Przedstawiamy protokół wykorzystania karalucha syczącego z Madagaskaru jako alternatywnego modelu zwierzęcego niebędącego ssakiem do prowadzenia badań nad zjadliwością bakteryjną, patogenezą, toksycznością leków, skutecznością leków i wrodzoną odpowiedzią immunologiczną.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Syczący karaluch z Madagaskaru jako alternatywny model zwierzęcy nienależący do ssaków do badania zjadliwości, patogenezy i skuteczności leków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele aspektów odporności wrodzonej jest zachowanych między ssakami a owadami. Owad, syczący karaluch madagaskarski z rodzaju Gromphadorhina, może być wykorzystany jako alternatywny model zwierzęcy do badania zjadliwości, interakcji gospodarz-patogen, wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i skuteczności leków. Podano szczegółowe informacje na temat hodowli, pielęgnacji i hodowli syczącego karalucha. Pokazujemy również, w jaki sposób może zostać zainfekowany bakteriami, takimi jak wewnątrzkomórkowe patogeny Burkholderia mallei, B. pseudomallei i B. thailandensis. Wykorzystanie syczącego karalucha jest niedrogie i pozwala przezwyciężyć problemy regulacyjne związane z wykorzystaniem ssaków w badaniach. Ponadto wyniki uzyskane przy użyciu modelu syczącego karalucha są powtarzalne i podobne do tych uzyskanych przy użyciu modeli ssaków. Tak więc syczący karaluch z Madagaskaru stanowi atrakcyjnego zastępczego gospodarza, którego należy zbadać podczas prowadzenia badań na zwierzętach.
Wprowadzenie
Wykorzystanie owadów jako alternatywnych modeli zwierzęcych niebędących ssakami do badania patogenezy bakteryjnej i wrodzonej obrony gospodarza nabiera rozpędu w ostatnich latach. Logistycznie wynika to z ich stosunkowo niedrogiego kosztu oraz łatwości pozyskiwania, obsługi i opieki nad owadami w porównaniu ze ssakami. Nie istnieje również polityka regulacyjna regulująca wykorzystanie owadów w badaniach; Nie podlega zakresom ani ograniczeniom określonym przez jakikolwiek komitet ds. użytkowania zwierząt lub agencję rządową. Owady jako zastępcze modele zwierzęce są szczególnie podatne na kompleksowe badania przesiewowe pod kątem czynników wirulencji, interakcji gospodarz-patogen oraz oceny skuteczności leków przeciwdrobnoustrojowych. Ich użycie może zmniejszyć liczbę ssaków wykorzystywanych do badań, przezwyciężając w ten sposób niektóre dylematy etyczne związane z prowadzeniem eksperymentów na zwierzętach 1,2.
Owady mogą służyć jako zastępcze gospodarze, ponieważ istnieje wysoki stopień podobieństwa między wrodzonymi układami odpornościowymi owadów i ssaków 1,3. Zarówno plazmatocyty owadów, jak i mikroorganizmy fagocytozy makrofagów ssaków 4. Owadzim odpowiednikiem neutrofili jest hemocyt 5,6. Wewnątrzkomórkowe szlaki wybuchu oksydacyjnego w komórkach owadów i ssaków są podobne; Reaktywne formy tlenu w obu są wytwarzane przez ortologiczne białka P47Phox i P67Phox 5. Kaskady sygnałowe poniżej receptorów Toll u owadów i receptorów Toll-podobnych oraz interleukiny-1 u ssaków są również niezwykle podobne; Oba powodują produkcję peptydów przeciwdrobnoustrojowych, takich jak defensyny 7. W ten sposób owady można wykorzystać do badania ogólnych wrodzonych mechanizmów odpornościowych, które są wspólne dla metazoanów.
