperymentalnej. Ten szczegółowy protokół ma na celu pomóc naukowcom początkującym w tej dziedzinie rutynowo identyfikować i dokładnie określać ilościowo tysiące białek z lizatu lub tkanki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki (tj. MSDS) przed użyciem. Podczas wykonywania tego protokołu należy stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa.

UWAGA: W tym protokole do ilościowego oznaczania proteomu używany jest zestaw odczynników do oznaczania metaomu 10 próbek.

1. Przygotowanie komórek/tkanek

UWAGA: Bardzo ważne jest pobieranie próbek w jak najkrótszym czasie w niskiej temperaturze, aby utrzymać białka w ich pierwotnym stanie biologicznym.

  1. Umyj przylegające komórki (np. komórki HEK 293) na 10 cm płytce dwukrotnie 10 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Zeskrob i zbierz komórki (~ 2 x 106 komórek) w 1 ml PBS. Przenieść do probówek o pojemności 1,5 ml i usunąć PBS po odwirowaniu w temperaturze 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przechowywać granulki komórkowe w temperaturze -80 °C do czasu lizy.
    UWAGA: Często przeprowadza się eksperyment pilotażowy w celu zbadania wydajności białka. Około 1 mg białek można wyekstrahować z komórek 10 x10 6 ssaków lub z 15 cm płytki z 80% konfluencją.
  2. Alternatywnie, lizować przylegające komórki na ich płytce, dodając bufor do lizy bezpośrednio do płytki po umyciu. Zebrać lizaty do probówek o pojemności 1,5 ml i skorzystać z opisu protokołu w kroku 2.5.
  3. Zebrać komórki zawiesiny do probówek o pojemności 15 ml, przemyć dwukrotnie 10 ml lodowatego PBS, przenieść do probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 600 x g w celu usunięcia PBS. Całkowicie usunąć PBS z etapów mycia, aby utrzymać pożądane stężenie składników buforu do lizy. Przechowywać granulki komórkowe w temperaturze -80 °C do czasu lizy.
  4. Szybko zbieraj i waż tkanki. Natychmiast po rozbiorzeniu tkanki należy przechowywać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Wydajność białka w tkankach wynosi około 5% do 10% masy tkanki
  5. Użyj jednorodnych rozmiarów tkanek i regionów anatomicznych dla 10 próbek, aby zmniejszyć niejednorodność próbki. Usuń zanieczyszczenie krwi, przepłukując próbki dwukrotnie 1 ml lodowatego PBS, aby uniknąć wpływu dużej ilości białek krwi na ilościowe oznaczanie białek i dalszą analizę danych.

2. Ekstrakcja białek, kontrola jakości Western Blotting, trawienie w roztworze i odsalanie peptydów

UWAGA: Obchodzenie się z każdą z 10 próbek w ten sam sposób na każdym etapie przed zebraniem próbek oznaczonych TMT jest niezbędne do zmniejszenia różnic.

