Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tworzenie mysich modeli zaburzeń neurologicznych wywołanych wirusem Zika przy użyciu strategii iniekcji domózgowych: embrionalnej, noworodkowej i dorosłej

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56486

⸱

26 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Biomedical and Health Sciences Institute, University of Georgia, 2Center for Craniofacial Molecular Biology, University of Southern California, 3Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę tworzenia modelu mikrocefalii wywołanej wirusem Zika u myszy. Protokół ten obejmuje metody inokulacji śródmózgowej wirusa Zika w stadium embrionalnym, noworodkowym i dorosłym.

Streszczenie

Wirus Zika (ZIKV) to flawiwirus obecnie endemiczny w Ameryce Północnej, Środkowej i Południowej. Obecnie ustalono, że ZIKV może powodować małogłowie i dodatkowe nieprawidłowości w mózgu. Jednak mechanizm leżący u podstaw patogenezy ZIKV w rozwijającym się mózgu pozostaje niejasny. Śródmózgowe metody chirurgiczne są często stosowane w badaniach neurobiologicznych w celu odpowiedzi na pytania dotyczące zarówno normalnego, jak i nieprawidłowego rozwoju mózgu i jego funkcji. Protokół ten wykorzystuje klasyczne techniki chirurgiczne i opisuje metody, które pozwalają na modelowanie choroby neurologicznej człowieka związanej z ZIKV w układzie nerwowym myszy. Chociaż bezpośrednia inokulacja mózgu nie modeluje normalnego sposobu przenoszenia wirusa, metoda ta pozwala badaczom na zadawanie ukierunkowanych pytań dotyczących konsekwencji po zakażeniu ZIKV rozwijającego się mózgu. Protokół ten opisuje embrionalne, noworodkowe i dorosłe stadia dokomorowej inokulacji ZIKV. Po opanowaniu ta metoda może stać się prostą i powtarzalną techniką, której wykonanie zajmuje tylko kilka godzin.

Wprowadzenie

Małogłowie to stan wynikający z wadliwego rozwoju mózgu, charakteryzujący się mniejszym niż przeciętny rozmiarem głowy u noworodków. Dzieci z małogłowiem wykazują szereg objawów, które mogą obejmować między innymi opóźnienie rozwoju, drgawki, niepełnosprawność intelektualną, utratę słuchu, problemy ze wzrokiem oraz problemy z poruszaniem się i równowagą, w zależności od ciężkości choroby i przyczyny1,2,3. Ten stan ma charakter wieloczynnikowy, z czynnikami genetycznymi, zakaźnymi i środowiskowymi związanymi z wywoływaniem małogłowia4,5,6,7,8,9. Przed wybuchem epidemii ZIKV w latach 2015-2016 u 8 dzieci na 10 000 urodzeń zdiagnozowano małogłowie w Stanach Zjednoczonych według CDC10. W dniu 1 lutego 2016 r. Światowa Organizacja Zdrowia ogłosiła wirusa Zika stanem zagrożenia zdrowia publicznego o zasięgu międzynarodowym z powodu alarmującego wzrostu liczby diagnoz małogłowia związanych z zakażeniem ZIKV u matek11,12. Niedawne badanie przeprowadzone przez CDC na temat przypadków ZIKV w Stanach Zjednoczonych sugeruje, że zakażenie ZIKV u matki powoduje 20-krotne zwiększenie ryzyka rozwoju małogłowia u dziecka w porównaniu z osobami niezakażonymi, a 4% matek zakażonych ZIKV z USA ma dzieci z małogłowiem11. Stwierdzono, że częstość występowania wad wrodzonych związanych z małogłowiem w czasie ciąży z powodu zakażenia ZIKV w Brazylii dotknęła do 17% dzieci u zakażonych matek, co wskazuje, że inne czynniki w Ameryce Łacińskiej mogą przyczyniać się do zwiększonego ryzyka13. Chociaż wiemy, że ZIKV może powodować małogłowie i patogenezę w populacji neuronalnych komórek progenitorowych (NPC)7,8,14, pełna patogeneza ZIKV w rozwijającym się mózgu pozostaje nieuchwytna. Ważne jest opracowanie modeli zwierzęcych w celu dalszego zbadania mechanizmów chorobowych leżących u podstaw nieprawidłowości w mózgu związanych z zakażeniem ZIKV.