Owad zwany madagaskarskim syczącym karaluchem z rodzaju Gromphadorhina, jest jednym z największych gatunków karaluchów, jaki istnieje, osiągając zazwyczaj od 5 do 8 cm w okresie dojrzałości. Pochodzi tylko z wyspy Madagaskar i charakteryzuje się syczącym dźwiękiem, który wydaje - dźwiękiem, który powstaje, gdy syczący karaluch wydmuchuje powietrze przez otwory oddechowe zwane przetchlinkami 8. Charakterystyczny syk służy jako forma komunikacji społecznej między syczącymi karaluchami do zalotów i agresji 9 i można go usłyszeć, gdy samiec jest niepokojony w swoim środowisku. Syczący karaluch z Madagaskaru porusza się wolno w porównaniu z karaluchem amerykańskim i innymi miejskimi gatunkami szkodników. Jest łatwy w pielęgnacji i hodowli; Ciężarny syczący karaluch może jednorazowo wydać od 20 do 30 potomstwa. Mały syczący karaluch, zwany nimfą, osiąga dojrzałość płciową w ciągu 5 miesięcy po przejściu 6 linień i może żyć do 5 lat zarówno na wolności, jak i w niewoli 8.
Wykorzystaliśmy karalucha syczącego z Madagaskaru jako zastępczego gospodarza dla infekcji wewnątrzkomórkowymi patogenami Burkholderia mallei, B. pseudomallei i B. thailandensis 10,11. Zjadliwość tych patogenów u syczących karaluchów porównano z ich zjadliwością w wzorcowym modelu zwierzęcym dla Burkholderia, chomika syryjskiego. Odkryliśmy, że 50% dawka śmiertelna (LD50) B. pseudomallei i B. mallei była podobna w obu modelach 11. Co ciekawe, B. thailandensis, choć awirulentny w modelu gryzonia, jest śmiertelny u syczącego karalucha 11. Ta różnica w odniesieniu do infekcji B. thailandensis podkreśla użyteczność modelu syczącego karalucha; Mutanty tłumiące B. thailandensis mogą być łatwiej rozwiązane w syczącym karaluchu niż w modelach gryzoni. Ponadto, ponieważ B. thailandensis jest często używany jako organizm modelowy dla B. pseudomallei i B. mallei 10,12,13, zidentyfikowanie w nim mutacji osłabiających może prowadzić do podobnych celów u jego bardziej zjadliwych krewnych.
Pomimo różnicy w zjadliwości B. thailandensis u syczącego karalucha w porównaniu z chomikiem syryjskim, mutacje w krytycznych czynnikach wirulencji, takich jak te w systemie wydzielania typu 6-1 (T6SS-1), które osłabiają się u B. mallei i B. pseudomallei, są podobnie osłabiające dla B. thailandensis 11. Model syczącego karalucha jest dalej weryfikowany w tym, że indywidualne mutanty T6SS (od T6SS-2 do T6SS-6) u B. pseudomallei, które nie mają wpływu na zjadliwość u chomików syryjskich, pozostają zjadliwe u syczących karaluchów 11. Tak więc syczący karaluch jest realnym zastępczym modelem zwierzęcym dla trzech gatunków Burkholderia. Niedawno wykorzystaliśmy syczącego karalucha jako zastępczy model zwierzęcy do zbadania skuteczności leku przeciwmalarycznego chlorochiny (CLQ) przeciwko infekcji Burkholderia 10 i jego toksyczności.
Tutaj opisujemy hodowlę i pielęgnację syczącego karalucha z Madagaskaru oraz podajemy szczegóły, jak zarazić tego owada trzema gatunkami Burkholderia. Ponadto pokazujemy, że syczący karaluch jest realnym modelem zastępczym do badania zjadliwości i skuteczności leków w infekcjach Burkholderia i że prawdopodobnie może również służyć jako zastępczy gospodarz dla innych patogenów bakteryjnych w podobnych badaniach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowania do utrzymania kolonii syczących karaluchów
- Przygotuj klatki, w których będą mogły żyć syczące karaluchy. Nałóż cienką warstwę wazeliny o szerokości około 20 do 30 mm na obwód wewnętrznych ścianek w pobliżu górnej części klatki, aby zapobiec wydostaniu się syczących karaluchów z klatki i ucieczce.