  1. Przygotuj bufor do lizy (50 mM HEPES [pH 8,5], 8 M mocznika i 0,5% deoksycholanu sodu) w dniu eksperymentu.
    UWAGA: Częściowa denaturacja białka podczas lizy próbki wpływa na efektywność trawienia białek.
  2. Dodać bufor do lizy tak, aby stosunek buforu do objętości próbki wynosił 10:1 i ~ 20% końcowej objętości szklanych kulek (średnica 0,5 mm) do granulek komórek lub tkanek (np. stosunek objętości 10: 1 między buforem a próbkami), aby uzyskać końcowe stężenie białka od 5 do 10 mg / ml. Utrzymuj wszystkie 10 próbek w tym samym stężeniu, biorąc pod uwagę liczbę użytych komórek lub masę tkankową każdej próbki.
  3. Utrzymać stężenie mocznika na poziomie 8 M, dodając mocznik w postaci stałej do próbki. Pamiętaj, aby wziąć pod uwagę objętość osadu komórkowego lub tkanki przy obliczaniu ilości mocznika w postaci stałej, który należy dodać do próbki, aby osiągnąć stężenie 8 M.
    UWAGA: Nieświeży bufor mocznikowy może wprowadzać sztuczną modyfikację chemiczną (np. karbamylację białek) i negatywnie wpływać na liczbę zidentyfikowanych peptydów. Mocznik zajmuje znaczną objętość (100 mg mocznika zajmuje ~73 μL w roztworze).
  4. Nierozpuszczalne zanieczyszczenia należy przechowywać w lizacie, aby umożliwić trawienie nierozpuszczalnych białek23.
  5. Próbki poddać lizie w mieszalniku w temperaturze 4 °C z prędkością 8 przez 30 s, odpocząć przez 5 s i powtórzyć 5 razy lub do momentu, gdy próbki zostaną zhomogenizowane. Próbki mogą być również poddawane lizie przez wirowanie przez 30 s w temperaturze pokojowej (RT) z 30-sekundowym okresem chłodzenia na lodzie przez ~10 cykli. W razie potrzeby dostosować warunki lizy, w zależności od rodzaju próbki.
  6. Dobrze wymieszaj lizat bez odwirowania i przygotuj 2 małe porcje (~15 μL każdy). Użyj 1 podwielokrotności do pomiaru stężenia białka i 1 podwielokrotności do przeprowadzenia walidacji kontroli dodatniej poprzez przeprowadzenie analizy Western Blot. Zachowaj pozostałą dużą podwielokrotność do analizy proteomicznej.
  7. Zmierz stężenie białka za pomocą standardowego testu ilościowego białka lub za pomocą barwionego Coomassie żelu poliakryloamidowego z krótkim dodecylosiarczanem sodu (10%)22 z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) jako standardem. Stosować wzorzec BSA o wysokim stopniu znanej dokładności stężenia. Aby osiągnąć najwyższy poziom dokładności, należy przeprowadzić analizę aminokwasów zgodnie ze standardem BSA.
    UWAGA: Mogą być dostępne inne dokładne standardy. Stężenia białek można również oszacować na podstawie liczby komórek lub masy tkanek. Chociaż zalecane jest 1 mg białka (100 μg/próbkę), analizę można przeprowadzić przy użyciu zaledwie 100 μg białka (10 μg/próbkę).
  8. Dodać 100% acetonitrylu (ACN), aby osiągnąć końcowe stężenie 10% ACN i proteazy LysC w stosunku enzymu do substratu 1:100 (w/w) w celu trawienia białek w warunkach silnej denaturacji w RT przez 2 h1. Dodać ditiotreitol (DTT) do końcowego stężenia 1 mM w celu redukcji wiązań dwusiarczkowych w białkach i inkubować przez 1 godzinę. Przeprowadzić trawienie LysC przy końcowym stężeniu 7,2 M mocznika.