Aby bezpośrednio zbadać wpływ ZIKV na rozwój mózgu, najpierw opracowaliśmy model myszy, używając inokulacji domózgowej mózgu embrionalnego dnia 14.5 (E14.5) za pomocą ZIKV7. Ten etap został wybrany, ponieważ jest uważany za reprezentatywny dla końca pierwszego trymestru ciąży u człowieka14. Młode mogą przeżyć do 5 dnia po urodzeniu (P5) dzięki tej metodzie embrionalnego wstrzyknięcia domózgowego (~ 1 μL dawki infekcyjnej 1,7 x 106 hodowli tkankowej (TCID50/mL)). Te młode po urodzeniu wykazują szereg fenotypów podobnie obserwowanych u zakażonych ludzkich niemowląt, w tym powiększone komory, utratę neuronów, rozrzedzenie aksonów, astroglejozę i aktywację mikrogleju12,15. Mózg nowonarodzonej myszy jest stosunkowo niedojrzały, podobnie jak stadium rozwojowe ludzkiego mózgu w połowie ciąży16, a rozwój mózgu myszy obejmuje główny komponent pourodzeniowy. Aby zbadać infekcje w późniejszym okresie ciąży, opisano również metodę infekcji poporodowej. Noworodki zakażone ZIKV w P1 są w stanie przeżyć do 13 dni po wstrzyknięciu. Zakażenie w stadium dorosłym u krwi zostało opisane u myszy wcześniej17, ale wymaga użycia czynników transkrypcyjnych czynnika regulacyjnego interferonu (IFN) (IRF) IRF-3, -5, -7 szczep potrójnego nokautu. Protokół ten opisuje metodę inokulacji ZIKV dokomorowo w celu uniknięcia wyłączenia odpowiedzi przeciwwirusowej modelu mysiego u osoby dorosłej. Chociaż omija to mysi układ odpornościowy, ta droga wstrzyknięcia nie naśladuje bezpośrednio typowej drogi infekcji. Aby bezpośrednio rozwiązać tę rozbieżność, eksperymentator może przeprowadzić wewnątrzmaciczne zakażenie ZIKV zamiast drogi wewnątrzczaszkowej. Zaczerpnięta z poprzedniej pracy work18, pokrótce opisaliśmy tę technikę w tym protokole infekcji embrionalnej.

Szczepy wirusa Zika zaimplementowane tą techniką obejmują meksykański izolat MEX1-447,19 oraz afrykański izolat MR-766 wyizolowany w 194720. Wirus Zika MEX1-44 został wyizolowany w Chiapas w Meksyku w styczniu 2016 r. od zakażonego komara Aedes aegypti. Uzyskaliśmy tego wirusa za zgodą Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksańskiego w Galveston (UTMB). Ponadto serotyp 2 wirusa dengi (DENV2) został zaszczepiony przy użyciu tej techniki w badaniu porównawczym. DENV2, szczep S16803 (sekwencja GenBank GU289914), został wyizolowany z próbki pacjenta z Tajlandii w 1974 roku i poddany pasażowi w komórkach C6/36. Wirus był dwukrotnie pasażowany w komórkach Vero przez Światowe Centrum Referencyjne ds. Pojawiających się Wirusów i Arbowirusów (WRCEVA) przed wstrzyknięciem myszy. Pokazuje to, że technika ta działa równie dobrze w przypadku różnych szczepów ZIKV i innych flawiwirusów, które mogą mieć wpływ na rozwój mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły użytkowania zwierząt są zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Południowej Kalifornii i Uniwersytetu Georgii. Metody eutanazji u ciężarnych matek i dorosłych są wykonywane zgodnie z zatwierdzonymi protokołami: uduszenie dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy jako drugorzędna metoda zapewniająca eutanazję. Nowonarodzone szczenięta są poddawane eutanazji przez dekapitację.

Uwaga: Następujący protokół obejmuje postępowanie z wirusem chorobotwórczym. Należy zachować odpowiednie środki ostrożności podczas obchodzenia się z wirusem. Wszystkie protokoły muszą zostać zatwierdzone przez odpowiedni komitet instytucjonalny przed ich użyciem.