UWAGA: Syczące karaluchy mogą być trzymane w różnych pojemnikach, które mają dużą powierzchnię podłogi, mają wystarczającą wysokość i mają pokrywki. Użyj klatek na myszy (~43 cm x 23 cm x 20 cm). W przypadku koszyków przeznaczonych do pracy w temperaturze 37 °C nie należy stosować wazeliny. - Dołącz kartonowy karton na jajka umieszczony do góry nogami wewnątrz klatki, aby zapewnić schronienie dla naturalnie płochliwych owadów. Nie zastępuj kartonowego kartonu na jajka kartonem wykonanym z pianki polistyrenowej, aby zapobiec połknięciu plastiku.
- Nie należy zapewniać ściółki dla łatwiejszego sprzątania i zwiększenia widoczności nowo wyklutych nimf.
- Zaopatrz się w suchą karmę dla psów, która zawiera kompozycję ~20% białka surowego. Karmę dla psów grubo zmielić za pomocą robota kuchennego lub blendera i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Zaopatrz się w kilka płytkich naczyń i kamieni akwariowych lub gąbkę do jedzenia i wody.
UWAGA: Zaleca się stosowanie szalek Petriego.
2. Pielęgnacja i hodowla syczących karaluchów
- Zdobądź niekrewniacze syczące karaluchy z Madagaskaru (~5 cm) od komercyjnego hodowcy. Gatunkiem użytym w tym protokole jest Gromphadorhina laevigata. Rozpakuj pudełko wysyłkowe zawierające syczące karaluchy natychmiast po otrzymaniu.
- Należy przestrzegać odpowiednich wytycznych instytucjonalnych dotyczących stosowania środków ochrony indywidualnej podczas obchodzenia się ze zwierzętami.
UWAGA: Do obchodzenia się z karaluchami używaj grubych jednorazowych rękawiczek, ponieważ pazury stępu syczącego karalucha są ostre. - Przenieś do 75 dużych syczących karaluchów (>3 cm) na dużą klatkę. Nowo wyklute i mniejsze nimfy (<3 cm) przenieść do osobnej klatki.
UWAGA: Trzymanie znacznie więcej niż 75 dużych syczących karaluchów w klatce myszy może prowadzić do pogorszenia stanu zdrowia kolonii, a także może skutkować śmiercią. - Delikatnie obchodź się ze świeżo wyliniałym karaluchem, który ma kolor złamanej bieli i unikaj ściskania go. Alternatywnie, pozwól egzoszkieletowi ciemniejeć i stwardnieć przed użyciem.
UWAGA: Nie jest konieczne usuwanie roztoczy, Gromphadorholaelaps schaeferi, które często towarzyszą syczącym karaluchom po otrzymaniu od hodowców. Pożyteczne roztocza utrzymują syczące karaluchy w czystości i są nieszkodliwe dla ludzi. - Karm syczące karaluchy mieloną suchą karmą dla psów w płytkim naczyniu raz lub dwa razy w tygodniu. Zapewnij wystarczającą ilość karmy dla psów, aby upewnić się, że syczące karaluchy mają wystarczającą ilość pożywienia do następnego karmienia. Wyrzuć żywność, która stała się mokra i spleśniała.
- Oprócz karmy dla psów podawaj pokrojone owoce i warzywa, takie jak jabłka, ziemniaki lub sałata, w płytkim naczyniu. Wyrzuć spleśniałe lub zgniłe jedzenie.
- Raz lub dwa razy w tygodniu wlej wodę pitną do płytkiego naczynia, ale nie przepełniaj naczynia, aby zapobiec rozlaniu w klatce. Umieść w naczyniu małe kamienie akwariowe lub gąbkę, aby zapewnić lądowisko dla małych nimf. Użyj wody z odwróconej osmozy, jeśli jest dostępna.
- Syczące karaluchy trzymaj w ciemności w temperaturach od 21 °C do 30 °C. Trzymaj duże syczące karaluchy przeznaczone do eksperymentów w niższej temperaturze (~21 °C) przez ~ 2 miesiące, aby zmniejszyć rozmnażanie i ciążę. W przeciwieństwie do tego, trzymaj nimfy w wyższych temperaturach (28 °C do 30 °C), aby przyspieszyć wzrost.