  9. Rozcieńczyć próbki do 2 M mocznika za pomocą 50 mM HEPES (pH 8,5) i dalej trawić próbki trypsyną w temperaturze pokojowej przez 3 godziny lub przez noc w stosunku trypsyny do białka wynoszącym 1:50 (w/w). Użyj około 2 μg trypsyny na 100 μg białka i stężenie trypsyny około 10 ng/μL.
    UWAGA: Czynniki, które mogą prowadzić do nieefektywnego trawienia trypsyny, to problemy z pH, nieaktywna trypsyna lub stosowanie niewłaściwego stosunku enzymu do substratu.
  10. Dodaj DTT, aby uzyskać 1 mM i dalej redukuj peptydy przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  11. Dodaj jodoacetamid (IAA), aby uzyskać 10 mM. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności, aby alkilować peptydy zawierające Cys.
  12. Ugasić nieprzereagowane IAA, dodając naziemną telewizję cyfrową w celu uzyskania 30 mM i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Sprawdź skuteczność trawienia trypsyny, badając małą porcję każdej próbki. Odsalać za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl z pożywką chromatograficzną osadzoną w martwym polu, zgodnie z protokołem producenta. Analizuj każdą próbkę za pomocą LC-MS/MS. LC-MS/MS parametry są takie same jak w kroku 5, z wyjątkiem tego, że gradient wynosi 10 min23.
  14. Przeszukaj bazę danych w poszukiwaniu surowych danych MS (zobacz więcej szczegółów w kroku 6), używając 4 pominiętych podziałów jako parametru wyszukiwania.
    UWAGA: Jeśli liczba pominiętych dekoltów wynosi >10%, może to wskazywać na niepełne trawienie trypsyny. Wpłynie to negatywnie na dalsze wyniki. Jest to krytyczny etap kontroli jakości (QC).
  15. Jeśli pominięte rozszczepienie wynosi >10%, należy ponownie roztrawić próbki, dodając do nich dodatkowe 10 μl trypsyny.
  16. Zakwasić próbki, dodając kwas trifluorooctowy (TFA) w celu uzyskania stężenia 1%. Zmierz pH za pomocą paska pH. Sprawdź, czy pH wynosi od 2 do 3. W razie potrzeby dodawać więcej TFA kroplami (1 μl), aż do uzyskania prawidłowego pH.
  17. Odwirować przy 20 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut i zebrać supernatant.
  18. Kolumny wirowe o pojemności od 0,5 do 60 μg zawierające żywicę C18 z odwróconymi fazami przemyć 0,25 ml metanolu, jeśli używa się próbek o wielkości 100 μg. Umyj kolumny wirowe o pojemności od 0,03 do 30 μg 0,25 ml 60% ACN/0,1% TFA, jeśli używasz próbek 10 μg. Wirować kolumny wirujące przy 500 x g przez 30 s.
  19. Zrównoważyć kolumny 0,5 ml 0,1% TFA i usunąć przez odwirowanie przy 500 x g przez 30 s.
  20. Umieścić próbki w kolumnach i związać je z kolumnami przez odwirowanie przy 100 x g przez 3 minuty lub do momentu, gdy cała próbka przejdzie przez kolumnę.
  21. Dodać 0,5 ml 0,1% TFA do kolumn i wirować przy 500 x g przez 30 s.
  22. Dodać 125 μl 60% ACN/0,1% TFA do każdej kolumny i eluować przez odwirowanie przy 100 x g przez 3 minuty. Upewnij się, że cały roztwór przeszedł przez kolumnę.
  23. Wysuszyć eluenty w koncentratorze próżniowym. Upewnij się, że próbki są całkowicie suche i że w probówkach nie pozostały żadne płyny. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