1. Embrionalna inokulacja domózgowa wirusa Zika

  1. W przypadku krycia ciężarnego w czasie należy wziąć pod uwagę południe dnia po kryciu jako E0,5. Połącz myszy w pary pod koniec dnia i sprawdź wtyczki wczesnym rankiem, aby zmniejszyć zmienność czasu krycia.
  2. Przygotuj szklaną igłę przed zabiegiem. Pociągnij igłę i odetnij na 1/3 jej długości, a następnie naostrz pod kątem 45° za pomocą młynka do mikropipet z kroplówką wody, aż pory zmieszczą się na poziomie 50 - 70 μm. Sprawdź końcówki igieł pod stereoskopem pod kątem jakości i złamania.
  3. Utrzymać podwielokrotność wirusa na lodzie. Tuż przed zabiegiem należy załadować mieszankę iniekcyjną ZIKV do przygotowanej szklanej igły iniekcyjnej. Zmontować gazoszczelną strzykawkę iniekcyjną (objętość 50 μl), nasadkę luer-lock i rurkę, a następnie nasącz zmontowaną strzykawkę rurką olejem mineralnym. Po nasyceniu przymocuj igłę i wciągnij do igły ~ 6 - 7 μL ZIKV (~ 1 μL to 1,7 ×10 6 TCID50/mL).
  4. Ciężarnym myszom C57BL/6J lub 129S1/SvImJ należy wstrzyknąć zarodki E14,5 dnia zarodkowego (do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego) lub zarodki E10,5 (do wstrzyknięcia wewnątrzmacicznego) chlorowodorek ketaminy (80-100 mg/kg) i ksylazynę (5-10 mg/kg) rozcieńczone dootrzewnowo w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w celu wywołania znieczulenia u matki. Alternatywnie, znieczulić matki monitorowanym izofluranem podawanym przez drogi oddechowe, w razie potrzeby z odchłanianiem gazów odlotowych. Buprenorfina-SR (0,5-1,0 mg/kg) należy wstrzyknąć podskórnie w celu wywołania działania przeciwbólowego.
  5. Przetestuj znieczulone matki na czubku palca u nogi lub ogonie, a następnie połóż je na wznak na poduszce grzewczej zatwierdzonej przez zwierzęta (podkładka termiczna 100 x 200 2,5 mm). Kleszcze do szczypania palców u nóg nie są sterylne i nie są używane do przenoszenia tkanek podczas operacji. Alternatywnie, do zbadania odruchu odruchu wycofania palców u nóg można użyć dłoni w rękawiczkach.
    UWAGA: Skontaktuj się z personelem weterynaryjnym w swojej instytucji, aby uzyskać preferowaną metodę ogrzewania okołooperacyjnego. Pomiędzy tą poduszką grzewczą a zwierzęciem umieszczono osłonę.
  6. Dodaj maść okulistyczną do oczu.
  7. Ogol powierzchnię brzucha i trzykrotnie wysterylizuj jodem i alkoholem. Naprzemiennie chusteczki nasączone jodem i alkoholem; Wytrzyj okrężnymi ruchami z dala od pola operacyjnego.
  8. Skórę otaczającą pole operacyjne należy obrysować sterylnymi szmatkami, aby uniknąć zanieczyszczenia nacięcia i narzędzi.
    UWAGA: Otwór serwety nie powinien być większy niż przygotowane pole operacyjne; W otworze serwety nie powinny być widoczne żadne włosy.
  9. Ściśnij skórę matki od brzucha kleszczami i przetnij dolną część brzucha w linii 1 - 1,5 cm na przyśrodkowej linii strzałkowej sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi. To wcina się w skórę i dalej w jamę brzuszną, tak że zarodki są teraz odsłonięte.
    UWAGA: Nożyczki chirurgiczne służą do nacinania skóry i warstwy otrzewnej. Do każdego zabiegu używane są sterylne narzędzia i rękawiczki.
  10. Wytnij szczelinę pośrodku małej sterylnej gazy i nałóż na otwór chirurgiczny. Nawadniaj sterylną solą fizjologiczną. Przeciągnij zarodki przez szczelinę, aby spoczęły na sterylnej gazie, uważając, aby nie usunąć więcej niż 4-5 zarodków skupiających się na jednym rogu macicy za jednym razem.