UWAGA: Przechowuj klatki w temperaturze pokojowej (21 °C) w ciemnej szafce. - Zapewnij wilgotność, dołączając osobną miskę z wodą, jeśli syczące karaluchy są trzymane w inkubatorze.
- Czyść klatkę, regularnie zbierając suchy kał lub przenosząc syczące karaluchy do czystej klatki co 2 do 3 tygodni. Utrzymuj dno klatki w suchości. Natychmiast wyczyść klatkę, jeśli nadmiar wody może się nagromadzić i wymieszać z odchodami na dnie klatki.
3. Przygotowanie karalucha do eksperymentów
- Przenieść odpowiednią liczbę syczących karaluchów z klatki do inkubatora z wilgotnością 37 °C na 1 do 3 tygodni przed eksperymentem w celu aklimatyzacji. Należy dołączyć grupę kontrolną do wstrzyknięcia. Ten okres aklimatyzacji ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia szoku temperaturowego podczas eksperymentowania.
- Nie należy stosować wazeliny do klatek przeznaczonych do temperatury 37 °C, ponieważ wyższa temperatura topi galaretkę.
- Sprawdzaj syczące karaluchy co 1 do 2 dni, aby wymienić jedzenie i wodę oraz wyczyścić klatkę.
- Zaopatrz się w przezroczyste jednorazowe plastikowe pojemniki na żywność z pokrywkami do grupowania syczących karaluchów podczas eksperymentów. W celu wentylacji przebij otwory w pokrywie lub boku pojemnika za pomocą gwoździa i młotka.
UWAGA: Używaj pojemników z zakrętką zamiast pojemników zatrzaskowych przy ustawieniu poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3. W razie potrzeby pojemniki z zatrzaskiem można wzmocnić taśmą. - W dniu wstrzyknięcia należy rozprowadzić od 6 do 12 zaaklimatyzowanych syczących karaluchów w grupach w pojemniku, zapewniając równomierne rozprowadzenie według płci i masy ciała.
- Określ płeć poszczególnych syczących karaluchów. Określ płeć na podstawie wypukłości rogów znalezionych u samców i ich braku u samic.
- Zważ poszczególne syczące karaluchy. Aby ułatwić ważenie syczącego karalucha na wadze, należy go zamknąć w dwóch łodziach wagowych, które zostały wytarowane.
UWAGA: Aby zachować spójność między eksperymentami, należy używać syczących karaluchów o wadze od 4 do 8 g. Jednak nie stwierdzono różnicy w przeżywalności po zakażeniu między małymi (1,5 do 2 g) i dużymi (6 do 8 g) syczącymi karaluchami. Do badań nad lekami należy używać syczących karaluchów o wadze ~5 g, aby uzyskać bardziej spójne stężenie leku na masę ciała. - Zamiast naczynia z wodą dodaj owoce lub warzywa o wysokiej zawartości wody, takie jak plasterek jabłka lub ziemniaka. Wyrzuć zgniłe jedzenie. Nie dostarczaj dodatkowej wody, aby pojemnik był suchy.
- Przywrócić syczące karaluchy do temperatury 37 °C do momentu wstrzyknięć.
4. Hodowla i preparaty bakteryjne
UWAGA: Gatunki bakterii użyte w tym protokole to B. mallei, B. pseudomallei i B. thailandensis. Wszystkie manipulacje z użyciem B. mallei i B. pseudomallei muszą być wykonywane w komorach bezpieczeństwa biologicznego klasy II lub III znajdujących się w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 3. Wykonywać manipulacje z B. thailandensis w podobnych komorach bezpieczeństwa biologicznego znajdujących się w laboratorium BSL2 lub BSL3. Postępuj zgodnie z instytucjonalną standardową procedurą operacyjną dla pracy BSL3. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi stosowania środków ochrony osobistej podczas obchodzenia się z bakteriami.