3. Etykietowanie peptydów TMT

UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wszystkie próbki były w pełni oznakowane przez odczynniki TMT. Kilka czynników (np. ilość użytych odczynników TMT, wartość pH i dokładność oznaczania ilościowego białka) może wpływać na skuteczność znakowania TMT, co negatywnie wpłynie na wszystkie dalsze wyniki.

  1. Każdą odsoloną próbkę peptydu rozpuścić w 50 μl 50 mM buforu HEPES (pH 8,5). Sprawdź pH i upewnij się, że wynosi od 7 do 8,
    UWAGA: Próbka może być kwaśna, jeśli nie zostanie całkowicie wysuszona po etapie odsalania, co wpłynie na skuteczność etykietowania.
  2. Zachowaj ~1 μg każdej nieoznakowanej próbki do kolejnego testu skuteczności etykietowania TMT, jak opisano w kroku 3.3.
  3. Rozpuść odczynniki TMT w bezwodnym ACN i oznacz próbki peptydów, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować odczynniki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Przeprowadzić test skuteczności znakowania QC TMT, odsalając ~1 μg każdej próbki znakowanej i nieznakowanej TMT za pomocą 10 μl końcówek do pipet z wbudowanymi mediami chromatograficznymi zgodnie z protokołem producenta. Analiza próbek znakowanych i nieznakowanych TMT za pomocą LC-MS/MS.
    UWAGA: Parametry LC-MS/MS są takie same jak w sekcji 5, z wyjątkiem tego, że gradient wynosi 10 minut.
  5. Zbadaj surowe dane, aby upewnić się, że nieznakowane peptydy nie są wykrywane w znakowanych próbkach, zapewniając pełną skuteczność etykietowania (Rysunek 2). Zrób to dla 6 do 10 oddzielnych peptydów, aby zweryfikować skuteczność etykietowania.
  6. Ugasić reakcję, dodając 4 μl 5% hydroksyloaminy i inkubować przez 15 minut.
  7. Wymieszać małą i równą objętość (2 μl) podwielokrotności każdej próbki znakowanej TMT. Odsalać za pomocą końcówek do pipet o pojemności 10 μl z wbudowanymi pożywkami chromatograficznymi. Analizować próbki za pomocą LC-MS/MS, zgodnie z opisem w kroku 3.4. Użyj oprogramowania JUMP (algorytm przeszukiwania bazy danych o otwartym kodzie źródłowym, który konwertuje nieprzetworzone pliki MS tandem na listę peptydów i białek), aby określić względny stosunek stężeń wszystkich 10 próbek na podstawie intensywności znacznika TMT wszystkich zidentyfikowanych peptydów.
    UWAGA: Ten test proporcji premiksów QC jest pomocny w określeniu prawidłowego stosunku dla równego mieszania przed ostatecznym łączeniem, ponieważ mogą wystąpić błędy pipetowania, które zmienią stężenia, a etap oznaczania ilościowego białka może nie zawsze być dokładny. Jest to również najlepszy sposób na zapewnienie, że ilość każdej z 10 próbek użytych do końcowego wymieszania jest jednakowa w proporcji, jak opisano w kroku 3.5.
  8. Powtórz tyle razy, ile to konieczne, aby uzyskać stosunek 1:1 we wszystkich 10 próbkach.
  9. Równomiernie wymieszać 10 próbek zgodnie z wynikami testu proporcji wstępnego mieszania. Użyj próbki o najniższym stężeniu jako linii bazowej, aby dostosować objętość pozostałych 9 próbek.
  10. Usunąć produkty uboczne reakcji hartowania z zbiorczej próbki znakowanej TMT przez odsolenie.
  11. Przemyć 1 ml wkładów ekstrakcyjnych do fazy stałej zawierających 50 mg sorbentu na kolumnę 1 ml/0,25 ml metanolu, jeśli używa się próbek 100 μg. Umyj kolumny wirowe C18 o pojemności od 0,5 do 60 μg 1 ml/0,25 ml 60% ACN/0,1% TFA, jeśli używasz próbek 10 μg. Kolumny wirowe przy 500 x g przez 30 s.
  12. Zrównoważyć kolumny 0,5 ml 0,1% TFA i usunąć przez odwirowanie przy 500 x g przez 30 s.
  13. Próbki należy umieścić na kolumnach i związać przez odwirowanie przy 100 x g przez 3 minuty lub do momentu, gdy cała próbka przejdzie przez kolumnę.
  14. Dodać 0,5 ml 0,1% TFA do kolumn i wirować przy 500 x g przez 30 s.
  15. Dodać 125 μl 60% ACN/0,1% TFA do każdej kolumny i eluować przez wirowanie przy 100 x g przez 3 minuty. Upewnij się, że cały roztwór przeszedł przez kolumnę.
  16. Wysuszyć eluenty w koncentratorze próżniowym. Upewnij się, że próbki są całkowicie suche i że w probówkach nie pozostały żadne płyny. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