  11. Nawodnij zarodki sterylną solą fizjologiczną przed i w trakcie inokulacji, aby upewnić się, że nie wyschną. Śledź, które zarodki są wstrzykiwane i ich lokalizację w rogu macicy. Poszczególne zarodki są zatem traktowane jako oddzielne eksperymenty, ponieważ zarodki nie zmieniają pozycji podczas rozwoju w macicy. (Przejdź do kroku 1.15 w przypadku wstrzyknięcia domacicznego).
  12. Delikatnie umieść szpatułkę pod główką zarodka. Dobrze oświetl zarodki lampą, aby uwidocznić szwy głowy i czaszki.
    UWAGA: Przestrzegana jest technika aseptyczna, w tym sterylne rękawice chirurgiczne i narzędzia. Po manipulacji niesterylnymi przedmiotami (takimi jak lampa) rękawice należy wymienić na nowe sterylne rękawice przed przystąpieniem do pracy ze sterylnymi narzędziami i obszarami.
  13. Ustaw głowę, manipulując zarodkiem zarówno lampą (za głową dla widoczności), jak i wolnymi palcami, aż główka zarodka zostanie dociśnięta bezpośrednio do ściany macicy i przytrzymana na miejscu ręką niedominującą.
    UWAGA: Umiejscowienie zarodka jest krytyczną częścią i techniką, która wymaga najwięcej praktyki. Zbyt duży nacisk palca może uszkodzić błony embrionalne, prowadząc do śmiertelności, a niewystarczający nacisk może utrudnić wstrzyknięcie.
  14. Użyj naczyń krwionośnych biegnących wzdłuż szwu czaszki jako przewodnika. Wstrzyknąć wirusa ZIKV (~ 1 μL, 1,7 × 106 TCID50/mL izolatu meksykańskiego MEX1-44) do komór bocznych mózgu zarodka E14,5 za pomocą zmontowanej strzykawki i igły. Użyj pożywki kontrolnej jako pozorowanego wstrzyknięcia.
  15. Aby poprawić trwałość ciąży, należy unikać wstrzykiwania wirusa do dwóch zarodków obok jajników i dwóch zarodków obok górnej pochwy (Ryc. 1A). Ogólnie rzecz biorąc, nie więcej niż 6 zarodków jest wstrzykiwanych w miocie, aby skrócić czas operacji i zapobiec utracie zarodków.
  16. Umieść wstrzyknięte zarodki z powrotem w ciężarnych matkach i wypełnij jamę brzuszną ~ 0,5 ml sterylnego soli fizjologicznej. Aby zamknąć, najpierw zszyj zarówno mięsień otrzewnowy brzuszny, a następnie zszyj zewnętrzną warstwę skóry za pomocą sterylnych szwów 4,0. Zaleca się stosowanie szwów przerywanych; Istnieje możliwość rozejścia się rany, jeśli mysz przeżuwa szew.
  17. Umieść mysz w klatce częściowo spoczywającej na poduszce grzewczej, aby w razie potrzeby umożliwić mysz ucieczkę do nieogrzewanego obszaru. Monitoruj matki podczas ich rekonwalescencji (1 - 2 godziny) po znieczuleniu. Rozwijaj zarodki po operacji przez różny czas zgodnie z indywidualnymi eksperymentami.
  18. Iniekcja wewnątrzmaciczna
    1. Z odsłoniętym jednym rogiem macicy i zarodkami użyj strzykawki o pojemności 1 ml i igły 27G, aby wstrzyknąć 100 μl wirusa Zika (106 TCID50 jednostek zawieszonych w 100 μl DMEM) lub pożywkę kontrolną do przestrzeni wewnątrzmacicznej lub do tkanki łożyska. Zwróć uwagę, które zarodki zostały wstrzyknięte w celu przeprowadzenia sekcji w stadium embrionalnym. Zobacz poprzednio opublikowane prace, aby uzyskać więcej informacji18.
    2. Umieść wstrzyknięte zarodki z powrotem w ciężarnych matkach i wypełnij jamę brzuszną ~ 0,5 ml sterylnego soli fizjologicznej. Aby zamknąć, najpierw zszyj mięsień otrzewnowy brzuszny, a następnie zszyj zewnętrzną warstwę skóry sterylnymi szwami 4,0. Zaleca się stosowanie szwów przerywanych; Istnieje możliwość rozejścia się rany, jeśli mysz przeżuwa szew.
    3. Umieść mysz w klatce częściowo spoczywającej na poduszce grzewczej, aby w razie potrzeby umożliwić mysz ucieczkę do nieogrzewanego obszaru. Monitoruj matki podczas ich rekonwalescencji (1 - 2 godziny) po znieczuleniu. Rozwijaj zarodki po operacji przez różny czas zgodnie z indywidualnymi eksperymentami.