- Przygotuj płytkę wzorcową Burkholderia co najmniej 3 dni przed zakażeniem. Użyj agaru Luria-Bertani (Lennox) (LB) dla B. pseudomallei lub B. thailandensis i użyj agaru LB uzupełnionego 4% glicerolem dla B. mallei. Bakterie smugowe z 25% glicerolu przechowywanego w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Zawsze należy spryskiwać płytkę główną bezpośrednio z zamrożonego wywaru glicerolowego; Unikaj seryjnego przechodzenia bakterii z płytki na płytkę, ponieważ może to spowodować zmniejszenie zjadliwości. - Zaszczepić od 10 do 20 ml bulionu LB kilkoma koloniami B. pseudomallei lub B. thailandensis z płytki głównej. Podobnie zaszczepić bulion LB uzupełniony 4% glicerolem dla B. mallei.
- Wstrząsać kulturą bulionową z prędkością 175 do 250 obr./min w temperaturze 37 °C przez ~18 godzin.
- Odwirować od 2 do 3 ml kultury o stężeniu 5 000 x g przez 10 minut.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4).
- Rozcieńczyć bakterie PBS, aby uzyskać gęstość optyczną (OD) 0,5, mierzoną przy absorbancji przy 600 nm w spektrofotometrze.
- Seryjnie rozcieńczyć bakterie dziesięciokrotnie w PBS od początkowego OD 0,5. Zawiesiny te należy stosować w przypadku infekcji.
- Oznaczyć jednostki tworzące kolonie (CFU) inokulum przez seryjne rozcieńczanie i posiewanie 100 μl podwielokrotności na pożywce agarowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24-48 godzin.
5. Preparaty lecznicze
- Określ odpowiednią ilość leku, która ma być podawana na masę ciała. Dawka CLQ podana syczącemu karaluchowi była oparta na standardowej dawce dla ssaków, która wynosi 50 mg/kg/dzień.
- Zawiesić lub rozcieńczyć lek będący przedmiotem zainteresowania w nośniku. Na przykład rozcieńczyć CLQ w PBS w stężeniu 12 mg/ml. To stężenie dostarcza 300 μg leku do ~6 g syczącego karalucha w wstrzykniętej objętości 25 μL.
- W razie potrzeby wysterylizuj roztwór leku, przepuszczając go przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
- Roztwór leku należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Przed wstrzyknięciem należy ogrzać roztwór leku do temperatury co najmniej 21 °C (temperatura pokojowa).
6. Montaż wtryskiwacza
- Ustaw wskazówkę na żądaną objętość (25 μl), obracając regulacyjną na powtarzalnej pipecie.
- Wciśnij pręt zwalniający pipety powtarzalnej do środka i pociągnij popychacz na zewnątrz. Pipeta powtarzalna jest teraz gotowa do umieszczenia załadowanej strzykawki.
UWAGA: Skalibruj objętość wyrzucaną przez powtarzalną pipetę, mierząc ilość wody wyrzucanej na wadze. - Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml zawiesiną zawierającą bakterie lub lek.
- Podłączyć strzykawkę do sterylnej igły o wymiarach 26 lub 27 G x 1/2 cala (lub krótszej).
- Postukaj w strzykawkę, aby unieść pęcherzyki powietrza do góry i usunąć bąbelki oraz część zawiesiny do pojemnika wypełnionego 10% wybielaczem.
- Zatrzasnąć strzykawkę na zacisku strzykawki pipety powtarzalnej z igłą pod kątem skierowanym do góry.
- Pociągnąć pręt zwalniający na zewnątrz i mocno nacisnąć przycisk dozownika, aby wykonać ślepe wstrzyknięcia do pojemnika wypełnionego 10% wybielaczem, aż tłok strzykawki dotknie popychacza.
- Wykonać 1 lub 2 dodatkowe ślepe wstrzyknięcia, aby upewnić się, że płyn jest wyrzucany ze strzykawki. Pipeta powtarzalna jest gotowa do wstrzykiwań.