4. Ekstensywna prefrakcjonacja LC o wysokiej rozdzielczości

  1. Ustaw 2 połączone kolumny C18 zawierające zmostkowane cząstki hybrydowe etylenu (4,6 mm x 25 cm, łącznie 50 cm; wielkość cząstek 3,5 μm) i użyj wysokowydajnej pompy LC o przepływie mikrolitrów do frakcjonowania.
    UWAGA: Użycie 2 kolumn zwiększa obciążenie peptydami i niekoniecznie poprawia chromatografię. W przypadku próbek zawierających ≤200 μg peptydów wystarczy 1 kolumna.
  2. Przemyć pętlę o pojemności 100 μl, dodając po 300 μl metanolu, wody i buforu A (10 mM mrówczanu amonu, pH 8,0).
  3. Przemyć kolumny 100 μl równomiernie wymieszanego izopropanolu, metanolu, ACN i wody i zrównoważyć kolumnę w 95% buforze A przez 2 godziny.
  4. Rozpuścić odsoloną próbkę peptydu znakowaną TMT w 65 μl buforu A. Sprawdzić, czy pH próbki wynosi ~8,0. Jeśli nadal jest kwaśny, użyj wodorotlenku amonu, aby dostosować pH do 8,0.
  5. Frakcjonować próbkę przy użyciu następującego gradientu z buforem B (bufor A plus 90% ACN): 15% do 20% przez 15 minut, od 20% do 35% przez 100 minut i od 35% do 50% przez 30 minut. Ustaw kolektor frakcji tak, aby zbierał frakcje co 2 minuty, łącznie z czasem ładowania. Ustaw natężenie przepływu na 0,4 ml/min. Zobacz reference29 i Rysunek 1 dla reprezentatywnego chromatogramu.
  6. Zbierz w sumie 80 frakcji i wysusz 40 frakcji (co drugą frakcję) za pomocą koncentratora próżniowego, aż do całkowitego wyschnięcia.
  7. Użyj 40 wysuszonych próbek do analizy LC-MS/MS.
  8. Przeanalizuj wszystkie 80 frakcji za pomocą LC-MS/MS, aby uzyskać ultragłębokie pokrycie proteomu.

5. Przygotowanie i parametry LC-MS/MS

UWAGA: W pomiarze ilościowym opartym na TMT, jony peptydowe są izobaryczne i pojawiają się jako 1 masa w skanie MS1. Są one jednak określane ilościowo zgodnie z intensywnością jonów reporterowych (10 unikalnych jonów reporterowych) w skanowaniu MS/MS po rozdrobnieniu jonu peptydowego z dysocjacją zderzeń o wyższej energii (HCD). Stosunki jonów reporterowych TMT mogą być tłumione przez koelucję jonów znakowanych TMT24. Zawężenie okna izolacji jonów25, oczyszczanie w fazie gazowej26, metoda MultiNotch MS327, lub ekstensywna frakcjonowanie z wielowymiarowym LC i długimi gradientami (4-8 h)28 to alternatywne podejścia.