2. Inokulacja śródmózgowa noworodków wirusem Zika: P0/P1

  1. Upewnić się, że gazoszczelne strzykawki iniekcyjne (objętość 10 μl) i igły nie są zatkane. Wyczyść i przetestuj, ładując trzy jednorazowe strzykawki o pojemności 20 ml z igłami o rozmiarze 26: jedną z solą fizjologiczną, jedną z 70% etanolem i jedną z powietrzem w celu usunięcia roztworów. Sterylizuj 10% wybielaczem, jeśli wcześniej używano go do wstrzykiwania wirusa.
  2. Utrzymuj wirusa na lodzie. Załadować strzykawkę, napełniając ją solą fizjologiczną, aby zmniejszyć martwą objętość w strzykawce, i pobrać 0,75 μl powietrza, aby oddzielić roztwór soli fizjologicznej od materiału do wstrzykiwań.
  3. Ustawić ogrzewaną, nawilżoną komorę rekonwalescencji dla wstrzykniętych szczeniąt. Za pomocą bloku grzewczego umieść zamykany pojemnik (taki jak puste pudełko na końcówki) ze sterylną gazą i zwilż solą fizjologiczną. Podgrzej go przed rozpoczęciem wstrzykiwań.
  4. Skonfiguruj mikrowtryskiwacz wraz z pompą i sterownikiem. Określ kod typu urządzenia dla konkretnej strzykawki (tj. dla strzykawki 10 μl typ urządzenia to "D"). Określić szybkość wstrzykiwania.
  5. Zbierz młode w dniu poporodowym 0 lub 1 (P0/P1) w pobliżu stanowiska chirurgicznego. Umieścić wirusa w strzykawce do wstrzykiwań. Zdezynfekuj mocowanie głowy szczeniaka za pomocą 70% EtOH.
  6. Zawiń szczenięta w cienką warstwę gazy i zanurz je całkowicie w lodzie, aby uzyskać stan znieczulający. Szczenięta są krioanezjowalizowane przez 5 minut. Upewnij się, że szczenięta są wystarczająco znieczulone do wstrzyknięcia, wykonując szczypanie ogona/palca u nogi bez odpowiedzi. Daje to w przybliżeniu 15 minut stanu znieczulającego.
  7. Umieść szczeniaka na uchwycie na głowie, wysterylizuj powierzchnię głowy jodem i etanolem (trzy razy), a następnie wytrzyj do sucha sterylną chusteczką (izopropanol lub 70% EtOH).
  8. Oznacz lambdę czarnym markerem i zapisz współrzędne w lambda za pomocą instrumentu stereotaktycznego. Zmierz odległość od lambdy do krawędzi oka i zaczynając od współrzędnych stereotaktycznych lambda oblicz odległość 2/5 od lambda do oka (dla obu półkul, jeśli wstrzykujesz oba).
  9. Ponownie sprawdź głębokość znieczulenia przed utworzeniem otworu w miejscu wstrzyknięcia. Za pomocą igły o rozmiarze 26 należy ostrożnie i powierzchownie nakłuć skórę głowy i czaszkę w miejscu wstrzyknięcia (czaszka jest bardzo miękka u noworodków), aby utworzyć otwór na igłę do wstrzykiwań.
  10. Opuścić igłę do iniekcji w miejscu nakłucia, a gdy igła właśnie przebije się przez skórę, obliczyć głębokość 1 mm dla miejsca wstrzyknięcia (komory bocznej) za pomocą przyrządu stereotaktycznego.
  11. Po opuszczeniu igły do głębokości wstrzyknięcia, zaprogramować mikrowstrzykiwacz tak, aby wstrzykiwał: 1 μl wirusa, z szybkością 10 nL/s, wstrzykując około 1 μl w ciągu 1,5 minuty (~ 1 μl 3,4 x 105 TCID50/mL ZIKV).
  12. Po zakończeniu wstrzykiwania odczekaj 30 s i cofnij igłę w odstępach co 0,5 mm, obracając (grzbietowo), odczekaj 30 s po każdym wstawieniu.
    UWAGA: Zmniejsza to wyciek wstrzykniętego wirusa.
  13. Po wyjęciu należy szybko załadować igłę i strzykawkę większą ilością wirusa (różne wirusy lub pozorowane kontrole należy załadować do oddzielnych strzykawek/igieł) lub wyjąć szczenię z mocowania głowy do wstępnie ogrzanej, nawilżonej komory. Monitoruj szczenię co kilka minut, aby ocenić powrót do zdrowia. Zastąp szczenięta miotem.