7. Zastrzyki z karaluchów
- Wszystkie wstrzyknięcia karaluchów należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II lub III w warunkach BSL2 lub BSL3, używając zalecanego przez instytucję wyposażenia ochrony osobistej.
- Oczyść powierzchnie robocze w szafie bezpieczeństwa, które mogą mieć kontakt z syczącymi karaluchami. Użyj 10% wybielacza, a następnie 70% etanolu, aby usunąć resztki wybielacza. Pozostaw powierzchnię do wyschnięcia na powietrzu.
- Jedną ręką chwyć syczącego karalucha za bok. Unieruchomić syczącego karalucha tak, aby nie był w stanie odskoczyć podczas wstrzykiwania. Zegnij lekko syczącego karalucha, aby błony skórne między tergą brzuszną były odsłonięte.
- Drugą ręką trzymaj pipetę tak, aby igła znajdowała się pod kątem od 0° do 30° od grzbietowo-brzusznej linii środkowej syczącego karalucha. Nakłuć błonę skórną przylegającą do3., 4. lub 5. tergum od tylnego końca.
UWAGA: Wprowadzenie igły do syczącego karalucha pod wskazanym kątem zapewnia, że igła nie przejdzie i nie wyjdzie z syczącego karalucha. Miejsce iniekcji zapewnia, że wyrzucony materiał znajduje się w jamie brzusznej wypełnionej hemolimfą. Ćwicz trzymanie syczących karaluchów i wstrzykiwanie wody przed podjęciem zastrzyków z żywymi bakteriami lub lekiem. - Mocno naciśnij przycisk dozowania, aby wstrzyknąć objętość. Delikatnie wyjąć igłę pod tym samym kątem, pod jakim została użyta do wprowadzenia.
- Umieść wstrzykniętego syczącego karalucha w osobnym pojemniku, aby odróżnić go od syczących karaluchów, które nie zostały jeszcze wstrzyknięte. Wytrzeć hemolimfę, która mogła wycieknąć z miejsca wstrzyknięcia.
- Kontynuuj wstrzykiwanie innych syczących karaluchów w grupie za pomocą tej samej strzykawki i igły. Należy przerwać wstrzykiwanie, zanim tłok strzykawki dotrze do dna cylindra, aby zapobiec niepełnemu dozowaniu w ostatnim wstrzyknięciu.
- W przypadku wielu wstrzyknięć w jednego syczącego karalucha, takiego jak te z bakteriami i lekiem, wstrzyknij po różnych stronach tergum po grzbietowej stronie syczących karaluchów. Alternatywnie, należy wykonać wiele wstrzyknięć, wstrzykując w różne tergi (od 3 do 5).
- Upewnij się, że pokrywy pojemników są dobrze zamocowane. W razie potrzeby wzmocnij pokrywki taśmą.
- Wysiaduj syczące karaluchy w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C.
8. Nagrywanie zachorowalności i śmiertelności syczących karaluchów
- Wszystkie badania syczących karaluchów należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II lub III przy użyciu zalecanego przez instytucję sprzętu ochrony osobistej. Wyczyść powierzchnie w szafie bezpieczeństwa 10% wybielaczem, a następnie 70% etanolem. Pozostaw obszar roboczy do wyschnięcia na powietrzu.
- Oceniaj syczące karaluchy raz lub dwa razy dziennie przez okres od 1 do 2 tygodni, korzystając z tabeli oceny zachorowalności (Tabela 1).
- Usuń martwe syczące karaluchy z pojemnika i zapisz liczbę ocalałych.
- Przenieś pozostałe żywe syczące karaluchy do czystego pojemnika, jeśli na dnie pojemnika nagromadził się nadmiar wilgoci. Alternatywnie użyj jednorazowych ręczników papierowych, aby wytrzeć nadmiar wilgoci.
- Codziennie wymieniaj zepsute jedzenie i włóż syczące karaluchy z powrotem do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 °C.
- Pod koniec badania umieść pozostałe osoby, które przeżyły, w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego i zamroź w temperaturze -80 °C w celu eutanazji.