  1. Zapakuj puste kolumny o średnicy wewnętrznej (ID) 75 μm z 1,9 μm żywicy C18 o długości od 30 do 40 cm (~1,3 μl objętości złoża).
  2. Ogrzewać kolumny w temperaturze 65 °C za pomocą podgrzewacza motylkowego w celu zmniejszenia ciśnienia wstecznego i zapobieżenia nadmiernemu ciśnieniu w systemie ultrawysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (UPLC). Zwiń kolumnę 2 do 3 razy w grzałce motylkowej, aby upewnić się, że cała długość łoża kolumny jest podgrzana. Przyklej kolumnę do wnętrza grzejnika, uważając, aby nie zakleić taśmą czujnika temperatury wewnątrz grzejnika.
    UWAGA: Grzałka portfela motylkowego jest zamontowana i przyklejona do specjalnie wykonanego kawałka pleksi przymocowanego do stolika XYZ instrumentu.
  3. Przygotować bufor A (3% dimetylosulfotlenku i 0,2% kwasu mrówkowego) oraz bufor B (bufor A plus 67% ACN) i dokładnie przemyć kolumny 95% buforem B. Następnie w pełni zrównoważ kolumny w 95% buforze A (co najmniej 3 objętości kolumn). Stosować natężenie przepływu ~0,25 μl/min i ciśnienie zwrotne od 280 do 320 barów.
  4. Zbadaj jakość systemu LC-MS/MS, uruchamiając dwukrotnie 100 ng peptydów mózgu szczura (lub wybranego przez nas standardu) przed analizą próbek znakowanych TMT. Aby zapewnić wysoką jakość zbierania danych, często sprawdzaj następujące parametry: pomiar intensywności sygnału MS (między e8 a e9 dla natężenia piku podstawowego), jakość widm MS/MS (dobre odwzorowanie jonów y i b), szerokość piku (12-22 s), całkowity czas retencji, ciśnienie w układzie LC (wzrost ciśnienia >50 barów wskazuje na brudną kolumnę lub zatkaną końcówkę emitera), oraz zmienność między seriami (identyczne wartości szczytowe powinny wynosić <30 s między cyklami).
    UWAGA: Aby rozpuścić prawie izobaryczne jony reporterowe odczynników TMT 10-plex (różnica 6.32 mDa), rozdzielczość MS/MS musi być ustawiona na co najmniej 30 000 przy 400 m/z. HCD jest zwykle używany do fragmentacji jonów reporterowych TMT10-plex, ponieważ nie podlega zasadzie jednej trzeciej, która ma zastosowanie do dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID) w instrumentach pułapki jonowej.
  5. Regularnie czyść i kalibruj przyrząd MS oraz używaj świeżych LC, aby poprawić wydajność systemu.
  6. Rozpuść wysuszone peptydy z zasadowego oddzielenia pH w 5% TFA.
  7. Załaduj ~0,2 μg na kolumnę podczas przepływu 5% bufora A.
  8. Eluować od 15% do 45% buforu B w ciągu 150 min. Jako punkt wyjścia użyj następującego gradientu: czas 0, bufor B 5%; czas 2, bufor B 15%; czas 135, bufor B 45%, czas 145, bufor B 70%; i czas 150, bufor B 95%. Nieznacznie dostosować gradient dla wczesnych i późnych zasadowych frakcji pH RPLC po przejrzeniu chromatogramów pików podstawowych.
  9. Uruchomić spektrometr mas w trybie zależnym od danych ze skanem przeglądowym w analizatorze masy pułapki jonowej (400-1600 m/z; rozdzielczość 60 000; cel automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 1 x 106; maksymalny czas jonowania 50 ms; i tryb centroidu). Wykonaj skanowanie w wysokiej rozdzielczości 20 MS/MS (rozdzielczość 60 000, 1 x 10 5celów AGC, maksymalny czas jonów ~100 ms, znormalizowana energia zderzenia 35 HCD, okno izolacji 0,4 m/z i wykluczenie dynamiczne 20 s).
    UWAGA: Dysocjacja transferu elektronów (ETD) nie jest zalecana dla odczynników TMT10-plex, ponieważ miejsca cięcia ETD różnią się od HCD, co powoduje nakładanie się jonów reporterowych. Ponadto ETD nie jest skuteczny, podobnie jak HCD, ponieważ peptydy tryptyczne zazwyczaj generują stany naładowane +2, a ETD jest bardziej wydajny w stanach wyższego ładunku.

6. Analiza danych MS

UWAGA: Opisujemy analizę danych za pomocą oprogramowania JUMP. Jednak analiza danych może być wykonywana za pomocą innych dostępnych na rynku lub bezpłatnych programów.