3. Domózgowe szczepienie dorosłych wirusem Zika

  1. Dorosłym myszom wstrzyknąć dootrzewnowo chlorowodorek ketaminy (80-100 mg / kg) i ksylazynę (5-10 mg / kg) rozcieńczone w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w celu wywołania znieczulenia. Wstrzyknąć buprenorfinę-SR (0,5-1,0 mg/kg) podskórnie w celu wywołania znieczulenia. Uszczypnij mysz palcami/ogonami, aby zapewnić jej stan znieczulania, a następnie zamontuj ją na instrumencie stereotaktycznym (z poduszką grzewczą), aby unieruchomić głowę podczas operacji.
  2. Dodaj maść okulistyczną do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu myszy podczas operacji. Ogol skórę głowy, zaczynając za oczami do początku uszu. Wysterylizuj odsłoniętą skórę jodem i 70% EtOH trzy razy. Naprzemiennie chusteczki jodowe i nasączone alkoholem; Wytrzyj okrężnymi ruchami z dala od pola operacyjnego.
  3. Ponownie sprawdź głębokość znieczulenia przed nacięciem skóry. Za pomocą skalpela wykonaj 0,5 cm nacięcie wzdłuż przyśrodkowej linii strzałkowej głowy w wysterylizowanym miejscu, odsłaniając bregmę. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką oczyścić powierzchnię czaszki z tkanek opon mózgowych, jednocześnie odpychając skórę od miejsc wstrzyknięcia.
  4. Zaczynając od bregmy, wyrównaj wiertło chirurgiczne i zidentyfikuj miejsca wstrzyknięć za pomocą następujących współrzędnych: AP -0,5 mm, ML: +/-1,5 mm. Za pomocą pedału nożnego sterującego powoli wiercić w czaszce, tak aby wiercić kość tylko do momentu, gdy zostanie oczyszczony otwór na igłę.
  5. Zastąp wiertło pompką mikrowtryskiwacza i gazoszczelną strzykawką (objętość 10 μl) na stereotaktyce. Pozostawiając mały pęcherzyk powietrza między roztworem soli fizjologicznej a wirusem, należy pobrać ~ 4-5 μL wirusa. Określ kod typu urządzenia dla określonej objętości strzykawki (np. D dla strzykawki o objętości 10 μl). Opuścić igłę do DV: -1,5 mm od powierzchni mózgu. Aby wstrzyknąć 1 μl wirusa, zaprogramuj szybkość 10 nL/s, wstrzykując około 1 μl w ciągu 1,5 minuty.
  6. Po zakończeniu iniekcji należy odczekać 30 s i wyjmować igłę w odstępach co 0,5 mm, odczekując 30 s po każdym obrocie. Zmniejsza to przepływ wsteczny i wyciek wstrzykniętego wirusa.
  7. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy użyć kleszczy, aby rozluźnić skórę i odzyskać odsłoniętą czaszkę. Zszyj skórę głowy z powrotem za pomocą szwów 4.0 i wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego. Umieść mysz w klatce, częściowo spoczywając na poduszce grzewczej, aby w razie potrzeby umożliwić myszowi ucieczkę do nieogrzewanego obszaru i monitoruj, aż dojdzie do siebie (1-2 godziny) po znieczuleniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy naszych metod wstrzykiwania dla inokulacji ZIKV do zarodkowego mózgu przedstawiono na schematach obrazujących wstrzyknięcia domózgowe (Rycina 1A) oraz wstrzyknięcia dopłodowe i dopłodkowe (Rycina 1B), które ilustrują sposób, w jaki ciężarna samica i zarodki powinny być oglądane i zorientowane podczas operacji (protokół inokulacji zarodkowej). Rycina 2A przedstawia zakażenie ZIK...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisano tutaj metodę domózgowej inokulacji ZIKV w stadium embrionalnym, noworodkowym i dorosłym w celu zbadania uszkodzeń mózgu wywołanych przez ZIKV. Chociaż jest to proste, istnieje kilka kwestii, które badacze powinni podjąć, aby zapewnić jakość badania i bezpieczeństwo zaangażowanych osób.