- Przeanalizuj statystycznie data14, aby określić LD50 oraz za pomocą analizy Kaplana-Meiera i Log-Rank dla przeżycia. Podobnie jak w przypadku wszystkich eksperymentów z owadami, niektóre zgony mogą wystąpić w grupie kontrolnej. Zgony te przypisuje się naturalnej śmiertelności owadów 15. Bardziej szczegółowa dyskusja na temat tego, jak uwzględnić zgony w grupie kontrolnej, znajduje się w reference15.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W tej sekcji przedstawiono wyniki uzyskane po zainfekowaniu karaczanów madagaskarskich (karaczanów syczących) za pomocą B. mallei, B. pseudomallei, lub B. thailandensis; wyniki pokazują, że owad ten jest podatnym modelem zwierzęcym dla różnych gatunków Burkholderia w badaniach nad wirulencją, toksycznością leków oraz skutecznością leków przeciwko zakażeniom bakteryjnym. Więcej karaczanów syczących przeżyło w grupach zakażonych mutantami atenuowanymi (Δhcp1
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Optymalne warunki eksperymentalne zaczynają się od zdrowej syczącej kolonii karaluchów, która wymaga minimalnego, ale konsekwentnego zaangażowania czasowego. Chociaż syczące karaluchy mogą wytrzymać stosunkowo długi okres czasu (~tygodnie) bez jedzenia i wody, należy zapewnić cotygodniową lub dwutygodniową konserwację klatki. Obejmuje to sprawdzenie dopływu pokarmu i wody oraz upewnienie się, że klatka jest sucha. Utrzymanie suchych warunków życia jest szczególnie ważne podczas aklimatyzacji i inkubacji w wyższych temper...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
J. Chua, N.A. Fisher, D. DeShazer i A.M. Friedlander zaprojektowali procedury opisane w manuskrypcie. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli i D. DeShazer przeprowadzili eksperymenty. J. Chua napisał rękopis.
Autorzy dziękują Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Nicholas R. Carter i Steven A. Tobery za doskonałą pomoc techniczną oraz Davidowi P. Fettererowi i Stevenowi J. Kernowi za analizę statystyczną.
Praca została wsparta przez Defense Threat Reduction Agency Proposal #CBCALL12-THRB1-1-0270 do A.M.F i #CBS. MEDBIO.02.10.RD.034 do D.D.
Opinie, interpretacje, wnioski i rekomendacje należą do autorów i niekoniecznie są popierane przez armię amerykańską.
Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Obrony, a wzmianki o nazwach handlowych, produktach komercyjnych lub organizacjach nie sugerują poparcia ze strony rządu USA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Madagaskar syczący karaluch | Carolina Biological Supply Co, Burlington, Karolina Północna | ||
| Krokiety i bity, dowolny smak | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Zatrzask na jednorazowych plastikowych pojemnikach lub odpowiednikach | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Przykręć jednorazowe plastikowe pojemniki lub ich odpowiedniki | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series powtarzalne pipeta | Dymax Corporation www.dymax.com | T15469 | |
| Strzykawka (1 ml) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 lub 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Difosforan chlorochiny | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Iskry, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
Bibliografia
- Sifri, C. D., Ausubel, F. M. Cellular Microbiology. Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. , ASM Press. 543-563 (2004).
- Silcock, S. Is your experiment really necessary? New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).
- Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. The innate immune system of mammals and insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Mulder, P. G., Shufran, A. Madagascar hissing cockroaches, information and care. Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , Oklahoma State University. 4(2016).
- Nelson, M. C., Fraser, J. Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing. Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infect Immun. 85 (1), e0058616(2017).
- Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. BMC Microbiol. 12, 117(2012).
- Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).
- West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).
- Finney, D. J. Probit Analysis. , University Press. Cambridge. (1971).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).
- Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei. J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).
- Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis. BMC Microbiol. 11 (1), 11(2011).
- Pilatova, M., Dionne, M. S. Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (11), e49745(2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp. (70), e4392(2012).
- Eklund, B. E., et al. The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis. PeerJ Preprints. 4, e1524v1522(2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