  1. Przetwarzaj surowe pliki ze spektrometru mas za pomocą hybrydowej wyszukiwarki opartej na znacznikach JUMP21, która łączy wyszukiwanie w bazie danych oparte na wzorcach i sekwencjonowanie de novo oparte na znacznikach w celu poprawy czułości i swoistości.
  2. Konwertuj surowe dane do formatu mzXML i przeszukaj widma MS2 w ludzkiej bazie danych UniProt (lub innej odpowiedniej bazie danych specyficznej dla gatunku), aby obliczyć współczynnik fałszywych odkryć (FDR).
  3. Wyszukiwanie należy przeprowadzać przy użyciu tolerancji masowej 10 ppm zarówno dla jonów prekursorowych, jak i fragmentacyjnych. Ustaw inne parametry wyszukiwania na pełne ograniczenie tryptyczne z 2 maksymalnymi pominiętymi cięciami, 3 maksymalnymi miejscami modyfikacji na peptyd oraz przypisaniem jonów a, b i y do oceny peptydów. Ustaw modyfikacje statyczne znaczników TMT na resztach Lys i końcach N (+229,162 Da) oraz karbamidometylację reszt Cys (+57,021 Da). Ustaw dynamiczne modyfikacje tak, aby obejmowały utlenianie Met (+15,994 Da), które jest powszechnym artefaktem peptydowym wynikającym z obchodzenia się z próbką.
  4. Filtruj dane według następujących kryteriów: minimalna długość peptydu 7 aminokwasów, dokładność m/z (np. 5 ppm) i pasujące wyniki (wynik J i deltaCn). Grupuj peptydy według długości peptydu, tryptyczności i stanu ładunku.
  5. Użyj dodatkowego poziomu filtrowania poprzez dopasowanie wyników, aby zredukować białko FDR do poziomu poniżej 1%. Białka zidentyfikowane za pomocą pojedynczej liczby spektralnej wymagają wyższego wyniku dopasowania.
  6. W przypadku peptydów wspólnych dla wielu członków rodziny białek, należy zgrupować dopasowane białka w 1 grupę.
    UWAGA: Zgodnie z zasadą oszczędności, grupa jest reprezentowana przez białko o największej liczbie przypisanych peptydów i innych białek dopasowanych przez unikalne peptydy1.
  7. Określ ilościowo białka, sumując liczbę jonów reporterowych we wszystkich dopasowanych dopasowaniach widma peptydów (PSM) za pomocą programu wbudowanego w pakiet oprogramowania JUMP.
  8. Dla każdego zaakceptowanego PSM ekstrahować i korygować intensywność jonów reporterowych TMT zgodnie z rozkładem izotopowym odczynników do znakowania i odchyleniem obciążenia, które oblicza się na podstawie globalnych danych ilościowych PSM. Filtruj PSM o niskim natężeniu i wysokim poziomie szumów z progami zdefiniowanymi przez użytkownika podczas oznaczania ilościowego.
  9. Oblicz względny sygnał między każdym jonem reporterowym a średnią wszystkich 10 jonów reporterowych. Zsumuj względne sygnały PSM dla zidentyfikowanych białek. Przekształć te względne sygnały w sygnały bezwzględne, mnożąc uśrednioną intensywność jonów reporterowych 3 górnych PSM w odpowiednich białkach.
  10. Użyj podejścia obliczeniowego po stworzeniu układu współrzędnych, aby skorygować zakłócenia. Zakładając, że intensywność jonów y1 jest proporcjonalna do intensywności jonów reporterowych, oblicz zależność liniową na podstawie czystych skanów i wyprowadź poziom zakłóceń na podstawie intensywności zanieczyszczonego jonu y1 w skanach zaszumionych23.
    UWAGA: W przypadku peptydów tryptycznych znakowanych TMT, reszty K-TMT i R to 2 rodzaje jonów y1 (odpowiednio 376.27574 Da i 175.11895 Da) w skanach MS2. Jeśli zostanie wykryty tylko jon 1 y1 i jest on zgodny ze zidentyfikowanym peptydem, MS2 jest uważany za czysty skan (Rysunek 3A). Jeśli zostaną wykryte oba jony y1, MS2 zostanie uznany za skanowanie zaszumione.
  11. Eksportuj wartości ilościowe białka do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy. Użyj porównań parami lub analizy wariancji, aby zidentyfikować białka, które są wyrażane w różny sposób.

7. Walidacja danych MS

UWAGA: Aby ocenić jakość danych dotyczących MS, należy przeprowadzić co najmniej 1 metodę walidacji przed przystąpieniem do czasochłonnych eksperymentów biologicznych.