DENV jest blisko spokrewniony z ZIKV w rodzaju flavivirus. DENV nie jest przyczynowo związany z zaburzeniami mózgu u dzieci. DENV2 może z powodzeniem infekować i replikować się w rozwijającym się mózgu p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Abdellatifowi Benraissowi z Uniwersytetu w Rochester za jego mentoring i dyskusje związane z nauką technik chirurgicznych dla dorosłych i noworodków. Autorzy chcieliby również podziękować dr Jamesowi Lauderdale'owi z UGA za wykorzystanie jego sprzętu stereotaktycznego i dyskusje związane z ustaleniem metodologii tej techniki, a także fundacji Advancement for Research College Scientists (ARCS) za ich wsparcie i nasze wsparcie NIH (granty NINDS R01NS096176-02, R01NS097231-01 i F99NS105187-01).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Elastyczny wał napędowy Wiertarka Silnik wiszącyLeica39416001
Stereotax Kopf04557R
Micro4 Sterownik pompy mikrostrzykawkowejWPISYS-MICRO4
UMP3 UltraMicroPumpWPIUMP3
ModulampRurka Schott-Luer-lock
(19 gauge)Hamilton90619
Temperatura topnienia KapilarnaKimble34500-99Szklana igła
Fluoro-Max: Czerwone mikrosfery fluorescencyjneThermo ScientificR25Bez rozcieńczenia; Stosować do iniekcji treningowych
10 i mikro; L, Model 1701 LT SYRHamilton80001do inokulacji embrionalnej
10 i mikro; L, Model 1701 RN SYR, Mały wyjmowany NDL, 26s ga, 2 cale, styl punktowy 2Hamilton80030dla noworodka/dorosłego
4-0 Nici nylonowe EthilonEthicon-Olej
mineralny VWR-ściągacz
do mikropipetSutter InstrumentsP-1000
Młynek do mikropipetNarishigeEG-44
Fastgreen FCF DyeSigmaF7252wstrzyknąć 0,5% barwnika
przeciwciała
grupa flawiwirusówprzeciwciało MilliporeMAB10216ms IgG2a 1:400 (Rysunek 2, Rysunek 3)
Pax6DBHBPax6-sms IgG1 1:20
Mysz

Bibliografia

  1. Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
  2. Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
  3. Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
  4. Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
  5. Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
  6. Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
  7. Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
  8. Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672(2016).
  9. Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
  10. Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
  11. Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
  12. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
  13. Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
  14. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
  15. Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
  16. Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
  17. Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
  18. Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575(2017).
  19. Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
  20. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
  21. Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Infekcja wirusem Zikamodel mysim zg embrionalnym zg noworodkowydoros a myszwsp rz dne stereotaktycznekomora bocznareplikacja wirusazaburzenia neurorozwojowe
Tworzenie mysich modeli zaburzeń neurologicznych wywołanych wirusem Zika przy użyciu strategii iniekcji domózgowych: embrionalnej, noworodkowej i dorosłej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.