  1. Ręcznie zbadaj widma MS/MS interesujących Cię białek, aby zweryfikować sekwencję peptydową i ilościowe określenie ilościowe jonów reporterowych TMT.
  2. Należy wykorzystać znane dane ilościowe dotyczące białka, aby potwierdzić wyniki MS.
  3. Zweryfikuj zmiany białek za pomocą podejść opartych na przeciwciałach (np. Western blot i analizie immunohistochemicznej).
  4. Chemicznie zsyntetyzuj interesujące nas peptydy i użyj ich jako wewnętrznych wzorców, aby potwierdzić identyfikację natywnych peptydów.
    UWAGA: Ich wzorce MS/MS i czas przechowywania podczas LC-MS/MS powinny być identyczne.
  5. Zweryfikuj zmiany białek za pomocą ukierunkowanego podejścia do stwardnienia rozsianego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy wcześniej opisanej mieszanki peptydów międzygatunkowych, aby systematycznie analizować efekt kompresji proporcji w 3 głównych krokach protokołu, w tym frakcjonowanie przed MS, ustawienia MS i korektę po MS23. Frakcjonowanie przed MS oceniono i zoptymalizowano przy użyciu kombinacji zasadowego pH RPLC i kwaśnego pH RPLC. Do analizy po stwardnieniu rozsianym uwzględniono tylko peptydy specyficzne dla gatunku. Użyliśmy tego modelu interferencyjnego do zbadani...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy wysokoprzepustowy protokół oznaczania ilościowego białek ze strategią znakowania izobarycznego 10-plex, który został z powodzeniem wdrożony w kilku publikacjach 12,13,14,32. W tym protokole możemy przeanalizować do 10 różnych próbek białek biologicznych w 1 eksperymencie. Z dużą pewnością jesteśmy w stanie rutynowo zidentyfikować i określić ilościowo ponad 10 000 białek. Chociaż znako...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują wszystkim pozostałym członkom laboratorium i placówki za pomocną dyskusję. Praca ta była częściowo wspierana przez granty NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 i ALSAC. Analiza stwardnienia rozsianego została przeprowadzona w St. Jude Children's Research Hospital Proteomics Facility, częściowo wspieranym przez NIH Cancer Center Support grant P30CA021765. Autorzy dziękują Nishy Badders za pomoc w redakcji rękopisu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
System 1220 LCAgilentG4288B
50% HydroksyloaminaThermo Scientific90115
AcetonitrylBurdick & JacksonAH015-4
Bullet BlenderNext AdvanceBB24-AU
Grzejnik portfelowy motylkowyPhoenix S& TPST-BPH-20
C18 KońcówkiAparat Harvarda74-4607
Ditiothreitol (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
Kwas mrówkowySigma94318
Kolektor frakcjiGilsonFC203B
Koraliki szklaneNext AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
Jodoacetamid (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
MetanolBurdick & ZestawAH230-4
Pierce BCASpektrometr masowy Thermo Scientific23225
Thermo ScientificQ Exactive HF
nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
Żywica ReproSil-Pur C18, 1,9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Kolumny samodzielne PckNowy celPF360-75-15-N-5
Deoksycholan soduSigma30970
SpeedvaThermo ScientificSPD11V
TMT 10plex Odczynnik do etykiet izobarycznychThermo Scientific90110
Kwas trifluorooctowy (TFA)Applied Biosystems400003
TrypsynaPromegaV511C
MocznikSigmaU5378
Xbridge Kolumna C18kolumna Wody186003943
Ziptips C18MilliporeZTC18S096
SepPak 1cc 50mgWodyWAT054960
do oznaczania białek Jackson

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464(2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171(2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Deep Proteome ProfilingIsobaric LabelingLiquid ChromatographyMass SpectrometryTMT Labeling2D LCHigh Resolution Mass SpectrometryComputational Data ProcessingProtein QuantitationPost Translational Modifications

Related Articles